DE69731292T2 - Promotorelemente, welche wurzel-bevorzugte genexpression verleihen - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen Mechanismen der Genexpression in Pflanzen und im Besonderen die Expressionsregulation von Genen in Pflanzen in einer "gewebebevorzugten" Art und Weise. Es wird ein Verfahren zur Isolierung von transkriptionalen Regulationselementen, die zur gewebebevorzugten Genexpression beitragen, offenbart. Es werden transkriptionale Regulationselemente, isoliert unter Verwendung dieser Methode, gezeigt, um gewebebevorzugte Genexpression von Genen innerhalb bestimmter Gewebe einer Pflanze zu steuern. Es werden DNA-Moleküle gezeigt, die gewebebevorzugte transkriptionale Regulationselemente und Vektoren darstellen, umfassend besagte DNA-Moleküle. Besagte transkriptionale Regulationseinheit wird letztendlich verwendet werden, um gewebebevorzugte Expression mindestens eines Gens zu steuern, das einer Pflanze einen selektiven Vorteil verleiht.
  • Beschreibung des zugehörigen Standes der Technik
  • Die Genexpression umfasst eine Anzahl von Schritten vom DNA-Templat zum Endprotein oder Proteinprodukt. Die Initiierung der Transkription eines Gens wird im Allgemeinen als der vorherrschende Kontrollfaktor im Bestimmen der Genexpression verstanden. Die Transkriptionskontrollen sind im Allgemeinen auf relativ kurze Sequenzelemente verbannt, eingebettet in die 5'-flankierende oder Upstream-Region des transkribierten Gens mit welchem DNA-Bindeproteine interagieren können. Diese DNA-Sequenzelemente dienen dazu, die Bildung von transkriptionalen Komplexen zu begünstigen und eventuell Genexpressionsprozesse auszulösen. Eine Anzahl von Laboratorien haben Promotorelemente und korrespondierende DNA-bindende Proteine identifiziert, die auf spezifische Gewebe innerhalb der Pflanze begrenzt sind (Weising, et al. Z. Naturforsch C 46: 1; Oeda, et al. EMBO J. 10: 1793; Takatsuji, et al. EMBO J 11: 241; Yanagisawa, et al. Plant Mol. Biol. 19: 545; Zhou, et al. J. Biol. Chem. 267: 23515; Consonni, et al. Plant J. 3: 335; Foley, et al. Plant J. 3: 669; Matsuoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 9586). Es ist wahrscheinlich, dass eine große Anzahl von DNA-bindenden Faktoren auf spezifische Gewebe, Umweltbedingungen oder Entwicklungsstadien begrenzt sein werden. Von den Fachleuten wird es als wichtig angesehen, transkriptionale Regulationseinheiten zu entwickeln, die die Genexpression auf bestimmte Gewebe einer Pflanze begrenzen. Die Fähigkeit, gewebespezifische Genexpression in Pflanzen zu steuern, wird von den Fachleuten als von agronomischer Bedeutung angesehen.
  • Die Kontrolle der Expression von agronomischen Genen in transgenen Pflanzen wird von den Fachleuten als zur Verfügungstellung mehrerer Vorteile gegenüber generalisierter oder konstitutiver Expression angesehen. Die Fähigkeit, Genexpression zu kontrollieren, kann genutzt werden, um Expression in Keimbahngeweben auszuschließen und folglich bestimmte behördliche und kommerzielle Streitfragen zu verhindern. Es kann ebenso einen Schädlingsschutz im Falle von Insekten und Krankheitsresistenz, eine bevorzugte Schädlingsmanagementstrategie zur Verfügung stellen (Norton, G., Agricultural Development Paths and Pest Management – A Pragmatic View of Sustainability, in Crop Protection and Sustainable Agriculture, 1993, S. 100–115), und es kann einen potenziellen Ertragsverlust reduzieren, durch Beschränken der Expression von schädlichen, noch immer nützlichen agronomischen Genen allein auf spezifische Gewebe. Weitere Vorteile von nützlichen Promotoren, die in einer gewebebevorzugten Art und Weise funktionieren, schließen eine reduzierte Ressourcenbelastung für die Pflanze ein, indem ein bestimmtes Genprodukt hergestellt wird, als auch Lokalisierung oder Kompartimentierung der Genexpression in Fällen, wo das Genprodukt auf oder von bestimmten Geweben begrenzt werden muss. Besagte Genprodukte können allgemeine zelluläre Inhibitoren wie beispielsweise RNAase oder andere Zytotoxine einschließen. Als ein Beispiel zeigten Mariani et al. (Nature 347: 737, 1990) Staubbeutel-spezifische Genexpression von suc-Inhibitorgenen zur Verwendung in männlichen Sterilitätssystemen, da die Expression in anderen Regionen als im Staubbeutel einer Pflanze, toxisch wären. Es besteht im Stand der Technik Bedarf an neuen transkriptionalen Regulationselementen, die in der Lage sind, gewebebevorzugte Genexpression in Pflanzen zu steuern. Von Fachleuten wird es als bedeutsam angesehen, fortzufahren gewebebevorzugte Transkriptionseinheiten zur Verfügung zu stellen, die in der Lage sind, die Genexpression zu steuern, die einer Pflanze einen selektiven Vorteil verleihen kann.
