KR20010033150A - 항종양제용 다촉매 프로테아제 억제제 - Google Patents

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KR20010033150A
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로버트 사이만
지테쉬 피. 자니
로날드 에이치. 골드파브
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세파론, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 종양세포에서의 프로그램된 세포사멸(즉, 고사) 유도물질, 더 구체적으로는 항종양제로서 사용하기 위한 다촉매 프로테아제(MCP)의 특이 억제제의 용도를 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 MCP 억제제를 사용하여 형질전환된 세포에서 고사를 유도하는 방법, 형질전환된 세포에서 증식을 억제하는 방법 및 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.

Description

항종양제용 다촉매 프로테아제 억제제{Multicatalytic Protease Inhibitors for Use as Anti-Tumor Agents}
Ⅰ. 암에 걸린 상태에서의 고사
고사는 예컨대 벌레로부터 인간에 이르기까지 진화 과정 내내 보존된 프로그램된 세포사멸의 활발한 과정이다(Jacobson, M.J., et al. Cell 88, 347-354, 1997). 고사는 두가지 생리적 단계, 즉 포획 및 실행단계로 일어난다. 고사 실행은 카스파제(caspase)족의 특정 프로테아제가 활성화되어 개시되며, 비정상적인 기질특이성 즉, 아스파르트산("Asp") 잔기 뒤에서의 절단을 나타낸다(Martin, S.J. 및 Green, D.R. Cell, 82:349-352, 1995). 지금까지, 적어도 10종의 카스파제 동족체가 동정되어 클론되었다(Alnemri, E.S., et al. Cell 87, 171, 1996). 카스파제의 활성화는 중요한 세포 단백질이 프로테아제에 의하여 절단되는 것과 극히 유사하게 고사를 초래한다. 폴리(ADP)-리보오스 폴리머라제("PARP"; Lazebnik, Y.A., et al. Nature, 371:346-347, 1994), 액틴(Kayalar, C., et al. PNAS USA, 93:2234-2238, 1996), 스테롤 조절 결합 단백질(Wang, X., et al. EMBO J, 15:1012-1020, 1996) 및 DNA-의존성 단백질 키나제(Song, Q., et al. EMBO J, 15:3238-3246, 1996)를 비롯한 수많은 단백질들이 고사 중에 Asp 잔기 뒤에서 절단되므로, 카스파제가 절단효소임을 나타낸다고 보고되었다. HL-60 또는 U937 세포들을 항암제로 처리하였을 때, 중요한 세포주기 조절물질이고 종양 억제제인 레티노블라스토머(RB) 단백질(Weinberg, R.A. Cell, 81:323-330, 1995)이 프로테아제에 의하여 "p68"과 "p48"로 불리우는 두개의 주요 단편으로 절단된다고 보고되었다(An, B., 및 Dou, Q.P., Cancer Res. 56:438-442, 1996). RB의 내부 절단 및 고사 모두, YVAD-CMK(상기 An, B., 및 Dou, Q.P., Cancer Res.), Bcl-2 종양 단백질, 또는 카우팍스 바이러스 CrmA 단백질(Dou, Q.P., et al. J. Cell Biochem., 64:586-594, 1997)과 같은 상이한 카스파제 억제제에 의하여 억제될 수 있는 것으로 보고되었다. 그 후, 다른 그룹은 고사 중에 RB가 또한 카스파제 3-유사 프로테아제에 의하여 C-말단으로부터 절단된다고 보고하였다(Janicke, R.U., et al. EMBO J, 15:6969-6978, 1996; Chen, W., et al. Oncogene 14, 1243-1248, 1997; Tan, X., et al. J. Biol. Chem. 272, 9613-9616, 1997). 또한, RB가 DNA의 엔도뉴클레오좀 단편화 전에 탈인산화된다고 보고되었다(Dou, Q.P., et al. PNAS USA, 92:9019-9023, 1995; Wang, H., et al. Oncogene 13, 373-379, 1996; 및 Morana, et al. J. Biol. Chem. 271, 18263-18271, 1996).
세포 고사 프로그램의 활성화가 인간의 암을 치료하는 현재 전략이다. X-선 조사 및 표준 화학요법 약물들이 고사를 유발시켜 일부 종양 세포를 사멸시키는 것으로 입증되었다(Fisher, D.E. Cell 78, 539-542, 1994). 불행하게도, 현재 대다수의 인간 암은 이들 치료법에 내성이 있다(Harrison, D.J. J. Patho 175, 7-12, 1995). 비록 인간 암에서 다약물 내성의 발전에 대한 분자적 메카니즘은 불분명하지만, Bcl-2의 과잉발현(Reed, J.C. J. Cell. Bio. 124, 1-6, 1994), 종양 억제 단백질 "p53"의 불활성화(Milner, J. Nature Medicine. 1, 789-880, 1995), 또는 전사 조절물질 NF-κB를 통한 생존 프로그램의 활성화(Beg, A.A. 및 Baltimore, D., Science. 274, 782-784, 1996; Wang et al., Science. 274, 784-787, 1996)가 이 과정에 관여하는 것으로 제안되었다.
Ⅱ. 다촉매 프로테아제(MCP)
진핵세포는 일정하게 세포 단백질을 분해하고 교체한다. 이에 의하여, 세포는 선택적이고도 신속하게 비정상적인 형태를 갖는 단백질 및 펩타이드를 제거할 수 있고, 조절 펩타이드의 수준을 조정하여 대사 경로상 제어를 가할 수 있고, 아사(餓死)시와 같이 필요할 때에는 에너지원으로 아미노산을 제공할 수 있다(Goldberg, A.L. ＆ St. John, A.C. Annu.Rev.Biochem. 45: 747-803, 1976). 포유동물의 세포 메카니즘에 의해 단백질 분해는 다경로로 일어날 수 있다. 이들 경로 중 일부는 아데노신 트리포스페이트("ATP")의 형태로 에너지 공급을 필요로 한다(상기 Goldberg, A.L. ＆ St. John, A.C.).
다촉매 프로테아제(MCP, 또는 전형적으로는 "다촉매 프로테이나제", "프로테아좀", "다촉매 프로테이나제 복합체", "다촉매 엔도펩티다제 복합체", "20S 프로테아좀" 및 "인겐신"이라고도 한다)는 단백질을 펩타이드와 아미노산으로 분해하는 적어도 두가지 세포 경로에서 중요한 역할을 하는 분자량이 큰(700kD) 진핵세포의 비-리소좀 프로테이나제 복합체이다(Orlowski, M. Biochemistry. 29(45): 10289-10297, 1990). 상기 복합체는 적어도 5종의 상이한 형태의 가수분해 활성을 갖는다. 즉, (1) 펩타이드 결합을 염기성 아미노산의 카르복실쪽에서 절단하는 트립신-유사 활성, (2) 펩타이드 결합을 소수성 아미노산의 카르복실쪽에서 절단하는 키모트립신-유사 활성, (3) 펩타이드 결합을 글루탐산의 카르복실쪽에서 절단하는 활성, (4) 분지쇄 아미노산을 선호하는 활성 및 (5) 작은 중성 아미노산을 선호하는 활성(Rivett, A.J. J. Biol. Chem. 264:21 12215-12219, 1989 및 상기 Orlowski).
MCP가 관여하는 단백질 가수분해의 한가지 경로는 폴리펩타이드 "유비퀴틴"을 또한 포함한다(Hershko, A. ＆ Ceichanover, A. Annu. Rev. Biochem. 51:335-364, 1982). 이 경로는 MCP, ATP 및 유비퀴틴을 요하며 매우 비정상적인 단백질, 특정한 단명의 정상적인 단백질, 섬유아세포를 증식시키고 망상 적혈구를 성숙시키는데 관여하는 단백질 군들의 분해에 관한 것으로 보인다(Driscoll, J. 및 Goldberg, A.L. PNAS USA 86:787-791, 1989). 이 경로에 의하여 분해되는 단백질들은 ATP에 의존하여 그들의 라이신 아미노기를 통하여 유비퀴틴과 공유 결합된다. 이어서, 유비퀴틴과 결합된 단백질들은 ATP-의존성 프로테아제 복합체, 단백질 분해 코어로서 MCP를 함유하는 26S 프로테아좀에 의하여 작은 펩타이드로 분해된다 (Goldberg, A.L. ＆ Rock, K.L. Nature 357:375-379, 1992).
MCP 및 ATP를 요하나 유비퀴틴은 요하지 않는 단백질 분해의 제2 경로가 또한 개시되어 있다(상기 Driscoll, J. ＆ Goldberg, A.L.). 이 과정에서 MCP는 ATP에 의존하여 단백질을 가수분해한다(상기 Goldberg, A.L. ＆ Rock,K.L.). 이 과정은 골격근에서 관찰되었다(상기 Driscoll, J. ＆ Goldberg, A.L.). 그러나, MCP는 또다른 프로테아제인 멀티페인과 상승적으로 작용하여 근육 단백질의 분해를 가속화하는 것으로 제안되었다(상기 Goldberg ＆ Rock).
MCP는 단백질 분해 메카니즘으로 작용하며, 활성부위 친핵체는 N-말단 트레오닌 잔기의 히드록실기인 것으로 보고되었다. 따라서, MCP는 최초로 알려진 트레오닌 프로테아제의 예이다(Seemuller et al., Science 268 579-582, 1995; Goldberg, A.L, Science 268 522-523, 1995).
최근 연구는 MCP 시스템이 고사의 조절에 관여하는 것으로 제안하였으나, 이 가정된 역할에 대하여 논란이 있다. 트리펩타이드 알데히드류(예, LLnL 또는 LLnV) 또는 락타시스틴(미생물 대사산물)과 같은 몇몇 MCP 억제제들이 흉선세포에서의 프로그램된 세포사멸(Grimm, L.M., et al. EMBO J. 15, 3835-3844, 1996)과 뉴우런에서의 프로그램된 세포사멸(Sadoul, R. etal., EMBO J. 15, 3845-3852, 1996) 과정을 차단하는 것으로 발견되었다. 대조적으로, 동일 또는 유사한 MCP 억제제들이 인간 백혈병에서 고사를 유도하는 것으로 발견되었고(Imajoh-Ohmi, et al. Biochem. Biophy. Res. Commu. 217, 1070-1077, 1995; Shinohara, K., et al. Biochem. J. 317, 385-388, 1996; 및 Drexler, H.C.A. PNAS USA 94, 855-860, 1997), 다른 증식하는 세포주에서 고사를 유도하는 것으로 발견되었다(Lopes, U.G., et al. J. Biol.Chem. 272, 12893-12896, 1997).
Ⅲ. MCP 억제제들
본 발명의 대상인 MCP의 특이 억제제들은 세파론 인크.로 양도된 미국특허 제5,614,649호 및 제5,550,262호에 개시되어 있다. 이들 특허 서류들은 전적으로 본 명세서에 참고로 혼입되었다.
〈관련 문헌의 상호 참조〉
본 출원은 1997년 12월 16일 출원된 미국 가출원 제60/069,804호 및 1998년 12월 15일 출원된 "항종양제용 다촉매 프로테아제 억제제"를 발명의 명칭으로 하는 미국특허출원의 우선권을 주장하고 있다.
