MXPA04005585A - Composiciones farmaceuticas a base de timosina alfa 1 para el tratamiento de glioblastomas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones farmaceuticas a base de timosina alfa 1 como adyuvante en combinacion con carmusino (BCNU) en el tratamiento eficaz de glioblastomas malignos.

Description

COMPOSICIONES FARMACEUTICAS A BASE TIMOSINA ALFA-1 PARA EL TRATAMIENTO DE GLIOBLASTOMAS Campo de la Invención La invención se refiere a la timosina alfa-1 como ingrediente activo en composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento de gliblastomas.

Antecedentes de la Invención Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional No. 60/337,149, presentada el 10 de diciembre de 2001. El glioblastoma es el neoplasma maligno del sistema nervioso central primario más común en adultos, y llega casi al 75 por ciento de los casos. Aunque ha habido un progreso constante en su tratamiento, debido a las mejoras en la formación de neuroimágenes, la microcirugía y la radiación, los glioblastomas siguen siendo incurables (McDonald, 2001; Burton, 2000; Prados, 2000). La esperanza de vida promedio es de menos de un año a partir del diagnóstico, y la tasa de sobrevivencia de cinco años después de la terapia agresiva, que incluye resección de tumor grande, es menos del 10 por ciento (Burton, 2000; Nieder, 2000; Napolitano, 1999; Dazzi, 2000). Los glioblastomas provocan la muerte debido al crecimiento rápido, agresivo e infiltrante en el cerebro. El patrón de crecimiento infiltrante es el responsable de la naturaleza no resecable de estos tumores. Los glioblastomas también son relativamente resistentes a la radiación y a la quimioterapia y, por lo tanto, las tasas de recurrencia posterior al tratamiento son altas. Además, la respuesta inmunológica a las células neoplásticas es primordialmente inefectiva en la erradicación completa de las células neoplásticas residuales, después de la resección y de la terapia con radiación (Roth, 1999; Dix, 1999; Sablotzki, 2000). Las células de glioma malignas evaden su detección por el sistema inmunológico del huésped, al producir péptidos inmunosupresores que impiden la proliferación de las células T y la producción de EL-2 (Dix, 1999). El sistema nervioso central también es un tanto inmunoprivilegiado, lo que permite que crezcan sin ser detectadas las células neoplásticas malignas. Todavía en la actualidad continúa la búsqueda de tratamientos efectivos para los glioblastomas en pacientes. La inmunoterapia, o el tratamiento mediante el reclutamiento del sistema inmunológico para que luche contra las células neoplásticas, ha sido investigada en muchos modelos. La fracción 5 del timosin (TF5), el timosin a-1 (timalfasin), el EFN-a y el IL-2 están entre los muchos componentes relacionados con la inmunidad, que han sido estudiados en cuanto a su capacidad para luchar contra los neoplasmas malignos. La carmustina (biscloroetil-nitrosourea, BCNU o BiCNU) es un agente quimioterapéutico de la familia de la cloroetilnitrosourea, que incluye otros agentes quimioterapéuticos, como clorozotien (DCNU) (Anderson, 1975), lomustine (CCNU) (Cárter, 1968), nimustine (Saijo, 1980) y ranimustine (Sekido, 1979). Se han utilizado las cloroetilnitrosoureas como una quimioterapia de tratamiento individual, durante muchos años, en tumores cerebrales primarios; sin embargo, las estadísticas históricas no siempre parecen apoyar la efectividad de estos compuestos como agente individual para tumores cerebrales (por ejemplo, Aquafredda y coautores). La combinación de carmustina más radioterapia produjo un beneficio modesto en una sobrevivencia de largo plazo (18 meses) en pacientes afligidos con glioblastoma maligno, en comparación con la radioterapia sola, si bien la diferencia entre las curvas de sobrevivencia no fue significativa al nivel de 0.05 (Walker, 1980). El timosin a-1 (timalfasin) es un péptido de 28 aminoácidos, una forma sintética de un compuesto que ocurre en la naturaleza, que se encuentra en la circulación (Bodey, 2000, Bodey, 2001). El timalfasin estimula el desarrollo y la diferenciación de los timocitos, la producción de IL-2, los receptores de IL-2 de célula T, IFN-? e IFN-a (Andreone, 2001; Sztein, 1989; Knutsen, 1999; Spangelo, 2000; Tijerina, 1997; Garbín, 1997; Attia, 1993; Cordero, 1992; Baxevamis, 1994 y 1990; Beuth, 2000). Se ha usado timalfasin en ensayos clínicos para tratar la infección por el virus de hepatitis B (Chan, L-Y, 2001); la infección por hepatitis C (Chan, H. L, 2001; Sherman, 1998; Schinazi); los carcinomas del pulmón o de la cabeza y cuello; los melanomas (Bodey, 2000 y 2001 ; Garaci 2000) y el SIDA (Billich, 2002). Los resultados promisorios de estas investigaciones, combinados con la evidencia de capacidad de respuesta reducida de células T a los glioblastomas, condujo al presente trabajo, que evalúa el beneficio terapéutico potencial de la inmunoterapia con timalfasin, para tratar gliomas malignos, y determinar los mecanismos en los que el timalfasin ejerce sus efectos anti-neoplásticos.