  • Es wird von Fachleuten ebenso als bedeutsam angesehen, transkriptionale Regulationseinheiten zu entwickeln, die die Genexpression selektiv zu Wurzelgewebe steuern. Wurzelbevorzugte Genexpression wird der Pflanze mehrere Vorteile zur Verfügung stellen, einschließlich aber nicht beschränkt auf die Veränderung der Wachstumsrate oder Funktion des Wurzelgewebes, Resistenz gegenüber wurzelbevorzugten Pathogenen, Schädlingen, Herbiziden oder ungünstigen Wetterbedingungen als auch Verbreiterung des Bereichs an Böden oder Umgebungen, in denen besagte Pflanze gedeihen kann. Die wurzelbevorzugte Genexpression würde ebenso einen Mechanismus zur Verfügung stellen, in welchem die Wurzelmorphologie und der Metabolismus verändert sein können, um den Ertrag zu verbessern (d. h. direkte Expression der Transporterproteine). Weitere Vorteile der wurzelbevorzugten Genexpression schließen die Herstellung von nützlichen Proteinen in einem industriellen Rahmen ein. Lichtsensitive Proteine können im Wurzelgewebe derart synthetisiert werden, dass besagte Proteine nicht dem Licht ausgesetzt werden.
  • Ein Promotorelement oder Elemente, die spezifisch wurzelbevorzugte Expression verleihen, wurden bisher nicht beschrieben. Kurze Elemente, die zur wurzelbevorzugten Expression beitragen können, wurden offenbart, jedoch wurde von der Identifizierung von spezifischen Sequenzen, die für die wurzelspezifische Genexpression verantwortlich sind, nicht berichtet (Lam, et al. 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7890). Bedeutsamerweise sind die meisten der offenbarten Elemente von Dicotyledonen nicht von Monocotyledonen (wie diese Erfindung war) abgeleitet. Basierend auf dem, was von den Fachleuten gewusst wird, ist es unwahrscheinlich, dass eine Dicotyledon-Promotorsequenz richtig in einem Monocotyledon funktionieren wird.
  • Die Ansätze, die genutzt werden können um gewebespezifische transkriptionale Kontrollelemente zu isolieren, schließen differenzielle oder subtraktive cDNA-Klonierung, gefolgt von der Klonierung der genomischen 5'-flankierenden Se quenz, umfassend die Promotorelemente, die für die gewebebevorzugte Genexpression verantwortlich sind. Eine jüngst entwickelte Technik, die differenzielle Displayanalyse (Liang, et al. Science 257: 967; Bauer, et al. Nuc. Acids Res. 21: 4272), involviert auf PCR-basierende Identifikation von unterschiedlich exprimierten Genen als partielle cDNAs. Ein Hauptnachteil der im Stand der Technik gelehrten Techniken ist, dass die Klonierung einer Volllängen-cDNA und genomischer Sequenzen als auch die Kartierung des identifizierten Promotors der genomischen Klone benötigt werden kann. Diese Techniken benötigen potenziell ein Projekt über viele Jahre mit minimaler Rückgewinnung der Investition. Die vorliegende Erfindung, die Gegenstand dieser Anmeldung ist, richtet sich an diese Fragen, indem eine Verfahrensweise beschrieben wird, die eine schnelle Isolierung, Identifizierung und Nutzung der DNA-Elemente erlaubt, die gewebebevorzugte Genexpression steuern.
