DE60013777T2

DE60013777T2 - Verfahren zur herstellung von addressierten ligandmatrizen auf einer oberfläche

Info

Publication number: DE60013777T2
Application number: DE60013777T
Authority: DE
Inventors: Thierry Livache; Frederic Lesbre
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1999-02-08
Filing date: 2000-02-08
Publication date: 2005-09-29
Anticipated expiration: 2020-02-09
Also published as: US6962782B1; JP4786034B2; EP1152821B1; DE60013777D1; JP2002538416A; WO2000047317A1; FR2789401A1; FR2789401B1; US20060032750A1; EP1152821A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Matrices von adressierten Liganden auf einem Träger.
Die Liganden können natürliche oder synthetische Produkte sein, die eine biologische Aktivität oder eine Affinität für biologische Moleküle oder andere Moleküle, wie z.B. Peptide, Oligonucleotide, Rezeptoren (Empfänger) oder andere Moleküle von biologischem Interesse aufweisen. Matrices dieses Typs sind auf zahlreichen Gebieten verwendbar, insbesondere für den Nachweis und die Identifizierung von Bestandteilen in biologischen Proben sowie für das Screening (Durchsuchen) von Molekül-Bibliotheken. Derartige Matrices können insbesondere Matrices von Oligonucleotid-Sonden sein.
Stand der Technik
Seit einigen Jahren werden mehrere Verfahren zur Herstellung von Matrices dieses Typs entwickelt. Bekannt sind bisher drei Verfahren, bei denen die Adressierung auf fotochemischem, mechanischem oder elektrochemischem Wege durchgeführt wird.
In dem Dokument von S. Fodor et al., "Science" 1991, 251, Seiten 767-773 [1], ist ein Verfahren zur Herstellung einer Oligonucleotid-Matrix durch fotochemische Adressierung beschrieben. Bei diesem Verfahren geht man von einem Träger aus, der durch funktionelle Gruppen funktionalisiert ist, die durch fotolabile Schutzgruppen geschützt sind, eliminiert anschließend diese Schutzgruppen durch Bestrahlung durch eine Maske hindurch der Stellen, die mit den Molekülen von biologischem Interesse gekuppelt werden sollen, und führt dann die Kupplung dieser Moleküle an die von den Schutzgruppen befreiten funktionellen Gruppen durch.
Diese Art der fotochemischen Adressierung hat den Nachteil, dass eine große Anzahl von unterschiedlichen Masken erforderlich ist, um die Gesamtheit der Kupplungsarbeitsgängen durchzuführen.
In den Dokumenten von K. R. Khrapko et al., "DNA Sequence-I. DNA Sequencing and Mapping", 1991, Band 1, Seiten 375 bis 388 [2] und GB-A-2 319 838 [3] ist ein Verfahren zur Herstellung von Matrices durch mechanisches Adressieren beschrieben. In dem Dokument [2] verwendet man einen Träger, der von einem Polyacrylamidgel bedeckt ist, das man aktiviert, indem man bestimmte Amidgruppen durch Hydrazidgruppen ersetzt. Anschließend fixiert man die aktivierten Oligonucleotide in Form von Aldehyden an den Hydrazidgruppen unter Anwendung einer Methode zur Mikropipettierung von Oligonucleotid-Lösungen an den Stellen, an die sie gekuppelt werden sollen.
Im Falle des Dokuments [3] geht man von einem Träger aus, der durch reaktionsfähige Gruppen funktionalisiert ist, die man an biologisch identische Moleküle kuppelt. Anschließend zerschneidet man den Träger in einzelne Teile, die jeweils einer Kupplung eines Moleküls entsprechen, und vereinigt anschließend auf einer Platte mehrere Teile, die unterschiedliche Moleküle tragen, mit den gewünschten Stellen.
Die Anwendung dieser mechanischen Adressierungs-Methoden hat den Nachteil, dass es erforderlich ist, das zu fixierende Molekül direkt der zu adressierenden Stelle zuzuführen. Daher können die Dimensionen der Stelle nicht kleiner sein als diejenigen des ausgefeilten (ausgegebenen) Tropfens aus dem Reagens. Darüber hinaus umfasst das Verfahren zwei Phasen, bei denen es sich jeweils handelt um eine Austeilungsphase und anschließend um eine kovalente Bindungsphase. Außerdem muss der Träger so modifiziert werden, dass eine kovalente Bindung zwischen dem Träger und dem zu fixierenden Molekül entstehen kann.
In den Dokumenten von T. Livache et al., "Nucleic Acids Res.", 1994, 22, 15, Seiten 2915 – 2921 [4], und WO-A-94/22889 [5] sind elektrochemische Adressierungsmethoden zur Herstellung von Matrices von biologischen Produkten beschrieben.
In diesem Fall geht man von einem Träger aus, der mehrere Elektroden aufweist, und man verwendet diese Elektroden, um die biologischen Moleküle auf elektrochemischem Wege zu fixieren. Zu diesem Zweck taucht man den mit seinen Elektroden ausgestatteten Träger in eine Lösung ein, die das zu fixierende Molekül enthält, und durch Aktivierung der gewünschten Elektroden bedeckt man diese mit dem Molekül auf elektrochemischem Wege. Daher können die Molekül-Abscheidungen nur auf aufeinanderfolgende Weise durchgeführt werden. Darüber hinaus ist es erforderlich, einen Träger, der individuell adressierbare Elektroden trägt, und somit komplexe Systeme, gegebenenfalls multiplexe Systeme, zu verwenden.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es insbesondere, ein Verfahren zur Herstellung von Matrices von biologischen Produkten auf einem Träger anzugeben, bei dem die Nachteile der oben genannten Verfahren vermieden werden und das es darüber hinaus erlaubt, die Adressierung und die Fixierung des biologischen Moleküls in einer einzigen Stufe durchzuführen, ohne dass eine vorherige Funktionalisierung des Trägers erforderlich ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Zur Erreichung des oben genannten Ziels wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung einer Matrix vorgeschlagen, die mindestens einen Liganden umfasst, der auf elektrochemischem Wege auf einem elektrisch leitenden Träger oder auf elektrisch leitenden Zonen eines Trägers fixiert wird, wobei man mindestens ein Element, das den (die) an ein elektroplymerisierbares Monomer gekuppelten Liganden) aus- bzw. verteilen kann, als Elektrode verwendet zur Durchführung einer Synthese auf elektrischem Wege, unterstützt von einem Polymer, das den (die) Liganden auf dem elektrisch leitenden Träger oder auf den elektrisch leitenden Zonen des Trägers trägt.