Compendio de la Invención Los glioblastomas son neoplasmas malignos en alto grado del sistema nervioso central (SNC), que casi siempre son fatales dentro de los 12 meses a partir del diagnóstico. Estudios recientes demostraron que la inmunoterapia usando citocinas pro-inflamatorias, tales como IL-2 o IL-12, puede prolongar la sobrevivencia de pacientes con glioblastomas. Timosin-a-? (timalfasin) es un péptido tímico que actúa como inmuno-modulador, incrementando la producción de IL-2 y la proliferación de células T. El presente trabajo demostró una carga significativamente reducida de tumor y una respuesta incrementada de las células inflamatorias linfo-mononucleares en sujetos tratados con timalfasin + BCNU, con respecto a todos los demás grupos. Los experimentos in viíro demostraron que el tratamiento con timalfasin no tenía efecto directo sobre la viabilidad ni sobre la función mitocondriana en células 9L cultivadas. Sin embargo, el tratamiento con timalfasin dio por resultado niveles significativamente incrementados de expresión del gene pro-apoptosis, incluyendo FasL, FasR y TNF -ER (65.89 por ciento, 44.08 por ciento y 22.18 por ciento, respectivamente). Además, el tratamiento con timalfasin hizo a las células 9L más sensibles a la tensión oxidante, de manera que las dosis ordinariamente no letales de H202 mataron del 30 al 50 por ciento de las células 9L que habían sido tratadas con timalfasin. Otros estudios revelaron que el timalfasin incrementa la sensibilidad de las células 9L a la muerte mediada por Granzyme B (células T) o por BCNU. Los resultados muestran que el timalfasin aumenta la erradicación de glioblastomas in vivo mediada por cloroetilnitrosourea, y que el timalfasin media sus efectos activando mecanismos pro-apoptosis, haciendo a las células neoplásticas más sensibles a la tensión oxidante y a la muerte por Granzyme B (células T) o quimioterapia.

Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 muestra que el timalfasin tiene efecto mínimo sobre la viabilidad de las células 9L y sobre la función mitocondriana.

La figura 2 muestra la expresión incrementada del gene pro-apoptosis en las células 9L expuestas a timalfasin durante 72 horas. La figura 3 muestra que el timalfasin (THY) hace más sensibles las células de glioblastoma 9L a la muerte por tensión oxidante o por quimioterapia con BCNU. La figura 4 muestra que el timalfasin hace más sensibles las células de glioblastoma de 9L a la muerte mediada por Granzyme B; el panel A muestra el efecto sobre las células expuestas al vehículo o a timalfasin (24 horas aguda, 72 horas crónica); luego , divididas para un tratamiento adicional durante una hora con vehículo; y el panel (B) muestra el efecto sobre células expuestas a vehículo o a timalfasin (24 horas aguda, 72 horas crónica), luego divididas durante un tratamiento adicional de tres horas con vehículo. La figura 5 muestra el desarrollo, en el transcurso del tiempo, de anormalidades clinico-neuropatológicas después de implantar 10,000 células de glioblastoma 9L en el lóbulo frontal derecho de ratas Long Evans adultas. La figura 6 muestra el efecto de BCNU y de BCNU + timalfasin (THY) sobre el avance del glioblastoma in vivo. La figura 7 muestra la carga reducida de glioblastoma y la curación en el 25 por ciento de las ratas tratadas con BCNU + timalfasin (THY).

