CN1282242A

CN1282242A - 多相催化蛋白酶抑制剂用作抗肿瘤剂

Info

Publication number: CN1282242A
Application number: CN98812269A
Authority: CN
Inventors: 罗伯特·西曼; 吉泰施·P·亚尼; 罗纳德·H·戈德法布; 窦庆平
Original assignee: Cephalon LLC; University of Pittsburgh
Current assignee: Cephalon LLC; University of Pittsburgh
Priority date: 1997-12-16
Filing date: 1998-12-15
Publication date: 2001-01-31
Also published as: KR20010033150A; EP1037626A1; JP2002508321A; AU1915499A; WO1999030707A1; AU735685B2; US20010012854A1; CA2314259A1

Abstract

本文涉及多相催化蛋白酶(MCP)特异性抑制剂用作肿瘤细胞程序性细胞死亡(即,编程性细胞死亡)的诱导剂,更具体地说用作抗肿瘤剂的应用方法。本发明提供了利用MCP抑制剂诱导转化细胞的编程性细胞死亡,抑制转化细胞增殖,以及抑制肿瘤生长的方法。

Description

多相催化蛋白酶抑制剂用作抗肿瘤剂

相关申请的相互参考

本申请要求1997年12月16日申请、序号为60／069，804的美国临时申请，和1998年12月15日申请、名称为“多相蛋白酶抑制剂用作抗肿瘤剂”的美国专利申请的优先权。上述专利申请的内容通过参考其全文引入本文。

发明领域

本发明涉及美国专利5，614，649和5，550，262所公开的多相催化蛋白酶(MCP)特异性抑制剂，用作肿瘤细胞程序性细胞死亡(即，编程性细胞死亡)的诱导剂，更具体地说用作抗肿瘤剂。

发明背景Ⅰ．癌病症中的编程性细胞死亡

编程性细胞死亡是，例如，程序性细胞死亡的主动过程，它在从蠕虫到人的进化过程中一直是保守的(Jacobson，M．J．，等，细胞，88，347-354，1997)。编程性细胞死亡发生在两个生理阶段，即定型和执行。编程性细胞死亡的执行由表现罕见底物特异性，即在天冬氨酸(“Asp”)残基之后酶切的caspase家族特异性蛋白酶的激活引发(Martin，S．J．和Green，D．R，细胞，82：349-352，1995)。到目前为止，至少鉴定和克隆了十个Caspase的同源体(Alnemri，E．S．，等，细胞87，171，1996)。caspase的激活导致编程性细胞死亡，很可能经重要细胞蛋白质的蛋白酶解切割导致。曾报道，很多蛋白质，包括聚(ADP)-核糖聚合酶(“PARP”，Lazebnik，Y．A．，等，自然，371：346-347，1994)、肌动蛋白(Kayalar，C．等，PNAS USA，93：2234-2238，1996)、固醇调控结合蛋白(Wang，X．，等，EMBO J．，15：1012-1020，1996)和DNA-依赖性蛋白激酶(Song，Q．，等，EMBO J．，15：3238-3246，1996)，在编程性细胞死亡过程中，在Asp残基之后被酶切，表明caspase是切割酶。曾报道(An，B．，和Dou，Q．P．，癌症研究56：438-442，1996)，当用抗癌剂处理HL-60或U937细胞时，成视网膜细胞瘤(RB)蛋白，作为一种重要的细胞周期调节物和肿瘤抑制物(Weinberg，R．A．，细胞，81：323-330，1995)，被蛋白酶解切割成被称为“p68”和“p48”的两种主要片段。据报道，不同的caspase抑制剂例如YVAD-CMK(An，B．，和Dou，Q．P．，癌症研究，同上)、Bcl-2肿瘤蛋白质或者牛痘病毒CrmA蛋白质(Dou，Q．P．等，细胞生化杂志，64；586-594，1997)可以抑制RB内切和编程性细胞死亡。之后，据其它课题组报道，在编程性细胞死亡过程中，RB还被caspase 3-样蛋白酶从其C-末端酶切(Janicke，R．U．，等，EMBO J．15，6969-6978，1996；Chen，W．，等，肿瘤基因14，1243-1248，1997；Tan，X．，等，生物化学杂志，272：9613-9616，1997)。还曾报道，内核小体的DNA断裂之前，RB首先脱磷酸化(Dou，Q．P．，等，PNAS USA，92：9019-9023，1995；Wang，H．，等，肿瘤基因，13：373-379，1996；和Morana，等，生物化学杂志，271：18263-18271，1996)。

编程性细胞死亡程序的激活是目前治疗人类癌症的的策略。已经证明X-照射和化疗药物通过诱导编程性细胞死亡来杀死一些肿瘤细胞(Fisher，D．E．，细胞78，539-542，1994)。不幸的是，目前大多数人类癌症已经对这种治疗产生抗性(Harrison，D．J．，病理学杂志(J．Patho．)175，7-12，1995)。虽然在人类癌症中这种多药物抗性形成的分子机制还不清楚，但曾提出，该过程涉及Bcl-2的过度表达(Reed，J．C．，细胞生物学杂志124，1-6，1994)，肿瘤抑制基因“p53”的失活(Milner，天然药物杂志，1，789-880，1995)，或者通过转录调节子NF-κB作用的生存程序的激活(Beg，A．A．和Baltimore，D．，科学274：782-784，1996；Wang等，科学274：784-787，1996)。Ⅱ．多相催化蛋白酶(MCP)

真核细胞经常降解，而且细胞内的蛋白质也经常更换。这使细胞可选择性地和快速地去除具有异常构象的蛋白质和肽，通过调节调控肽的量来控制代谢途径，以及在必要时，如在饥饿时，为供能而提供氨基酸(参见Goldberg，A．L．& St．John，A．C．Annu．Rev．Biochem．(年度生化回顾)45：747-803，1976)。哺乳动物的细胞机制使蛋白质降解有多条途径。这些途径中的一些需要三磷酸腺苷(ATP)形式能量的输入(参见Goldberg，A．L．&St．John，期卷同上文)。

多相催化蛋白酶(MCP，一般也被称为“多相催化蛋白酶”、“蛋白酶体”(proteasome)、“多相催化蛋白酶复合体”、“多相催化内肽酶复合体”、“20S蛋白酶体”和“ingensin”)是大分子量(700kD)的真核非溶酶体蛋白酶复合体，它至少在将蛋白质降解为肽和氨基酸的两条细胞途径中起作用(Orlowski，M．Biochemistry(生物化学)29(45)10289-10297，1990)。该复合体具有至少五种不同的水解活性类型：(1)胰蛋白酶样活性类型，其中的肽键在碱性氨基酸的羧基端断裂；(2)胰凝乳蛋白酶样活性类型，其中的肽键在疏水氨基酸的羧基端断裂；(3)其中的肽键在谷氨酸的羧基端断裂的活性类型；(4)支链氨基酸优选活性；以及(5)小中性氨基酸优选活性(Rivertt，A．J．J．Biol．Chem．(生物化学杂志)264：21 12215-12219，1989；和Orlowski，期卷同上文)。

涉及MCP的蛋白质水解的一条途径也涉及多肽″遍在蛋白质”(Hershko，A．& Ciechanover，A．Annu．Rev．Bioehem．(年度生化回顾)51：335-364，1982)。需要MCP、ATP和遍在蛋白质的该途径在生长的成纤维细胞和成熟网状细胞中负责高度异常的蛋白质、某些短寿命的正常蛋白质和蛋白质本体的降解(Driscoll，J．和Goldberg，A．L．PNASU．S．A．(美国自然科学进展)86：787-791，1989)。被该途径降解的蛋白质以依赖ATP的方式通过其赖氨酸的氨基与遍在蛋白质共价结合。然后，与遍在蛋白质结合的蛋白质通过ATP依赖的蛋白酶复合体，26S蛋白酶体，降解成小肽，所述26S蛋白酶体含有作为其蛋白水解核心的MCP(Goldberg，A．L．&Rock，K．L．自然357：375-379，1992)。

有人还描述了需要MCP和ATP而不需要遍在蛋白质的第二种途径(Driscoll，J．和Goldberg，A．L．，期卷同上文)。在该过程中，MCP以依赖ATP的方式降解蛋白质(Goldberg，A．L．&Rock，K．L．，期卷同上文)。该过程已在骨骼肌中观察到(Driscoll，J．& Goldberg，A．L．，期卷同上文)。然而，还有人建议，在肌肉中MCP与另一种蛋白酶multipain协同作用，因此导致肌肉蛋白质的加速降解(参见Goldberg &Rock，期卷同上文)。

已有报道说MCP通过蛋白水解机制起作用，该机制的活性位点亲核物质是N-末端的苏氨酸残基的羟基。因此，MCP是已知的苏氨酸蛋白酶的第一个例子(Seemuller，et al．，Science(科学)268，579-582，(1995)；Goldberg，A．L．，Science(科学)268，522-523，(1985))。