Erfindungsgemäß verwendet man als Elektrode ein Element, das den (die) Liganden austeilten (verteilen) kann. Dieses Element kann aus einem Reservoir bestehen, das den an das elektropolymerisierbare Monomer gekuppelten Liganden enthält und einen elektrisch leitenden Abschnitt aufweist, oder einfach gebildet wird von einer draht- oder nadelförmigen Elektrode, die nach dem Eintauchen in einen Behälter, der den zu fixierenden Liganden enthält, der an das elektropolymerisierbare Monomer gekuppelt ist, aufgrund der Kapillarwirkung mit diesem Liganden beladen wird.
Durch die erfindungsgemäße Verwendung einer Elektrode, die aus einem solchen Element besteht, kann man den Liganden mit dem elektrisch leitenden Träger oder mit den elektrisch leitenden Zonen des Trägers in Kontakt bringen, ihn dann direkt an dem elektrisch leitenden Träger (oder einer elektrisch leitenden Zone) durch elektrochemische Aktivierung fixieren, indem man beispielsweise eine Potentialdifferenz erzeugt oder einen Strom zwischen dem elektrisch leitenden Träger (oder einer elektrisch leitenden Zone) und dem Element erzeugt, das die Rolle einer Elektrode spielt.
Auf diese Weise wird in einer einzigen Stufe die Austeilung und Fixierung des Liganden an dem Träger durchgeführt.
Bei einer ersten Ausführungsform der Erfindung umfasst das genannte Element ein Reservoir, das mit dem Liganden gefüllt ist und einen isolierenden Verteilungsstutzen bzw. -mundstück sowie mindestens eine in dem Reservoir angeordnete Elektrode umfasst, wobei das genannte Mundstück mit dem elektrisch leitenden Träger oder mit mindestens einer elektrisch leitenden Zone des Trägers bei dem Fixierungs-Arbeitsgang direkt in Kontakt steht.
Das Mundstück kann insbesondere ein Kapillarrohr sein, das man direkt auf die elektrisch leitende Oberfläche aufsetzt.
Bei einer zweiten Ausführungsform der Erfindung umfasst das genannte Element ein Reservoir, das mit dem Liganden gefüllt ist und ein elektrisch leitendes Verteilungs-Mundstück umfasst, wobei der Kontakt zwischen dem elektrisch leitenden Mundstück und dem elektrisch leitenden Träger oder mindestens einer elektrisch leitenden Zone des Trägers durch einen Ligandentropfen gewährleistet wird, der bei der Durchführung des Fixierungsarbeitsganges aus dem Mundstück austritt.
In diesem Fall steht das elektrisch leitende Mundstück nicht in Kontakt mit dem elektrisch leitenden Träger oder der elektrisch leitenden Zone. Wie weiter oben kann das elektrisch leitende Mundstück aus einem Kapillarrohr bestehen.
Bei einer dritten Ausführungsform der Erfindung besteht das genannte Element aus einer Elektrode in Form eines Drahtes oder einer Nadel, der von außen ein Ligand, der an das elektropolymerisierbare Monomer gekuppelt ist, zugeführt wird, wobei der Kontakt zwischen der Elektrode und dem elektrisch leitenden Träger oder einer elektrisch leitenden Zone des Trägers bei der Durchführung der Fixierung durch einen Liganden-Tropfen gewährleistet wird, der von der Elektrode aufgenommen wird.
Bei den vorstehend beschriebenen verschiedenen Ausführungsformen enthält das Reservoir im Allgemeinen eine Lösung des zu fixierenden Liganden und ein oder mehrere Reagentien, die gegebenenfalls erforderlich sind, um die Fixierung des Liganden auf elektrochemischem Wege zu gewährleisten.
Erfindungsgemäß wird insbesondere die elektrochemische Fixierung des Liganden dadurch sichergestellt, dass man ihn an ein elektropolymerisierbares Monomer kuppelt. In diesem Fall kann die Lösung den an das elektropolymerisierbare Monomer gekuppelten Liganden, das elektropolymerisierbare Monomer und gegebenenfalls ein Dotierungsmittel enthalten.
Das elektropolymerisierbare Monomer kann insbesondere eines derjenigen sein, wie sie von S. Emr und A. Yacynych in "Electroanalysis", 1995, 7, Seiten 913 – 323 [7] beschrieben sind. Sie können zu zwei Kategorien gehören, d.h. zu denjenigen, die zu elektrisch leitenden Polymeren führen, wie z.B. Pyrrol, Anilin, Thiophen... und ihren Derivaten, und zu denjenigen, die zu isolierenden Polymeren führen, wie z.B. Derivate von Phenol oder Benzol.
In diesem Fall wird die Fixierung des Liganden durch Elektrocopolymerisation des Monomers und des an das Monomer gekuppelten Liganden erzielt.
Der Ligand kann beispielsweise ein Oligonucleotid, ein Nucleotid, eine Aminosäure oder ein Peptid sein.
Ein solches Verfahren zur elektrochemischen Fixierung ist in dem Dokument [5] beschrieben für den Fall, dass der Ligand ein Oligonucleotid oder ein Nucleotid ist.
In dem zuletzt genannten Fall kann man nach Durchführung der Fixierung die Kette des fixierten Oligonucleotids oder Nucleotids verlängern durch Anwendung von klassischen Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden durch aufeinanderfolgendes Aneinanderkuppeln der gewünschten Nucleotide, wobei man jedoch bei dem fixierten letzten Nucleotid eine elektrochemische Entfernung der Schutzgruppe durchführt.
Im Falle von Peptiden kann man die gleiche Methode anwenden, um die Peptid-Kette durch Ankuppeln der gewünschten Aminosäuren zu verlängern.
Die Verwendung der vorstehend beschriebenen Elektroden zur Durchführung der Abscheidung und Fixierung eines Liganden auf elektrochemischem Wege bietet die folgenden Vorteile:

– das Verfahren zur Abscheidung und Fixierung wird in einer einzigen Stufe durchgeführt und es läuft sehr schnell ab;
– diese Methode ist leicht durchzuführen, weil darin einfach eine mechanische Abscheidungstechnik angewendet wird, beispielsweise durch Verschiebung mit Hilfe einer Mikropipette, wobei man diese jedoch mit den Möglichkeiten der räumlichen Auflösung der Elektrochemie koppelt;
– diese Technik erlaubt die Durchführung mehrerer Abscheidungen im parallelen Modus;
– darüber hinaus ist bei diesem Verfahren die Verwendung von modifizierten Trägern oder von Trägern, die individuell adressierbare Elektroden tragen, nicht erforderlich.

Im Falle eines Trägers aus einem elektrisch leitenden Material kann dieser vollständig aus einem elektrisch leitenden Material hergestellt sein oder er kann aus einem isolierenden Material bestehen, das von einer Schicht aus einem elektrisch leitenden Material bedeckt ist.
Als elektrisch leitende Materialien können solche verschiedener Typen verwendet werden, es kann sich dabei handeln unter anderem um Metalle, wie z.B. Gold, Silber und Platin, um elektrisch leitende Oxide, wie das Indium/Zinn-Oxid (ITO), um Kohlenstoff oder um elektrisch leitende organische Polymere.
Für den Fall, dass der Träger elektrisch leitende Zonen umfasst, können diese aus den oben genannten elektrisch leitenden Materialien gebildet werden und auf einem isolierenden Träger angeordnet werden. Der isolierende Träger kann beispielsweise aus Glas, aus Silicium oder aus einem Kunststoffmaterial bestehen. Man kann auch einen Träger aus einem elektrisch leitenden Material verwenden, dessen elektrisch leitende Zonen durch Abscheidung eines isolierenden Materials auf der Oberfläche des elektrisch leitenden Materials voneinander abgegrenzt sind.
Erfindungsgemäß können die elektrisch leitenden Zonen elektrisch miteinander verbunden sein oder sie können individuell oder in Gruppen elektrisch adressierbar sein, um getrennt aktiviert werden zu können.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in der Weise durchgeführt werden, dass man gleiche oder verschiedene Liganden an verschiedenen elektrisch leitenden Stellen des Trägers fixiert.
In diesem Fall kann man eine gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Fixierung der gleichen oder verschiedenen Liganden durchführen durch Verwendung mehrerer Elemente, welche die jeweiligen identischen oder verschiedenen Liganden verteilen (zuteilen). In diesem Fall können mindestens zwei Elemente miteinander vereinigt werden zur Bildung eines Druckkopfes.
Bei einer Ausfführungsvariante der Erfindung führt man eine aufeinanderfolgende Fixierung von mindestens zwei verschiedenen Liganden an verschiedenen Stellen des Trägers durch, indem man ein einziges Element verwendet, wobei man jedoch mindestens einmal den von diesem Element abgegebenen Liganden austauscht.
Bei allen vorstehend beschriebenen Ausführungsformen beruht der Hauptvorteil auf dem Ligandenverteilungs-Kupplungs-Verfahren, das die extrem schnelle Herstellung von Trägern, die adressierte Moleküle tragen, erlaubt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann unter Verwendung einer Vorrichtung zur Herstellung einer Ligandenmatrix auf einem elektrisch leitenden Träger oder auf elektrisch leitenden Zonen eines Trägers durchgeführt werden, wobei die Vorrichtung umfasst:

– mindestens eine Einrichtung zur Austeilung eines Liganden, der mit einem elektrisch leitenden Abschnitt ausgestattet ist,
– Einrichtungen, um einerseits den elektrisch leitenden Träger oder die elektrisch leitenden Zonen des Trägers und andererseits den elektrisch leiten den Abschnitt der Austeilungseinrichtung mit einem elektrischen Generator zu verbinden, und
– Einrichtungen, um den Träger und/oder die Verteilungseinrichtungen) nacheinander anzuordnen und/oder zu verschieben und auf diese Weise miteinander in Kontakt zu bringen, um mehrere Liganden-Abscheidungen auf dem Träger an unterschiedlichen Stellen zu erzeugen.