본 발명은 종양세포에서의 프로그램된 세포사멸(즉, 고사) 유도물질, 더 구체적으로는 항종양제로서 사용하기 위한 미국특허 제5,614,649호 및 제5,550,262호에 개시된 다촉매 프로테아제(MCP)의 특이 억제제에 관한 것이다.
〈발명의 요약〉
본 발명은 프로그램된 세포사멸(즉, 고사)의 유도물질 및 항종양제로서 MCP 억제제의 사용에 관한 것이다.
일부 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 형질전환된 세포와 본 발명의 화합물을 접촉시켜 상기 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다.
다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 형질전환된 세포와 본 발명의 화합물을 접촉시킴으로써, 형질전환된 세포의 존재로 특징지워지는 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 세포와 본 발명의 화합물을 접촉시킴으로써 상기 세포의 고사를 유발하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 형질전환된 세포와 본 발명의 화합물을 접촉시킴으로써 상기 세포의 증식을 억제하는 방법 및, 종양과 본 발명의 화합물을 접촉시킴으로써 종양의 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 종양은 고형 종양이다.
본 발명의 방법의 일부 바람직한 실시태양에서, 화합물은 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여된다.
본 발명의 방법의 일부 바람직한 실시태양에서, 형질전환된 세포는 유방암 세포, 전립선암 세포, 설암 세포, 뇌암 세포, 폐암세포, 췌장암 세포, 난소암 세포, 또는 피부암 세포이다.
일부 다른 바람직한 실시태양에서, 형질전환된 세포는 Bcl-2 단백질을 과량 생산하고/하거나 p53 단백질을 결여하고 있다.
본 발명의 MCP 억제제는 미국 특허 제5,550,262호 및 제5,614,649호에 개시되어 있고, 이들 각각의 개시는 전적으로 본 명세서에 참고로 혼입되었다. 이들 화합물은 하기식으로 표시된다.
구성원들뿐 아니라 바람직한 항종양제를 위한 바람직한 구성원들이 하기에 정의된다. 이들 화합물은 다양한 종양세포 유형, 특히 현재 승인된 화학요법제 치료에 내성인 고형 종양에 적용할 수 있는 유용한 고사 유도물질이다. 본 발명의 이들 및 다른 특징들은 이하에서 상세하게 설명될 것이다.
〈도면의 간단한 설명〉
제1도 및 제1A도는 인간 백혈병 세포에서 고사 유도물질로 개시된 MCP 억제제의 효과를 나타낸다.
제2도 및 2A도는 개시된 MCP 억제제들의 고사 유도능을 비교한 것이다.
제3도는 Bcl-2 종양 단백질의 과잉발현이 화합물 A에 의하여 유도된 고사 핵변화를 억제하지 못함을 보여주는 사진의 사본이다.
제4도는 Bcl-2 종양 단백질의 과잉발현이 화합물 A에 의하여 유도된 PARP의 절단 및 p112-115/RB의 생산을 억제하지 못함을 보여주는 사진의 사본이다.
제5도는 여러 인간 암 세포주에서 에토포시드 또는 시스플라틴에 의한 것이 아닌, 화합물 A에 의한 분리 및 고사의 유도를 나타내는 사진의 사본이다.
제6도는 화합물 A가 정상적인 인간 모(母) 섬유아세포에서가 아닌 SV 40-형질전환된 인간 섬유아세포에서 고사 핵 변화를 선택적으로 유도하는 것을 보여주는 사진의 사본이다.
제7도는 화합물 A가 정상적인 인간 모(母) 섬유아세포에서가 아닌 SV 40-형질전환된 인간 섬유아세포에서 PARP 절단을 선택적으로 유도하는 것을 보여주는 사진의 사본이다.
제8도는 화합물 D 및 E의 생체내 항암활성을 나타내는 그래프도이다.
제9도는 화합물 I 및 J에 의한 폐암 조직 증식의 생체내 억제를 나타내는 그래프도이다.
제10도는 화합물 I에 의한 쥐의 전립선암 조직 증식의 생체내 억제를 나타내는 그래프도이다.
〈발명의 상세한 설명〉
본 발명에 따른 항암제로서 사용하기 위한 고사 유도에 유용한 MCP 억제제는 하기 식으로 표시된다.
상기식에서,
R1은 -C≡N, -C(=O)OR9, 프탈이미도, -NH-SO2R9, 및 -NH-J로 구성된 군으로부터 선택되고,
R2는 H, 히드록실, 탄소 원자수가 1 내지 10인 알킬, 및 탄소 원자수가 3 내지 7인 시클로알킬로 구성된 군으로부터 선택되고,
R3는 -(CH2)m-NH-C(=N-R5)-NH2, -R6-NO2, -R6-J 및 -R6-C≡N로 구성된 군으로부터 선택되고,
R4는 -CH(CH2-R7)-Q이고,
Q는 -CH-R8, -C(=O)CH3, -C(=O)CH2Cl, -C(=O)CH2Br, -C(=O)CH2F, -C(=O)CHF2, -C(=O)CF3,-C(=O)C(=O)R7, -C(=O)C(=O)NHR7, -C(=O)CO2-R7, -C(=O)CO2H, -B(OH)2,
로 구성된 군으로부터 선택되고(상기 식에서, p 및 q는 독립적으로 2 또는 3 이고, W는 시클로 알킬임),
R5는 -NO2, -C=N, 및 -J로 구성된 군으로부터 선택되고,
R6는 -(CH2)m-NH-C(=NH)-NH-이고,
R7은 페닐, 및 탄소 원자수가 1 내지 8개이고 하나 이상의 할로겐 원자, 아릴 또는 헤테로 아릴기로 임의로 치환된 알킬로 구성된 군으로부터 선택되고,
R8은 =O, =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3, =N-O-CH2-C6H5, =NNH-C(=S)-NH2및 =N-NH-J로 구성된 군으로부터 선택되고,
R9은 수소 및 탄소 원자수가 1 내지 6개이고 하나 이상의 할로겐 원자, 아릴 또는 헤테로 아릴기로 임의로 치환된 알킬로 구성된 군으로부터 선택되고,
J는 보호기이고,
n은 3 내지 10의 정수이고,
m은 2 내지 5의 정수이다.
일부 바람직한 실시태양에서, R1은 -C≡N, -C(=O)OCH3, 프탈이미도 또는 -NH-SO2CF3이고 다른 바람직한 실시태양에서, R2는 H 또는 시클로펜틸이고,
R3는 바람직하게는 -(CH2)3-NH-C(=N-R5)-NH2이고,
Q는 바람직하게는 -CH-R8, -B(OH)2, -C(=O)C(=O)NH-R7, 또는 하기 구조식
을 갖고(상기 식에서, W는 피난임),
R5는 바람직하게는 -NO2, -C≡N, -PMC, -MTR, -MTS, 또는 Tos이고,
R7은 바람직하게는 -CH(CH3)2, -(CH2)2-CH3, -CH2-CH3, 또는 -C6H5이고,
R8은 =O, =N-OH, =N-O-CH2-C6H5, =NNH-C(=O)-NH2또는 =NNH-C(=S)-NH2이다.
일부 바람직한 실시태양에서, R1은 -C(=O)OCH3, 프탈이미도 또는 -NH-SO2CF3이고, R2는 시클로펜틸이고, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2이고, R7은 -CH(CH3)2이고, R8은 =O이다.
다른 바람직한 실시태양에서, R1은 -C≡N이고, R2는 시클로펜틸이고, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2또는 -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2이고, R7은 -CH(CH3)2이고, R8은 =O이다.
다른 바람직한 실시태양에서, R1은 -C≡N이고, R2는 시클로펜틸이고, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2또는 -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2이고, R7은 -CH(CH3)2이고, Q는 -CH-R8이고 R8은 =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3, =N-O-CH2-C6H5이다.
일부 특히 바람직한 실시태양에서, R1, R2, R3및 R4는 표 1에 나타낸 화합물들에 대한 치환기로부터 선택될 수 있다. 일부 특히 바람직한 실시태양에서, R1, R2, R3및 R4는 하기 표 1에 나타낸 화합물 A-J를 형성하도록 선택될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "알킬"은 에틸, 이소프로필 및 시클로펜틸기와 같이, 직쇄, 분지쇄 및 고리형 탄화수소를 포함하는 것을 의미한다. 치환된 알킬기는 하나 이상의 수소원자가 할로겐, 다른 탄화수소기(예, 펜틸기), 헤테로 아릴기에 의하여 치환된 알킬기, 또는 하나 이상의 탄소원자가 산소원자에 의하여 차단된 기로 치환된 알킬기이다. 바람직한 알킬기는 1 내지 약 8개의 탄소원자를 갖는다. 본 발명에서 사용된 "할로겐"이란 용어는 통상의 의미를 가지며 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 포함하며 불소가 바람직한 할로겐이다. 본 발명에서 사용된 용어 "Arg"는 아미노산 "아르기닌"의 약어로서 통상의 의미를 갖는다.
본 발명에서 기술된 각 구조식들은 하기와 같이 그들의 상응하는 호변 이성질체(tautomeric form)를 포함하도록 기술된 것으로 이해된다.
구체적인 MCP 억제제들은 보호기를 함유할 수 있다. 본 발명에서 사용된 "보호기"라는 구는 넓은 의미로 해석되는 것이다. 보호기는 히드록실기, 아미노기 및 카르복실기와 같은 작용기에 선택적으로 결합하거나 그로부터 제거될 수 있는 화학적 작용기로 알려진 그 자체이다. 이들 기는 화합물에 존재하여 이 화합물이 노출된 화학 반응조건에서 상기 작용기를 불활성화시킨다. 임의의 다양한 보호기가 본 발명에서 사용될 수 있다. 그러한 보호기중 하나는 프탈이미도기이다. 본 발명에 따른 다른 바람직한 보호기는 하기 구조식을 갖는다.
나아가 본 발명의 실시에 적합한 대표적인 보호기는 문헌[Greene, T.W. 및 Wuts, P.G.M., "유기 합성에 있어서 보호기(Protecting Groups in Organic Synthesis)" 제2판 Wiley ＆ Sons, 1991]에서 찾아볼 수 있다.
전술한 바와 같이, MCP 억제제는 세포 유형에 따라 고사를 유도하거나 차단할 수 있다. 본 발명에서 개시된 MCP 억제제는 고사에 의하여 종양세포, 화학요법제에 내성인 종양주까지도 사멸시킨다. 이러한 화합물의 유용성은 연구 및 치료분야 모두에 적용될 수 있다. MCP와 본 발명의 화합물을 접촉시켜 MCP의 활성을 억제하는 방법은 인간을 비롯한 포유동물에 상기 화합물을 의약 또는 약학제제로서 제공하는 것을 포함한다.