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas Se ha descubierto ahora que el timalfasin puede potenciar la muerte inmuno-mediada de las células de glioblastoma, lo que hace su uso como un adyuvante, en combinación con un compuesto quimioterapéutico de cloroetilnitrosourea, una terapia efectiva contra el glioblastoma. La invención es aplicable a los péptidos de timalfasin (TAI), incluyendo el TAI que ocurre naturalmente, así como al TAI sintético y al TAI recombinante que tienen la secuencia de aminoácidos del TAI que ocurre naturalmente, secuencias de aminoácidos sustancialmente similares a ella, o una forma de su secuencia abreviada, y sus análogos biológicamente activos, que tienen secuencias con sustituciones, omisiones, alargamiento, reemplazos, o secuencias modificadas de otra manera, que posean bioactividad sustancialmente similar a la del TAI, por ejemplo, un péptido derivado de TAI que tiene homología de aminoácidos suficiente con TAI, de tal manera que funciona sustancialmente de la misma manera, sustancialmente con la misma actividad que TAI. Los estudios in vivo usando un modelo experimental de glioblastoma demostraron que, aunque el tratamiento con BCNU reducía significativamente la carga de tumor, la respuesta era heterogénea, ya que en muchos casos no hubo respuesta detectable. Sin embargo, el tratamiento con timalfasin + BCNU proporcionó beneficio terapéutico importante, tanto con respecto a reducir la carga media de tumor, como en la curación de tumores aproximadamente en el 25 por ciento de los casos. Las reducciones de la carga de tumor, mediadas con timalfasin + BCNU, estuvieron asociadas con infiltrados celulares linfo-mononucleares incrementados, dentro de y en los alrededores de las células neoplásticas en el cerebro. En los casos en que no se pudo encontrar tumor residual, únicamente fueron detectados tejido gliótico cicatrizado e inflamación escasa, asociados con los infiltrados iniciales de células tumorales. Se observó que había curaciones del glioblastoma aproximadamente en el 25 por ciento de los grupos tratados con dosis altas y dosis baj as de timalfasin + BCNU. Un descubrimiento un tanto inesperado fue que los grupos tratados únicamente con timalfasin se comportaron igual o peor que los de control. Frecuentemente los cerebros de ratas tratadas con timalfasin estaban más hinchados y herniados debido a la inflamación y el edema, combinados con la masa tumoral creciente. En estos sentidos, vale la pena hacer notar que las ratas tratadas con la menor concentración de timalfasin + BCNU tuvieron mejores resultados que las tratadas con la mayor concentración de timalfasin + BCNU, puesto que la muerte de las células tumorales fue similar en los dos grupos; pero el edema y el herniado prevalecieron más en el grupo que recibió la mayor concentración de timalfasin. Por lo tanto, el tratamiento con timalfasin solo no erradicó los glioblastomas, y probablemente fue dañino debido al exceso de hinchamiento en ausencia de la muerte concomitante de las células tumorales. Los resultados sugirieron además que el timalfasin tenía poco o ningún efecto citotóxico directo sobre células neoplásticas malignas, y que la muerte de células tumorales adicionales, observada con el tratamiento con timalfasin + BCNU, fue mediada por acciones indirectas del timalfasin. En los cerebros de ratas tratadas con timalfasin, el descubrimiento de densidades incrementadas de células inflamatorias linfo-mononucleares, que fueron caracterizadas predominantemente como células T y macrófagos, sugiere que el timalfasin tiene un papel importante en reclutar células inrnunológicas efectoras para los neoplasmas malignos. Se llevó a cabo una serie de experimentos in vitro para determinar el mecanismo mediante el cual el timalfasin media sus efectos anti-glioblastoma. Los estudios iniciales determinaron que el timalfasin no tenía efectos citotóxicos directos, de importancia, sobre las células del glioblastoma. Lo mismo puede decirse de otros tipos de células, incluyendo las células de neuroblastoma y las neuronas corticales post-mitóticas. Para prolongar estas investigaciones, se evaluó si el timalfasin afectaba adversamente la función celular, y posiblemente las hacía más susceptibles a la apoptosis. Para hacerlo se examinaron los niveles de expresión de los genes pro-apoptosis y pro-sobrevivencia, así como los genes de crecimiento y de economía interna. Esos estudios revelaron que el tratamiento con timalfasin durante 24 o 72 horas daba por resultado niveles significativamente incrementados de genes pro-apoptosis en las células de glioblastoma 9L. Se obtuvieron resultados similares para células de neuroblastoma de Sy5y. En células 293 se notó el mismo fenómeno, excepto que se inhibieron los mecanismo pro-sobrevivencia y que los genes pro-apoptosis no fueron afectados. Estos descubrimientos sugieren que, aunque el timalfasin no tiene efectos citotóxicos directos, puede hacer más sensibles las células a los agentes citotóxicos, al incrementar la expresión basal de los genes pro-apoptosis o reducir la expresión basa] de los genes de sobrevivencia. Para probar esta hipótesis, se determinó si las células tratadas con timalfasin eran más sensibles a la tensión oxidante o a la muerte mediada por cloroetilnitrosourea. Los estudios demostraron que, después de 24 o 72 horas de tratamiento con timalfasin, las concentraciones sub-letales de H202 o de GNU, respectivamente, mataban el 25 por ciento o el 40 por ciento de las células 9L. Por lo tanto, por lo menos algunos de los efectos del timalfasin eran mediados por sus acciones sobre las células neoplásticas, en lugar de deberse en su totalidad a la modulación inmunológica y al reclutamiento de células T y de macrófagos. Se han establecido