近期研究表明MCP系统参与编程性细胞死亡的调节，虽然对该推测的作用还存在争议。已经发现一些MCP抑制剂，例如三肽醛(例如，LLnL或LLnV)或者lactacystin(一种微生物代谢物)，阻断胸腺细胞(Grimm，L．M．，等，EMBO J．15，3835-3844，1996)和神经元(Sadoul，R．，等，EMBO J．15，3845-3852，1996)程序性细胞死亡的进程。相反，已经发现同样或类似的MCP抑制剂诱导人白血病(Imajoh-Ohmi，等，Biochem．Biophy．Res．Commu．(生物化学和生物物理学研究通讯)217，1070-1077，1995；Shinohara，K．，等，Biochem．J．(生物化学杂志)317，385-388，1996；以及Drexler，H．C．A．PNAS USA 94，855-860，1997)和其它增殖细胞系(Lopes，U．G．，等，J．Biol．Chem．(生物学化学杂志)272，12893-1896，1997)的编程性细胞死亡。Ⅲ．MCP抑制剂

美国专利5，614，649和5，550，262(二者均授权于Cephalon公司)公开了作为本发明主题的MCP的特异性抑制剂。这些专利文献通过参考其全文引入本文。

发明概述

本发明涉及MCR抑制剂用作程序性细胞死亡(即，编程性细胞死亡)的诱导剂和用作抗肿瘤剂的应用。

在一些优选实施方案中，本发明提供了导致转化细胞死亡的方法，该方法包括将本发明的化合物与所述细胞接触。

在进一步优选实施方案中，本发明提供了用于治疗患有疾病的患者的方法，所述疾病的特征在于存在转化细胞，所述方法包括用本发明的化合物接触所述的细胞。

再进一步的优选实施方案中，提供了诱导编程性细胞死亡的方法，包括用本发明的化合物接触所述的细胞。

本发明还提供了抑制转化细胞增殖的方法，包括用本发明的化合物接触所述的细胞；和抑制肿瘤生长的方法，包括用本发明的化合物接触接触所述的肿瘤。在一些优选实施方式中，所述肿瘤是实体瘤。

在本发明方法的一些优选实施方案中，对哺乳动物，优选对人，给药所述化合物。

在本发明方法的一些优选实施方案中，所述转化细胞是乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、舌癌细胞、脑癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞或皮肤癌细胞。

在一些进一步优选的实施方案中，所述转化细胞超量生产Bcl2蛋白质，和／或缺乏p53蛋白质。

本发明的MCP抑制剂公开在美国专利5，550，262和5，614，649中，通过参考其全文将它们各自的公开内容引入本文。这些化合物由下面的通式表示：

组成成员以及用于优选抗肿瘤剂的优选组成成员在下文定义。这些化合物是诱导多种肿瘤细胞类型，特别是诱导对目前被认可的化疗剂治疗产生抗性的实体瘤细胞，发生凋亡的有用诱导剂。

本发明的这些和其它特征将以展开的方式在下文继续阐述。

附图的简要说明

图1和lA显示已公开的MCP抑制剂作为人白血病细胞编程性细胞死亡诱导剂的效果。

图2和2A比较了已公开的MCP诱导剂诱导编程性细胞死亡的能力。

图3是显示Bcl-2肿瘤蛋白质的超量表达未能抑制化合物A诱导的凋亡性细胞核改变的照片复印件。

图4是显示Bcl-2肿瘤蛋白质的超量表达未能抑制化合物A诱导的PARP的酶切和p112-115／RB的产生的照片复印件。

图5是显示在几种人癌症细胞系中，化合物A诱导解吸附和编程性细胞死亡，但依托泊甙或顺铂不能诱导解吸附和编程性细胞死亡的照片复印件。

图6是显示化合物A选择性地诱导SV40转化的人成纤维细胞，但不诱导亲代正常的人成纤维细胞发生凋亡性细胞核改变的照片复印件。

图7显示化合物A选择性地诱导SV40转化的人成纤维细胞，但不诱导亲代正常的人成纤维细胞发生PARP酶切。

图8是显示化合物D和E的体内抗肿瘤活性的图示。

图9是显示化合物I和J体内抑制肺癌组织生长的图示。

图10是显示化合物I体内抑制大鼠前列腺癌的图示。

发明详述

按照本发明用作抗肿瘤剂的用于诱导编程性细胞死亡的MCP抑制剂由下列通式表示：其中，

R₁选自-C≡N、-C(=O)OR₉、苯二甲酰亚氨基、-NH-SO₂R₉和-NH-J：

R₂选自H、羟基、具有1至10个碳原子的烷基和具有3至7个碳原子的环烷基；

R₃选自-(CH₂)_m-NH-C(=N-R₅)-NH₂、-R₆-NO₂、-R₆-J和-R₆-C≡N；

R₄为-CH(CH₂-R₇)-Q；

Q选自-CH-R₈、-C(=O)CH₃、-C(=O)CH₂Cl、-C(=O)CH₂Br、C(=O)CH₂F、-C(=O)CHF₂、-C(=O)CF₃、-C(=O)C(=O)R₇、-C(=O)C(=O)NH-R₇、-C(=O)CO₂-R₇、-C(=O)CO₂H、-B(OH)₂、

和

其中p和q独立地为2或3；

W为环烷基；R₅选自-NO₂、-CN、和-J；R₆为-(CH₂)_m-NH-C(=NH)-NH-；

R₇选自苯基、具有1至8个碳原子的烷基，所述烷基可被一个或多个卤原子、芳基或杂芳基任意取代；

R₈选自=O、=N-NHC(=O)-NH₂、=N-OH、=N-OCH₃、=N-O-CH₂-C₆H₅、=NNH-C(=S)-NH₂和=N-NH-J；

R₉选自氢、和具有1至6个碳原子的烷基，所述烷基可被一个或多个卤原子、芳基或杂芳基任意取代；

J为保护基团；

n为3至10的整数；以及

m为2至5的整数。

在一些优选的实施方案中，R₁是-C≡N、-C(=O)OCH₃、苯二甲酰亚氨基或-NH-SO₂CF₃；以及在其它优选的实施方案中，R₂是氢和环戊烷基。

R₃优选为-(CH₂)₃-NH-C(=N-R₅)-NH₂。

Q优选为-CH-R₈、-B(OH)₂、-C(=O)C(=O)NH-R₇或具有下列结构的基团：

或

其中W为蒎烷。

R₅优选为-NO₂、-C≡N、-PMC、-MTR、-MTS或Tos。

R₇优选为-CH(CH₃)₂、-(CH₂)₂-CH₃、-CH₂-CH₃或-C₆H₅。

R₈优选为=O、=N-OH、=N-O-CH₂-C₆H₅、=NNH-C(=O)-NH₂或=NNH-C(=S)-NH₂。

在一些优选的实施方案中，R₁为-C(=O)OCH₃、苯二甲酰亚氨基或-NH-SO₂CF₃；R₂为环戊烷基；R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-NO₂)-NH₂；R₇为-CH(CH₃)₂；以及R₈为=O。

在其它优选的实施方案中，R₁为-C≡N；R₂为环戊烷基；R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-NO₂)-NH₂或-(CH₂)₃-NH-C(=N-J)-NH₂；R₇为-CH(CH₃)₂；以及R₈为=O。

在进一步优选的实施方案中，R₁为C≡N；R₂为环戊烷基；R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-NO₂)-NH₂或-(CH₂)₃-NH-C(=N-J)-NH₂；R₇为-CH(CH₃)₂；Q为-CH-R₈；R₈为=N-NHC(=O)-NH₂、=N-OH、=N-OCH₃或=N-O-CH₂-C₆H₅。

在一些特别优选的实施方案中，R₁、R₂、R₃和R₄选自表1中化合物所示的取代基。在一些尤其优选的实施方案中，R₁、R₂、R₃和R₄选白形成下文表1所示的化合物A-J的基团。

本文所用的术语“烷基”，包括直链、支链和环状烃基如乙基、异丙基和环戊烷基。取代的烷基是其中的一个或多个氢原子被卤素、其它烃基(例如，苯基)、杂芳基、或一个或多个碳原子被氧原子打断的基团所置换的烷基。优选的烷基具有1至约8个碳原子。本文所用的术语″卤素″具有其通常的涵义，包括氟、氯、溴和碘，其中氟是优选的卤素。本发明所用的术语符号″Arg″具有其正常的涵义，它是精氨酸的缩写符号。

应当理解，本发明所述的各种结构式应当包括它们的相应互变异构型，例如下面所示；

MCP抑制剂的实施方案可以包含保护基团。本发明所用的术语“保护基团”具有广泛的意义。人们知道保护基团本身是指可选择性地附着到被保护的官能基团(如羟基、氨基和羧基)上并可从其上移去的化学官能团。这些基团存在于化合物中，使所述的被保护的官能基团在该化合物所暴露的化学反应条件下是惰性的。各种各样的保护基团均可用于本发明。一个这样的保护基团是苯二甲酰亚氨基。根据本发明，其它优选的保护基团具有下列通式：

