DE4427394A1 - Testverfahren zur Identifizierung von Substanzen, die auf den Serotonin-5-HT-1¶D¶-Rezeptor wirken - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein funktionelles Test­ verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die auf den Serotonin-5-HT-1_D-Rezeptor wirken.

Der Neurotransmitter Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) spielt eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl physiologischer Funktio­ nen, hinsichtlich kognitiver Fähigkeiten oder auch im Bereich des Verhaltens. Störungen der serotonergen Reizübertragen sind invol­ viert in zahlreiche pathologische Zustände wie Depression, Mi­ gräne, Bluthochdruck oder Bulimie. Serotonin entfaltet seine phy­ siologische und pathophysiologische Wirkung über Rezeptoren, die Serotonin mit unterschiedlicher Affinität binden. Diese Rezep­ toren können in 4 Klassen unterteilt werden: 5-HT₁, 5-HT₂, 5-HT₃, 5-HT₄. Diese Unterteilung reflektiert sowohl unterschiedliche Re­ zeptorkopplung als auch unterschiedliche Rezeptorbindungsprofile für eine Reihe von 5-HT-Rezeptorliganden. Bei Nagetieren sind mindestens 4 Subtypen der 5-HT₁-Rezeptorsubklasse beschrieben (5-HT_1A bis 5-HT_1D). Alle 5-HT-Rezeptoren besitzen hohe Affinität zu Serotonin (Ki < 100 nm) und sind über G-Proteine an Adenylat­ zyklase oder Phospholipase C gekoppelt.

Bislang gibt es keine Antagonisten, die selektiv für die 5-HT-Re­ zeptor-Subklasse spezifisch sind. Alle bekannten Antagonisten binden mit hoher Affinität an mindestens eine weitere Klasse von Neurotransmitter-Rezeptoren.

Das klassische Screening nach Substanzen mit Wirkung auf Rezep­ toren beruht auf Rezeptorbindungsassays. Nach diesem Vorgehen läßt sich allerdings nichts über die Funktion von identifizierten Wirksubstanzen (Antagonismus, Agonismus) aussagen. Diese Infor­ mation muß erst in komplexeren in vitro-Modellen (z. B. radio­ aktive cAMP-Bestimmung) bzw. in aufwendigen Tierversuchen er­ arbeitet werden.

Es bestand daher die Aufgabe, Testsysteme zur Verfügung zu stel­ len, die es erlauben, geeignete Substanzen mit agonistischen oder antagonistischen Eigenschaften zu Serotonin-5-HT-1_D-Rezeptoren zu identifizieren.

Diese Aufgabe wurde gelöst durch das erfindungsgemäße Testver­ fahren zur Identifizierung von Substanzen, die auf den Seroto­ nin-5-HT-1_D-Rezeptor wirken, welches die folgenden Schritte um­ faßt:

• a) Transfektion einer Wirtszelle, die einen Serotonin-5-HT-1_D- Rezeptor rekombinant stabil exprimiert, mit einem rekom­ binanten Vektor, der
  • a1) einen Promotor enthält, der durch Erhöhung intra­ zellulärer Botenstoffe aktiviert wird, und
  • a2) ein Reportergen, funktionell mit dem in a1) beschriebenen Promotor verknüpft, trägt,
• b) Etablieren von Zellen nach Schritt a), die
  • b1) den unter Schritt a) beschriebenen Vektor transient ent­ halten, oder
  • b2) den unter Schritt a) beschriebenem Vektor stabil integriert enthalten,
• c) Exposition der Zellen aus Schritt b) mit der zu testenden Substanz,
• d) Messung der Expression des Reportergens in den Zellen nach Schritt c).

Das Grundprinzip der Erfindung beruht auf der Kopplung der durch Ligandenbindung induzierten Rezeptoraktivierung und der damit verbundenen Induktion der Signaltransduktionskette (z. B. cAMP- Generierung) an ein hochsensitives Reportersystem.

Das Reportersystem besteht aus einem Konstrukt, das einen Promo­ tor enthält, der durch Änderung der Konzentration an intra­ zellulären Botenstoffen ("second messengers") aktivierbar ist. Vorzugsweise kommen hier Promotoren zum Einsatz, die auf Calcium, cAMP, cGMP oder Phosphoinositolphosphat (PIP) ansprechen.