Die Verteilungseinrichtung kann ein Reservoir, das den Liganden enthält, und mindestens eine in dem Reservoir angeordnete Elektrode umfassen, die den elektrisch leitenden Abschnitt der Einrichtung darstellt.
Bei einer speziellen Vorrichtung umfasst diese mehrere Einrichtungen zur Verteilung der miteinander kombinierten Liganden in Form eines Druckkopfes.
Bei einer Ausführungsvariante umfasst die Vorrichtung zur Herstellung einer Matrix von Liganden auf einem elektrisch leitenden Träger oder auf elektrisch leitenden Zonen eines Trägers:

– eine Einrichtung zur Verteilung eines Liganden, der aus einer Elektrode in Form eines Drahtes oder einer Nadel besteht, die von außen mit dem Liganden beladen werden kann,
– Einrichtungen, um einerseits den elektrisch leitenden Träger oder die elektrisch leitenden Zonen des Trägers und andererseits die Elektrode mit einem elektrischen Generator zu verbinden und
– Einrichtungen, um den Träger und/oder die Elektrode nacheinander so anzuordnen und/oder zu verschieben, dass mehrere Abscheidungen des Liganden auf dem Träger an verschiedenen Stellen erzeugt werden.

Weitere Charakteristika und Vorteile der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung, welche die Erfindung nur erläutert, ohne sie jedoch zu beschränken, unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen hervor.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 zeigt in schematischer Form ein Element, das ein Reservoir zur Verteilung eines Liganden und mindestens eine Elektrode zum Fixieren des Liganden auf einem elektrisch leitenden Träger umfasst.
Die 2 stellt ein Element dar, das analog zu demjenigen der 1 ist, zur Durchführung der Fixierung eines Liganden auf einem elektrisch leitenden Träger, der mit elektrisch leitenden Zonen ausgestattet ist, die elektrisch miteinander verbunden sind.
Die 3 zeigt in vergrößertem Maßstab das Mundstück (den Kegel) des Verteilungsreservoirs der 1 zur Durchführung der Fixierung des Liganden auf einem Träger, der multiplexierte elektrisch leitende Zonen umfasst.
Die 4A und 4B erläutern die Stufen, die zur Durchführung der Fixierung eines Liganden auf einem elektrisch leitenden Träger unter Verwendung einer Elektrode in Form eines Drahtes erforderlich sind.
Die 5 zeigt ein Verteilungselement, das mit einem Flüssigkeitseinlass und einem Flüssigkeitsauslass ausgestattet ist, um seine Füllung und seine Entleerung zwischen zwei Arbeitsgängen zur Fixierung von unterschiedlichen Liganden zu gewährleisten.
Die 6 zeigt in schematischer Form einen Druckkopf, der mehrere Reservoirs zur Verteilung von gleichen oder verschiedenen Liganden umfasst.
Detaillierte Beschreibung der Ausführungsformen
In der 1 ist die erste Ausführungsform der Erfindung dargestellt, bei der man als Elektrode ein Element verwendet, das ein Reservoir 1, das mit dem zu fixierenden Liganden gefüllt ist, und ein Verteilungsmundstück 1a umfasst. Im Innern des Reservoirs 1 sind eine Gegenelektrode 3, die beispielsweise aus Platin oder aus Gold hergestellt ist, und eine Bezugselektrode 5 angeordnet.
Das Reservoir kann ein Reaktionsvolumen enthalten, das ausreicht, um eine bestimmte Anzahl von Abscheidungen zu gewährleisten, die beispielsweise bis zu 1000 betragen können. Bei dieser ersten Ausführungsform, die in der 1 dargestellt ist, verwendet man einen elektrisch leitenden Träger 7, der ein Substrat aus Glas umfassen kann, das von einer Goldschicht bedeckt ist.
In dieser Figur sind die Abscheidungen 9 dargestellt, die mit einem solchen Reservoir durchgeführt wurden, wobei man beispielsweise den Träger entlang den Richtungen x und y zwischen zwei Abscheidungen verschob. Für den Fall, dass das Mundstück 1A des Reservoirs, das beispielsweise die Form einer Kapillarröhre haben kann, aus einem isolierenden Material hergestellt ist, kann dieses auf den elektrisch leitenden Träger 7 aufgesetzt werden und durch Erzeugung einer Potential-Differenz oder eines Stroms zwischen der elektrisch leitenden Oberfläche 7 und der Gegenelektrode 3 kann man Abscheidungen 9 erhalten, die durch einen elektrischen Impuls auf der elektrisch leitenden Oberfläche 7 fixiert werden können. In diesem Fall wird die Dimension der Abscheidungen 9 durch die Dimensionen der Reservoir/Träger-Grenzfläche festgelegt, die in den elektrischen Feldlinien zwischen der Elektrode und der elektrisch leitenden Oberfläche liegt. Diese Grenzfläche muss die kleinst mögliche sein, um die Dimension der erhaltenen Abscheidung zu vermindern.
Das Reservoir der 1 kann außerdem ein Mundstück 1a aus einem elektrisch leitenden Material aufweisen. In diesem Fall führt man die Fixierung des in dem Reservoir vorhandenen Liganden durch, indem man den Kontakt zwischen der elektrisch leitenden Oberfläche 7 und der durch das Mundstück 1a gebildeten Elektrode gewährleistet mittels eines Tropfens, der das Mundstück 1a verlässt. In diesem Fall werden ebenfalls die Dimensionen der Abscheidungen durch die Grenzfläche zwischen der Flüssigkeit und der elektrisch leitenden Oberfläche gesteuert, die in den elektrischen Feldlinien vorhanden ist.