可在Green，T．W．和Wuts，P．G．M．，″Protecting Groups in OrganicSynthesis″(有机合成中的保护基团，第二版，Wiley & Sons出版，1991)中找到适用于本发明实际操作的其它代表性的保护基团。

正如以前所指出的，MCP抑制剂可以根据细胞类型诱导或阻断编程性细胞死亡。本发明公开的MCP抑制剂通过编程性细胞死亡杀死肿瘤细胞，甚至于杀死对化疗剂产生抗性的肿瘤细胞系。这类化合物的这种有效性可以应用于研究和治疗情况。通过用本发明的化合物接触MCP来抑制MCP活性的方法包括，对哺乳动物，包括人，提供作为药物或药用物质的化合物。

本发明所用的术语″接触″是指将要接触的部分直接或间接地放置在一起，以使所述要接触的部分彼此物理接触。因此接触包括物理行为如将所述要接触的部分一起置于容器中，或用所要接触的部分对患者给药。因此，例如，对表现患有与异常细胞增殖有关或涉及转化细胞存在的疾病或紊乱的病人施用本发明的化合物，即在术语″接触″所定义的范围内。

在优选的实施方案中，对患有与MCP正常、异常和／或偏离活性(例如，干扰编程性细胞死亡的调节)有关的紊乱(即异常身体状态)、疾病或病理生理状态的患者施用本发明的药物组合物。被施用本发明组合物的紊乱优选是那些直接或间接地抑制或异常干扰编程性细胞死亡的紊乱，特别是该抑制或异常干扰导致或产生癌病症的情况。

期望通过诱导编程性细胞死亡而实现细胞消除的一些疾病包括各种癌症包括，例如，黑素瘤、前列腺、胰腺、卵巢、乳腺、舌和肺癌。可以用本发明的方法治疗的肿瘤包括但不限于黑素瘤、前列腺、胰腺、卵巢、乳腺、舌、肺和平滑肌肿瘤；以及来自成胶质细胞瘤的细胞、骨髓干细胞、造血细胞、成骨细胞、上皮细胞和成纤维细胞。本领域普通技术人员能够容易地利用标准诊断技术鉴定出疑患有该疾病、病症和紊乱的个体。

按照本发明的方法，细胞可以在体内或离体治疗。对于体内治疗，通过本领域已知的多种给药方式中的任何方式使动物细胞，优选哺乳动物细胞，最优选人细胞与本发明的化合物接触。因此，按照本发明的方法，本发明的化合物可以通过任何能够使活性药物在哺乳动物体内到达药物作用位点的方法给药。

在本发明的上下文中，“施用”或“给药”意味着将药物组合物引入患者体内。优选的施用药物的方法包括静脉内、皮下和肌肉内给药。优选以药物组合物的形式施用上述MCP抑制剂，所述药物组合物含有MPC抑制剂和药物学上可接受的载体如生理盐水。其它适当的载体可在Remington’s Pharmaceutical Sciences(药物科学)(Mark Pub．Co．，Easton，PA，1980)中找到。

本发明所述的化合物在药物组合物中的浓度的变化取决于许多因素，所述因素包括药物施给的剂量、所用的化合物的化学性质(即疏水性)和给药的途径。总的说来，可使生理缓冲水溶液中含有约0．1-10％(重量／体积)的MCP抑制剂用于非肠道给药提供本发明的化合物。通常的剂量范围是约1ug-1g／kg体重／天；优选的剂量范围是约0．01mg-100mg／kg体重／天。优选的给药剂量可能依赖于下列可变因素：疾病或紊乱的类型和发展程度、特定患者的整体健康状况、所选化合物的相对生物学效能、MCP抑制剂的赋形剂的配方和其给药途径。本文所用的术语“患者”是指任何类型的脊椎动物。优选的患者是人。

如同下面实施例将要论证的，本发明公开的MCP抑制剂是诱导多种肿瘤细胞编程性细胞死亡的强效诱导剂，由此提供了该化合物作为抗肿瘤剂的用途。重要的是，本发明公开的数据支持这样的结论，即优选的化合物A比两种目前被认可的化疗剂依托泊甙(VP-16)或顺铂具有更优越的编程性细胞死亡诱导效力。

本发明进一步通过下面实施例的方式举例说明。这些实施例在于阐述本发明。这些实施例不想限制本发明由权利要求限定的范围。作为本发明例子的具体化合物的结构在下表1中显示。

表1作为例子的MCP抑制剂的结构

实施例1．体外材料和方法

材料MCP抑制剂由Cephalon，Inc．(West Chester，PA，USA)生产。这些化合物按照美国专利5，614，649和5，550，262阐述的程序合成。

(1)抗-人RB(G3-245)和p21的纯化的小鼠单克隆抗体从PharMingen(San Diego，CA)购买；(2)抗-CPP32的纯化的小鼠单克隆抗体从Transduction实验室(Lexington，KY)得到；以及(3)抗-人PARP(C-2-10)的纯化的小鼠单克隆抗体从Unitéde SantéatEnvironnement(Quebec，Canada)得到。纯化的抗-p27的兔多克隆抗体从Upstate生物技术公司(Lake Placid，N．Y．)得到。小鼠对人RB(XZ55)的单克隆培养上清液由N．Dyson和E Harlow博士(马萨诸塞公立医院癌症中心，Charlestown，MA)提供。依托泊甙、顺铂、propidiumiodide、Hoechst 33258和其它化合物从Sigma(St．Louis，MO)得到。乙酰-YVAD-氯甲酮(YVAD-CMK)从生物科学公司(King of Prussia，PA)得到。

b．细胞培养。人Jurkat T和HL-60细胞在添加10％胎牛血清(Sigma)、100单位／ml青霉素、100μg／ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640(Life Technologies，Inc．)(生长培养基)中生长。超量表达Bcl-2肿瘤蛋白质或载体本身的Jurkat T．细胞(由D．Johnson博士提供，匹兹堡大学，PA)在加有0．4μg／ml G418的同样生长培养基中生长。从美国典型培养物收藏中心(ATCC，Rockville，MD)得到的人乳腺癌细胞系(MCF-7、MDA-MB-231)、前列腺癌细胞系(DU145，PC3)和骨肉瘤(U2-OS)也在RPMI生长培养基上生长。人卵巢癌细胞系(SCC-25；来自ATCC)和脑癌细胞系(SNB-19；Welch，W．C．，等，In Vitro Cell Dev．Biol．，31：610-616，1995)，以及正常人成纤维细胞(WI-38)和SV40-转化的人成纤维细胞(WI-38 VA-13；来自ATCC)在含10％胎牛血清、青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺的DMEM培养基中生长。

c．用MCP抑制剂处理细胞。用特异性MCP抑制剂、标准抗肿瘤试剂(依托泊甙或顺铂)、或DMSO(溶媒)处理细胞。在该过程中，监测形态学改变和细胞解吸附作用(对于贴壁细胞系)。在每个时间点，收获细胞，用于测定编程性细胞死亡和其它生化反应。在下文涉及YVAD-CMK的实施例1中，首先将化合物A加到Jurkat T细胞中。接着立即将细胞分到多个组织培养瓶中。然后将YVAD-CMK加到指示浓度。

d．流动细胞记数，核染色和DNA片段分析。按照以前的描述(Nicoletti，I．，等，免疫学方法杂志(J．Immunol．Methods)139：271-279，1992)利用流动细胞记数进行DNA含量分析。为了分析细胞核形态，用PBS冲洗细胞，用70％的乙醇固定1小时，然后用Hoechst 33258(1mM)染色30min。利用荧光显微镜(OLYMPUS BH2)观察细胞核的形态。按照以前的描述(Grant，S．，等，癌症研究52：6270-6278，1992)分析DNA片段。

e．全细胞提取物和western印记分析。为了制备全细胞提取物，用PBS冲洗细胞，在溶胞缓冲液(50 mM Tris，pH 8．0，5 mM EDTA，150 mM NaCl，0．5％Nonidet P-40，0．5 mM PMSF和0．5 mM二硫苏糖醇)中匀浆。在4℃振摇30分钟后，离心细胞溶解液，收集上清液作为全细胞提取物。然后用十二烷基磺酸钠-6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白质样品(每道20-60μg蛋白质)，随后利用CPP32、PARP、p21、p27或RB的特异性抗体进行增强的化学发光Western印记分析。

f．细胞生存力检测。用MCP抑制剂或溶媒在37℃处理Jurkat细胞30分钟。接着，加入伊屋诺霉素(1μM)和佛波酯PMA(10 ng／ml)，以及0．2％乙醇。24小时后，通过XTT(Sigma，X4251)的降低评价细胞生存力。向每孔中加入50μl XTT(1 mg／ml)和25μl PMS(Sigma9625，5mM)。37℃，3小时后，用平板读数仪记录450 nm／690 nm的各孔的OD。2．实施例1：已公开的MCP抑制剂对人白血病细胞编程性细胞死亡的诱导和caspases的激活