las propiedades inmuno-moduladoras del timalfasin y de moléculas relacionadas. Sus principales efectos son incrementar la producción de citosina pro-inflamatoria y la proliferación de linfocitos. Los linfocitos T activados matan las células de blanco a través de interacciones FasL-FasR y activando el sistema perforin-granzyme. El descubrimiento de la expresión incrementada de FasL/FasR en células de glioblastoma 9L tratadas con timalfasin sugiere que las células T pudieron matar efectivamente esas células de blanco por medio de las interacciones FasL/FasR. Sin embargo, utilizando un análisis novedoso in vitro, construido con SLO (agente permeabilizante) y Granzyme B en lugar de células T activadas, se demostró que las células de glioblastoma 9L tratadas con timalfasin eran matadas rápidamente por exposición a SLO y a Granzyme B. Estos descubrimientos sugieren que el timalfasin puede promover de manera efectiva la muerte inmuno-mediada de células de glioblastoma, de varias maneras: 1) aumentando los niveles básales de expresión del gene pro-apoptosis, lo que hace a las células más sensibles a la tensión oxidante y a los agentes citotóxicos/quimioterapéuticos; 2) incrementando los niveles de FasR, que podrían interactuar con FasL en las células T activadas, y conducir a apoptosis incrementada; y 3) reclutando células T activadas y macrófagos, e incrementando la muerte de las células tumorales de blanco, mediada por perforin-granzyme. Adicionalmente, los resultados indican fuertemente que el tratamiento de glioblastomas con timalfasin es efectivo cuando se usa en combinación con cloroetilnitrosoureas; pero no como agente único. Los resultados proveen evidencia sustancial de que el timalfasin administrado solo puede ser dañino debido al hinchamiento y la inflamación incrementados con erradicación mínima de células tumorales. Por consiguiente, el papel más adecuado del timalfasin en el tratamiento de los glioblastomas es como agente adyuvante para potenciar la respuesta inmunológica del huésped y erradicar las células tumorales residuales que sobreviven a la quimioterapia convencional. En conclusión, el trabajo descrito aquí demuestra que el timalfasin exhibe efectos anti-glioblastoma que son mediados por medio de varios canales, que incluyen: 1) la modulación de los genes pro-apoptosis/sobrevivencia, lo que conduce a mayor sensibilidad de la célula tumoral a la tensión oxidante o a los agentes citotóxicos/quimioterapéuticos; 2) la promoción de cascadas de muertes de células inmunes, mediada por FasR-FasL; y 3) el incremento en la sensibilidad de la célula de destino a la muerte de la célula inmune mediada por perforin-granzyme. Sin embargo, los efectos terapéuticos del timalfasin con respecto a sus propiedades anti-glioblastoma fueron dependientes de la administración concomitante de cloroetilnitrosoureas, lo que enfatiza que el timalfasin sería mejor adecuado como un inmuno-modulador adyuvante, y no como un agente anti-neoplásico definido. También es probable que cuando se lo combine con otros compuestos quimioterapéuticos, el timalfasin tenga efectos positivos similares para ayudar a reducir la carga tumoral, el avance y las recurrencias, a tasas significativamente mayores que las observadas actualmente con la quimioterapia convencional. La invención es aplicable a timalfasin natural (es decir, que ocurre en la naturaleza), así como a timalfasin sintético y a timalfasin recombinante, que tiene la secuencia de aminoácidos del timosin natural, secuencias de aminoácidos sustancialmente similares a ella, o una secuencia abreviada de ella, y sus análogos biológicamente activos que tienen secuencias con sustituciones, omisiones, alargamientos, reemplazos o modificaciones de otro tipo, que posean bioactividad sustancialmente similar a la del timalfasin. El aislamiento, la caracterización y el uso de timalfasin están descritos, por ejemplo, en la patente estadounidense No. 4,079,127, en la patente estadounidense No. 4,353,821; la patente estadounidense No. 4,148,788 y la patente estadounidense No. 4,116,951. La cantidad de timalfasin necesaria para provocar el grado deseado de potenciación del efecto quimioterapéutico de la BCNU puede ser determinada mediante experimentos rutinarios de titulación de dosis. Se ha descubierto que el timalfasin es seguro para los humanos cuando se administra a dosis de hasta 16 mg/kg de peso de cuerpo/día. Una dosis preferida de timalfasin está en la escala de 0.001 mg/kg de peso de cuerpo/día, a 10 mg/kg de peso de cuerpo/día, siendo la más preferida una dosis aproximada de 0.02 mg/kg de peso de cuerpo/día. La cloroetilnitrosourea puede ser administrada a una dosis aproximada de 90-250 mg/m2, mediante inyección, oralmente, por medio de una oblea biodegradable, o por cualquier otro medio conveniente, conocido en la técnica. Se puede administrar como una sola dosis, o se puede dividir a inyecciones diarias, tales como 75 a 100 mg/m2 en dos días sucesivos. La dosis subsiguiente a la dosis inicial se debe ajustar de acuerdo con la respuesta hematológica del paciente, respecto a la dosis previa. Se deben vigilar semanalmente las cuentas sanguíneas y no se deben administrar cursos repetidos antes de las seis semanas, debido a que la toxicidad hematológica es retardada y acumulativa. Una cloroetilnitrosourea preferida, es la que puede ser administrada a una dosis de 150-200 mg/m2 por vía intravenosa, cada seis semanas. La BCNU también puede ser administrada mediante implantación de obleas biodegradables (por ejemplo, Gliadel, Guilford Pharmaceuticals) directamente en el lecho tumoral. Si la administración se efectúa por medio de oblea biodegradable, se puede combinar convenientemente el timalfasin coadministrado con la BCNU directamente en la oblea.