Diese Promotoren regulieren Gene, deren Genprodukt leicht meßbar ist. Vorzugsweise kommen hierbei Reportergene wie Luziferase, Chloramphenicolacetyltransferase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase zum Einsatz.

Im ersten Schritt a) des erfindungsgemäßen Testverfahrens wird eine Wirtszelle ausgewählt, die einen Serotonin-5-HT-1_D-Rezeptor rekombinant stabil exprimiert.

Als Wirtszelle für die Expression eines Serotonin-5-HT-1_D-Rezep­ tors eignet sich besonders die HEK-293-Zellinie.

Geeignete Wirtszellen und deren Herstellung sind beispielsweise aus WO 92/11362 bekannt.

In einem weiteren Schritt wird ein rekombinanter Vektor herge­ stellt, der einen Promotor trägt, welcher abhängig von der Konzentration an intrazellulären Botenstoffen reguliert wird. Unter intrazellulären Botenstoffen oder "second messengers" sind insbesondere Calcium, cAMP, cGMP und Phosphoinositolphosphat zu verstehen.

Unter einem solchen Promotor ist der Sequenzbereich zu verstehen, der alle, für die "second messenger"-kontrollierte Transkription notwendigen Elemente umfaßt. Darunter fallen sowohl Elemente der basalen Transkriptionskontrolle, wie die "TATA-box" und die "CCAAT-box", als auch Elemente der induzierbaren Transkriptions­ kontrolle, wie Bindungssequenzen für "second messenger"-abhängige Transkriptionsfaktoren, sogenannte "response elements" (REs).

Hierbei kann es sich um Calcium-REs, cAMP-REs, cGMP-REs oder Phosphoinositolphosphat-REs handeln. Die Sequenz dieser REs und die an sie bindenden Faktoren sind bekannt, so z. B. für das cAMP response element binding protein (CREB) (Montminy, M.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 6682-6686, 1986).

Die für die Erfindung geeigneten Promotoren können sowohl natür­ lich vorkommende sein, wie z. B. der Promotor des Somatostatin­ gens, des fos-Gens, des HIV-1 LTRs oder des vasoactive intestinal peptide (VIP)-Gens, oder aus mehreren verschiedenen Genpromotoren künstlich zusammengesetzt sein.

Dies kann beispielsweise über Fusion und Ligation synthetischer Oligonukleotide erfolgen. Bevorzugt wird die Fusion mehrerer cAMP response elements mit dem basalen Cytomegalovirus IE-Genpromotor durchgeführt.

An diesen zusammengesetzten Promotor wird ein Reportergen funk­ tionell angeknüpft. Reportergene sind solche Gene, deren expri­ miertes Genprodukt ein leicht meß- bzw. quantifizierbares Signal liefert.

In der Regel sind geeignete Reportergene Gene für solche Pro­ teine, die mit gängigen Methoden nachweisbar sind. Bevorzugt wer­ den als Reportergene Gene für Enzyme verwendet, die eine leicht nachweisbare Reaktion katalysieren.

Besonders geeignete Reportergene sind die Gene für Chlorampheni­ col-Acetyl-Transferase (CAT) oder Luziferase.

Die funktionelle Verknüpfung von zusammengesetztem Promotor und Reportergen bedeutet, daß die Transkription des Reportergens unter der Kontrolle des "second messenger"-abhängigen Promotors erfolgt.

Die Transformation einer Wirtszelle durch den rekombinanten Vek­ tor (Schritt a)) kann durch alle gängigen Transformationsver­ fahren, z. B. Elektroporation, Calciumphosphat oder Liposomen ver­ mittelte Transfektion erfolgen. Besonders gut geeignet für die Transformation ist die in Beispiel 2 benutzte Liposomen ver­ mittelte Transfektion.

Nachdem die Wirtszelle mit dem rekombinanten Vektor transformiert worden ist, werden in einem weiteren Schritt b) solche Zellen weiterbenutzt, die den Vektor entweder transient oder stabil integriert exprimieren.

Unter transienter Expression versteht man eine Expression von nur begrenzter Dauer (etwa 24-48 h). Für die stabile Expression integriert der Vektor in das Genom der Wirtszelle.

In einem weiteren Schritt c) werden die im Schritt b) isolierten Zellen den zu testenden Substanzen zusammen mit dem spezifischen Serotonin-5-HT-1_D-Rezeptor-Liganden (z. B. 5-CT (Carboxaminotrypt­ aminmaleat)) ausgesetzt.