设计实施例1用来确定MCP是否参与生存信号传递途径，以及MCP活性的抑制是否诱导编程性细胞死亡。用30μM化合物A处理人JurkatT细胞4小时。在该条件下，通过(a)含有sub-G₁ DNA的凋亡群体的出现(图1，图1b对图1a)；(b)细胞核的浓缩和破碎(图3，b对a比较)；和(c)内核小体的DNA断裂(图1A，图1g)证明编程性细胞死亡的发生。化合物A的处理还诱导caspase-3的加工，这是激活编程性细胞死亡所需要的。该处理还诱导PARP酶切成为p85片段，以及RB酶切成为p68片段(图1A，d-f，第2道对第1道)。同样的处理还诱导RB C-末端酶切和脱磷酸化过程，这通过C-末端缩短形式的RB(p112)和次磷酸化形式的RB(p115)的产生证明(图1A，f，第2道对第1道)。RB的p112和p115型作为p112-115／RB混合，用作编程性细胞死亡的标记。当用化合物B处理人白血病HL-60细胞时，也观察到所有上述编程性细胞死亡事件。例如，HL-60细胞与化合物B的接触导致内核小体DNA断裂(图1A，图g)。

因为人Jurkat T细胞(Iwamoto，K．S．，等，癌症研究，56：3862-3865，1996)和HL-60细胞(Danova，M．，等，白血病研究(Leukemia Res．)14，417-422，1990)含有突变的p53基因，上述数据支持这样的结论，即已公开的MCP抑制剂诱导的编程性细胞死亡是p53-非依赖性的。

为了进一步获得MCP的胰凝乳蛋白酶样活性的抑制导致Jurkat T编程性细胞死亡的证据，用各种浓度的七种不同化合物处理细胞24小时，然后通过XTT降低评价它们的生存力，然后按等级划分细胞杀伤能力和MCP抑制能力。Jurkat细胞杀伤能力的等级与MCP抑制的等级精确匹配(参见，下表2)。

表2化合物对人Jurkat T细胞白血病细胞系的毒性和它们作为MCP抑制剂的能力

化合物	抑制，MCP胰凝乳蛋白酶样活性(IC₅₀，nM)	毒性(IC₅₀，μM)
化合物	抑制，MCP胰凝乳蛋白酶样活性(IC₅₀，nM)	毒性(IC₅₀，μM)	A	2	0．5
B	6	1．6	A	2	0．5
B	6	1．6	C	21	9．7
D	5	0．6	C	21	9．7
D	5	0．6	F	10	1．7
G	20	5．7	F	10	1．7
G	20	5．7	H	300	＞30

为了提供已公开的MCP抑制剂诱导的编程性细胞死亡涉及caspase激活的其它证据，本发明人利用了乙酰-YVAD-氯甲酮(YVAD-CMK)，一种抑制某些caspase活性(Thomberry，N．A．，等，M．J．自然，356：768-774，1992；和Lazebnik，Y．A．，期刊及卷号同上)和在某些细胞系统中防止编程性细胞死亡(Enari，M．，等，自然，375：78-81，1995；和An，B．，和Dou，Q．P．，期刊卷号同上)的四肽抑制剂。YVAD-CMK加入化合物A处理的Jurkat T细胞完全阻止了：(a)编程性细胞死亡峰的产生(图1，图c对b)；(b)caspase-3的加工；(c)PARP的酶切；和(d)RB的脱磷酸化和酶切(图1A，d-f，第3道对第2道)。这些数据支持这样的结论：即caspase的活性作用发生在上述事件的上游。3．实施例2：MCP抑制剂的编程性细胞死亡诱导能力与它们对MCP胰凝乳蛋白酶样活性的抑制活性成比例

已有人报道了已公开的MCP抑制剂对MCP胰凝乳蛋白酶样活性的抑制作用，但这些MCP抑制剂对MCP胰蛋白酶样活性和组织蛋白酶B(一种空泡半胱氨酸蛋白酶)产生相对较小的抑制作用(Iqbal，M．，等，医学化学杂志(J．Med．Chem．)38：2276-2277，1995；Iqbal，M．，等，Bioorg．Med．Chem．Lett．6：287-290，1996；和Harding，C．V．，等，免疫学杂志，155：1767-1775，1995)。而且，据报道，利用分离的MCP和完整鼠B细胞测定的胰凝乳蛋白酶样活性抑制能力的顺序为化合物A＞化合物B＞化合物C(Iqbal，M．，等，医学化学杂志(J．Med．Chem．)38：2276-2277，1995；Iqbal，M．，等，Bioorg．Med．Chem．Lett．6：287-290，1996；和Harding，C．V．，等，免疫学杂志，155：1767-1775，1995)。

为了证明已公开的MCP抑制剂诱导的编程性细胞死亡是由带来生存有利条件的蛋白酶体酶活性的抑制引起的，而不只是由于MCP抑制剂引起的毒性，考察了化合物A、化合物B和化合物C诱导编程性细胞死亡的能力。当用15μM化合物A处理人Jurkat T细胞8小时后，具有sub-G₁ DNA的凋亡群体增加了23％(图2，图b对a)。相比较而言，当使用化合物B时，仅检测到sub-G₁群体8％的增长(图2，图c对a)。同样条件下用化合物C(CMPD 8)处理，不会诱导这些状况下的编程性细胞死亡(图2，图d)。

还在一个平行试验中研究了这三种MCP抑制剂诱导PARP和RB蛋白改变的能力。当用15μM化合物A处理Jurkat T细胞时，2小时后，观察到p85／PARP和p112-115／RB的产生(图2A，e和f，第2-5道对第1道)。然而，当这些细胞接触同样浓度的化合物B时，8小时之内发现p85／PARP和p112-115／RB很少(图2A，第6-9道对第2-5道)，但处理后12小时或更长时间，它们显著增加(图2A，第14、16道)。化合物C比化合物A或B效力更低，其在24小时后几乎不诱导产生p85／PARP和p112-115／RB(图2A，第17道)。因此，根据这些数据，通过诱导sub-G1群体产生和PARP和RB蛋白的改变，来判断这些MCP抑制剂诱导编程性细胞死亡效力的顺序是化合物A＞化合物B＞化合物C(图2和2A)。该顺序与这三种化合物在分离的蛋白酶体中(Iqbal，M．等，医学化学杂志(J．Med．Chem．)38：2276-2277，1995；Iqbal，M．，等，Bioorg．Med．Chem．Lett．6：287-290，1996)和在完整鼠B细胞中(Harding，C．V．，等，免疫学杂志，155：1767-1775，1995)抑制胰凝乳蛋白酶样活性的等级完全对应。

这里得出的结果支持这样的结论，即由已公开的MCP抑制剂诱导编程性细胞死亡是基于MCP的胰凝乳蛋白酶样活性的抑制。4．实施例3：化合物A具有编程性细胞死亡诱导效力并能够克服Bcl-2-介导的编程性细胞死亡保护作用

比较了化合物A和两种标准化疗抗癌剂——依托泊甙和顺铂诱导编程性细胞死亡的效力。用30μM化合物A处理3．5小时后，将近100％的Jurkat细胞(未显示数据)或用对照载体转染的Jurkat细胞(用于下面的Bcl-2研究；图3，图b对a)表现出凋亡性细胞核改变。相比较而言，用50μM依托泊甙处理8小时仅约47％细胞发生编程性细胞死亡(图3，图c对a)。10μM化合物A处理，而不是依托泊甙或顺铂，诱导人前列腺、乳腺、舌和脑癌细胞以及SV40 DNA病毒转化的人成纤维细胞发生编程性细胞死亡(参见图5-7)。

已经显示，在一些细胞系统中Bcl-2肿瘤蛋白质的过度表达抑制编程性细胞死亡(Miura，M．，等，细胞杂志，75：653-660，1993)。研究了Bcl-2在人Jurkat T细胞中的表达对化合物A诱导的编程性细胞死亡的抑制作用。在接触30μM化合物A 3．5小时后，约100％的Bcl-2-过度表达Jurkat细胞(图3，图e对d)，类似于载体转化细胞(图3，图b对a)，显示出编程性细胞死亡特异性细胞核形态。相反，如本发明人以前的论证(An．B．，等，Int．J．Mol．Med．，正在印刷)和其他人的论证(Miyashita，T．，和Reed，J．C．血液(Blood)，81：151-157，1993)，Bcl-2蛋白质的表达阻断由依托铂甙诱导的凋亡性细胞核改变(图3，图f对c)。

为了进一步确证化合物A克服Bcl-2对编程性细胞死亡的保护作用，将对照载体细胞与15μM化合物A接触8小时，通过表现出凋亡细胞核形态的细胞百分率证明该处理比50μM依托铂甙处理8小时的有效性低(分别为30％和47％)。Bcl-2的表达不能抑制低浓度化合物A诱导的凋亡性细胞核改变(数据未显示)。与此一致，Bcl-2的过度表达同样不能阻断由15μM化合物A诱导的PARP的酶切和p112-115／RB的产生(图4，a和b，第8-10道对第3-5道)。相反，Bcl-2的表达抑制由50μM依托铂甙诱导的这些PARP和RB的改变(图4，c和d，第6-10道对第1-5道)。基于这些数据，已公开的MCP抑制剂通过Bcl-2非依赖途径引发编程性细胞死亡程序。5．实施例4：化合物A诱导多种人类肿瘤细胞系的编程性细胞死亡