EJEMPLO 1. Tratamiento con timosin-a? de líneas de células tumorales de 9L y 293 Líneas de células tumorales: Se mantuvieron células de glioblastoma 9L de rata y células de riñon humano 293 en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado con 5 por ciento de suero de ternera fetal (FCS), 2 mM de L-glutamina y 100 µ? de aminoácidos no esenciales (Gibco-BRL, Grand Island, NY). Todas las líneas de células fueron mantenidas a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5 por ciento de C02. Se obtuvo las líneas de células de la American Type Culture Collection, y fueron certificadas libres de patógenos. Tratamiento con timosin-al. Para un tratamiento agudo con timalfasin, se trató células sembradas en placas de 96 concavidades, a una densidad de células de 20,000 células/concavidad, con 10~5 M de timalfasin durante 24 horas. Las células tratadas crónicamente con timalfasin fueron desarrolladas en matraces y tratadas cada 24 horas con 10"5 M de timalfasin (añadido a medio fresco) durante el tiempo que dure el tratamiento (3 días). Además, para la determinación de una curva de dosis-respuesta al timalfasin para las células 9L, se trataron las células con cantidades de timalfasin diluidas seriadamente, lo que produce concentraciones de timalfasin que varían de 50 uM a 0.022 uM. Se usó H202 con las células para inducir tensión oxidante. Las células que habían sido tratadas con timalfasin o con vehículo durante 24 horas, fueron expuestas a H202 a concentraciones que variaban de 9 µ? a 1.8 mM, y luego se las evaluó en cuanto a la viabilidad y la función mitocondriana usando los análisis CV y MTT, como se describen más adelante. En los experimentos en los que se administró a las células cantidades seriadamente diluidas de timalfasin, se usó una cantidad constante de 1.8 mM de H202 para tratar las células. Para las células 9L se desarrolló una curva de H202 a fin de determinar la concentración correcta con la que se traten las células. Se llevó a cabo el análisis MTT en líneas de células 9L y 293 para determinar los efectos del tratamiento con timalfasin y/o la tensión oxidante inducida por H202 sobre la función mitocondriana de las células. Después del tratamiento, se añadieron 10 µ?, de solución MTT a cada concavidad que contenía 100 µL· de medio. Se incubaron las placas con el tinte MTT en la incubadora a 37°C durante 15 minutos a una hora, dependiendo del tipo de célula. Luego se retiró el medio y se añadió a cada concavidad 200 pL de isopropanol ácido. Se sacudió las placas a la temperatura ambiente hasta que ocurrió la lisis de las células, y luego se leyó en una máquina SpectraCount™ de Packard, a 540 nm. También se usó violeta cristal (CV) para teñir las células en las placas de 96 concavidades. Después de desechar el medio se añadió 20 de violeta cristal a cada una de las concavidades y se sacudió a la temperatura ambiente durante 10 minutos. Después se lavaron las placas varias veces con agua tibia y se secaron. Se añadió a cada concavidad de 100 a 200 iL (dependiendo de la densidad de las células) de PBS con 1 por ciento de SDS. Se incubaron las placas a la temperatura ambiente en un sacudidor hasta que las células sufrieron suficiente lisis. Se leyó las placas a 540 nm para detectar las diferencias en la viabilidad de las células entre los diversos grupos probados. Se efectuaron análisis ELISA inmunocitoquímicos de microtitulador (MICE) (de la Monte, 1999) en células 9L y 293. Se sembraron las células en placas de 96 concavidades, se las trató con 10"5 M de timalfasin durante 24 horas y se las histofijó durante la noche, antes de analizarlas usando el análisis MICE. Se permeabilizó las células fijadas con 0.05 por ciento de saponina en solución salina regulada con Tris (50 mM de Tris, pH 7.5, 0.9 por ciento de NaCl; TBS); se bloqueó con Superblock-TBS (Pierce, Rockford, IL, E. U. A.), y luego se incubó durante la noche a 4°C, con anticuerpos primarios para el antígeno nuclear de célula proliferante (PCNA), bcl-2, p21/Wwaf-l, p53, FasL, FasR, TNF-R1 o GAPDH, cada uno diluido a 0.5-1 µg/mL en TBS que contenía 0.05 por ciento de Tween-20 y 0.5 por ciento de albúmina de suero bovino (TBST-BSA). Se detectó la inmunorreactividad usando anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (Pierce, Rockford, IL, E. U. A.) y el substrato soluble en TMB (Pierce, Rockford, EL, E. U. A.) Se detuvieron las reacciones mediante la adición de 1 M de H2S04 y se midió las absorbencias a 450 nm en un lector de microplacas Spectracount (Packard Instrument Co., Meriden, CT, E. U. A.). Posteriormente se midió la densidad de las células mediante tinción de las células adherentes con tinte azul Coomassie, y se midió la absorbencia del tinte eluido (de la Monte, 1999). El índice MICE fue la razón calculada de TMB y la absorbencia de azul Coomassie, medida en la misma concavidad de cultivo. Se usó la media ± S. D. de los resultados obtenidos de 16 concavidades de cultivo duplicadas, para comparaciones estadísticas entre los grupos. Los experimentos primarios, en los que se trataron células 9L durante veinticuatro horas con diversas concentraciones de timalfasin, mostraron una disminución insignificante en el funcionamiento mitocondriano de las células, como se ve por medio de los análisis MTT (figura 1). Se midió la función mitocondriana debido a que la muerte de las células puede estar mediada por disfunción mitocondriana en lugar de por apoptosis o por necrosis. Los estudios demostraron niveles similares de viabilidad y de actividad MTT en el control tratado con vehículo y en los cultivos tratados con timalfasin (figura 1), lo que indica que el timalfasin no tiene efectos citotóxicos directos sobre las células de glioblastoma 9L, consistente con los resultados in vivo. Se obtuvieron resultados similares con respecto a otras líneas de células, incluyendo células 293 de riñon y células SH-Sy5y neuronales (datos no mostrados). Puesto que el timalfasin no tenía efectos citotóxicos directos, se exploró otros mecanismos potenciales mediante los cuales el timalfasin puede funcionar para inhibir el desarrollo de glioblastomas. En este sentido, se examinó la expresión de los productos de genes que promueven ya sea la apoptosis o bien la sobrevivencia de la célula, usando como control la expresión del gene de economía interna. Se llevaron a cabo estudios en placas de 96 concavidades usando el análisis ELISA inmunocitoquímico de microtitulador (MICE) para generar datos a partir de múltiples cultivos duplicados. El tratamiento durante 24 horas con timalfasin dio por resultado niveles significativamente incrementados de FasR (44.08%), FasL (65.89%) y TNF-Rl (22.18%) con respecto a los controles tratados con vehículo (P<0.01, figura 2). En contraste, los niveles de expresión de be 1-2 y GAPDH no fueron afectados de manera significativa por el tratamiento con timalfasin. También se llevaron a cabo estudios usando células 293, que demostraron reducciones de importancia en bel-2 (36.67%, PO.01), pero sin cambios de importancia en los niveles de expresión de FasR, FasL ni de TNF-R1 (datos no mostrados). De tal manera, los resultados de los análisis MICE indican que para las dos líneas de células el timalfasin funciona a través de trayectorias diferentes para incrementar la susceptibilidad de las células a la muerte de la célula por apoptosis. Se buscó la validación de la capacidad del timalfasin para incrementar la susceptibilidad de las células 9L y 293 a la apoptosis, probando la tensión oxidante inducida por H202. Según se determinó a través de análisis MIT, las células 9L tratadas con timalfasin durante 24 horas, y subsecuentemente con H202 durante veinticuatro horas, mostraron en realidad pérdida importante en la viabilidad, en comparación con las células 9L tratadas únicamente con H202 durante veinticuatro horas (figura 3). Las células 9L tratadas con timalfasin y con 270 µ? de H202 mostraron una disminución de 26.6 por ciento en el funcionamiento mitocondriano, como se ve a través de MIT, en comparación con las células 9L tratadas únicamente con 270 µ? de H202 (figura 3). Se obtuvieron resultados similares usando células 293 como blancos en los análisis (datos no mostrados).

