DE4444037A1

DE4444037A1 - Diagnostische Methode zur Vorhersage von Veranlagungen zu Schäden des menschlichen und tierischen Bewegungsapparates

Info

Publication number: DE4444037A1
Application number: DE4444037A
Authority: DE
Inventors: Peter Wehling; Julio Reinecke
Original assignee: Orthogen Gentechnologie GmbH
Current assignee: Orthogen Gentechnologie GmbH
Priority date: 1994-12-10
Filing date: 1994-12-10
Publication date: 1996-06-13

Description

DNA für den Test wird aus Blut gewonnen. Diese DNA (ca. 0.1 µg bis 1 µg) wird einer zyklischen Primer Extension Reaktion in einem Thermo Cykler un terworfen. Diese Reaktion erfolgt unter folgenden Bedingungen:

1-5 Units einer thermostabilen DNA-Polymerase
125-300 µM jedes der 4 Desoxyribonukleotide (dATP, dCTP, dGTP, TTP oder modifizierte Nukleotide)
0.1-2 µM jedes der beiden Reaktions-Primer
geeigneten Pufferbedingungen (1-2 mM MgCI, pH 8.8 bei 25°C)
Wasser bis zum gewünschten Gesamtvolumen, überschichtet mit hoch reinem Paraffin

Reaktionsbedingungen

Diese Bedingungen sind in jedem Labor zu optimieren.

Die in diesem Verfahren wird ein bestimmter Abschnitt von ca. 90 Basenpaa ren Länge des VDR-Gens im Bereich zwischen Exon 7 und der 3′ untransla tierten Region zu einer großen Stückzahl vermehrt. Die produzierten DNA- Fragmente werden anschließend einem Verdau mit diagnostisch aussagekräf tigen Restriktionsendonukleasen (Bsml, EcoRV, Taql, Apal) unterzogen.

Dieser Verdau führt zu DNA-Fragmenten von ca. 650 bzw. ca. 250 Basen paaren, die auf einem Agarose-Gel (0.8%-1.8% w/v) elektrophoretisch ge trennt werden können. Das durch anschließende Fluoreszenzfärbung des Gels entstehende DNA-Bandenmuster ermöglicht eine Zuordnung der Patien tenallele nach b (Bsml Schnittstelle) oder B (keine Bsml Schnittstelle): (Ab bildung 3). Das Ergebnisses wird durch ein Polaroidphoto oder eine Videoauf nahme dokumentiert.

In Abhängigkeit von der Dosis von B (Heterozygot/Homozygot siehe Abb. 3) hat der Patient ein statistisch erhöhtes Risiko zu einem früheren Zeitpunkt seines Lebens an Osteoporose zu erkranken.

Das Auftreten eines spezifischen Vitamin D Rezeptor Gen Allels (B) ist mit einer verminderten Knochendichte der Lendenwirbel korreliert: Entwicklung eines schnellen und zuverlässigen Diagnoseverfahrens.

Dr. rer. nat. J. Reinecke, P.D. Dr. med. P. Wehling ORTHOGEN Gentechnologie GmbH, Graf Adolf Str. 43, 40210 Düsseldorf, FRG

Einleitung

ORTHOGEN hat ein Verfahren entwickelt, weiches eine schnelle und zuverlässige Dif ferenzierung zwischen den Vitamin D Rezeptor (VDR) Gen Allelen B und b möglich ist. Wir führten eine Studie durch, in der die Korrelation von niedriger Knochenmasse mit einem bestimmten Allel nachgewiesen wurde.

Osteoporoseprophylaxe ist möglich. Deshalb ist die Vorhersage der Knochendichte der Lendenwirbelsäule von großer klinischer Relevanz.

Material und Methoden

28 Patienten wurden für die Untersuchung ausgewählt. Sekundäre Osteoporosen wur den ausgeschlossen. Die Lendenwirbelsäulen Knochendichte wurde mit Computertomo graphie bestimmt. Aus Blutproben der Patienten wurde DNA nach Standardprotokollen isoliert. PCR wurde mit einem Thermocycler und Primern (modifiziert nach Morrison et al.) mit 30 Thermocycles vorgenommen.

Die Größe des amplifizierten DNA-Fragments beträgt routinemäßig 0.85 Kilo-Basen paare (kb). Diese Fragmente wurden mit BsmI nach Herstellerangaben restriktionsver daut. Nach Gelelektrophorese auf einem 1.5% Agarosegel bei 150V/300A für 30 Minu ten wurden die Ergebnisse mit einer Polaroidkamera dokumentiert. Die Zuordnung zu den entsprechenden Allelen wurde anhand der auftretenden Restriktionsfragmente vor genommen.