본 발명에 사용된 용어 "접촉"은 접촉될 부분들(moieties)을 직접적으로 또는 간접적으로 함께 위치시켜 상기 부분들이 서로 물리적으로 접촉하도록 하는 것을 의미한다. 따라서, 접촉은 용기내에 부분들을 함께 넣거나 부분들을 환자에게 투여하는 것과 같은 물리적 작용을 포함한다. 따라서, 예를들면, 본 발명의 화합물을 비정상적인 세포증식과 관련되거나 형질전환된 세포가 관여하는 질병 또는 질환을 갖는 인간 환자에게 투여하는 것은 "접촉"이라는 용어 정의의 범위내에 속한다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 MCP의 정상적, 비정상적 및/또는 고사 조절 방해와 같은 변형된 활성과 연관된, 질병(즉 비정상적인 육체적 상태), 질환 또는 병생리학적 상태로 고통받는 환자에게 투여된다. 본 발명의 조성물이 투여되는 질환은 바람직하게는 고사를 직접적으로 또는 간접적으로 억제하거나 비정상적으로 방해하는 것들로 특히, 상기 억제 및 비정상적 방해가 암상태를 초래하거나 가져오게 되는 것들이다.
고사유도에 의한 세포제거가 바람직한 일부 질환에는 다양한 암이 포함되며 예를들면, 흑색종, 전립선암, 췌장암, 난소암, 유방암, 설암 및 폐암이 있다. 신경교아종 세포, 골수 간세포, 조혈세포, 골아세포, 상피세포 및 섬유아세포 뿐만 아니라 본 발명의 방법에 의하여 치료될 수 있는 종양에는 흑색종, 전립선 종양, 췌장 종양, 난소 종양, 유방 종양, 설 종양, 폐 종양 및 평활근 종양이 있으나 이에 한정되지 않는다. 당업자는 표준 진단기술을 사용하여 질환, 상태, 질병으로부터 고통받는 것으로 의심되는 개체를 쉽게 동정할 수 있다.
세포들은 본 발명의 방법에 따라서 생체내 또는 생체외에서 치료될 수 있다. 생체내 치료를 위하여, 동물 특히 포유동물, 가장 바람직하게는 인간의 세포를 당업계에 공지된 다양한 임의의 투여방법에 의하여 본 발명의 화합물과 접촉시킨다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 본 발명의 화합물들은 그 유효 약제가 포유동물의 신체내에 있는 상기 약제의 작용부위에 도달할 수 있도록 하는 임의의 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 문맥에 있어서, "투여"는 약학 조성물을 환자에게 도입하는 것을 의미한다. 바람직한 투여방법에는 정맥내 투여, 피하내 투여 및 근육내 투여가 있다. 바람직하게는, MCP 억제제는 생리학적 살린과 같은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 MCP 억제제를 포함하는 약학 조성물로서 투여될 것이다. 다른 적합한 담체는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980)]에서 찾을 수 있다.
본 명세서에 기재된 약학 조성물중의 화합물의 농도는 투여될 약물의 용량, 사용되는 화합물의 화학적 특징(예. 소수성), 및 투여 경로를 비롯한 수많은 요인에 따라서 달라질 것이다. 일반적 의미에서, 본 발명의 화합물은 비경구투여용으로 약 0.1 내지 10% w/v의 MCP 억제제를 함유하는 생리학적 완충 수용액으로 제공될 것이다. 전형적인 용량 범위는 일일 체중 kg당 약 1μg/kg 내지 약 1g/kg이고, 바람직한 용량 범위는 일일 체중 kg당 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg이다. 투여될 약물의 바람직한 용량은 질병 또는 질환의 유형, 진행정도, 특정 환자의 전반적인 건강상태, 선택된 화합물의 상대적인 생물학적 효능, MCP 억제제 부형제 제제 및 그 투여 경로와 같은 변수에 의하여 좌우될 수 있다. 본 발명에 사용된 "환자"라는 용어는 임의의 척추동물을 의미한다. 바람직하게는, 환자는 인간이다.
하기 실시예의 의하여 설명되는 바와 같이, 본 발명에 개시된 MCP 억제제는 다양한 종양세포에서 강력한 고사 유도물질이므로 항종양제로서 활용된다. 중요한 것은 본 명세서에 개시된 데이타가 바람직한 화합물 A가 현재 승인된 두 화학치료요법제인 에토포시드(VP-16) 또는 시스플라틴 어느 것보다도 우수한 고사-유도능을 갖는다는 결론을 지지하고 있다는 것이다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하고자 하는 것이다. 이들 실시예는 첨부된 임의의 청구범위의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다. 본 발명에서 예시된 구체적인 화합물의 구조는 하기 표 1에 기재되어 있다.
1. 시험관내에서의 재료 및 방법
a. 재료: MCP 억제제는 세파론 인크.(미국 펜실베니아주 웨스트 췌스터)에 의해 생성되었다. 이들 화합물은 미국특허 제5,614,649호 및 제5,550,262호에 제시된 공정에 따라 합성되었다.
정제된 쥐의 단일클론 항체로서, (1) 인간 RB(G3-245) 및 p21에 대한 것은 파민젠(PharMingen)(캘리포니아주 샌디에고)로부터 구입하였고, (2) CPP32에 대한 것은 트랜스덕션 래보라토리스(Transduction Laboratories)(켄터키주 렉싱턴)로부터 구입하였으며, (3) 인간 PARP(C-2-10)에 대한 것은 유니테 드 산테 앳 인바이런먼트(Unite de Sante at Environment)(캐나다 퀘벡)로부터 구입하였다. p27에 대한 정제된 토끼의 다클론 항체는 업스테이트 바이오테크놀로지 인크.(Upstate Biotechnology Inc.)(뉴욕주 레이크 플래시드)로부터 구입하였다. 인간 RB(XZ55)에대한 쥐의 단일클론 배양 상층액은 엔. 다이슨(N. Dyson) 박사와 이. 할로우(E. Harlow) 박사에 의해 제공되었다(매사츄세츠주 종합병원 암센터, 매사츄세츠주 찰스타운). 에토포시드, 시스플라틴, 프로피디움 아이오다이드, 훽스트 33258 및 그 외 화학물질들은 시그마(미주리주 세인트루이스)로부터 얻었다. 아세틸-YVAD-클로로메틸 케톤(YVAD-CMK)은 바켐 바이오사이언스 인크.(Bachem Bioscience Inc.)(킹 오브 푸러시아, 펜시베니아주)로부터 구입하였다.
b. 세포 배양: 인간 저캣(Jurkat) T 세포 및 HL-60 세포는 10% 태아 송아지 혈청(시그마), 페니실린 100 단위/㎖, 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖ 및 2mM L-글루타민 (성장 배지)를 보충한 RPMI 1640(라이프 테크놀로지스, 인크.)에서 배양하였다. Bcl-2 종양단백질(oncoprotein) 또는 벡터(펜실베니아주 피츠버그 대학교의 디. 존슨 박사에 의해 제공)만을 과도하게 발현시키는 저캣 T 세포는 G418 0.4 ㎍/㎖을 첨가한 동일한 성장 배지에서 배양시켰다. 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, 매릴랜드주 로크빌)으로부터 얻은 유방암(MCF-7, MDA-MB-231), 전립선암(DU145, PC3) 및 골육종(U2-OS)의 인간 암 세포주도 RPMI 성장 배지에서 배양하였다. 인간 구강암(SCC-25; ATCC로부터 얻음) 및 뇌암(SNB-19; 웰치, 더블유.씨. 외, In Vitro Cell. Dev. Biol., 31:610-616, 1995) 세포주 및 정상(WI-38) 및 SV40-형질전환 인간 섬유아세포(WI-38 VA-13; ATCC로부터 얻음)는 10% 태아 송아지 혈청, 페니실린, 스트렙토마이신 및 L-글루타민을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였다.
c. MCP 억제제에 의한 세포의 처리: 세포를 특정 MCP 억제제, 표준 항암제(에토포시드 또는 시스플라틴), 또는 DMSO(운반체)로 처리하였다. 이 과정 동안 형태학상 변화 및 세포 분리(부착된 세포주에 대하여)가 관찰되었다. 각 시간별로 세포를 수확하여, 고사 및 기타 생화학적 사건을 측정하기 위하여 사용하였다. YVAD-CMK가 관여하는 이하 실시예 1에서, 화합물 A를 먼저 저캣 T 세포에 첨가하였다. 곧 이어서 세포를 다수의 조직 배양 플라스크로 나누었다. 그 다음 YVAD-CMK을 표시된 농도로 첨가하였다.
d. 유동 세포분석법, 핵 염색 및 DNA 절편 분석: 앞서 기술한 바(니코레티, 아이., 외. J. Immunol. Methods 139: 271-279, 1992)에 따라 유동 세포분석법을 이용한 DNA 함량 분석을 하였다. 핵의 형태학적 분석을 위하여 세포를 PBS로 세척하고, 70% 에탄올로 1시간 동안 고정시킨 후, 훽스트 33258(1mM)로 30분 동안 염색시켰다. 세포의 핵 형태학은 형광현미경(OLYMPUS BH2)으로 가시화되었다. DNA 절편은 앞서 기술한 바대로 분석하였다(그랜트, 에스., 외. Cancer Res. 52:6270-6278, 1992).
e. 전세포 추출물 및 웨스턴 블롯 분석: 전세포 추출물을 준비하기 위하여, 세포를 PBS로 세척하고, 세포 용해(lysis) 완충액(50mM 트리스, pH 8.0, 5mM EDTA, 150mM NaCl, 0.5% 노니뎃 P-40, 0.5mM PMSF 및 0.5mM 디티오트레이톨)에서 균질화시켰다. 4℃에서 30분간 흔든 다음, 용해물을 원심분리하고, 상층액을 전세포 추출물로서 수거하였다. 이어서 단백질 시료를 소듐 도데실 설페이트-6% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(레인당 20-6㎍의 단백질)으로 분석한 후, CPP32, PARP, p21, p27 또는 RB에 대한 특정 항체를 사용하여 강화 화학발광 웨스턴 블롯 분석법으로 분석하였다.
f. 세포 생활성 분석: 저캣 세포를 MCP 억제제 또는 운반체로 37℃에서 30분간 처리하였다. 그 다음, 이오노마이신(1μM) 및 포볼 에스터 PMA(10ng/㎖)를, 0.2% 에탄올과 함께 첨가하였다. 24시간 후, 세포 생활성을 XTT(시그마, X4251)의 환원에 의해 평가하였다. 각 웰에 XTT(1㎎/㎖) 50㎕ 및 PMS(시그마 9625, 5mM) 25㎕를 첨가하였다. 37℃에서 3시간 후, 각 웰의 OD를 450nm/690nm에서 플레이트 리더로 읽었다.
2. 실시예 1: 인간 백혈구 세포에서 개시된 MCP 억제제에 의한 고사 유도 및 카스파제의 활성화
실시예 1은 MCP가 생존 신호 경로(들)에 관여하는지 여부 및 MCP 활성의 억제가 고사를 유도하는지 여부를 결정하기 위하여 고안되었다. 인간 저캣 T 세포는 30μM의 화합물 A로 4시간 동안 처리되었다. 그러한 조건하에서, (a) 서브-G1DNA 함량과 고사 집단의 출현(도 1, 패널 b 대 a); (b) 핵의 축소와 절편화(도 3, b 대 a과 비교됨); 및 (c) 뉴클레오좀간의 DNA 절편화(도 1A, 패널 g)에 의해 보여지는 바와 같이 고사가 일어난다. 화합물 A에 의한 처리도 고사의 활성화에 필요한 카스파제-3의 프로세싱을 유도하였다. 그러한 처리는 또한 PARP의 p85로의 절단 및 RB의 p68로의 절단을 유도하였다(도 1A, d-f, 레인 2 대 1). 동일한 처리는 또한 RB의 C-말단 절단(p112) 및 저인산화(p115) 형태(도 1A, f, 레인 2 대 1)의 생성에 의해 증명되는 바와 같이, RB의 C-말단 절단 및 탈인산화 프로세스를 유도하였다. RB의 p112 및 p115 형태 모두는 p112-115/RB로서 조합되어 고사 표식자로 사용되었다. 주목되는 고사 현상의 모든 것이 인간 백혈병 HL-60 세포를 화합물 B로 처리할 때에도 관찰되었다. 예를 들면, 화합물 B에 대한 HL-60 세포의 노출은 뉴클레오좀간의 DNA 절편화를 유도하였다(도 1A, 패널 g).