大多数人类实体瘤对目前应用的化疗药物治疗存在抗性。已经表明，Bcl-2肿瘤蛋白质的过表达对形成多药物抗性起作用，至少对于人前列腺癌和乳腺癌是如此(Harrison等，病理学杂志(J．Pathol．)，175：7-12，1995；Desoize等，抗癌研究(AnticancerRes．)14：2291-2294，1994；Kellen等人，抗癌研究14：433-436，1994)。因为化合物A能够在人JurkatT细胞中克服Bcl-2介导的编程性细胞死亡的抑制(图3，4)，研究了化合物A诱导人前列腺癌(PC-3，DU145)和乳腺癌(MDA-MB-231，MCF-7)癌症细胞系编程性细胞死亡的能力。在这些实验中，将化合物A的效能与依托铂甙的效能进行了比较。

用10μM化合物A、依托铂甙、或等百分比的溶媒(DMSO)处理人前列腺癌PC-3细胞，然后分离吸附和解吸附细胞群。然后用吸附细胞群和解吸附细胞群检测凋亡性细胞核改变。化合物A处理后36小时后，约50％的PC-3细胞解吸附。所有解吸附的PC-3细胞表现典型的凋亡性细胞核浓缩和破裂(图5，图a)。不希望被任何特别的理论所限制，该细胞解吸附可能由编程性细胞死亡的诱导引发，因为其余的贴壁细胞也表现凋亡性细胞核形态(图5，图b)。用依托泊甙或DMSO处理的PC-3细胞中很少或没有观察到解吸附；与此一致，所有其余的贴壁细胞均含有正常的圆形细胞核(图5，分别为图c和d)。

与PC-3类似，人前列腺癌DU145细胞在接触化合物A16小时后，约一半细胞解吸附。几乎所有解吸附的DU145细胞和甚至贴壁的DU145细胞表现出凋亡特异性细胞核形态(图5，图e，f对h)。依托泊甙处理这些细胞仅诱导极少量的解吸附，其余的贴壁细胞仍然含有正常细胞核(图5，图g)。

人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞在接触化合物A24小时后，也发现至少一半的细胞发生解吸附。核染色分析证明所有解吸附和大多数贴壁的细胞表现出凋亡性形态(图5，图1，j，m和n)。同样条件下用依托泊甙处理这两种细胞系，并不诱导编程性细胞死亡(图5，图k，o)。因为MDA-MB-231细胞含有突变的p53基因(Casey，G，等，肿瘤基因(Oncogene)6：1791-1797，1991)，而MCF-7细胞表达野生型p53(Bartek，J．等，肿瘤基因，5：893-899，1990)，这些数据支持这样的结论，即化合物A诱导编程性细胞死亡是p53非依赖性的。

用化合物A，而不是依托泊甙或顺铂处理，诱导其它几种人肿瘤细胞系细胞的解吸附和编程性细胞死亡，所述细胞系包括口aquamous癌细胞系SCC-25(图5，图q-t)、成胶质细胞瘤细胞系SNB-19(图u-x)和骨肉瘤细胞系U2OS(数据未显示)。总而言之，这些数据支持这样的结论，即化合物A比依托泊甙和顺铂具有较强的编程性细胞死亡诱导效力，证明该MCP抑制剂能够在多种人癌细胞系中克服抗药性。6．实施例5：化合物A选择性地在SV-40转化的人成纤维细胞中而不在亲代正常的人成纤维细胞中诱导编程性细胞死亡

研究了化合物A在诱导转化细胞和正常细胞的编程性细胞死亡之间是否具有选择性。应用正常人成纤维细胞系(WI-38)和其SV40转化的衍生物(WI-38 VA13)。用10μM化合物A、依托泊甙或DMSO处理这两种细胞系高达22小时，然后分离贴壁细胞群和解吸附的细胞群。化合物A的处理诱导大多数SV40转化细胞解吸附；所有解吸附的和大多数贴壁的转化细胞均表现出凋亡性细胞核改变(图6，图a，b对d)。相反，化合物A与正常WI-38细胞的接触既不诱导解吸附也不诱导凋亡性细胞核形态，虽然该处理增加了正常WI-38细胞的体积(图e对g)，不期望被任何特别的理论所限制，这可能起因于G₁中的生长抑制(Hinds，P．W．等，细胞70：993-1006，1992)。依托泊甙的处理在转化的WI-38细胞或正常WI-38细胞中均没有诱导编程性细胞死亡，虽然该处理也增加了两种细胞系的细胞体积(图6，图c对d和f对g)。

在一个平行比较实验中，用化合物A、依托泊甙或DMSO处理后，收集总细胞群(解吸附细胞和贴壁细胞的混合物)。然后从这些细胞制备总细胞提取物，并用于PARP酶切测定。与核染色分析结果一致(图6)，化合物A诱导的PARP酶切仅在转化细胞中观察到(图7，第6道对第4道)，但在正常细胞中观察不到(图7，第3道对第1道；注：该实验中使用4倍多量来自WI-38细胞的蛋白质)。总而言之，这些数据支持这样的结论，即化合物A选择性地诱导SV40转化的人成纤维细胞的编程性细胞死亡程序。7．实施例6：化合物A处理的细胞诱导细胞周期蛋白-依赖性激酶抑制剂p21和p27的累积

已报道遍在蛋白-蛋白酶体途径在控制几种细胞周期调节蛋白质的水平方面发挥重要作用，这些细胞周期调节蛋白质包括细胞周期蛋白-依赖性激酶抑制剂p21(Blagosklonny，M．V．，等，生物化学生物物理学研究通讯(Biochem．Biophys Res．Comm．)227：564-569(1996))和p27(Pagano，M．，等，科学，269：682-685，1995)。通过Western印记考察了化合物A在人乳腺癌MDA-MB-231细胞中对p21和p27水平的影响。接触15μM化合物A 6小时后，p21的水平增长了45倍。6小时后p27的水平轻微增长，但在12或24小时后升高了3到4倍。另外，还观察到可能代表遍在蛋白p70的70 kDa色带。相反，当用浓度高达100μM的依托泊甙处理17小时时，仅产生p21(≤4倍)和p27(≤2倍)的有限累积。

还在SV-40转化的WI-38成纤维细胞和正常WI-38成纤维细胞中评价了化合物A处理后p21和p27的累积。正常或转化的WI-38细胞与10μM化合物A一起保温22小时后，导致p21水平增长9到10倍。在上述条件下，正常细胞中的p27水平仅轻微增长，但SV-40转化细胞中p27水平却升高了8倍。8．体外结果分析

上述结论支持这样的结论，即通过具有sub-G₁ DNA的凋亡群体的出现、细胞核的浓缩和破裂、内核小体DNA的断裂，caspase-3的加工和激活，PARP的酶切、以及RB的脱磷酸化和酶切，证明化合物A在p53突变的人Jurkat T和HL-60细胞中迅速诱导编程性细胞死亡(图1)。添加YVAD-CMK会阻断上述所有的编程性细胞死亡事件(图1A)，确证在MCP抑制剂诱导的、p53-非依赖性编程性细胞死亡中需要激活caspase。这些数据与大多数近期其它报道一致，并有进一步的发展，即其它MCP抑制剂诱导编程性细胞死亡性死亡，所述其它MCP抑制剂包括三肽醛(LLL，LLnV)或者lactacystin(Jmajoh，Ohmi，等，生物化学和生物物理学研究通讯217：1070-1077，1995；Shinohara，K．，等，生物化学杂志(Biochem．J．)317：385-388，1996；Drexler，H．C．A．PNAS USA．94：855-860，1997；和Lopes，U．G．，等，生物学化学杂志(J．Biol．Chem．)272：12893-1896，1997)。化合物A、B和C的编程性细胞死亡诱导能力(图2)与它们对MCP的胰凝乳蛋白酶样活性的抑制能力成比例(Iqbal，M．，等，医学化学杂志(J．Med Chem．)38：2276-2277，1995；Iqbal，M．，等，Bioorg．Med．Chem．Lett．6：287-290，1996)。化合物A比两种标准化疗药物——依托泊甙和顺铂具有更强的编程性细胞死亡诱导能力。与此一致的是这样的结果，即化合物A，而不是依托泊甙或顺铂，能够在超量表达Bcl-2的Jurkat细胞中或者在前列腺癌、乳腺癌、舌癌和脑癌的多种人癌症细胞系中诱导编程性细胞死亡(图3-5)。化合物A选择性地在SV40-转化的人成纤维细胞，而不是亲代正常人成纤维细胞中诱导编程性细胞死亡(图6，7)。

此外，化合物A增加了人乳腺细胞瘤系中细胞周期蛋白-依赖性激酶抑制剂p21和p27的水平。p27的水平在SV40-转化的成纤维细胞中选择性增加，但在未转化的亲代细胞系中没有增加。a．蛋白酶体胰凝乳蛋白酶样活性的抑制与编程性细胞死亡的诱导有关