Man kann die Auflösung der Abscheidungen 9 verbessern, indem man, wie in der 2 dargestellt, einen Träger verwendet, der aus miteinander verbundenen elektrisch leitenden Zonen besteht. In der 2 dienen die gleichen Bezugsziffern wie in der 1 für die Bezeichnung des Reservoirs 1, das mit seinem Mundstück 1a ausgestattet ist, einer Bezugselektrode 5 und einer Gegenelektrode 3. In diesem Fall besteht der Träger aus einem isolierenden Träger 11, der mit elektrisch leitenden Zonen ausgestattet ist, die gegeneinander isoliert sind, jedoch elektrisch miteinander in Verbindung stehen. Diese elektrisch leitenden Zonen können aus Gold sein auf einem Träger beispielsweise aus Glas oder Silicium. In diesem Fall erhält man die Abscheidungen 9, indem man oberhalb der elektrisch leitenden Zonen den Liganden verteilt, wobei jedoch nur die elektrisch leitenden Zonen, die mit dem Liganden in Kontakt stehen, von diesem bedeckt werden können. Auf diese Weise wer den die Dimensionen der Abscheidungen durch die Dimensionen der elektrisch leitenden Zonen 13 bestimmt.
In diesem Fall umfasst der verwendete elektrisch leitende Träger in Wirklichkeit nur eine einzige Elektrode; dies vereinfacht sehr stark seine Herstellung und seine Herstellungskosten können sehr niedrig sein, da einfache Folien aus einem Kunststoffmaterial, das von einem elektrisch leitenden Material bedeckt ist, verwendet werden können.
Die Verwendung eines Netzwerks von elektrisch leitenden Zonen erlaubt die Herabsetzung der Größe der Abscheidungen 9, jedoch nicht die Erhöhung der Dichte der Matrix. Diese Dichte hängt nämlich direkt von der Dimension der Grenzfläche zwischen dem Kapillarmundstück 1a und dem Träger ab und sie ist begrenzt durch die Dimensionen des Mundstücks.
Man kann jedoch die Dichte der Matrix erhöhen durch Verwendung eines Trägers, der elektrisch leitende Zonen umfasst, die Multiplex-Elektroden bilden, wie in der 3 dargestellt.
In der 3 sind das Mundstück 1a des Reservoirs 1 der 1 und 2 in einem vergrößerten Maßstab und ein Teil eines isolierenden Trägers 11, der mit elektrisch leitenden Zonen 13 ausgestattet ist, die einzeln mit Einrichtungen zum Anlegen eines Potentials oder eines Stroms ausgestattet sind, um sie getrennt aktivieren zu können, dargestellt. In diesem Fall werden die Dimensionen der Abscheidungen durch die Dimensionen der aktivierten elektrisch leitenden Zonen 13 bestimmt, wie dies im Falle der 3 ersichtlich ist. Die anderen elektrisch leitenden Zonen, die mit dem Liganden in Kontakt stehen, können nicht zu einer Fixierung des letzteren führen, da sie nicht elektrisch aktiviert sind. Auf diese Weise kann man gleichzeitig eine hohe Dimensionsauflösung und eine hohe Dichte der Matrixbildung erreichen.
In den 4A und 4B ist eine andere Ausführungsform der Erfindung dargestellt, bei der das Element, das den Liganden verteilen kann, aus einer Elektrode in Form eines Drahtes 15 besteht.
In diesem Fall kann man einen elektrisch leitenden Träger 7 verwenden, wie in 4A dargestellt. Zur Durchführung der Abscheidung des Liganden wird die Elektrode 15 zunächst in einen Behälter 17 eingetaucht, der den zu fixierenden Liganden enthält, und sie nimmt dadurch einen Tropfen 19 dieses Liganden auf. Anschließend überführt man die Elektrode, die den Tropfen 19 des Liganden aufweist, in eine Position oberhalb des elektrisch leitenden Trägers 7, wie in der 4B dargestellt, wobei man den elektrischen Kontakt mittels des Tropfens 19 herstellt. Durch Anlegen eines elektrischen Impulses zwischen der Elektrode 15 und dem elektrisch leitenden Träger 7 wird die Bildung von Abscheidungen 9 des Liganden gewährleistet.
Nach diesem Arbeitsgang spült man die Elektrode 15 in einem Spülbehälter 21, sodass sie erneut für die Herstellung einer weiteren Abscheidung 9 entweder mit dem gleichen Liganden oder mit einem anderen Liganden dienen kann. Wenn man diesen Elektroden-Typ verwendet, kann die Auflösung der Abscheidungen weniger gut sein, in diesem Fall ist jedoch die Leichtigkeit der Spülung der Elektrode 15 ein bestimmender Vorteil.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist sehr interessant, weil es einerseits die Verwendung eines sehr geringen Volumens des Reaktionsmediums und damit die Einsparung an zu kuppelnden Molekülen von biologischem Interesse erlaubt. Darüber hinaus kann man die Dimensionen der erzeugten Abscheidungen auf dem Träger steuern, während im Falle von Verfahren zur mechanischen Adressierung, die klassische chemische Aktivierungsverfahren erfordern, die Dimension der Abscheidungen nicht unter 50, sogar nicht unter 100 μm liegen kann.
Erfindungsgemäß kann man die Dimension der Abscheidungen sehr leicht verringern, nicht durch Herabsetzung der Größe des Tropfens, was in der Praxis schwierig durchzuführen ist, sondern durch Verkleinerung der Oberfläche der elektrisch aktivierbaren Zone. Die Auflösung der Abscheidungen wird nämlich optimiert durch den Umstand, dass nur die Elektroden/Träger-Grenzfläche, die in den elektrischen Feldlinien liegt, aktivierbar ist; d.h., wenn ein Tropfen über diese Zone hinaus geht, wird sein Gehalt an der elektrisch leitenden Oberfläche nicht fixiert.
Wenn der Durchmesser der Grenzfläche zwischen den Mundstücken 1a und dem elektrisch leitenden Träger 200 μm beträgt, und man eine elektrisch leitende Zone verwendet, die eine Seitenlänge von nur 10 μm hat, kann nur diese elektrisch leitende Zone von den Molekülen von biologischem Interesse bedeckt sein kann.