인간 저캣 T 세포(이와모토, 케이. 에스., 외. Cancer Res. 56:3862-3865, 1996) 및 HL-60 세포(다노바, 엠., 외. Leukemia Res. 14, 417-422, 1990)는 모두 돌연변이 p53 유전자를 함유하기 때문에, 상기 데이터는 개시된 MCP 억제제에 의해 유도된 고사가 p53-독립성이라는 입장을 뒷받침한다.
저캣 T 세포 고사가 MCP의 키모트립신 유사 활성의 억제로 인한 것이라는 증거를 추가로 얻기 위하여, 세포를 농도가 다른 7개의 다른 화합물로 24시간 동안 처리한 후, XTT 환원에 의해 세포의 생활성을 평가하고, 세포 사멸 효능 및 MCP 억제 효능을 순위화하였다. 저캣 세포 사멸에 대한 효능의 순위는 MCP 억제에 대한 순위와 정확하게 일치하였다(아래 표 2).
저캣 인간 T 세포 백혈병 계통에 대한 화합물의 독성 및 그의 MCP 억제제로서의 효능
화합물 억제, MCP-키모트립신 유사 활성(IC50, nM) 독성((IC50, μM)
A 2 0.5
B 6 1.6
C 21 9.7
D 5 0.6
F 10 1.7
G 20 5.7
H 300 〉30
개시된 MCP 억제제에 의해 유도된 고사에서 카스파제 활성화가 관여한다는 추가적 증거 제공을 위해, 본 발명자들은 몇몇 카스파제 활성(돈베리, 엔.에이., 외. M.J. Nature, 365:768-774, 1992; 및 라제브닉, 와이.에이., 상기 문헌)을 억제하며 또한 몇몇 세포계(에나리, 엠., 외. Nature, 375:78-81, 1995; 및 안, 비., 및 도우, 큐.피. 상기 문헌)에서 고사를 방지하는 테트라펩타이드 억제제인 아세틸-YVAD-클로로메틸 케톤(YVAD-CMK)을 사용하였다. 화합물 A-처리 저캣 T 세포로의 YVAD-CMK의 첨가는, (a) 고사 피크의 생성(도 1, 패널 c 대 b); (b) 카스파제-3의 프로세싱; (c) PARP의 절단; 및 (d) RB의 탈인산화 및 절단(도 1A, d-f, 레인 3 대 2)를 완전히 차단시켰다. 이들 데이터는 카스파제가 이들 기작의 상위에 위치하여 작용한다는 입장을 뒷받침한다.
3. 실시예 2: MCP 억제제의 고사-유도 능력은 MCP 키모트립신-유사 활성을 향한 그들의 억제 활성에 비례한다.
개시된 MCP 억제제에 의한 MCP의 키모트립신-유사 활성의 억제가 보고되어 왔으나, 이들 MCP 억제제는 MCP 트립신-유사 활성 및 소포성 시스테인 프로테아제인 카텝신 B에 대하여 상대적으로 거의 억제를 나타내지 않았다(이크발, 엠, 외. J. Med. Chem. 38:2276-2277, 1995; 이크발, 엠, 외. Bioorg. Med. Chem. Lett. 6:287-290, 1996; 및 하딩, 씨.브이., 외. J. Immuno. 155:1767-1775, 1995). 나아가, 키모트립신-유사 활성의 억제 효능 순위는, 단리된 MCP 및 천연의 쥐의 B 세포를 이용함에 의하여 화합물 A 〉 화합물 B 〉 화합물 C로 보고되었다(이크발, 엠, 외. J. Med. Chem. 38:2276-2277, 1995; 이크발, 엠, 외. Bioorg. Med. Chem. Lett. 6:287-290, 1996; 및 하딩, 씨.브이., 외. J. Immuno. 155:1767-1775, 1995).
개시된 MCP 억제제에 의해 유도된 고사가 생존 잇점을 부여하는 프로테오좀의 효소 활성의 억제 때문이지 MCP 억제제에 의해 야기된 독성 때문만은 아니라는 점을 입증하기 위하여, 고사를 유도하는 화합물 A, 화합물 B 및 화합물 C의 능력을 조사하였다. 인간 저캣 T 세포를 15μM의 화합물 A로 8시간동안 처리하였을 때, 고사 집단에서 서브-G1DNA 함량이 23% 증가하였다(도 2, 패널 b 대 a). 비교하면, 화합물 B가 사용되었을 때, 서브-G1집단에서 8%의 증가가 검출되었다(도 2, 패널 c 대 a). 동일한 조건하에서 화합물 C(CMPD 8)로 처리하는 경우 이들 조건하에서의 고사를 유도하지 않았다(도 2, 패널 d).
병행 실험에서 PARP 및 RB 단백질의 변화를 유도하는 이들 세 개의 MCP 억제제의 능력 또한 조사되었다. 저캣 T 세포를 15μM의 화합물 A로 처리하였을 때, p85/PARP 및 p112-115/RB의 생성은 2시간 후에 관찰되었다(도 2A, e 및 f, 레인 2-5 대 1). 그러나, 이들 세포가 화합물 B에 같은 농도로 노출되었을 때, 8시간 전에 훨씬 적은 p85/PARP 및 p112-115/RB가 발견되었으나(도 2A, 레인 6-9 대 레인 2-5), 12시간 이상 처리한 후에는 상당히 증가하였다(도 2A, 레인 14, 16). 화합물 A 또는 B 중 어느 하나보다 덜 강력한 화합물 C(CMPD 8)는 24시간 후에 p85/PARP 및 p112-115/RB를 거의 유도하지 않을 뿐이었다(도 2A, 레인 17). 따라서, 이들 데이터에 기초한 이들 MCP 억제제에 대한 고사-유도 효능의 순위는, 서브-G1집단의 유도 및 PARP와 RB 단백질의 변화(도 2 및 2A)에 의해 판단되는 바와 같이, 화합물 A 〉 화합물 B 〉 화합물 C이었다. 이 순위는 단리된 프로테아좀(이크발, 엠, 외. J. Med. Chem. 38:2276-2277, 1995; 이크발, 엠, 외. Bioorg. Med. Chem. Lett. 6:287-290, 1996; 및 하딩, 씨.브이., 외. J. Immuno. 155:1767-1775, 1995) 및 천연의 쥐의 B 세포(하딩, 씨.브이., 외. J. Immuno. 155:1767-1775, 1995)에서의 키모트립신-유사 활성의 억제에 대한 세 화합물의 순위와 정확하게 상응한다.
여기에 제시된 결과는 개시된 MCP 억제제에 의한 고사의 유도가 MCP의 키모트립신-유사 활성의 억제 때문이라는 입장을 지지한다.
4. 실시예 3: 화합물 A는 고사-유도 효능을 가지며, Bcl-2-매개된 고사로부터의 보호를 극복할 수 있다.
화합물 A의 고사-유도 효능은 두개의 표준 화학요법 항암제인 에토포시드 및 시스플라틴과 비교되었다. 화합물 A 30μM로 3.5시간동안 처리한 후, 거의 100%의 저캣 세포(데이터는 제시하지 않음) 또는 대조군 벡터로 트랜스펙션시킨 저캣 세포(아래 Bcl-2 연구에 대하여; 도 3, 패널 b 대 a)가 고사성 핵 변화를 보였다. 비교하면, 에토포시드 50μM의 8시간 처리는 이들 세포의 단 ~47%만이 고사를 거치도록 유도하였다(도 3, 패널 c 대 a). 에토포시드 또는 시스플라틴이 아닌, 화합물 A 10μM의 처리는 인간 전립선암, 유방암, 설암 및 뇌암의 세포 및 SV40 DNA 바이러스로 형질전환된 인간 섬유아세포에서 고사를 유도하였다(도 5-7 참조).
Bcl-2 종양단백질의 과잉발현은 많은 세포계에서 고사를 억제하는 것으로 밝혀졌다(미우라, 엠., 외., J. Cell 75:653-660, 1993). 화합물 A-유도 고사의 억제를 위한 인간 저캣 T 세포에서의 Bcl-2 발현이 조사되었다. 화합물 A 30μM에 3.5시간 동안 노출 후, 벡터로 트랜스펙션시킨 세포들(도 3, 패널 b 대 a)과 유사하게 Bcl-2-과잉발현 저캣 세포의 ~100%(도 3, 패널 e 대 d)가 고사-특이적 핵 형태학을 보였다. 대조적으로, Bcl-2 단백질의 발현은, 본 발명자들(안 비., 외. Int. J. Mol. Med., 인쇄 중) 및 다른 이들(미야시타, 티., 및 리드, 제이.씨. Blood, 81:151-157, 1993)에 의해 앞서 측정된 바와 같이, 에토포시드에 의해 유도된 고사성 핵 변화를 차단하였다(도 3, 패널 f 대 c).
화합물 A가 Bcl-2에 의한 고사로부터의 보호를 극복하였음을 더 확인하기 위하여, 대조군 벡터 세포를 화합물 A 15μM에 8시간 동안 노출시켰다. 이 처리는 고사성 핵 형태학을 나타내는 세포들의 비율(각각30% 대 47%)에 의해 결정되는 바와 같이, 에토포시드 50μM로 8시간 동안 처리하는 것보다 덜 효과적이었다. Bcl-2의 발현은 저농도의 화합물 A에 의해 유도된 고사성 핵 변화를 억제하지 않았다(데이터는 제시되지 않음). 이와 일관되게, Bcl-2의 과잉 발현은 또한 화합물 A 15μM에 의해 유도된 PARP 절단 및 p112-115/RB의 생성을 차단하지 못하였다(도 4, a 및 b, 레인 8-10 대 3-5). 대조적으로, Bcl-2의 발현은 에토포시드 50μM에 의해 유도된 이들 PARP 및 RB 변화를 억제하였다(도 4, c 및 d, 레인 6-10 대 레인 1-5). 이들 데이터에 기초하여, 개시된 MCP 억제제는 Bcl-2-독립적인 경로를 통하여 고사성 사멸 프로그램을 개시한다.
5. 실시예 4: 화합물 A는 다수의 인간 종양 세포주에서 고사를 유도한다.