前面的数据支持这样的结论，即蛋白酶体胰凝乳蛋白酶成分，而不是胰蛋白酶样成分，对于细胞生存是必须的，虽然不能排除支链氨基酸优选活性的作用。数据表明化合物A、B和C在Jurkat T细胞中诱导编程性细胞死亡能力的能级(图2)与它们对蛋白酶体胰凝乳蛋白酶活性的抑制能力的等级完全对应。(Iqbal，M．等，医学化学杂志(J．Med Chem．)38：2276-2277，1995；Iqbal，M．，等，Bioorg．Med．Chem．Lett．6∶287-290，1996；和Harding，C．V．等，免疫学杂志155：1767-1775，1995)。另外，这些数据支持这样的结论，即对蛋白酶体胰凝乳蛋白酶样活性，化合物A(Ki=＜2nM；Iqbal，M．，等，卷期同上)是比三肽醛(Ki=20nM；Rock，K．L．，等，细胞78：761-771，1994)更强效的抑制剂。与此一致，化合物A比三肽醛具有更强的编程性细胞死亡诱导能力。例如，用30μM化合物A处理3-4小时，足以在人HL-60细胞的Jurkat细胞中诱导PARP完全酶切(图1A)。相反，曾报道，用50μMLLnV处理HL-60细胞6小时，诱导约50％的PARP酶切(Drexler，H．C．A．PNAS USA．94：855-860，1997)。这些结果支持这样的结论，即蛋白酶体胰凝乳蛋白酶样活性参与细胞生存途径，该活性的抑制导致编程性细胞死亡的诱发。b．化合物A克服人癌症细胞的抗药性

基于本文提供的数据，化合物A是一种强效的编程性细胞死亡诱导剂，看起来能够克服人癌症细胞的抗药性。化合物A，但不是依托泊甙，能够在超量表达Bcl-2的Jurkat T细胞中诱导编程性细胞死亡(图3)。甚至当用较低浓度的化合物A与较高浓度的依托泊甙比较时，也是如此(图4)。这些数据支持这样的结论，即化合物A通过一种新的Bcl-2-非依赖性途径诱导编程性细胞死亡。大多数人癌症细胞对标准抗癌药物，例如依托泊甙或顺铂的处理表现出抗性(Harrison，D．J．，病理学杂志175：7-12，1995；图5)。然而，低浓度的化合物A迅速激活所有受测的人前列腺、乳腺、舌和脑癌细胞系的凋亡途径(图5)。另外，除了独立于Bcl-2外，MCP抑制剂-诱导的编程性细胞死亡还是p53非依赖的，这与大多数近期报道的蛋白酶体介导的p53依赖性编程性细胞死亡不同(Lopes，U．G．，生物化学杂志(J．Biol．Chem)，272∶12893-1896，1997)这些性质支持这样的结论，即，已公开的MCP抑制剂是治疗人类癌症，尤其是超量表达Bcl-2和／或缺乏p53的癌症的新型抗癌剂。c．化合物A选择性诱导SV40-转化的人成纤维细胞、但不诱导正常人成纤维细胞的编程性细胞死亡

比较了化合物A对正常WI-38和其SV40-转化衍生物(WI-38VA-13)细胞系之间的效力。发现化合物A的处理优选在SV40-转化细胞中诱导解吸附和编程性细胞死亡(图6)。与此一致，化合物A的处理仅在转化的细胞中、而不在正常的WI-38细胞中诱导PARP酶切(图7)。这些数据支持这样的结论，即化合物A-介导的杀伤作用不是细胞毒作用，并进一步提示，化合物A可能具有肿瘤选择性杀伤能力。化合物A在正常和转化细胞中的活性差异不能被解释为增殖速率的差别，因为对于WI-38和WI-36 VA-13细胞，其增殖速率是类似的。d．用化合物A处理细胞诱导细胞周期蛋白-依赖性激酶抑制剂p21和p27的累积

化合物A调节p21和p27水平的能力与据报道的蛋白酶体控制细胞周期蛋白-依赖性激酶抑制剂的作用一致(Blagosklonny，M．V．，等，卷期同上；Pagano，M．等，卷期同上)。化合物A处理之后，在SV40-转化的WI-38成纤维细胞中而不是在亲代细胞系中，p27选择性地累积，选择性地诱导转化细胞的编程性细胞死亡。该观察结果与这样的假设一致，即p27的累积达到上限极限浓度时导致编程性细胞死亡。9．实施例7：体内研究

a．材料：将用于体内研究的MCP抑制剂(化合物D和E)分别配制于25％Solutol。

b．细胞系：鼠黑素瘤细胞系，B16-F0，于37℃，在潮湿培养箱中，在95％空气／5％CO₂气体条件下，在含有10％胎牛血清(HycloneLabs，Logan，UT)、2 mM谷氨酰胺(GibcoBRL，Long Island，NY)、青霉素(100 I．U．／mL)(GibcoBRL)、和链霉素(100μg／mL)(GibcoBRL)并含4．5 g／l蔗糖(Cellgro／Mediatech，Washington，D．C．)的Dulbecco改进的Eagle培养基中生长。确定细胞无支原体和啮齿动物病毒(MAP实验)。用5 mL温胰蛋白酶／EDTA(0．05％，0．5 mM)(GibcoBRL)收获处于指数生长期的细胞。用完全培养基将总体积调整到10 mL以中和胰蛋白酶，然后用血球计对细胞计数。然后通过简单离心收集细胞，将细胞沉淀重悬浮于磷酸盐缓冲盐水(GibcoBRL)，以便得到每毫升1×10⁷个活细胞的终浓度。

c．动物：从Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，IN得到的雌性C57BL小鼠(20-25 g)维持每笼五只小鼠，随意提供商品饮食和水。动物在潮湿和控温条件下饲养，光／暗周期设置为12小时间隔。实验操作之前，隔离检疫小鼠一周。

d．肿瘤细胞的移植和生长：收获如上述培养的处于指数生长期的B16-F0细胞，并将其注射(1×10⁶个细胞／只鼠)到小鼠右侧腹内。将具有肿瘤尺寸为0．01-0．3 cm³的五十只动物分成5组，每组10只动物。以10 mg／kg／天腹膜内给药化合物；以1 ml／kg／天腹膜内给药溶媒(25％Solutol)。

e．肿瘤测定：每2到3天，用游标卡尺测量肿瘤的大小。利用下面的公式计算肿瘤体积：

V(cm)³=．5236×长度(cm)×宽度(cm)[(长度(cm)+宽度(cm))／2]

体内研究的结果在图8中显示。

该结果表明化合物D和E抑制黑素瘤生长。

10．实施例8：化合物I和化合物J对无胸腺裸鼠中Lewis肺癌异种移植物生长的体内抗肿瘤效果。

在雌性无胸腺裸鼠右侧下腹皮下(s．c．)注射1×106Lewis肺癌细胞。当肿瘤体积达到150到200 mm³时，将小鼠随机分组，每组十只动物，然后开始定量给药化合物I(2 mg／kg，s．c．，QD，一周5天)，化合物J(3 mg／kg，s．c．，QD，一周5天)，或者单独施用溶媒(30％ Solutol)，总共给药12天。每2到3天用游标卡尺二维测定肿瘤的测量值(体积)。利用Mann-Whitney秩和检验进行与药物有关的抗肿瘤效果相对于溶媒处理对照的统计学分析。

结果如图9所示。

该结果表明化合物I和J抑制肺癌肿瘤生长。

11．实施例9：化合物I对无胸腺裸鼠中AT-2大鼠前列腺癌异种移植物生长的体内抗肿瘤效果

在雌性无胸腺裸鼠右侧下腹皮下(s．c．)注射1×10⁶ AT-2大鼠前列腺癌细胞。将小鼠随机分组，每组十只动物，然后开始定量给药化合物I(2 mg／kg，s．c．，QD，一周5天)，或者单独施用溶媒(30％ Solutol)，共15天。每2到3天用游标卡尺二维测定肿瘤的测量值(体积)。利用Mann-Whitney秩和检验进行与药物有关的抗肿瘤效果相对于溶媒处理对照的统计学分析。结果如图10所示。

12．实施例10：化合物I和化合物J对人和啮齿动物肿瘤细胞系体外生存力的影响

首先，将细胞以不同密度接种到96孔平板中，24小时后应用Calcein-AM生存力检测法进行检测，确定各种类型细胞的终光密度。然后将该密度的细胞接种到96孔平板中，各孔中含有下述100μL适当细胞培养基：细胞系光密度培养基DU145前列腺癌 2500细胞／孔 DMEM／5％FBSPANC-1胰腺癌 4000细胞／孔 MEM／5％FBSSKMEL-5黑素瘤 3500细胞／孔 DMEM／5％FBSOVCAR-3卵巢癌 5000细胞／孔 RPMI 1640／5％FBSMCF-7乳腺癌 5000细胞／孔 DMEM／5％FBSAT-2(大鼠)前列腺癌 2500细胞／孔 RPMI 1640／5％FBSLewis lung(鼠)肺癌 3000细胞／孔 DMEM／5％FBS