  • Gemäß der Erfindung wurden neue DNA-Sequenzen, die mit gewebespezifischen DNA-bindenden Proteinen interagieren, durch ein Anreicherungsverfahren identifiziert. Die so isolierten DNA-Sequenzen wurden dann genutzt, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die zum Steuern von gewebespezifischer Genexpression innerhalb von transgenen Gewebe oder Organismen nützlich sind. Eine willkürliche Oligonukleotidbibliothek (ROL) wurde entwickelt und auf eine Rohmischung der Kernproteine des Zielgewebes (z. B. Wurzel), immobilisiert auf einem Filter, angewendet (entwickelt als eine Southwestern-Untersuchung). Die gebundene ROL wurde eluiert und auf eine immobilisierte Rohmischung der Kernproteine aus dem Nichtzielgewebe (z. B. Blatt) angewendet. Die nichtgebundene ROL wurden dann PCR-amplifiziert und der ganze Zyklus wiederholt, um DNA-Sequenzen weiter anzureichern, die Kernproteine aus dem Zielgewebe (z. B. Wurzel) binden. Die Verwendung von ROL's, die direkt an rohe Kernextrakte in einem subtraktiven Anreicherungsverfahren zur Generierung einer Bibliothek von Gewebe (oder Entwicklungs- oder Umweltzustand)-spezifischen Promotorelementen binden, wurde nicht beschrieben.
  • Wie von Oliphant, et al. (Mol. Cell. Biol. 9: 2944) gezeigt, wurden ROL's genutzt, um alternative DNA-Erkennungssequenzen von DNA-bindenden Proteinen zu identifizieren. Variationen dieser Technik wurden ebenso verwendet, um alternati ve Sequenzerkennung von spezifischen DNA-bindenden Faktoren zu identifizieren (Norby, et al. Nuc. Acids Res. 20: 6317; Catron, et al. Mol. Cell. Biol. 13: 2354; Ko, et al. Mol. Cell. Bill. 13: 4011; Shiraishi, et al. Plant J. 4: 385; Huang, et al. Nuc. Acids Res. 21: 4769). Die Technik, Rohkernextrakte auf eine ROL anzuwenden, wurde erfolgreich zur Identifizierung von mehreren Oligonukleotiden verwendet, die an Retinoblastoma Tumorsuppressor-Genprodukte binden (Ouellette, et al. Oncogene 7: 1075–1081). Bei jeder der oben beschriebenen Techniken, wird dennoch ein gereinigter DNA-bindender Faktor oder Antikörper, der für ein DNA-Bindungsfaktor spezifisch ist, benötigt. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden gewebespezifische Oligonukleotide aus einem Pool von willkürlichen Sequenzen unter Verwendung einer heterogenen Mischung (Rohextrakt) eines Kernproteins isoliert, ohne entweder ein gereinigtes Protein oder einen Antikörper irgendeiner Art zu benötigen. Die angereicherte Sammlung der Oligonukleotide wurde dann isoliert, in Expressionsvektoren kloniert und auf ihre Fähigkeit hin gewebespezifische Genexpression zu steuern, getestet. Dies stellt einen signifikanten methodologischen Fortschritt gegenüber bisher beschriebenen Techniken zur Verfügung.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Diese Erfindung stellt neue transkriptionale Regulationselemente zur Verfügung, die einen Beitrag zu den gewebebevorzugten Mustern von bestimmten Genen leisten. Gewebebevorzugte Genexpression schließt ein, aber ist nicht beschränkt auf Genexpression, die einzig und allein oder bevorzugt in bestimmten Geweben, Umweltsituationen oder während bestimmter Entwicklungsstadien beobachtet wird. Es werden transkriptionale Regulationselemente, die einen Beitrag zur wurzelgewebespezifischen Genexpression in Mais leisten und Expressionsvektoren, die besagte transkriptionale Regulationselemente umfassen, offenbart. Besagte transkriptionale Regulationselemente steuern die wurzelgewebebevorzugte Genexpression in transgenen Pflanzen. Besagte transkriptionale Regulationselemente werden genutzt, um Expressionsvektoren zu generieren, die eine transkriptionale Regulationsregion umfassen, die ein gewebebevorzugtes Element einschließt, das funktionell an ein Effektorgen gebunden ist, das nach der Expression des Proteinprodukts des besagten Effektorgens, der Pflanzen einen selektiven Vorteil verleiht. Besagter selektiver Vorteil kann einschließen, ist aber nicht be schränkt auf Resistenz gegen Schädlinge, Pathogene, Herbizide oder ungünstigen Wetterbedingungen als auch Auswirkungen auf Wachstum, Erträge oder reproduktive Kapazitäten der besagten Pflanzen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine isolierte Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 6 gezeigt, zur Verfügung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Vektor zur Verfügung, der eine Nukleinsäure der Erfindung umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenso eine Pflanzenzelle, transformiert mit einem Vektor der Erfindung, zur Verfügung.