Dies geschieht dadurch, daß die zu testenden Substanzen üblicher­ weise in einer Konzentration von 10^-3M bis 10^-6M sowie 5-CT übli­ cherweise in einer Konzentration von 10^-8M dem serumfreien Zell­ kulturmedium zugesetzt werden.

Die zu testenden Substanzen bleiben in der Regel 2 bis 24 Stunden mit den 5-CT-stimulierten Wirtszellen in Kontakt. Anschließend werden die Zellen lysiert und für die Auswertung der Reportergen- Expression vorbereitet, wie es in Beispiel 3 angegeben ist.

Die Expression des Reportergens in einer mit einer Testsubstanz behandelten Testzelle wird gemessen und verglichen mit einer Kon­ trolle, bei der die gleiche Zellinie lediglich mit 5-CT stimu­ liert wurde. Durch Vergleich der beiden Meßwerte läßt sich sofort eine Aussage darüber machen, ob die getestete Substanz die Repor­ tergenexpression und somit die 5-CT-Serotonin-5-HT-1_D- Rezeptor-Interaktion beeinflußt.

Entscheidender Vorteil der vorliegenden Erfindung ist ein Test­ verfahren, das direkt, mit hoher Sensitivität und hoher Durch­ satzrate funktionelle Daten bzgl. Wirkung von Substanzen auf Serotonin-5-HT-1_D-Rezeptoren liefert (Antagonismus, Agonismus). Dadurch wird es ermöglicht, ein effektives Massenscreening nach Substanzen durchzuführen, die auf Serotonin-5-HT-1_D-Rezeptoren wirken.

Die Erfindung wird durch folgende Beispiele weiter veran­ schaulicht.

Beispiel 1 Konstruktion des zusammengesetzten Promotors und Fusion mit dem Reportergen

• a) Ausgehend von dem käuflichen Reporterkonstrukt pMAMneo-luc (Fa. Clontech, Kat.No.6171-1) wurde ein Enhancer/Promotor­ freies Reporterplasmid konstruiert. Dazu wurde der die regu­ latorischen Sequenzen des RSV-LTRs und des MMTV-LTRs enthal­ tende Bereich in pMAMneo-luc durch Restriktionsspaltung mit NdeI und NheI deletiert und durch einen Polylinker, der die Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme NdeI, MluI, NotI, SpeI und NheI enthält, ersetzt. Das so entstandene Reporterplasmid pneoLuc dient somit der Aufnahme regulato­ rischer Sequenzen in die Polylinkerregion.
  Der zusammengesetzte Promotor wurde aus vier synthetischen Oligonukleotiden hergestellt:
• b) SEQ ID NO: 1 entspricht der Promotorregion des humanen Cyto­ megalovirus Immediate Early Gens von Position -67 bis +1 (Hennighausen L.G., Fleckenstein B.; EMBO J. 5, 1367-1371, 1986).
  Zusätzlich enthält SEQ ID NO: 1 zwei Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen: am 5, Ende für NotI, am 3′ Ende für SpeI.
  SEQ ID NO: 2 entspricht dem Gegenstrang zu SEQ ID NO: 1.
• c) SEQ ID NO: 3 entspricht der vierfachen Wiederholung des cAMP response elements des vasoactive intestinal peptide (VIP) Gens (Tsukada, T. et al. J.Biol.Chem. 262, 8743-8747, 1987).
  Zusätzlich enthält SEQ ID NO: 3 zwei Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen: am 5′ Ende für NdeI, am 3′ Ende für NotI.
  SEQ ID NO: 4 entspricht dem Gegenstrang zu SEQ ID NO: 3.
• d) Zur Herstellung des rekombinanten Vektors wurden SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 hybridisiert und NotI/SpeI gespalten, sowie SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 hybridisiert und NdeI/NotI ge­ spalten. Beide Produkte wurden dann in den mit NdeI und SpeI linearisierten Vektor pneoLuc aus Beispiel 2a) kloniert. Diese Klonierungsstrategie hat die richtige, d. h. funktio­ nelle Orientierung der Einzelkomponenten zur Folge.
  Durch Deletion des BglII/HindIII Restriktionsfragments aus pneoLuc wurde das NeoR-Gen so verkürzt, daß es nicht mehr funktionell war. Dies war notwendig, da die zu transfizieren­ den Wirtszellen bereits über den Serotonin-5-HT-1_D-Rezeptor Vektor gegen Neomycin resistent waren und somit eine entspre­ chende Selektion nicht möglich war. Die Selektion nach stabi­ len Transformanden erfolgte durch eine Kotransfektion mit einem Vektor, der ein Hygromycinresistenzgen trägt (Strata­ gene) durch Kultivierung in Hygromycin-haltigem Medium (Bei­ spiel 2).