制备连续稀释度的化合物，以使浓度为待评价的所需浓度的两倍。然后将100μL各稀释液加入接种于100μL培养基的细胞中，使终浓度为0、11．7、46．9、187．5、375和750 nM。接种细胞后三到四小时时将化合物加入平板，然后将平板在37℃保温到所需时间点(通常保温一、二、或三天)。

如下在所需时间点进行Calcein-AM生存力检测。利用歧管和金属平板对培养基抽气，使剩余量约为50μL／孔。然后用200μL DPBS(Gibco)冲洗孔三次，每次用歧管抽气，使每孔留下50μL。配制8μM Calcein-AM(Molecular Probes)的DPBS溶液，向每孔加入150μL。然后在37℃保温30分钟。保温后，用歧管对钙黄绿素抽气，然后用200μL DPBS如上述冲洗细胞。最后一次抽气后，用Cytofluor 2300荧光平板读数仪测定荧光。阴性对照含有培养基但没有细胞。所有研究均在两个独立实验中重复三次进行。

结果如下表3所示。

表3

细胞类型	时间点(小时)	化合物IIC₅₀(nM)	化合物JIC₅₀(nM)
细胞类型	时间点(小时)	化合物IIC₅₀(nM)	化合物JIC₅₀(nM)	PANC-1	2472	＞1000282	＞1000185
SKMEL-5	2472	52085	42782	PANC-1	2472	＞1000282	＞1000185
SKMEL-5	2472	52085	42782	OVCAR-3	2472	＞2100069	＞100029
MCF-7	2472	＞1000642	＞1000289	OVCAR-3	2472	＞2100069	＞100029
MCF-7	2472	＞1000642	＞1000289	Lewis lung	2472	435578	411505
AT-2	2472	＞1000＞1000	＞1000＞1000	Lewis lung	2472	435578	411505
AT-2	2472	＞1000＞1000	＞1000＞1000	DU-145	2472	942293	385167

本专利文件中提到的各种专利、申请、和印刷出版物意在通过参考其全文插入本发明。

本领域技术人员将理解，可以对本发明的优选实施方案进行变化和改进，并且可以不偏离本发明的实质实现这些变化和改进。因此本发明的所有权利要求意在覆盖在本发明真正实质和范围内的等同改变。

Claims

1．一种导致转化细胞死亡的方法，包括使所述细胞与下列通式所示的化合物接触：其中，

R₁选自-C≡N、-C(=O)OR₉、苯二甲酰亚氨基、-NH-SO₂R₉和-NH-J；

R₄为-CH(CH₂-R₇)-Q；

Q选自-CH-R₈、-C(=O)CH₃、-C(=O)CH₂Cl、-C(=O)CH₂Br、-C(=O)CH₂F、-C(=O)CHF₂、-C(=O)CF₃、-C(=O)C(=O)R₇、-C(=O)C(=O)NH-R₇、-C(=O)CO₂-R₇、-C(=O)CO₂H、-B(OH)₂、

和

其中p和q独立地为2或3；

W为环烷基；

R₅选自-NO₂、-C≡N和-J；

R₆为-(CH₂)_m-NH-C(=NH)-NH-；

R₇选自苯基和具有1至8个碳原子的烷基，所述烷基可被一个或多个卤原子、芳基或杂芳基任意取代；

R₉选自氢和具有1至6个碳原子的烷基，所述烷基可被一个或多个卤原子、芳基或杂芳基任意取代；

J为保护基团；

n为3至10的整数；以及

m为2至5的整数。

2．权利要求1的方法，其中R₁为-C≡N、-C(=O)OCH₃、苯二甲酰亚氨基或-NH-SO₂CF₃。

3．权利要求1的方法，其中R₂为氢和环戊烷基。

4．权利要求1的方法，其中R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-R₅)-NH₂。

5．权利要求1的方法，其中Q为-CH-R₈、-B(OH)₂、-C(=O)C(=O)NH-R₇或具有下列结构：

或

其中W是蒎烷。

6．权利要求1的方法，其中R₅为-NO₂、-C≡N、-PMC、-MTR、-MTS或Tos。

7．权利要求1的方法，其中R₇为-CH(CH₃)₂、-(CH₂)₂-CH₃、-CH₂-CH₃或-C₆H₅。

8．权利要求1的方法，其中R₈为=O、=N-OH、=N-O-CH₂-C₆H₅、=NNH-C(=O)-NH₂或=NNH-C(=S)-NH₂。

9．权利要求1的方法，其中R₁为-C(=O)OCH₃、苯二甲酰亚氨基或-NH-SO₂CF₃；R₂为环戊烷基；R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-NO₂)-NH₂；R₇为-CH(CH₃)₂；和R₈为=O。

10．权利要求1的方法，其中R₁为-C≡N；R₂为环戊烷基；R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-NO₂)-NH₂或-(CH₂)₃-NH-C(=N-J)-NH₂；R₇为-CH(CH₃)₂；和R₈为=O。

11．权利要求1的方法，其中R₁为-C≡N；R₂为环戊烷基；R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-NO₂)-NH₂或-(CH₂)₃-NH-C(=N-J)-NH₂；R₇为-CH(CH₃)₂；Q为-CH-R₈；和R₈为=N-NHC(=O)-NH₂、=N-OH、=N-O-CH₃或=N-O-CH₂-C₆H₅。

12．权利要求1的方法，其中R₁、R₂、R₃和R₄选自表1中化合物所示的取代基。

13．权利要求1的方法，其中所述化合物选自表1所示的化合物A-J。

14．权利要求1-13任意之一的方法，其中将所述化合物对哺乳动物施用。

15．权利要求14的方法，其中所述哺乳动物是人。

16．权利要求15的方法，其中所述转化细胞是乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、舌癌细胞、脑癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞或皮肤癌细胞。

17．权利要求1的方法，其中所述转化细胞超量生产Bc12蛋白，和／或缺乏p53蛋白。

18．一种治疗患有特征在于存在转化细胞的疾病的患者的方法，包括给所述患者施用下列通式的化合物：

其中，

R₄为-CH(CH₂-R₇)-Q；

和

其中p和q独立地为2或3；

W为环烷基；

R₅选自-NO₂、-C≡N和-J；

R₆为-(CH₂)_m-NH-C(=NH)-NH-；

J为保护基团；

n为3至10的整数；以及

m为2至5的整数。

19．权利要求18的方法，其中R₁为-C≡N、-C(=O)OCH₃、苯二甲酰亚氨基或-NH-SO₂CF₃。

20．权利要求18的方法，其中R2为氢和环戊烷基。

21．权利要求18的方法，其中R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-R₅)-NH₂。

22．权利要求18的方法，其中Q为-CH-R₈、-B(OH)₂、-C(=O)C(=O)NH-R₇或具有下列结构：

或

其中W是蒎烷。

23．权利要求18的方法，其中R₅为-NO₂、-C≡N、-PMC、-MTR、-MTS或Tos。

24．权利要求18的方法，其中R₇为-CH(CH₃)₂、-(CH₂)₂-CH₃、-CH₂-CH₃、或-C₆H₅。

25．权利要求18的方法，其中R₈为=O、=N-OH、=N-O-CH₂-C₆H₅、=NNH-C(=O)-NH₂或=NNH-C(=S)-NH₂。

26．权利要求18的方法，其中R₁为-C(=O)OCH₃、苯二甲酰亚氨基或-NH-SO₂CF₃；R₂为环戊烷基；R₃为-(CH2)₃-NH-C(=N-NO₂)-NH₂；R₇为-CH(CH₃)₂；和R₈为=O。

27．权利要求18的方法，其中R₁为-C≡N；R₂为环戊烷基；R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-NO₂)-NH₂或-(CH₂)₃-NH-C(=N-J)-NH₂；R₇为-CH(CH₃)₂；和R₈为=O。

28．权利要求18的方法，其中R₁为-C≡N；R₂为环戊烷基；R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-NO₂)-NH₂或-(CH₂)₃-NH-C(=N-J)-NH₂；R₇为-CH(CH₃)₂；Q为-CH-R₈；和R₈为=N-NHC(=O)-NH₂、=N-OH、=N-O-CH₃或=N-O-CH₂-C₆H₅。

29．权利要求18的方法，其中R₁、R₂、R₃和R₄选自表1中化合物所示的取代基。

30．权利要求18的方法，其中所述化合物选自1表所示的化合物A-J。

31．权利要求18-30任意之一的方法，其中所述患者是人。

32．权利要求31的方法，其中所述转化细胞是乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、舌癌细胞、脑癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞或皮肤癌细胞。

33．权利要求18的方法，其中所述转化细胞超量生产Bc12蛋白，和／或缺乏p53蛋白。

34．一种诱导细胞的编程性细胞死亡的方法，包括使所述细胞与下列通式所示的化合物接触：

其中，

R₄为-CH(CH₂-R₇)-Q；

Q选自-CH-R₈、-C(=O)CH₃、-C(=O)CH₂Cl、-C(=O)CH₂Br、-C(=O)CH₂F、-C(=O)CHF₂、-C(=O)CF₃、-C(=O)C(=O)R₇、-C(=O)C(=O)NH-R₇、-C(=O)CO₂-R₇、-C(=O)CO₂H、-B(OH)₂、和