  • Die Erfindung stellt ebenso eine transgene Pflanze, transformiert mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 6 gezeigt, funktionell an ein Reporter- oder Effektorgen gebunden, zur Verfügung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Generierung von transgenen Pflanzen, umfassend die Transformierung einer regenerierbaren Pflanzenzellkultur mit einem Vektor der Erfindung und Generierung transformierter Pflanzen, zur Verfügung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zum Exprimieren eines Effektorgens, vorzugsweise in Wurzelgewebe, umfassend funktionelles Verbinden einer Sequenz wie in SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 6 gezeigt, an ein Effektorgen, zur Verfügung.
  • Es ist ein Gegenstand der Erfindung, DNA-Moleküle, die Gene oder Fragmente davon darstellen, die in einer gewebebevorzugten Art und Weise exprimiert werden, zur Verfügung zu stellen.
  • Es ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung, DNA-Moleküle, die ein Element der transkriptionalen Regulationseinheit eines Genes bilden, das in einer gewebebevorzugten Art und Weise exprimiert wird, zur Verfügung zu stellen.
  • Es ist ebenso ein Gegenstand der Erfindung, Reporterkonstrukte, die zum Testen der Fähigkeit von potenziellen gewebebevorzugten transkriptionalen Regulationselementen, die die Expression eines Reportergens in einer gewebebevorzugten Art und Weise in vivo steuern, nützlich sind, zur Verfügung zu stellen.
  • Es ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren, das zum Testen der Fähigkeit von besagter transkriptionaler Regulationseinheit nützlich ist, um die Expression eines Reportergens in einer gewebebevorzugten Art und Weise in vivo zu steuern, zur Verfügung zu stellen.
  • Es ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung, DNA-Moleküle umfassend ein gewebespezifisches Promotor-Element oder -Elemente der Erfindung funktionell gebunden an ein Effektorgen, das nach Expression der Polypeptidprodukte des besagten Effektorgens der Pflanze, die mit besagtem DNA-Molekül transformiert ist, einen selektiven Vorteil verleihen wird, zur Verfügung zu stellen.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein isoliertes und gereinigtes subchromosomales DNA-Molekül, wie in SEQ ID NR. 5 gezeigt, zur Verfügung gestellt.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein isoliertes und gereinigtes subchromosomales DNA-Molekül, wie in SEQ ID Nr. 6 gezeigt, zur Verfügung gestellt.
  • In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, werden Expressionsvektoren zur Verfügung gestellt, wie in 6 und 10 gezeigt, in welchen die gewebebevorzugte Expression eines analysierbaren Genprodukts durch das seq6 transkriptionale Regulationselement kontrolliert wird.
  • Diese und andere Gegenstände der Erfindung werden den Fachleuten aus der folgenden detaillierten Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung offenbart werden.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1. Vorgehensweise zur Isolierung von wurzelbevorzugten transkriptionalen Regulationselementen unter Verwendung einer modifizierten Version der Southwestern-Bolt-Untersuchung.
  • 2. Southwestern-Bolts, die Oligonukleotide unterscheiden, die an Polypeptide des Wurzelgewebekernextraktes (R) binden und Polypeptide, die an Blattgewebekernextrakte (L) binden.
  • 3. Banden-Shift-Untersuchung unter Verwendung von Kernextrakten von 3 Wochen alten (3-W) oder 4 Tage alten Geweben (4-D), die zeigt, dass Seq6 mit bestimmten Faktoren in Wurzelgewebe, die nicht in Blattgewebe vorliegen, interagiert.
  • 4. Kompetitoren, die verwendet werden, um die Minimalsequenz von Seq6, die das Binden an Wurzelgewebekernextrakte bestimmt, zu identifizieren.
  • 5. Darstellung, dass die ungefähre 5'-Hälfte von Seq6 spezifisch an Kernfaktoren des Wurzelgewebes (R) bindet, das verschieden von denen des Blattgewebes (L) ist, isoliert von 3-wk alten (3-W) Pflanzen. Die verwendeten Kompetitoren sind wie in 4 angezeigt und markiert.
  • 6. Darstellung, dass die ungefähre 5'-Hälfte von Seq6 spezifisch an Kernfaktoren des Wurzelgewebes (R) bindet, das verschieden von denen des Blattgewebes (L) ist, isoliert von 4 Tage alten (4-D) Pflanzen. Die verwendeten Kompetitoren sind wie in 4 angezeigt und markiert.