Erfindungsgemäß kann man auf einem Träger Abscheidungen 9 aus verschiedenen Liganden erzeugen. Diese können erhalten werden, indem man nacheinander mindestens zwei verschiedene Liganden auf verschiedenen Stellen des Trägers fixiert, wobei man von einem einzigen Element ausgeht und den durch dieses Element verteilten Liganden austauscht. In diesem Fall können die Abscheidungen nacheinander durchgeführt werden entweder durch Austausch des Inhalts des Reservoirs 1 der in den 1 und 2 dargestellten Elemente oder durch Verwendung der Elektrode der 4, die man in verschiedene Reagentien eintaucht. Man kann auch ein festes Reservoir verwenden, das mit Einrichtungen zur Einführung und zum Abziehen des Liganden ausgestattet ist, d.h. das ein Flüssigkeitssystem zum Einlass und Auslass des Liganden aufweist, um den Inhalt des Reservoirs zu verändern, ohne dieses zu verschieben.
Die 5 erläutert eine solche Ausführungsform des Reservoirs 1, die mit einem Flüssigkeitseinlass 1b und einem Flüssigkeitsauslass 1c ausgestattet ist.
Selbstverständlich kann man zur Herstellung von Abscheidungen 9 von identischen oder unterschiedlichen Liganden auch mehrere Elemente verwenden, beispielsweise diejenigen, wie sie in den 1 und 4 dargestellt sind. Diese Elemente können gegebenenfalls zusammengefügt werden zur Bildung eines Druckkopfes, wie er in der 6 dargestellt ist.
In dieser 6 erkennt man, dass der Druckkopf ein erstes Reservoir R1, das mit einem Liganden P1 gefüllt ist, ein zweites Reservoir R2, das mit dem Liganden P2 gefüllt ist, und ein drittes Reservoir R3, das mit dem Liganden P3 gefüllt ist, umfasst. Mit einem Mehrfachkopf dieses Typs kann man auf der elektrisch leitenden Oberfläche 7 gleichzeitig drei Abscheidungen 9 erzeugen, die jeweils aus den Liganden P1, P2 und P3 bestehen.
Es sei darauf hingewiesen, dass die Abscheidungen in einer inerten Atmosphäre oder in einem flüssigen Medium, das elektrochemisch neutral und, wenn möglich, mit dem in dem Reservoir enthaltenen Reaktionsmedium nicht mischbar ist, durchgeführt werden können.
Nach der Phase der Abscheidung kann der Träger gespült und auf klassische Weise verwendet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung von Oligonucleotid- oder Peptid-Matrices, wobei man von Oligonucleotiden oder einem Peptid ausgeht, die (das) eine Pyrrol-Gruppe tragen (trägt), die (das) man auf einem elektrisch leitenden Träger fixiert, indem man sie (es) auf elektrochemischem Wege mit Pyrrol copolymerisiert nach dem in dem Dokument WO-A-94/22889 [5] beschriebenen Verfahren.
Beispiel 1
1 – Herstellung von Trägern, die Oligonucleotide tragen
Bei den verwendeten elektrisch leitenden Trägern handelt es sich um Glasplatten, die von einer Chromschicht (zur Verbesserung der Adhäsion) und einer zusammenhängenden, 0,5 μm dicken Schicht aus Gold bedeckt sind. Diese Schicht wird mit dem Auslass der "Arbeitselektrode" eines Potentiostaten EGG 283 verbunden.
Zwei verschiedene Oligonucleotide, die in der 5'-Stellung eine Pyrrol-Gruppe tragen, werden auf diesen Trägern copolymerisiert. Ihre Sequenzen sind die folgenden:
Sie wurden hergestellt nach dem von Livache et al. in dem Dokument [5] beschriebenen Verfahren.
Um diese Oligonucleotide auf dem Träger zu fixieren, verwendet man ein Reaktionsmedium, das 0,1 M LiClO₄, 20 mM Pyrrol und 1 μM Oligonucleotid mit einer Pyrrolgruppe in 5'-Stellung umfasst.
Diese Lösung wird in ein Reservoir aus Polypropylen mit konischer Form eingeführt, das eine Gegenelektrode aus Platin (CE) enthält, die mit dem Potentiostaten verbunden ist. Dieses Reservoir lässt sich leicht füllen unter Verwendung eines Mikropipette mit einem Volumen, das von 50 bis 1000 μl Reaktionsmedium variieren kann. Das Ende dieses Konus (Kegels) hat einen Durchmesser von etwa 0,8 mm. Feinere oder gröbere Konen erlauben die Verwendung von anderen Reagens-Volumina.
Das Ende des Konus (Kegels) wird mit der elektrisch leitenden Oberfläche in Kontakt gebracht und das Copolymer wird durch cyclische Voltametrie (von –0,35 bis +0,85 V/CE bei einer Geschwindigkeit von 100 mV/s) hergestellt. Die aufgenommene Ladung erlaubt die Festlegung der Dicke des gebildeten Polymers. Nach der Bildung dieser ersten Abscheidung wird der Kegel entleert, gespült, dann mit einem neuen Reaktionsmedium, das ein anderes Oligonucleotid enthält, gefüllt. Die elektrisch leitende Platte wird verschoben (Tabelle x/y/z) und es wird der gleiche Copolymerisations-Arbeitsgang auf einer anderen Stelle der elektrisch leitenden Oberfläche durchgeführt, der die Herstellung einer Abscheidung ermöglicht, die eine andere Oligonucleotid-Sequenz trägt.
Auf diese Weise stellt man zwei Matrices her, die nur Oligonucleotide pyrM5 umfasst, und zwei Matrices, die nur Oligonucleotide pyrCP aufweisen.
Man überprüft, ob die auf diese Weise erhaltenen Oligonucleotid-Matrices die gewünschten Eigenschaften für den Nachweis der komplementären Oligonucleotide durch Hybridisierung aufweisen.
2 – Hybridisierung der Oligonucleotide und Nachweis derselben
Die getesteten komplementären Oligonucleotide sind die folgenden:

biotinyliertes komplementäres –M5 : M5_compbio;
biotinyliertes komplementäres –CP: CP_compbio.

Die Hybridisierung der komplementären Oligonucleotide läuft ab in einem Puffer PBS (Sigma), der 0,5 M NaCl, 100 μg/ml DNA von Lachssperma (Sigma), 10 mM EDTA und 10 nM komplementäres Biotinyl-Oligonucleotid enthält. Die Hybridisierung wird bei 45 °C in einem Volumen von 20 μl 15 min lang durchgeführt. Danach wird eine schnelle Spülung mit PBS/NaCl durchgeführt. Der Nachweis der Hybride erfolgt dann nach der Inkubation in einer PBS/NaCl-Lösung, die 0,1 mg/ml R-Phycoerythrin (Molekül-Sonde) enthält. Die Fluoreszenz wird durch eine gekühlte Kamera (Hamamatsu) nachgewiesen, die auf einem Epifluoreszenz-Mikroskop montiert ist. Die Ergebnisse sind ausgedrückt in Grau-Stufen.
Man beobachtet einen Fleck von Polypyrrol mit einem Durchmesser von etwa 0,8 mm, dessen Fluoreszenz-Stärke nachstehend angegeben ist:

– Oligonucleotid auf dem Träger pyrM5 hybridisiert mit M5_compbio :110
– Oligonucleotid auf dem Träger pyrM5 hybridisiert mit CP_compbio : 5
– Oligonucleotid auf dem Träger pyrCP hybridisiert mit M5_compbio : 7
– Oligonucleotid auf dem Träger pyrCP hybridisiert mit CP_compbio : 84

Man stellt so eine hohe Spezifität der Hybridisierung und ein hohes Signal/Rausch-Verhältnis fest.
Beispiel 2
Zur Herstellung von Matrices der Oligonucleotide pyrM5 und pyrCP wiederholt man den gleichen Arbeitsmodus wie in Beispiel 1, wobei man diesmal jedoch als elektrisch leitenden Träger einen Träger aus einem Kunststoffmaterial verwendet, der von einem Indium/Zinn-Oxid (ITO) bedeckt ist.
Die mit diesen Matrices für den Nachweis der biotinylierten komplementären Oligonucleotide erhaltenen Ergebnisse sind die folgenden:

– Oligonucleotid auf dem Träger pyrM5 hybridisiert mit M5_compbio : 95
– Oligonucleotid auf dem Träger pyrM5 hybridisiert mit CP_compbio : 5
– Oligonucleotid auf dem Träger pyrCP hybridisiert mit M5_compbio : 7
– Oligonucleotid auf dem Träger pyrCP hybridisiert mit CP_compbio : 105