其中p和q独立地为2或3；

W为环烷基；

R₅选自-NO₂、-C≡N和-J；

R₆为-(CH₂)_m-NH-C(=NH)-NH-；

R₉选白氢和具有1至6个碳原子的烷基，所述烷基可被一个或多个卤原子、芳基或杂芳基任意取代；

J为保护基团；

n为3至10的整数；以及

m为2至5的整数。

35．权利要求34的方法，其中R₁为-C≡N、-C(=O)OCH₃、苯二甲酰亚氨基或-NH-SO₂CF₃。

36．权利要求34的方法，其中R₂为氢和环戊烷基。

37．权利要求34的方法，其中R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-R₅)-NH₂。

38．权利要求34的方法，其中Q为-CH-R₈、-B(OH)₂、-C(=O)C(=O)NH-R₇或具有下列结构：

或

其中W是蒎烷。

39．权利要求34的方法，其中R₅为-NO₂、-C≡N、-PMC、-MTR、-MTS或Tos。

40．权利要求34的方法，其中R₇为-CH(CH₃)₂、-(CH₂)₂-CH₃、-CH₂-CH₃或-C₆H₅。

41．权利要求34的方法，其中R₈为=O、=N-OH、=N-O-CH₂-C₆H₅、=NNH-C(=O)-NH₂或=NNH-C(=S)-NH₂。

42．权利要求34的方法，其中R₁为-C(=O)OCH₃、苯二甲酰亚氨基或-NH-SO₂CF₃；R₂为环戊烷基；R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-NO₂)-NH₂；R₇为-CH(CH₃)₂；和R₈为=O。

43．权利要求34的方法，其中R₁为-C≡N；R₂为环戊烷基；R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-NO₂)-NH₂或-(CH₂)₃-NH-C(=N-J)-NH₂；R₇为-CH(CH₃)₂；和R₈为=O。

44．权利要求34的方法，其中R₁为-C≡N；R₂为环戊烷基；R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-NO₂)-NH₂或-(CH₂)₃-NH-C(=N-J)-NH₂；R₇为-CH(CH₃)₂；Q为-CH-R₈；和R₈为=N-NHC(=O)-NH₂、=N-OH、=N-O-CH₃或=N-O-CH₂-C₆H₅。

45．权利要求34的方法，其中R₁、R₂、R₃和R₄选自表1中化合物所示的取代基。

46．权利要求34的方法，其中所述化合物选自表1所示的化合物A-J。

47．权利要求34-36任意之一的方法，其中将所述化合物对哺乳动物施用。

48．权利要求47的方法，其中所述哺乳动物是人。

49．权利要求48的方法，其中所述转化细胞是乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、舌癌细胞、脑癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞或皮肤癌细胞。

50．权利要求34的方法，其中所述转化细胞超量生产Bc12蛋白，和／或缺乏p53蛋白。

51．一种抑制转化细胞增殖的方法，包括使所述细胞与下列通式所示的化合物接触：其中，R₁选自-C≡N、-C(=O)OR₉、苯二甲酰亚氨基、-NH-SO₂R₉和-NH-J；

R₄为-CH(CH₂-R₇)-Q；

和

其中p和q独立地为2或3；

W为环烷基；

R₅选自-NO₂、-C≡N和-J；

R₆为-(CH₂)_m-NH-C(=NH)-NH-；

J为保护基团；

n为3至10的整数；以及

m为2至5的整数。

52．权利要求51的方法，其中R₁为-C≡N、-C(=O)OCH₃、苯二甲酰亚氨基或-NH-SO₂CF₃。

53．权利要求51的方法，其中R₂为氢和环戊烷基。

54．权利要求51的方法，其中R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-R₅)-NH₂。

55．权利要求51的方法，其中Q为-CH-R₈、-B(OH)₂、-C(=O)C(=O)NH-R₇或具有下列结构：

或

其中W是蒎烷。

56．权利要求51的方法，其中R₅为-NO₂、-C≡N、-PMC、-MTR、-MTS或Tos。

57．权利要求51的方法，其中R₇为-CH(CH₃)₂、-(CH₂)₂-CH₃、-CH₂-CH₃或-C₆H₅。

58．权利要求51的方法，其中R₈为=O、=N-OH、=N-O-CH₂-C₆H₅、=NNH-C(=O)-NH₂或=NNH-C(=S)-NH₂。

59．权利要求51的方法，其中R₁为-C(=O)OCH₃、苯二甲酰亚氨基或-NH-SO₂CF₃；R₂为环戊烷基；R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-NO₂)-NH₂；R₇为-CH(CH₃)₂；和R₈为=O。

60．权利要求51的方法，其中R₁为-C≡N；R₂为环戊烷基；R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-NO₂)-NH₂或-(CH₂)₃-NH-C(=N-J)-NH₂；R₇为-CH(CH₃)₂；和R₈为=O。

61．权利要求51的方法，其中R₁为-C≡N；R₂为环戊烷基；R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-NO₂)-NH₂或-(CH₂)₃-NH-C(=N-J)-NH₂；R₇为-CH(CH₃)₂；Q为-CH-R₈；和R₈为=N-NHC(=O)-NH₂、=N-OH、=N-O-CH₃或=N-O-CH₂-C₆H₅。

62．权利要求51的方法，其中R₁、R₂、R₃和R₄选自表1中化合物所示的取代基。

63．权利要求51的方法，其中所述化合物选自表1所示的化合物A-J。

64．权利要求51-63任意之一的方法，其中将所述化合物对哺乳动物施用。

65．权利要求64的方法，其中所述哺乳动物是人。

66．权利要求65的方法，其中所述转化细胞是乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、舌癌细胞、脑癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞或皮肤癌细胞。

67．权利要求51的方法，其中所述转化细胞超量生产Bcl2蛋白，和／或缺乏p53蛋白。

68．一种抑制肿瘤生长的方法，包括使所述肿瘤与下列通式所示的化合物接触：

其中，

R₄为-CH(CH₂-R₇)-Q；

和

其中p和q独立地为2或3；

W为环烷基；

R₅选自-NO₂、-C≡N和-J；

R₆为-(CH₂)_m-NH-C(=NH)-NH-；

J为保护基团；

n为3至10的整数；以及

m为2至5的整数。

69．权利要求68的方法，其中R₁为-C≡N、-C(=O)OCH₃、苯二甲酰亚氨基或-NH-SO₂CF₃。

70．权利要求68的方法，其中R₂为氢和环戊烷基。

71．权利要求68的方法，其中R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-R₅)-NH₂。

72．权利要求68的方法，其中Q为-CH-R₈、-B(OH)₂、-C(=O)C(=O)NH-R₇或具有下列结构：

或

其中W是蒎烷。

73．权利要求68的方法，其中R₅为-NO₂、-C≡N、-PMC、-MTR、-MTS或Tos。

74．权利要求68的方法，其中R₇为-CH(CH₃)₂、-(CH₂)₂-CH₃、-CH₂-CH₃或-C₆H₅。

75．权利要求68的方法，其中R₈为=O、=N-OH、=N-O-CH₂-C₆H₅、=NNH-C(=O)-NH₂或=NNH-C(=S)-NH₂。

76．权利要求68的方法，其中R₁为-C(=O)OCH₃、苯二甲酰亚氨基或-NH-SO₂CF₃；R₂为环戊烷基；R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-NO₂)-NH₂；R₇为-CH(CH₃)₂；和R₈为=O。

77．权利要求68的方法，其中R₁为-C≡N；R₂为环戊烷基；R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-NO₂)-NH₂或-(CH₂)₃-NH-C(=N-J)-NH₂；R₇为-CH(CH₃)₂；和R₈为=O。

78．权利要求68的方法，其中R₁为-C≡N；R₂为环戊烷基；R₃为-(CH₂)₃-NH-C(=N-NO₂)-NH₂或-(CH₂)₃-NH-C(=N-J)-NH₂；R₇为-CH(CH₃)₂；Q为-CH-R₈；和R₈为=N-NHC(=O)-NH₂、=N-OH、=N-O-CH₃或=N-O-CH₂-C₆H₅。

79．权利要求68的方法，其中R₁、R₂、R₃和R₄选自表1中化合物所示的取代基。

80．权利要求68的方法，其中所述化合物选自表1所示的化合物A-J。

81．权利要求68的方法，其中所述肿瘤是实体瘤。

82．权利要求68-81任意之一的方法，其中将所述化合物对哺乳动物施用。

83．权利要求82的方法，其中所述哺乳动物是人。

84．权利要求83的方法，其中所述转化细胞是乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、舌癌细胞、脑癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞或皮肤癌细胞。

85．权利要求84的方法，其中所述转化细胞超量生产Bc12蛋白，和／或缺乏p53蛋白。