EJEMPLO 2.- Estudios de apoptosis inducida por Granzyme Los estudios de análisis MICE descritos en lo que antecede demostraron la expresión de T F-R1, FasL y FasR, inducida por timalfasin, en glioblastomas 9L. A fin de determinar la susceptibilidad diferencial de las células de glioblastoma 9L tratadas (o no tratadas) con timalfasin, a la apoptosis inducida por linfocitos T citotóxicos (CTL), se llevaron a cabo análisis experimentales en los que se trataron células 9L tanto agudamente durante 24 horas, como crónicamente durante 72 horas, con timalfasin, después de lo cual fueron cosechadas, vueltas a sembrar en placas negras de 96 concavidades (7.5 x 105 células/75 µL/concavidad), y se las expuso a 20,000 unidades/mL de estreptolisina O (SLO) más 100 ng de Granzyme B recombinante (volumen de la reacción: 100 µ?,) durante una a tres horas a 37°C. Se usó la SLO en lugar de perforina para permeabilizar las células, y se usó Granzyme B recombinante para estandarizar el análisis. Los estudios de control incluyeron reacciones paralelas en las que se usó SLO, Granzyme B, o ambas fueron omitidas. Se midió la densidad de células viables usando el análisis ATPlite (Packard Instrument Company, Meriden, CT, E. U. A.), que tiene un rango dinámico lineal amplio, que correlaciona unidades de luz relativas con densidades de células, entre 103 y 106 células por concavidad de cultivo Las células neoplásticas malignas son matadas in vivo por células T citotóxicas y macrófagos, que son reclutados por las citocinas pro-inflamatorias, tales como IL-2 e IL-12. Las células T citotóxicas matan mediante la liberación de perforina, que genera agujeros en las membranas de las células de blanco, y Granzyme B, que provoca la destrucción enzimática y la muerte de las células de blanco. Para estudiar el papel potencial del timalfasin en incrementar la muerte mediada por células T, de las células de glioblastoma 9L, se utilizó un análisis in vitro en el que se incubaron células 9L tratadas con timalfasin y tratadas con vehículo, con Granzyme B, en presencia o ausencia de estreptolisina O (agente permeabilizante) durante una o tres horas. Se midió la viabilidad usando el análisis de luminiscencia de ATP y se hicieron comparaciones dentro del grupo para determinar la muerte relativa asociada con el tratamiento con SLO + Granzyme B. Los estudios demostraron reducciones de importancia en la viabilidad de las células en cultivos tratados con timalfasin que estuvieron expuestos a SLO + Granzyme B, con respecto a los cultivos tratados con timalfasin, expuestos a SLO, a Granzyme B o a vehículo únicamente (p<0.001, figuras 4A y 4B). Adicionalmente, las muertes mediadas por Granzyme B aumentaron con el tiempo, como se evidenció por los niveles sustancialmente más altos de pérdidas de células observados en análisis efectuados después de tres horas, en comparación con la incubación durante una hora con SLO + Granzyme B (figuras 4A y 4B). En contraste, los cultivos de control tratados con vehículo exhibieron niveles similares de viabilidad, cuando fueron expuestos a SLO, a Granzyme B, a vehículo o a SLO + Granzyme B. En estos estudios se asoció la exposición aguda (24 horas) a timalfasin con grados significativamente mayores de muertes de células mediadas por Granzyme B + SLO, en comparación con los cultivos incubados con timalfasin durante 72 horas (crónica), antes de los análisis (figura 4).