Beispiel 3
In diesem Beispiel führt man den gleichen Arbeitsmodus durch wie in Beispiel 1 zur Herstellung einer Matrix der Oligonucleotide pyrM5 auf einem Träger aus Gold, das auf Glas aufgebracht ist, man verwendet jedoch als Gegenelektrode einen Platin-Draht, der mit Reaktionsmedium beladen ist, anstelle des Reservoirs, das im Innern mit einer Platinelektrode ausgestattet ist.
Wie in der 4A dargestellt, wird der Platindraht 15 mit dem Reaktionsmedium beladen durch Eintauchen in ein Reservoir 17, das dieses Medium enthält. Der den Tropfen 19 tragende Draht wird anschließend an den Träger angenähert bis zum Kontakt mit dem Tropfen. Dann wird ein elektrochemischer Impuls erzeugt. Der Draht wird entfernt, dann mit Wasser gespült. Die übrigen Abscheidungen werden auf die gleiche Weise erzeugt. Man erhält so Abscheidungen mit einem Durchmesser von etwa 1 mm und es ist eine starke Fluoreszenz feststellbar, wenn man die Matrix zur Durchführung der Hybridisierung des komplementären Oligonucleotids verwendet. Die erhaltenen Ergebnisse sind die folgenden.

– Oligonucleotid auf dem Träger pyrM5 hybridisiert mit M5_compbio : 400
– Oligonucleotid auf dem Träger pyrM5 hybridisiert mit CP_compbio : 10

Beispiel 4
Auf die gleiche Weise können Peptide abgeschieden werden. Pyrrol-Peptide werden nach dem von T. Livache et al. in "Biosensors and Bioelectronics" 13, (1998) Seiten 629–634 [6] beschriebenen Verfahren synthetisiert. Sie werden nach dem üblichen Verfahren (Beispiel 1) abgeschieden. Die beiden Peptide ACTH (18-39) und ACTH (11-24) werden anschließend durch die biotinylierten Antikörper Mab (34-39) bzw. Mab (18-24) nachgewiesen.
Die Fluoreszenz-Ergebnisse nach der Inkubation mit dem Streptavidin Phycoerythrin sind die folgenden:
Zitierte Literaturstellen

[1]: Fodor S. et al. "Science", 1991, 251, Seiten 767–773.
[2]: Khrapko K. R. et al. "DNA Sequence-I.DNA "Sequencing and Mapping", 1991, Band 1, Seiten 375–388.
[3]: GB-A-2 319 838.
[4]: Livache T. et al. "Nucleic Acids Res.", 1994, 22, 15, Seiten 2915–2921.
[5]: WO-A-94/22889.
[6]: T. Livache et al, "Biosensors and Bioelectronics" 13, (1998), Seiten 629–634.
[7]: Emr, S. und Yacynych, "A. Electroanalysis", 1995, 7, Seiten 913–923.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Matrix mit wenigstens einem elektrochemisch auf einem leitenden Träger oder auf leitfähigen Zonen eines Trägers fixierten Liganden, bei dem man wenigstens ein Element verwendet, das fähig ist, den (die) mit einem elektropolymerisierbaren Monomer als Elektrode gekoppelten Liganden zu verteilen, um eine elektrisch unterstützte Synthese eines Trägerpolymers des (der) Liganden auf dem leitenden Träger oder auf den leitfähigen Zonen des Trägers zu realisieren.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das genannte Element durch einen Speicher gebildet wird, der den mit dem elektropolymerisierbaren Polymer gekoppelten und einen leitfähigen Teil umfassenden Liganden enthält.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der Speicher mit Einrichtungen zum Einfüllen und Ausgeben des Liganden ausgestattet ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das genannte Element durch eine draht- oder nadelförmige Elektrode gebildet wird, in die der mit dem elektropolymerisierbaren Monomer gekoppelte Ligand von außen eingespeist wird, wobei der Kontakt zwischen der Elektrode und dem leitenden Träger oder einer leitfähigen Zone des Trägers während der Fixierungsoperation durch einen von der Elektrode zurückgehaltenen Tropfen des Bindungspartners hergestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem man simultan oder sukzessive gleiche oder unterschiedliche Liganden auf verschiedenen leitfähigen Stellen des Trägers fixiert, indem man mehrere jeweils gleiche oder unterschiedliche Liganden verteilende Elemente benutzt.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem wenigstens zwei der Elemente vereinigt sind, um einen Druckkopf zu bilden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem man sukzessiv wenigstens zwei unterschiedliche Liganden auf verschiedenen Stellen des Trägers fixiert, indem man ein einziges Element benutzt und den durch dieses Element verteilten Liganden wenigstens einmal austauscht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die leiffähigen Zonen durch Zonen aus leiffähigem Material gebildet werden, realisiert auf einem isolierenden Träger.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Zonen aus leiffähigem Material elektrisch miteinander verbunden sind.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Zonen aus leiffähigem Material elektrisch adressierbar sind, einzeln oder gruppenweise, um getrennt aktiviert werden zu können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, bei dem das leiffähige Material aus der Gruppe ausgewählt wird, die gebildet wird durch Gold, Silber, Platin, Indiumoxid und Zinn (ITO), Kohlenstoff und leitfähige organische Polymere.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem jedes Element eine Lösung des Liganden verteilt, die den mit dem elektropolymerisierbaren Monomer gekoppelten Liganden, das elektropolymerisierbare Monomer und eventuell einen Dotierstoff umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 12, bei dem das elektropolymerisierbare Monomer Pyrrol ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 13, bei dem man die Fixierung des Liganden durch Elektropolymerisation des Monomers und des mit dem Monomer gekoppelten Liganden realisiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, bei dem der Ligand ein Nukleotid, ein Oligonukleotid, eine Aminosäure oder ein Peptid ist.