대부분의 인간 고형 종양은 현재 사용되는 화학요법제의 처리에 대하여 내성이 있다. Bcl-2 종양단백질의 과잉 발현은 적어도 인간 전립선암 및 유방암에 있어서 다수 약물 내성의 개발에 기여하는 것으로 제안되었다(해리슨 외, J. Pathol. 175:7-12, 1995; 데소이즈 외, Anticancer res. 14:2291-2294, 1994; 켈렌 외, Anticancer res. 14:433-436, 1994). 화합물 A는 인간 저캣 T세포에서 Bcl-2-매개된 고사의 억제를 극복할 수 있었기 때문에(도 3, 4), 화합물 A는 인간 전립선암(PC-3, DU145) 및 유방암(MDA-MB-231, MCF-7)의 암 세포주에서 고사를 유도하는 능력에 대하여 조사되었다. 이들 실험에서 화합물 A의 효능은 에토포시드의 효능과 비교되었다.
인간 전립선암 PC-3 세포를 화합물 A 10μM, 에토포시드 또는 동등한 비율의 운반체(DMSO)로 처리한 후, 부착된 세포 집단 및 분리된 세포 집단을 격리시켰다. 이어서, 부착된 세포 집단 및 분리된 세포 집단을 모두 고사성 핵 변화 감지를 위해 사용하였다. 화합물 A로 36시간 동안 처리한 후, PC-3 세포의 ~50%가 분리되었다. 모든 분리된 PC-3 세포는 전형적인 고사성 핵 축소 및 절편화를 나타내었다(도 5, 패널 a). 어느 특정한 이론에 얽매이고 싶지는 않으나, 그러한 세포 분리는 아마도 고사 유도에 의해 야기되는 것이고, 이는 남아있는 부착된 세포 또한 고사성 핵 형태학을 보이기 때문이다(도 5, 패널 b). 에토포시드나 DMSO 중 하나로 처리된 PC-3 세포에서는 분리가 거의 또는 전혀 관찰되지 않았으며, 이와 일관되게, 모든 남아있는 부착 세포들은 정상적인 둥근 핵을 포함하였다(도 5, 각각 패널 c 및 d).
PC-3과 유사하게, 인간 전립선암 DU145 세포의 약 절반은 화합물 A에 16시간 동안 노출된 후에 분리되었다. 거의 모든 분리된 세포 및 심지어 부착된 DU145 세포도 고사-특이적 핵 형택학을 나타내었다(도 5, 패널 e,f 대 h). 이들 세포에 대한 에토포시드의 처리는 단지 분리를 거의 유도하지 않았고, 남은 부착 세포들은 여전히 정상적인 핵을 포함하였다(도 5, 패널 g).
화합물 A에 24시간 동안 노출된 후 인간 유방암 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포의 적어도 절반에서 분리가 관찰되었다. 핵 염색 분석법은 모든 분리된 세포 및 대부분의 부착된 세포에서 고사성 형태학을 보여주었다(도 5, 패널 l, j, m 및 n). 동일한 조건하에서 이들 두 세포주를 에토포시드로 처리하는 경우 고사를 유도하지 않았다(도 5, 패널 k, o). MDA-MB-231 세포는 돌연변이 p53 유전자를 포함하고(케이시, 지., 외. Oncogene, 6:1791-1797, 1991), MCF-7 세포는 야생형 p53를 발현하기 때문에(바텍, 제이., 외. Oncogene, 5:893-899, 1990), 이들 데이터는 화합물 A에 의한 고사 유도가 p53-독립성이라는 입장을 뒷받침한다.
에토포시드 또는 시스플라틴이 아닌, 화합물 A의 처리는 구강 수암(oral auqamous carcinoma) 세포주 SCC-25(도 5, 패널 q-t), 신경교아세포종 세포주 SNB-19(패널 u-x) 및 골육종 세포주 U2OS(데이터는 제시되지 않음)를 포함하는 몇개의 기타 인간 종양 세포주에서 세포성 분리 및 고사를 유도하였다. 이와 함께, 이들 데이터는 화합물 A가 에토포시드 및 시스플라틴보다 더 강한 고사-유도 효능을 갖는다는 입장을 뒷받침하며, 이 MCP 억제제가 다양한 인간의 암 세포주에서 의약 내성을 극복할 수 있음을 입증한다.
6. 실시예 5: 화합물 A는 모세포인 정상적인 인간 섬유아세포에서가 아닌 SV40-형질전환된 세포에서 선택적으로 고사를 유도한다.
화합물 A가 형질전환된 세포 및 정상 세포간에 고사 유도에 있어서 어떤 선택성을 갖는지 여부가 조사되었다. 정상적인 인간 섬유아세포주(WI-38)와 그의 SV40-형질전환된 유도체(WI-38 VA13)가 이용되었다. 세포주들의 이러한 쌍은 화합물 A 10μM, 에토포시드 또는 DMSO로 22시간 이하 처리 후, 부착된 세포 집단과 분리된 세포 집단을 격리시켰다. 화합물 A 처리는 대다수의 SV40-형질전환 세포에서 분리를 유도하였고, 모든 분리된 형질전환 세포 및 대부분의 부착된 형질전환 세포는 고사성 핵 변화를 나타내었다(도 6, 패널 a,b 대 d). 대조적으로, 정상적인 WI-38 세포의 화합물 A에 대한 노출은 분리나 고사성 핵 형태학을 유도하지 않았으나, 이 처리는 정상적인 WI-38 세포의 부피를 증가시켰고(패널 e 대 g), 이는 어떤 특정한 이론에 얽매이고 싶지는 않으나 아마도 G1에서의 성장 정지 때문이었을 것이다(힌즈, 피.더블유., 외. Cell 70:993-1006, 1992). 에토포시드의 처리는 형질전환되었거나 정상적인 WI-38 세포의 어느 것에서도 고사를 유도하지 않았으나, 이 처리 또한 이들 두 세포주에서 세포의 부피를 증가시켰다(도 6, 패널 c 대 d 및 f 대 g).
병행 비교실험에서, 전체 세포 집단(분리된 세포 및 부착된 세포 모두의 혼합)을 화합물 A, 에토포시드 또는 DMSO로 처리 후 수거하였다. 그 다음, 이들 세포로부터의 전세포 추출물을 준비하여 PARP 절단의 측정에 사용하였다. 핵 염색 분석의 결과와 일관되게(도 6), 화합물 A-유도 PARP 절단은 정상세포가 아닌(도 7, 레인 3 대 1; 주: WI-38 세포로부터의 4배 이상의 단백질이 이 실험에 사용됨) 형질전환 세포에서만 관찰되었다(도 7, 레인 6 대 4). 이와 함께, 데이터는 화합물 A가 SV40-형질전환 인간 섬유아세포에서 고사성 사멸의 과정을 선택적으로 유도한다는 입장을 뒷받침한다.
7. 실시예 6: 화합물 A에 의한 세포의 처리는 사이클린-의존성 키나제 억제제인 p21 및 p27의 축적을 유도한다.
유비퀴틴-프로테아좀 경로는 사이클린-의존성 키나제 억제제 p21(블래고스클로니, 엠.브이., 외. Biochem. Biophys. Res. Commu. 227:564-569 (1996)) 및 p27(파가노, 엠., 외. Science 269:682-685, 1995)을 포함하는 여러 세포주기 조절단백질의 수준을 통제하는데 필수적인 기능을 하는 것으로 보고되었다. p21 및 p27의 수준에 대한 화합물 A의 효과는 인간 유방암 MDA-MB-231 세포에서 웨스턴 블롯에 의하여 조사되었다. 화합물 A 15μM에 6시간 동안 노출 후, p21의 수준은 45배 증가하였다. p27의 수준은 6시간 후에 약간 증가하였고 12시간 또는 24시간 후에는 3배 내지 4배 상승하였다. 추가적으로, 유비퀴틴화 p70을 나타낼 수도 있는 70kDa의 밴드가 또한 관찰되었다. 대조적으로, 에토포시드는 100μM 이하의 농도로 사용될 때, 17시간에서 p21(≤4배) 및 p27(≤2배)의 제한된 축적만을 일으켰다.
화합물 A의 처리 후 p21 및 p27의 축적은 또한 SV40 형질전환 및 정상적인 WI-38 섬유아세포에서도 관찰되었다. 정상적인 WI-38 세포 또는 형질전환 WI-38 세포 중 하나를 10μM 화합물 A로 2시간 동안 처리한 결과 p21 수준이 9배 내지 10배 증가하였다. 정상 세포에서의 p27 수준은 이 조건하에서 약간 증가했을 뿐이나 SV40 형질전환 세포에서의 p27 수준은 8배 상승하였다.
8. 시험관내 결과의 분석
상기 데이터는 화합물 A가 p53-돌연변이 인간 저캣 T 세포 및 HL-60 세포에서 고사를 빠르게 유도하였음을 지지하며, 이는 서브-G1함량에 의한 고사 집단의 출현, 핵의 축소 및 절편화, 뉴클레오좀간의 DNA 절편화, 카스파제-3의 프로세싱 및 활성화, PARP의 절단 및 RB의 탈인산화 및 절단(도 1)에 의하여 입증된 바와 같다. YVAD-CMK의 첨가는 상기 고사성 기작의 전부를 차단하였고(도 1A), 이는 MCP 억제제-유도된 p53-독립성 고사에 있어서 카스파제 활성화가 필요함을 확인해준다. 이들 데이터는, 고사성 사멸이 트리펩타이드 알데히드(LLL, LLnV) 또는 락타시스틴(이마조, 오미, 외. Biochem. Biophys. Res. Commu. 217:1070-1077, 1995; 시노하라, 케이., 외. Biochem. J. 317:385-388, 1996; 드렉슬러, 에이취.씨.에이. PNAS USA. 94:855-860, 1997; 및 로페스, 유.지. 외, J. Biol. Chem. 272:1893-1896, 1997)을 포함하는 다른 MCP 억제제에 의하여 유도되었다는 다른 사람들의 가장 최근 보고와 일치하며 이들 보고를 확장시켜준다. 화합물 A, B 및 C의 고사-유도 능력(도 2)은 MCP의 키모트립신-유사 활성에 대한 그들의 억제 효능에 비례한다(이크발, 엠, 외. J. Med. Chem. 38:2276-2277, 1995; 이크발, 엠, 외. Bioorg. Med. Chem. Lett. 6:287-290, 1996). 화합물 A는 두개의 표준 화학요법제인 에토포시드 및 시스플라틴보다 더 강한 고사-유도 효능을 갖는다. 이와 일관되게, 에토포시드 또는 시스플라틴이 아닌, 화합물 A는 Bcl-2를 과잉발현하는 저캣 세포 및 전립선암, 유방암, 설암 및 뇌암의 다수 인간 암 세포주에서 고사를 유도할 수 있었다(도 3-5). 화합물 A는 모세포인 정상적인 인간 섬유아세포가 아닌 SV40-형질전환된 세포에서 선택적으로 고사를 유도하였다.
또한, 화합물 A는 인간 유방 종양 세포주에서 사이클린-의존성 키나제 억제제인 p21 및 p27의 수준을 증가시켰다. p27의 수준은 형질전환되지 않은 모세포주에서가 아닌 SV40-형질전환된 섬유아세포에서 선택적으로 증가되었다.
a. 프로테아좀 키모트립신-유사 활성의 억제는 고사 유도와 연관이 있다.