  • 7. Darstellung, dass die ungefähre 5'-Hälfte von Seq6 spezifisch an Kernfaktoren des Wurzelgewebes (R) bindet, das verschieden von denen des Blattgewebes (L) ist, isoliert von 4 Tage alten (4-D) Pflanzen. Die verwendeten Kompetitoren sind wie in 4 angezeigt und markiert.
  • 8. Karte des Plasmids PHP8880, umfassend das Seq6 wurzelbevorzugte transkriptionale Regulationselement (S6) funktionell gebunden an das GUS-Reportergen.
  • 9. Karte des Plasmids PHP8887, umfassend das Seq22-Element (S22) funktionell gebunden an das GUS-Reportergen.
  • 10. Karte des Plasmids PHP8888, umfassend das Seq6 wurzelbevorzugte transkriptionale Regulationselement (S6) stromabwärts des Ubi-I Verstärkerelements (UbiU), während besagte S6 wurzelbevorzugte transkriptionale Regulationsregion funktionell in cis an das GUS-Reportergen gebunden ist.
  • 11. SEQ#::GUS-Kurzuntersuchungen in 4 Tage alten Maissetzlingen. Gezeigt wird die wurzelbevorzugte GUS-Genexpression, gesteuert durch das Seq6 transkriptionale Regulationselement. Generierte Daten unter Verwendung von negativen Kontrollplasmiden (SynMin, Seq15 und Seq22) sind eingeschlossen.
  • 12. SEQ#::CRC-Kurzuntersuchungen in 4 Tage alten Maissetzlingen. Gezeigt wird die wurzelbevorzugte Genexpression, gesteuert durch das Seq6 transkriptionale Regulationselement, gebunden an das 35S Kernpromotorelement (Seq6). Generierte Daten unter Verwendung von negativen Kontrollplasmiden (35S min, Seq4, Seq15, Seq22) sind eingeschlossen. Die Daten sind normalisiert auf Luciferase, exprimiert von einem BzI-LUC Konstrukt unter der transkriptionalen Kontrolle des 35SKern(-59)-CRC Konstrukts.
  • 13. UBI/SEQ#::GUS-Kurzuntersuchungen in 4 Tage alten Maissetzlingen. Wurzelbevorzugte GUS-Genexpression in 4 Tage alten Maissetzlingen, gesteuert durch die Seq6 transkriptionalen Regulationselemente (U/Seq6). Negative Kontrollplasmide schließen SynMin, Zm Ubi I und U/Seq22 ein.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindungen
  • Innerhalb dieser Anmeldung, bezieht sich Pflanze auf einen photosynthetischen Organismus einschließlich Algen, Moose, Farne, Gymnospermen und Angiospermen.
  • Eine Pflanzenzelle schließt irgendeine Zelle ein, abgeleitet von einer Pflanze, einschließlich Kallus als auch Protoplasten und embryonische und gametische Zellen.
  • Eine reife Pflanze ist definiert als eine Pflanze, in welcher eine normale Entwicklung aller vegetativen und reproduktiven Organe stattgefunden hat.
  • Transgene Pflanze definiert eine Pflanze, in welcher ein Gen zu der Keimbahn der besagten Pflanze hinzugefügt wurde.
  • Transformation bezieht sich auf ein Verfahren zur Einführung von DNA in eine Zelle. Besagte Einführung kann einschließen, ist aber nicht beschränkt auf Partikelbombardement, Lipofektion, Elektroporation, virale oder bakterielle vektorvermittelte und Kalziumphosphat-vermittelte Techniken.
  • Ein Genprodukt, das einer Pflanze einen selektiven Vorteil verleiht, ist definiert als irgendein Genprodukt welches, nach der Expression in besagter Pflanze, der Pflanze eine Eigenschaft verleiht, einschließlich aber nicht beschränkt auf verstärkte Wachstumsrate, Produktertrag oder Resistenz gegenüber Gefährdungen der Fähigkeit der besagten Pflanzen zu gedeihen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Pathogene, Schädlinge, ungünstige Wetterbedingungen und Herbizide im Vergleich zu Pflanzen, die besagtes Genprodukt nicht exprimieren.
  • Ein DNA-Fragment ist definiert als Segment einer einzel- oder doppelsträngigen DNA, abgeleitet von irgendeiner Quelle einschließlich synthetisch produzierter DNA.