EJEMPLO 3.- Efecto del timalfasin sobre la viabilidad de las células de cultivos de células neuronales primarias Se estudió cultivos de neuronas corticales primarias para permitir la selección de las dosis de timalfasin que no fueran tóxicas para las células neoplásticas del cerebro. Se midió la viabilidad de las células y la función mitocondriana usando análisis con violeta Cristal (CV) y análisis MTT, puesto que los estudios previos demostraron que las absorbencias de CV y MTT aumentan linealmente con la densidad de las células desde 1 x 104 hasta 5 x 105 células por concavidad (de la Monte, 2001 y 2000). Las células corticales neuronales primarias, tratadas en placas de 96 concavidades con diluciones seriadas de timalfasin (las concentraciones finales varían de 3.3 x 10"5 M a l x 10"9 M) no mostraron disminución en la viabilidad de las células, a las dosis experimentales usadas. La máxima concentración de timalfasin usada (3.3 x 10'7 M) sí mostró una disminución de 30 por ciento en la viabilidad, como se ve por medio del análisis MTT. Sin embargo, esta dosis es más alta que las dosis experimental y clínica establecidas.

EJEMPLO 4.- Tratamiento de glioblastoma de rata in vivo con el adyuvante timalfasin Se obtuvieron células de glioblastoma 9L de rata de la American Type Culture Collection (Washington, D. C, E. U. A.) certificadas libres de patógenos. Se mantuvieron las células en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 5 por ciento de suero de ternera fetal (FCS) y 2 mM de glutamina. No se añadieron antibióticos al medio. Antes de la inyección se enjuagaron las células con solución salina regulada con fosfato (PBS), se desprendieron de las superficies de cultivo y se las disoció a suspensiones de una sola célula con 0.25 por ciento de tripsina/0.05 por ciento de EDTA. Se lavaron tres veces las células disociadas en DMEM libre de suero y finalmente fueron suspendidas en DMEM libre de suero a una densidad de 5 x 106 células viables/mL. Se determinó la densidad de células viables usando la exclusión con azul Trypan y una cámara hemocitométrica. Se diseñaron experimentos para determinar si el timalfasin administrado solo o en combinación con BCNU podía reducir significativamente la carga de glioblastoma, en comparación con el tratamiento con biscloroetilnitrosourea (BCNU). Se generó un modelo de glioblastoma in vivo en ratas Long Evans adultas (250-300 gramos). Se anestesiaron las ratas con una sola inyección intraperitoneal de una mezcla que contenía 100 mg/kg de cetamina y 100 mg/kg de xilazina en etanol al 50 por ciento. Después de anestesiarlas, se les afeitó la cabeza y se las desinfectó con povidone-yodo, y se colocaron las ratas en un bastidor estereotáctico para cabeza. Se hizo una incisión en la línea media y se perforó un agujero de Burr de 3 mm en el lóbulo frontal, y se inyectó directamente en el cerebro 2 µ?. de una suspensión de células de glioma 9L (10,000 células en total), usando una jeringa de Hamilton, con aguja de calibre 26, colocada a una profundidad de 3.5 mm. Después de sacar la aguja se lavó la herida con solución salina estéril; se quitó el animal del bastidor y se cerró la piel con suturas reabsorbibles. Se regresaron las ratas a su jaula y se las observó en busca de algún signo de deterioro, incluyendo pérdida de peso, ingesta reducida de alimento y agua, hemiparesis, ataques o inactividad. Si se observó algún grado de sufrimiento se sometió los animales a eutanasia con 120 mg/kg de pentobarbital sódico. Se observó diariamente los animales y se los pesó semanalmente. Empíricamente, la inyección de 10,000 células 9L mataría el 100 por ciento de los animales dentro de los 26 días de implantación. Se dejó que el tumor se desarrollara durante cinco días, seguidos por el tratamiento antineoplástico. Se dividieron las ratas en seis grupos de tratamiento: control con vehículo, baja dosis de timalfasin (45 µg/kg), alta dosis de timalfasin (200 µg/kg); baja dosis de timalfasin + BCNU; alta dosis de timalfasin + BCNU y BCNU sola (9.4 mg/kg). Se administró la BCNU como una sola inyección intraperitoneal (I. P.) el día 6 después de la inoculación del tumor intracerebral. Se administró a las ratas tratadas con timalfasin una sola inyección I. P. de timalfasin durante tres días consecutivos, comenzando el día 6 después de la inoculación de las células tumorales. Se sacrificó las ratas el día 20 después de la inoculación del tumor. Se mató a las ratas mediante inyección I. P. de 120 mg/kg de pentobarbital sódico. Se cosecharon los cerebros, se seccionaron, se fijaron por inmersión en Histochoice (Amresco Co., Solón, Ohio, E. U. A.), y se los procesó para empapamiento en parafina. Se determinó la carga tumoral a partir de los bloques de tejido en bruto y se tiñeron secciones histológicas con hematoxilina y eosina. También se usaron las secciones histológicas en estudios de tinción inmunohistoquímcos, para detectar infiltrados de células inflamatorias.