상기 데이터는, 활성을 선호하는 분지쇄 아미노산에 대한 기능이 배제될 수는 없으나, 세포 생존을 위하여 트립신-유사 성분이 아닌 프로테아좀 키모트립신 성분의 필요성을 뒷받침한다. 이 데이터는 저캣 T 세포에서 화합물 A, B 및 C에 의한 고사를 유도하는 능력의 순위(도 2)가 프로테아좀 키모트립신 활성의 억제에 대한 효능의 순위와 정확하게 상응하였음을 보여준다(이크발, 엠, 외. J. Med. Chem. 38:2276-2277, 1995; 이크발, 엠, 외. Bioorg. Med. Chem. Lett. 6:287-290, 1996; 및 하딩, 씨.브이., 외. J. Immuno. 155:1767-1775, 1995). 또한, 이 데이터는 화합물 A(Ki=〈2nM; 이크발, 엠, 외. 상기 문헌)가 프로테아좀 키모트립신-유사 활성에 대하여 트리펩타이드 알데히드(Ki=〈20nM; 로크, 케이.엘., 외 Cell. 78:761-771, 1994)보다 더 강력한 억제제라는 입장을 지지한다. 이와 일관되게, 화합물 A는 트리펩타이드 알데히드보다 더 강한 고사-유도 능력을 갖는다. 예를 들면, 30μM 화합물 A에 의한 3-4시간 처리는 인간 저캣 세포 또는 HL-60 세포에서의 PARP의 완전한 절단을 유도하기에 충분하지 않았다(도 1A). 대조적으로, 50μM LLnV에 의한 HL-60 세포의 6시간 처리는 ~50%의 PARP 절단을 유도하였음이 보고되었다(드렉슬러, 에이취.씨.에이. PNAS USA. 94:855-860, 1997). 이들 결과는 프로테아좀 키모트립신-유사 활성이 세포의 생존 경로에 관련되며 이 활성의 억제가 고사를 유도한다는 입장을 지지한다.
b. 화합물 A는 인간 암세포의 약물 내성을 극복한다.
여기에 제시되어 있는 데이터에 기초하여 보면, 화합물 A는 강력한 고사 유도물질이고 인간 암세포의 약물 내성을 극복할 수 있는 것으로 보인다. 에토포시드가 아닌, 화합물 A는 Bcl-2를 과잉 발현하는 저캣 T 세포에서 고사를 유도할 수 있었다(도 3). 이는 또한 저농도의 화합물 A를 고농도의 에토포시드와 비교하여 사용하였을 때에도 사실이었다(도 4). 이들 데이터는 화합물 A가 신규의 Bcl-2-독립성 경로를 통하여 고사를 유도한다는 입장을 지지한다. 인간 암세포의 대부분은 표준 항암제인 에토포시드 또는 시스플라틴에 의한 처리에 내성이 있다(해리슨 외, J. Pathol. 175:7-12, 1995; 도 5). 그러나, 저농도의 화합물 A는 시험된 모든 인간의 전립선암, 유방암, 설암 및 뇌암의 세포주에서 고사 경로를 빠르게 활성화시켰다(도 5). 또한, Bcl-2의 독립성 외에, MCP 억제제-유도 고사는 또한 p53-독립성이고, 이는 가장 최근에 보고된 프로테아좀-매개 p53-의존성 고사와는 다르다(로페스, 유.지. 외, J. Biol. Chem. 272:1893-1896, 1997). 이들 특성은 개시된 MCP 억제제가 인간 암 치료, 특히 Bcl-2를 과잉발현시키고/시키거나 p53을 결여하는 경우를 치료하기 위한 신규의 항암제라는 입장을 지지한다.
c. 화합물 A는 정상적인 인간 섬유아세포에서가 아닌 SV40-형질전환된 세포에서 고사를 선택적으로 유도한다.
화합물 A의 효능은 정상적인 WI-38 및 SV40-형질전환 유도체(WI-38 VA-13) 세포주간에 비교되었다. 화합물 A 치료는 바람직하게는 SV40-형질전환 세포에서 분리 및 고사를 유도하는 것으로 밝혀졌다(도 6). 이와 일관되게, 화합물 A 치료는 정상적인 WI-38 세포에서가 아닌 형질전환된 WI-38 세포에서만 PARP 절단을 유도하였다(도 7). 이들 데이터는 화합물 A-매개된 사멸이 세포독성 효과가 아니라는 입장을 지지하며, 나아가 화합물 A가 종양-선택성 사멸 능력을 가질 수도 있음을 제안한다. 정상 세포 및 형질전환 세포에서의 화합물 A의 차별적 활성은, 증식 속도가 WI-38 및 WI-36 VA-13 세포 모두에서 유사하다는 점에서 증식 속도의 차이에 의한 것으로 설명될 수 없다.
d. 화합물 A에 의한 세포의 처리는 사이클린-의존성 키나제 억제제인 p21 및 p27의 축적을 유도한다.
p21 및 p27의 수준을 조절하는 화합물 A의 능력은 사이클린-의존성 키나제 억제제의 통제하에 프로테아좀의 보고된 기능과 일치한다(블래고스클로니, 엠.브이., 외. 상기 문헌; 파가노, 엠., 외. 상기 문헌). 화합물 A의 처리 후에 모세포주가 아닌 SV40-형질전환 WI-38 섬유아세포에서의 선택적인 p27의 축적은 형질전환 세포에서의 고사를 선택적으로 유도하였다. 이 관찰은 상기 p27의 축적의 결정적인 역치 농도가 고사를 일으킨다는 가설과 일치한다.
9. 실시예 7: 생체내 조사
a. 재료: 생체내 연구를 위해 사용된 MCP 억제제(화합물 C 및 E)는 각각 25% 솔루톨에서 제제화되었다.
b. 세포주: 쥐의 흑색종 세포주 B16-F0를 95% 공기/5% CO2대기하에, 글루코스 4.5g/l(셀그로/메디아테크, 와싱톤, 디.씨.)과 함께 10% 태아 송아지 혈청(하이클론 랩스, 유타주 로간), 2mM 글루타민(GibcoBRL, 뉴욕주 롱 아일랜드), 페니실린(100I.U./㎖)(GibcoBRL), 및 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖)(GibcoBRL)을 함유하는 둘베코의 변형 이글스 배지에, 37℃ 항습 인큐베이터에서 성장시켰다. 세포에는 마이코플라스마 및 설치류 바이러스가 없는 것으로 측정되었다(MAP 시험). 지수함수적으로 성장하는 세포를 따뜻한 트립신/EDTA(0.05%, 0.5mM)(GibcoBRL) 5mL을 사용하여 수확하였다. 트립신을 중화하기 위하여, 완전 배지로 총 부피가 10mL이 되게 하고, 세포의 수를 헤모사이토미터로 측정하였다. 이어서 세포를 단시간 원심분리하여 수거하고, 세포 펠릿을 포스페이트 완충 식염수(GibcoBRL)에 재현탁하여 최종 농도가 1x107생활세포/㎖이 되게 하였다.
c. 동물: 할란 스프라그 다우리(인디애나폴리스, 인디애나주)로부터 얻은 암컷 쥐 C57BL(20-25g)을 우리당 5마리씩 유지하였고, 상기로부터 구입한 상업용 식이 및 물을 제공하였다. 동물은 습도 및 온도가 통제된 조건 및 명암 사이클이 12시간 간격으로 고정된 곳에 수용하였다. 쥐들은 실험 조작 전 1주 동안 격리되었다.
d. 종양 세포 이식 및 성장: 상기 기술한 바와 같이 배양시켜 지수함수적으로 성장한 B16-F0 세포를 수확하여 쥐의 오른쪽 옆구리에 주사하였다(1x106세포/쥐). 0.01-0.3cm3크기의 종양을 지니는 50마리의 동물을 각 10마리씩 5군으로 나누었다. 화합물을 10mg/kg/일씩 복강내주사로 투여하였고, 운반체(25% 솔루톨)는 1㎖/kg/일씩 복강내주사로 투여하였다.
e. 종양 측정: 종양은 베니어 칼리퍼스를 이용하여 2-3일마다 측정되었다. 종양 부피는 하기 식으로 계산되었다.
V(cm)3= .5236 x 길이(cm) x 두께(cm) [(길이(cm) + 두께(cm))/2]
생체내 연구로부터의 결과는 도 8에 제시되어 있다.
결과는 화합물 D 및 E가 흑색종 종양 성장을 억제한다는 것을 보여준다.
10. 실시예 8: 무갑상선 누드 쥐에서 루이스 폐암 이종이식편(Lewis lung carcinoma xenografts)의 성장에 대한 화합물 I 및 화합물 J의 생체내 항-종양 효능
무갑상선 누드 암컷 쥐의 오른쪽 뒤 옆구리에 루이스 폐 종양 세포 1x106을 피하주사하였다. 종양의 부피가 150 내지 200mm3에 이르면 쥐들을 각 10마리씩의 군으로 무작위추출하여, 총 12일간 화합물 I(2mg/kg, 피하주사, QD, 주당 5일), 화합물 J(3mg/kg, 피하주사, 주당 5일) 또는 운반체(30% 솔루톨)만을 투여하기 시작하였다. 종양 측정(부피)은 베니어 칼리퍼스로 2 내지 3일마다 2차원적으로 측정되었다. 운반체-처리 대조군에 대한 약물-연관 항-종양 효능의 통계학적 분석은 만-휘트니 순위 합계 시험(Mann-Whitney Rank sum test)으로 수행하였다.
결과는 도 9에 나타나 있다.
결과는 화합물 I 및 J가 폐암 종양 성장을 억제함을 보여준다.
11. 실시예 9: 무갑상선 누드 쥐에서 AT-2 래트 전립선암 이종이식편의 성장에 대한 화합물 I의 생체내 항-종양 효능
무갑상선 누드 암컷 쥐의 오른쪽 뒤 옆구리에 AT-2 래트 전립선암 세포 1x106을 피하주사하였다. 쥐들을 각 10마리씩의 군으로 무작위추출하여, 총 15일간 화합물 I(2mg/kg, 피하주사, QD, 주당 5일) 또는 운반체(30% 솔루톨)만을 투여하기 시작하였다. 종양 측정(부피)은 베니어 칼리퍼스로 2 내지 3일마다 2차원적으로 측정되었다. 운반체-처리 대조군에 대한 약물-연관 항-종양 효능의 통계학적 분석은 만-휘트니 순위 합계 시험으로 수행하였다.
결과는 도 10에 나타나 있다.
12. 실시예 10: 인간 및 설치류 종양 세포주의 생체내 생활성에 대한 화합물 I 및 화합물 J의 효과
세포를 96-웰 플레이트에 다양한 밀도로 초기 접종한 다음, 24시간 후에 칼세인-AM 생활성 분석법으로 분석하여 각 세포 타입에 대한 최종 광학 밀도를 측정하였다. 이어서 세포를 다음과 같이 적절한 세포 배지 100μL에 그 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하였다.