Beispiel 2 Transformation und Selektion einer stabilen Testzellinie

HEK-293-Zellen wurden in DMEM-Medium mit 10% FCS in einer Zell­ dichte von 1×10⁶ Zellen in 10 cm-Petrischalen eingesät und über Nacht kultiviert.

Die Transfektion erfolgte mit 2 µg Vektor-DNA in 10 µl Transfectam (Promega Nr. E 1231), aufgenommen in 2 ml serumfreiem Medium über 6 Stunden. Danach erfolgte ein Überführen in serumhaltiges Me­ dium. Nach weiteren 42 Stunden wurden die Zellen in Selektions­ medium überführt.

Zellen, die den Vektor nach Schritt b) stabil exprimieren, wurden durch Selektion in Medium, dem 50 µg/ml Hygromycin zugesetzt wurde, erhalten.

Beispiel 3 Durchführung des Tests

Zellen gemäß Beispiel 2 wurden in Mikrotiterplatten (Packard "Viewplate" Nr. 600-5182) eingesät (Zelldichte 1×105 Zellen/well; DMEM-Medium mit 10% FCS) und nach 16 Stunden in serumfreies Medium überführt. Nach weiteren 4 Stunden wurden Verdünnungen der zu testenden Substanzen zusammen mit 10^-8M 5-CT + 100 µM IBMX zugegeben. Kontrollzellen wurden nur mit 5-CT behandelt.

Nach 2-16 Stunden Inkubation wurden die Zellen durch Zugabe von 30 µl/well Lysispuffer (25 nM Tris-Phosphat, pH 7,8; 2 mM DTT; 2 mM 1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N′,N′-tetraessigsäure; 10% Glycerol; 1% Triton X-100) aufgeschlossen (15 min. Raumtemperatur).

Zu diesem Zellextrakt wurden 50 µl Luziferase Assay Substrate (270 µM Coenzym A, 470 KLM Luciferin, 530 µM ATP) zugegeben. Die Messung der Luziferase-Aktivität kann in herkömmlichen Luminometern durchgeführt werden; vorzugsweise erfolgt die Messung in einem 2D-Luminometer der Firma Hamamatsu.

Beispiel 4 Einsatz des Testsystems im Massenscreening

Das Assaysystem gemäß Beispiel 3 wird eingesetzt für das "Random Screening" nach Substanzen, die spezifisch die Interaktion von 5-CT mit dem Serotonin-5-HT-1_D-Rezeptor beeinflussen.

Substanzen, die im Screening verwendet werden sollen, werden in µM Konzentrationen in DMSO gelöst und in geeigneten Verdünnungen gemäß Beispiel 3 im Test eingesetzt.

Claims (3)

1. Testverfahren zur Identifizierung von Substanzen, die auf den Serotonin-5-HT-1_D-Rezeptor wirken, welches die folgenden Schritte umfaßt:

• a) Transfektion einer Wirtszelle, die einen Serotonin- 5-HT-1_D-Rezeptor rekombinant stabil exprimiert, mit einem rekombinanten Vektor, der
  • a1) einen Promotor enthält, der durch Erhöhung intra­ zellulärer Botenstoffe aktiviert wird, und
  • a2) ein Reportergen, funktionell mit dem in a1) be­ schriebenen Promotor verknüpft, trägt.
• b) Etablieren von Zellen nach Schritt a), die
  • b1) den unter Schritt a) beschriebenen Vektor transient enthalten, oder
  • b2) den unter Schritt a) beschriebenem Vektor stabil integriert enthalten,
• c) Exposition der Zellen aus Schritt b) mit der zu testenden Substanz,
• d) Messung der Expression des Reportergens in den Zellen nach Schritt c).

2. Testverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Reportergen in Schritt a2) Luziferase verwendet wird.

3. Testverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Zelle in Schritt a) die Zelle HEK-293 verwendet wird.