El modelo de glioblastoma: La inoculación intracerebral de ratas Long Evans adultas con 10,000 células de glioblastoma 9L de rata produjo de manera reproducible tumores que crecieron progresivamente y provocaron la muerte en el término de 21 días. Se caracterizó el avance del tumor, dependiente del tiempo y los signos clínicos asociados, de la siguiente manera: 1) actividad física incrementada con diámetros de tumor de 4-5 mm el día 7; 2) hiper-sensibilidad el día 14, con diámetros de tumor de 7 a 8 mm y frecuentes hemorragias intratumorales asociadas; y 3) somnolencia con masas tumorales de 10-12 mm, acompañadas por herniado cerebral el día 21 (figura 5). Las secciones histológicas teñidas con hematoxilina y eosina confirmaron la presencia de masas tumorales grandes compuestas de células neoplásticas malignas infiltrantes. Los estudios histopatológicos de secciones coronales, a través de todo el cerebro, demostraron que dentro de los cinco días de inoculación con células 9L, las células neoplásticas formaron masas tumorales pequeñas que estaban localizadas en la corteza superficial y que cubrían las leptomeninges. A los 14 días, las masas tumorales se extendían a estructuras más profundas, que incluían los ganglios básales y las paredes del ventrículo lateral, y asociadas con edema moderado, pero sin producir herniado (desplazamiento de las estructuras de la línea media). Para el día 21 las masas tumorales ocupaban casi todo el lóbulo frontal derecho, con grados variables de extensión hacia el hemisferio contralateral (figura 3). La masa tumoral extensa estaba asociada con edema cerebral notable, con hemorragias y con herniado. Se usó una escala de calificación histológica semicuantitativa para determinar la carga de tumor para comparaciones entre los grupos: 0 = curación, sin tumor residual; 1 = tumor microscópico (<1 mm), confinado a la corteza superficial; 2 = masa tumoral que ocupa menos del 25 por ciento de la sección transversal del hemisferio (1-2 mm); 3 = masa tumoral que ocupa hasta el 50 por ciento de la sección transversal del hemisferio (2-3 mm) y que se extiende dentro de las estructuras profundas; 4 = carga de tumor masiva que involucra del 50 al 90 por ciento de la sección transversal del hemisferio, con herniado. Las secciones fueron codificadas y calificadas simultáneamente por dos individuos diferentes, sin conocimiento del grupo de tratamiento. Para verificar la consistencia en la calificación, se revolvieron todas las muestras y fueron revisadas de nuevo de acuerdo con el código.

Efectos del timalfasin y la BCNU sobre el desarrollo del glioblastoma ("figura 6). Puesto que no se observaron rechazos tumorales espontáneos en los estudios preliminares, se terminaron todos los experimentos el día 20 después de la implantación de las células de glioblastoma 9L. Las ratas tratadas con el vehículo exhibieron el mismo avance de desarrollo de los tumores, dependiente del tiempo, y los mismos signos clínicos que fueron observados en los animales sin tratamiento. Las ratas tratadas con BCNU exhibieron reducciones de importancia en la masa tumoral, con relación a los controles tratados con vehículo. Sin embargo, las respuestas fueron heterogéneas, sin que casi la mitad del grupo manifestara alguna respuesta terapéutica aparente. En el resto de los animales se redujeron las cargas tumorales hasta en un 50 por ciento. Las ratas tratadas únicamente con timalfasin tuvieron tasas desarrollo de tumor y deterioro clínico que fueron similares a las de control. Además, las ratas tratadas con timalfasin tuvieron inflamación intracerebral extrema y grados sustancialmente mayores de herniado (tejido cerebral que sobresale del agujero de Burr), en comparación con todos los demás grupos, inclusive los controles. En contraste, el grupo de timalfasin + BCNU exhibió la más baja carga bruta de tumor con fuerte evidencia de regresión del tumor. Al usar el esquema de calificación estandarizada para determinar la carga de tumor, se demostró que el tratamiento con BCNU sola reducía significativamente la carga de tumor con respecto al tratamiento con vehículo o con dosis altas o bajas de timalfasin (P < 0.001); y que las ratas tratadas con una dosis baja (45 Hg kg) o alta (200 µg/kg) de timalfasin + BCNU tuvieron las más bajas cargas medias de tumor (figura 6). Otros estudios confirmaron la mejora clínica y patológica adicional con cargas de tumor reducidas más tasas de 25 por ciento de curación en el grupo de tratamiento con timalfasin + BCNU (PO.001, figura 7). El análisis histopatológico demostró también la presencia de células inflamatorias linfomononucleares, adyacentes a, y dentro de los focos de tumor. En los cerebros de las ratas tratadas con vehículo o tratadas con BCNU, los infiltrados fueron escasos y estaban distribuidos principalmente en los espacios perivasculares. En las ratas tratadas con timalfasin, con o sin BCNU, los infiltrados de células inflamatorias fueron conspicuos y estuvieron asociados con las masas tumorales, así como con el parénquima adyacente y con las leptomeninges suprayacentes. Los estudios de tinción inmunohistoquímicos identificaron las células como linfocitos T y macrófagos. Las ratas tratadas con dosis altas de timalfasin, con o sin BCNU, tuvieron más inflamación cerebral que las ratas tratadas con bajas dosis de timalfasin. Los estudios histopatológico y de tinción inmunohistoquímica confirmaron la presencia de edema e inflamación más extensas, asociadas con las masas tumorales, en el grupo con elevada dosis de timalfasin.

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Claims (1)

1. Reivindicaciones 1. - Un método para tratar glioblastoma, caracterizado porque comprende administrar una cloroetilnitrosourea en combinación con un péptido timosin-a? (TAI). 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la cloroetilnitrosourea es BCNU. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque se administra la BCNU a una dosis de 150-200 mg/m2. 4. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el péptido (TAI) es timosin-ocl, y se lo administra a una dosis de 0.001 mg/kg de peso de cuerpo/día, a 10 mg/kg de peso de cuerpo/día. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque se administra el timosin-a? a una dosis de 0.02 mg/kg de peso de cuerpo/día.