세포주 광학 밀도 배양 배지
DU145 전립선암 2500 세포/웰 DMEM/5% FBS
PANC-1 췌장암 4000 세포/웰 MEM/5% FBS
SKMEL-5 흑색종 3500 세포/웰 DMEM/5% FBS
OVCAR-3 난소암 5000 세포/웰 RPMI 1640/5% FBS
MCF-7 유방암 5000 세포/웰 DMEM/5% FBS
AT-2 (래트) 전립선암 2500 세포/웰 RPMI 1640/5% FBS
루이스 폐(쥐) 폐암 3000 세포/웰 DMEM/5% FBS
화합물들을 연속적으로 희석하여 원하는 농도의 2배의 농도가 평가되도록 하였다. 100μL 배지에 플레이트된 세포에 희석액 100μL을 첨가하여, 최종 농도 0, 11.7, 46.9, 187.5, 375 및 750nM을 얻었다. 화합물을 세포의 접종 후 3 내지 4시간 후에 플레이트에 첨가한 다음, 플레이트를 37℃에서 원하는 시간 동안(일반적으로 1, 2 또는 3일 배양) 배양하였다.
칼세인-AM 생활성 분석은 원하는 시간에 다음과 같이 수행되었다. 배지는 매니폴드(manifold) 및 금속 플레이트를 사용하여 흡인시켜 대략 50μL/웰이 남도록 하였다. 이어서 웰을 200μL DPBS(Gibco)로 3회 세척하고, 매번 매니폴드로 50μL/웰이 남도록 흡인하였다. DPBS 중의 칼세인-AM(몰리큘라 프로브스) 8μM 용액을 준비하여 150μL을 각 웰에 첨가하였다. 이어서 플레이트를 37℃에서 30분간 배양하였다. 배양 후, 칼세인을 매니폴드로 흡인시키고 세포를 200μL DPBS로 전과 같이 세척하였다. 최종 흡인 후에, 사이토플루오르(Cytofluor) 2300 형광 플레이트 리더로 형광을 측정하였다. 음성 대조군은 세포 없이 배지만을 함유하였다. 모든 연구는 두개의 독립적 실험에 있어서 3배수로 수행되었다.
결과는 아래 표 3에 제시되어 있다.
세포 유형 시간(h) 화합물 IIC50(nM) 화합물 JIC50(nM)
PANC-1 2472 〉1000 282 〉1000 185
SKMEL-5 2472 520 85 427 82
OVCAR-3 2472 〉1000 69 〉1000 29
MCF-7 2472 〉1000 642 〉1000 289
루이스 폐 2472 435 578 411 505
AT-2 2472 〉1000〉1000 〉1000〉1000
DU-145 2472 942 293 385 167
이 특허 문서에 언급된 각 특허, 출원 및 인쇄된 간행물들은 여기에 그 전체로서 참고문헌으로서 혼입될 것이 의도된다.
당업자는 본 발명의 바람직한 실시태양에 대하여 수많은 변화 및 변형이 가해질 수 있다는 점 및 그러한 변화 및 변형이 본 발명의 취지로부터 벗어남이 없이 가해질 수 있다는 점을 이해할 것이다. 그러므로 어느 부속된 청구항도 본 발명의 진정한 취지 및 범위내에 속하는 바와 같은 모든 균등한 변이를 포괄하는 것으로 의도된다.

Claims (85)

  1. 형질전환된 세포를 하기 화학식의 화합물과 접촉시켜 상기 형질전환된 세포의 사멸을 야기시키는 방법.
    상기 식에서,
    R1은 -C≡N, -C(=O)OR9, 프탈이미도, -NH-SO2R9, 및 -NH-J로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R2는 H, 히드록실, C1-C10알킬 및 C3-C7시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R3는 -(CH2)m-NH-C(=N-R5)-NH2, -R6-NO2, -R6-J 및 -R6-C≡N으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R4는 -CH(CH2-R7)-Q이고,
    Q는 -CH-R8, -C(=O)CH3, -C(=O)CH2Cl, -C(=O)CH2Br, -C(=O)CH2F, -C(=O)CHF2, -C(=O)CF3, -C(=O)C(=O)R7, -C(=O)C(=O)NH-R7, -C(=O)CO2-R7, -C(=O)CO2H, -B(OH)2,
    (여기서, p 및 q는 독립적으로 2 또는 3이고 W는 시클로알킬임)로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R5는 -NO2, -C≡N, 및 -J로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R6는 -(CH2)m-NH-C(=NH)-NH-이며,
    R7은 페닐, 및 하나 이상의 할로겐 원자, 아릴 또는 헤테로아릴기에 의해 임의로 치환된 C1-C8알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R8은 =O, =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3, =N-O-CH2-C6H5, =NNH-C(=S)-NH2, 및 =N-NH-J로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R9은 수소, 및 하나 이상의 할로겐 원자, 아릴 또는 헤테로아릴기에 의해 임의로 치환된 C1-C6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    J는 보호기이며,
    n은 3 내지 10의 정수이고,
    m은 2 내지 5의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, R1은 -C≡N, -C(=O)OCH3, 프탈이미도 또는 -NH-SO2CF3인 방법.
  3. 제1항에 있어서, R2는 H 또는 시클로펜틸인 방법.
  4. 제1항에 있어서, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-R5)-NH2인 방법.
  5. 제1항에 있어서, Q는 -CH-R8, -B(OH)2, -C(=O)C(=O)NH-R7, 또는 하기식
    (여기서, W는 피난임)을 갖는 방법.
  6. 제1항에 있어서, R5는 -NO2, -C≡N, -PMC, -MTR, -MTS 또는 Tos인 방법.
  7. 제1항에 있어서, R7은 -CH(CH3)2, -(CH2)2-CH3, -CH2-CH3, 또는 -C6H5인 방법.
  8. 제1항에 있어서, R8은 =O, =N-OH, =N-O-CH2-C6H5, =NNH-C(=O)-NH2또는 =NNH-C(=S)-NH2인 방법.
  9. 제1항에 있어서, R1은 -C(=O)OCH3, 프탈이미도 또는 -NH-SO2CF3, R2는 시클로펜틸, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2, R7은 -CH(CH3)2및 R8는 =O인 방법.
  10. 제1항에 있어서, R1은 -C≡N; R2는 시클로펜틸; R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2또는 -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2; R7은 -CH(CH3)2및 R8은 =O인 방법.
  11. 제1항에 있어서, R1은 -C≡N, R2는 시클로펜틸, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2또는 -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2, R7은 -CH(CH3)2, Q는 -CH-R8, R8은 =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3또는 =N-O-CH2-C6H5인 방법.
  12. 제1항에 있이서, R1, R2, R3및 R4는 표1에 있는 화합물에 대해 표시된 치환체의 군으로부터 선택되는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 표1에 표시된 화합물 A-J로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물을 포유동물에 투여하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 형질전환된 세포가 유방암 세포, 전립선암 세포, 설암(tongue cancer) 세포, 뇌종양 세포, 폐암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포 또는 피부암 세포인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 형질전환된 세포가 Bcl2 단백질을 과도 생산 및(또는) p53 단백질이 부족한 방법.
  18. 하기 화학식의 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 형질전환된 세포의 존재에 의해 특징지워지는 질환을 갖는 환자의 치료방법.
    상기 식에서,
    R1은 -C≡N, -C(=O)OR9, 프탈이미도, -NH-SO2R9, 및 -NH-J로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R2는 H, 히드록실, C1-C10알킬 및 C3-C7시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R3는 -(CH2)m-NH-C(=N-R5)-NH2, -R6-NO2, -R6-J 및 -R6-C≡N으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R4는 -CH(CH2-R7)-Q이고,
    Q는 -CH-R8, -C(=O)CH3, -C(=O)CH2Cl, -C(=O)CH2Br, -C(=O)CH2F, -C(=O)CHF2, -C(=O)CF3, -C(=O)C(=O)R7, -C(=O)C(=O)NH-R7, -C(=O)CO2-R7, -C(=O)CO2H, -B(OH)2,
    (여기서, p 및 q는 독립적으로 2 또는 3이고 W는 시클로알킬임)로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R5는 -NO2, -C≡N, 및 -J로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R6는 -(CH2)m-NH-C(=NH)-NH-이며,
    R7은 페닐, 및 하나 이상의 할로겐 원자, 아릴 또는 헤테로아릴기에 의해 임의로 치환된 C1-C8알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R8은 =O, =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3, =N-O-CH2-C6H5, =NNH-C(=S)-NH2, 및 =N-NH-J로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R9은 수소, 및 하나 이상의 할로겐 원자, 아릴 또는 헤테로아릴기에 의해 임의로 치환된 C1-C6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    J는 보호기이며,
    n은 3 내지 10의 정수이고,
    m은 2 내지 5의 정수이다.
  19. 제18항에 있어서, R1은 -C≡N, -C(=O)OCH3, 프탈이미도 또는 -NH-SO2CF3인 방법.
  20. 제18항에 있어서, R2는 H 또는 시클로펜틸인 방법.
  21. 제18항에 있어서, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-R5)-NH2인 방법.
  22. 제18항에 있어서, Q는 -CH-R8, -B(OH)2, -C(=O)C(=O)NH-R7또는 하기 식
    (여기서, W는 피난임)을 갖는 방법.
  23. 제18항에 있어서, R5는 -NO2, -C≡N, -PMC, -MTR, -MTS 또는 TOS인 방법.
  24. 제18항에 있어서, R7는 -CH(CH3)2, -(CH2)2-CH3, -CH2-CH3또는 -C6H5인 방법.
  25. 제18항에 있어서, R8은 =O, =N-OH, =N-O-CH2-C6H5, =NNH-C(=O)-NH2또는 =NNH-C(=S)-NH2인 방법.
  26. 제18항에 있어서, R1은 -C(=O)OCH3, 프탈이미도 또는 -NH-SO2CF3, R2는 시클로펜틸, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2, R7은 -CH(CH3)2및 R8는 =O인 방법.
  27. 제18항에 있어서, R1은 -C≡N, R2는 시클로펜틸, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2또는 -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2, R7은 -CH(CH3)2및 R8은 =O인 방법.
  28. 제18항에 있어서, R1은 -C≡N, R2는 시클로펜틸, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2또는 -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2, R7은 -CH(CH3)2, Q는 -CH-R8및 R8은 =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3또는 =N-O-CH2-C6H5인 방법.
  29. 제18항에 있어서, R1, R2, R3및 R4는 표1에 있는 화합물에 대해 표시된 치환체의 군으로부터 선택되는 방법.
  30. 제18항에 있어서, 상기 화합물은 표1에 표시된 화합물 A-J로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  31. 제18항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 인간인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 형질전환된 세포가 유방암 세포, 전립선암 세포, 설암(tongue cancer) 세포, 뇌종양 세포, 폐암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포 또는 피부암 세포인 방법.
  33. 제18항에 있어서, 상기 형질전환된 세포가 Bcl2 단백질을 과도 생산 및(또는) p53 단백질이 부족한 방법.
  34. 세포를 하기 식의 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포내에 세포자멸사 (apoptosis)를 유도하는 방법.