Ergebnisse

Lendenwirbel-Knochendichte in Prozent des respektiven Altersdurchschnitts als Funk tion des Lebensalters bei weiblichen Deutschen mit den Allelen BB bzw. bb. Der Un terschied in der alterskorrigierten Knochendichte ist signifikant (BB/bb 75.4% ±19.4 zu 94.5% ±16.0, p<0.009, df 26). Alterszusammensetzung der beiden Gruppen ist ver gleichbar (Alter BB/bb 57.2 ±9.1 zu 55.3 ±13.8, p<0.67, df 26).

Diskussion

Die Wechselwirkung Knochendichte/Vitamin D3 ist etabliert. Es gibt Belege für eine Wirkung bestimmter Vitamin D Rezeptor Gen-Allele auf den Serum Osteocalcinspie gel. Das VDR-Gen hat Homologie zu anderen Genen der Glucocorticoid Rezeptor Fa milie. Deshalb erscheint es möglich, daß der VDR via Homo- und Heterodimensierung einen Einfluß auf die Steuerung anderer Gene ausübt.

Eine Assoziation verschiedener Allele des VDR Gens mit reduzierter Knochendichte gesunder Individuen ist beschrieben worden. Diese Allele sind Korreleiert mit DNA- Endonuklease Restriktionsstellen für BsmI, ApaI und TaqI. Von diesen Schnittstellen in nicht kodierenden Bereichen des Gens hat die BsmI Schnittstelle die höchste Aussage kraft. Wir zeigen hier, daß diese Korrelation auch bei erkrankten Individuen von Bedeu tung sein könnte.

Die Ergebnisse der Versuche sind in den Fig. 1 und 2 graphisch dargestellt. Es zeigen:

Fig. 1

Lendenwirbel-Knochendichte in Prozent des jeweiligen Altersdurchschnitts als Funk tion des Lebensalters bei weiblichen Deutschen mit den VDR-Allelen BB. Alters korrigierte Knochendichte für homozygot BB 75.4% ±19.4. Alterszusammensetzung der BB-Gruppe 57.2 ±9.1

Fig. 2

Lendenwirbel-Knochendichte in Prozent des jeweiligen Altersdurchschnitts als Funk tion des Lebensalters bei weiblichen Deutschen mit den VDR-Allelen bb. Alterskor rigierte Knochendichte für homozygot bb 94.5% ±16.0. Alterszusammensetzung der bb-Gruppe 55;3 ±1 3.8.

(Der Unterschied der alterskorrigierten Knochendichte ist signifikant (BB / bb 75.4% ±19.4 zu 94.5% ±16.0. p<0.009. df 26). Die Alterszusammensetzung der bei den Gruppen ist vergleichbar (Alter BB / bb 57.2 ±9.1 zu 55.3 ±13.8. p<0.67. df 26).

Fig. 3

Schematische Darstellung der verschiedenen VDR Gen Allele differenziert durch zy klische Primer Extension und anschließende BsmI Spaltung. Elektrophoretische Auf trennung der DNA Fragmente auf einem 1.5% Agarose-Gel durch Färbung mit Ethi diumbromid 0.5 µg/ml.

Spur 1: DNA Fragmente nach zyklischer Primer Extension
Spur 2: DNA Fragmente Genotyp bb (homozygot) nach BsmI Verdau
Spur 3: DNA Fragmente Genotyp bB (heterozygot) nach BsmI Verdau
Spur 4: DNA Fragmente Genotyp BB (homozygot) nach BsmI Verdau.

Claims

1. Verwendung von molekularbiologischen Methoden zur Testung menschlicher und tierischer Gene in Bezug auf Defekte, die zu Erkrankungen des Bewegungsapparates führen.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Methode die De tektion von Veranlagungen zu degenerativen, immungesteuerten (z. B. entzündlichen) und stoffwechselbedingten Erkrankungen erlaubt.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Gene betroffen sind, die für die Produktion von Mediatoren (auch im Sinne von Hormonen), Enzymen, Strukturmono-, -oligo-, oder -polymeren, Rezeptoren oder/und Zelloberflächende terminanten kodieren.

4. Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Gendefekte (Mutationen) mit Hilfe von Southern Blot, zyklische Primer Extension, Hybridisierung, Sequenzierung und DNA-Endonuklease Verdau festgestellt werden.

5. Verwendung nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in der Methode eine thermostabile DNA-Polymerase, spezifische Polymerisations Primer, alle 4 natür lichen oder auch modifizierte Desoxyribonukleotide, Proben-DNA und diagnostisch re levante DNA-Restriktionsenzyme verwendet werden.

6. Verwendung nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in der Methode Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit einer DNA Fluoreszenz- oder Sil berfärbung benutzt wird.

7. Verwendung nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Methode ei ne schnelle Detektion von relevanten Mutationen im Vitamin D Rezeptor Gen (VDR- Gen) ermöglicht.

8. Verwendung nach Anspruch 1 bis 7 , dadurch gekennzeichnet, daß die Methode durch die Definierung der VDR-Gen Allele zu einer Vorhersage des statistischen Oste oporoserisikos für individuelle Patienten führt.