    상기 식에서,
    R1은 -C≡N, -C(=O)OR9, 프탈이미도, -NH-SO2R9, 및 -NH-J로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R2는 H, 히드록실, C1-C10알킬 및 C3-C7시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R3는 -(CH2)m-NH-C(=N-R5)-NH2, -R6-NO2, -R6-J 및 -R6-C≡N으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R4는 -CH(CH2-R7)-Q이고,
    Q는 -CH-R8, -C(=O)CH3, -C(=O)CH2Cl, -C(=O)CH2Br, -C(=O)CH2F, -C(=O)CHF2, -C(=O)CF3, -C(=O)C(=O)R7, -C(=O)C(=O)NH-R7, -C(=O)CO2-R7, -C(=O)CO2H, -B(OH)2,
    (여기서, p 및 q는 독립적으로 2 또는 3이고 W는 시클로알킬임)로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R5는 -NO2, -C≡N, 및 -J로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R6는 -(CH2)m-NH-C(=NH)-NH-이며,
    R7은 페닐, 및 하나 이상의 할로겐 원자, 아릴 또는 헤테로아릴기에 의해 임의로 치환된 C1-C8알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R8은 =O, =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3, =N-O-CH2-C6H5, =NNH-C(=S)-NH2, 및 =N-NH-J로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R9은 수소, 및 하나 이상의 할로겐 원자, 아릴 또는 헤테로아릴기에 의해 임의로 치환된 C1-C6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    J는 보호기이며,
    n은 3 내지 10의 정수이고,
    m은 2 내지 5의 정수이다.
  35. 제34항에 있어서, R1은 -C≡N, -C(=O)OCH3, 프탈이미도 또는 -NH-SO2CF3인 방법.
  36. 제34항에 있어서, R2는 H 또는 시클로펜틸인 방법.
  37. 제34항에 있어서, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-R5)-NH2인 방법.
  38. 제34항에 있어서, Q는 -CH-R8, -B(OH)2, -C(=O)C(=O)NH-R7또는 하기식
    (여기서, W는 피난임)을 갖는 방법.
  39. 제34항에 있어서, R5는 -NO2, -C=N, -PMC, -MTR, -MTS 또는 TOS인 방법.
  40. 제34항에 있어서, R7은 -CH(CH3)2, -(CH2)2-CH3, -CH2-CH3또는 -C6H5인 방법.
  41. 제34항에 있어서, R8은 =O, =N-OH, =N-O-CH2-C6H5, =NNH-C(=O)-NH2또는 =NNH-C(=S)-NH2인 방법.
  42. 제34항에 있어서, R1은 -C(=O)OCH3, 프탈이미도 또는 -NH-SO2CF3, R2는 시클로펜틸, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2, R7은 -CH(CH3)2및 R8은 =O인 방법.
  43. 제34항에 있어서, R1은 -C≡N, R2는 시클로펜틸, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2또는 -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2, R7은 -CH(CH3)2및 R8은 =O인 방법.
  44. 제34항에 있어서, R1은 -C≡N, R2는 시클로펜틸, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2또는 -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2, R7은 -CH(CH3)2, Q는 -CH-R8및 R8은 =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3또는 N-O-CH2-C6H5인 방법.
  45. 제34항에 있어서, R1, R2, R3및 R4는 표1에 있는 화합물에 대해 표시된 치환체의 군으로부터 선택되는 방법.
  46. 제34항에 있어서, 상기 화합물은 표1에 표시된 화합물 A-J로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  47. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물을 포유동물에 투여하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 형질전환된 세포가 유방암 세포, 전립선암 세포, 설암(tongue cancer) 세포, 뇌종양 세포, 폐암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포 또는 피부암 세포인 방법.
  50. 제34항에 있어서, 상기 형질전환된 세포가 Bcl2 단백질을 과도 생산 및(또는) p53 단백질이 부족한 방법.
  51. 세포를 하기 식의 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는, 형질전환된 세포의 증식을 억제하는 방법.
    상기 식에서,
    R1은 -C≡N, -C(=O)OR9, 프탈이미도, -NH-SO2R9, 및 -NH-J로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R2는 H, 히드록실, C1-C10알킬 및 C3-C7시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R3는 -(CH2)m-NH-C(=N-R5)-NH2, -R6-NO2, -R6-J 및 -R6-C≡N으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R4는 -CH(CH2-R7)-Q이고,
    Q는 -CH-R8, -C(=O)CH3, -C(=O)CH2Cl, -C(=O)CH2Br, -C(=O)CH2F, -C(=O)CHF2, -C(=O)CF3, -C(=O)C(=O)R7, -C(=O)C(=O)NH-R7, -C(=O)CO2-R7, -C(=O)CO2H, -B(OH)2,
    (여기서, p 및 q는 독립적으로 2 또는 3이고 W는 시클로알킬임)로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R5는 -NO2, -C≡N, 및 -J로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R6는 -(CH2)m-NH-C(=NH)-NH-이며,
    R7은 페닐, 및 하나 이상의 할로겐 원자, 아릴 또는 헤테로아릴기에 의해 임의로 치환된 C1-C8알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R8은 =O, =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3, =N-O-CH2-C6H5, =NNH-C(=S)-NH2, 및 =N-NH-J로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R9은 수소, 및 하나 이상의 할로겐 원자, 아릴 또는 헤테로아릴기에 의해 임의로 치환된 C1-C6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    J는 보호기이며,
    n은 3 내지 10의 정수이고,
    m은 2 내지 5의 정수이다.
  52. 제51항에 있어서, R1은 -C≡N, -C(=O)OCH3, 프탈이미도 또는 -NH-SO2CF3인 방법.
  53. 제51항에 있어서, R2는 H 또는 시클로펜틸인 방법.
  54. 제51항에 있어서, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-R5)-NH2인 방법.
  55. 제51항에 있어서, Q는 -CH-R8, -B(OH)2, -C(=O)C(=O)NH-R7또는 하기식
    (여기서, W는 피난임)을 갖는 방법.
  56. 제51항에 있어서, R5는 -NO2, -C=N, -PMC, -MTR, -MTS 또는 TOS인 방법.
  57. 제51항에 있어서, R7은 -CH(CH3)2, -(CH2)2-CH3, -CH2-CH3또는 -C6H5인 방법.
  58. 제51항에 있어서, R8은 =O, =N-OH, =N-O-CH2-C6H5, =NNH-C(=O)-NH2또는 =NNH-C(=S)-NH2인 방법.
  59. 제51항에 있어서, R1은 -C(=O)OCH3, 프탈이미도 또는 -NH-SO2CF3, R2는 시클로펜틸, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2, R7은 -CH(CH3)2및 R8은 =O인 방법.
  60. 제51항에 있어서, R1은 -C≡N, R2는 시클로펜틸, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2또는 -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2, R7은 -CH(CH3)2및 R8은 =O인 방법.
  61. 제51항에 있어서, R1은 -C≡N, R2는 시클로펜틸, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2또는 -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2, R7은 -CH(CH3)2, Q는 -CH-R8및 R8은 =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3또는 N-O-CH2-C6H5인 방법.
  62. 제51항에 있어서, R1, R2, R3및 R4는 표1에 있는 화합물에 대해 표시된 치환체의 군으로부터 선택되는 방법.
  63. 제51항에 있어서, 상기 화합물은 표1에 표시된 화합물 A-J로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  64. 제51항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물을 포유동물에 투여하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 형질전환된 세포가 유방암 세포, 전립선암 세포, 설암(tongue cancer) 세포, 뇌종양 세포, 폐암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포 또는 피부암 세포인 방법.
  67. 제51항에 있어서, 상기 형질전환된 세포가 Bcl2 단백질을 과도 생산 및(또는) p53 단백질이 부족한 방법.
  68. 종양을 하기 식의 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는, 종양의 성장을 억제하는 방법.
    상기 식에서,
    R1은 -C≡N, -C(=O)OR9, 프탈이미도, -NH-SO2R9, 및 -NH-J로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R2는 H, 히드록실, C1-C10알킬 및 C3-C7시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R3는 -(CH2)m-NH-C(=N-R5)-NH2, -R6-NO2, -R6-J 및 -R6-C≡N으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R4는 -CH(CH2-R7)-Q이고,
    Q는 -CH-R8, -C(=O)CH3, -C(=O)CH2Cl, -C(=O)CH2Br, -C(=O)CH2F, -C(=O)CHF2, -C(=O)CF3, -C(=O)C(=O)R7, -C(=O)C(=O)NH-R7, -C(=O)CO2-R7, -C(=O)CO2H, -B(OH)2,
    (여기서, p 및 q는 독립적으로 2 또는 3이고 W는 시클로알킬임)로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R5는 -NO2, -C≡N, 및 -J로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R6는 -(CH2)m-NH-C(=NH)-NH-이며,
    R7은 페닐, 및 하나 이상의 할로겐 원자, 아릴 또는 헤테로아릴기에 의해 임의로 치환된 C1-C8알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R8은 =O, =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3, =N-O-CH2-C6H5, =NNH-C(=S)-NH2, 및 =N-NH-J로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    R9은 수소, 및 하나 이상의 할로겐 원자, 아릴 또는 헤테로아릴기에 의해 임의로 치환된 C1-C6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    J는 보호기이며,
    n은 3 내지 10의 정수이고,
    m은 2 내지 5의 정수이다.
  69. 제68항에 있어서, R1은 -C≡N, -C(=O)OCH3, 프탈이미도 또는 -NH-SO2CF3인 방법.
  70. 제68항에 있어서, R2는 H 또는 시클로펜틸인 방법.
  71. 제68항에 있어서, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-R5)-NH2인 방법.
  72. 제68항에 있어서, Q는 -CH-R8, -B(OH)2, -C(=O)C(=O)NH-R7또는 하기식
    (여기서, W는 피난임)을 갖는 방법.
  73. 제68항에 있어서, R5는 -NO2, -C=N, -PMC, -MTR, -MTS 또는 TOS인 방법.
  74. 제68항에 있어서, R7은 -CH(CH3)2, -(CH2)2-CH3, -CH2-CH3또는 -C6H5인 방법.
  75. 제68항에 있어서, R8은 =O, =N-OH, =N-O-CH2-C6H5, =NNH-C(=O)-NH2또는 =NNH-C(=S)-NH2인 방법.
  76. 제68항에 있어서, R1은 -C(=O)OCH3, 프탈이미도 또는 -NH-SO2CF3, R2는 시클로펜틸, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2, R7은 -CH(CH3)2및 R8은 =O인 방법.
  77. 제68항에 있어서, R1은 -C≡N, R2는 시클로펜틸, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2또는 -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2, R7은 -CH(CH3)2및 R8은 =O인 방법.
  78. 제68항에 있어서, R1은 -C≡N, R2는 시클로펜틸, R3는 -(CH2)3-NH-C(=N-NO2)-NH2또는 -(CH2)3-NH-C(=N-J)-NH2, R7은 -CH(CH3)2, Q는 -CH-R8및 R8은 =N-NHC(=O)-NH2, =N-OH, =N-OCH3또는 N-O-CH2-C6H5인 방법.
  79. 제68항에 있어서, R1, R2, R3및 R4는 표1에 있는 화합물에 대해 표시된 치환체의 군으로부터 선택되는 방법.
  80. 제68항에 있어서, 상기 화합물은 표1에 표시된 화합물 A-J로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  81. 제68항에 있어서, 상기 종양이 고체 종양인 방법.
  82. 제68항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물을 포유동물에 투여하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 형질전환된 세포가 유방암 세포, 전립선암 세포, 설암(tongue cancer) 세포, 뇌종양 세포, 폐암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포 또는 피부암 세포인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 형질전환된 세포가 Bcl2 단백질을 과도 생산 및(또는) p53 단백질이 부족한 방법.
KR1020007006526A 1997-12-16 1998-12-15 항종양제용 다촉매 프로테아제 억제제 KR20010033150A (ko)

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