  • Ein DNA-Konstrukt ist definiert als Plasmid, Virus, sich selbständig replizierende Sequenz, Phage oder lineares Segment einer einzel- oder doppelsträngigen DNA oder RNA, abgeleitet von irgendeiner Quelle.
  • Ein Reportergen ist definiert als subchromosomales oder gereinigtes DNA-Molekül, umfassend ein Gen, codierend für ein analysierbares Produkt.
  • Ein Reporterkonstrukt ist definiert als DNA-Konstrukt, umfassend ein Reportergen.
  • Ein Expressionsvektor ist definiert als ein DNA-Konstrukt, umfassend mindestens ein Gen, welches nach der Transektion in eine Zelle, zur Expression des Produktes des besagten Genes führt.
  • Ein analysierbares Produkt schließt irgendein Produkt ein, codiert durch ein Gen, das mittels einer Untersuchung detektierbar ist. Darüber hinaus wird von der Detektion und Quantifizierung des besagten analysierbaren Produkts erwartet, dass es direkt proportional zum Expressionsgrad besagten Genes ist.
  • Ein Effektorgen ist definiert als irgendein Gen, das nach Expression des codierten Polypeptids durch besagtes Gen, einen Effekt auf den Organismus, das Gewebe oder die Zelle ausübt.
  • Der Begriff funktionell gebunden bezieht sich auf die Kombination eines ersten Nukleinsäurefragmentes, das eine transkriptionale Kontrolleinheit bildet, die Aktivität in einer Zelle aufweist, die mit einem zweiten Nukleinsäurefragment verbunden ist, das für ein Reporter- oder Effektorgen codiert, in der Art, dass die Expression von besagtem Reporter- oder Effektorgen durch die Anwesenheit besagter transkriptionaler Kontrolleinheit beeinflusst wird.
  • Eine transkriptionale Regulationsregion ist definiert als irgendeine Region eines Gens, involviert in die regulative Transkription eines Genes, einschließlich aber nicht beschränkt auf Promotoren, Verstärker und Repressoren.
  • Ein transkriptionales Regulationselement ist definiert als irgendein Element, involviert in das Regulieren der Transkription eines Genes, einschließlich aber nicht beschränkt auf Promotoren, Verstärker und Repressoren.
  • Gewebebevorzugt definiert ein Gen oder Genprodukt, exprimiert in einem Gewebe in einer größeren Menge im Gegensatz zu einem oder mehreren zweiten Geweben in einem Organismus oder dass die Funktion eines bestimmten Genes oder Genproduktes in einem Gewebe optimal ist, im Gegensatz zu einem oder mehreren zweiten Geweben in einem Organismus. Besagte Gewebe können durch eine Anzahl von Bedingungen unterschieden sein, einschließlich aber nicht beschränkt auf Gewebetyp, Entwicklungsstadium des Gewebes und Umweltzustand des besagten Gewebes.
  • Ein gewebebevorzugtes Promotorelement oder ein gewebebevorzugtes transkriptionales Regulationselement ist definiert als ein Promotorelement oder eine transkriptionale Regulationsregion, die die Expression von mindestens einem Gen in einer gewebebevorzugten Art und Weise steuert.
  • Ein Gewebe von unterschiedlichem Gewebeursprung ist definiert als Gewebe, das unterschieden werden kann von mindestens einem anderen Gewebe durch mindestens einem von mehreren Kriterien, einschließlich aber nicht beschränkt auf Gewebetyp, Umweltzustand des besagten Gewebes oder Entwicklungsstadium des besagten Gewebes.
  • Eine regenerierbare Kultur ist definiert als eine Zell- oder Gewebekultur, die so manipuliert werden kann, dass sie die Regeneration von Pflanzen erlaubt.
  • Ein zur Kontrolle von Schädlingen nützliches Genprodukt definiert irgendein Gen, das dazu dient, das Wachstum, die Migration, die Existenz oder das Verhalten von irgendeinem Schädling, der den normalen Lebenszyklus von einem oder mehreren Organismen bedrohen kann, zu inhibieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Oligonukleotide, transkriptionale Regulationselemente, Expressionsvektoren und transgene Pflanzen zur Verfügung, die Genpromotorelemente enthalten, die zur gewebebevorzugten Expression von bestimmten Genen beitragen. Diese wurden durch die Entwicklung einer Bibliothek eines mutmaßlichen gewebebevorzugten Elements, das gescreent werden kann, um beide, Aktivator- und Repressorelemente von bestimmten Gewebetypen der meisten beliebigen Organismen zu identifizieren, identifiziert. Eine willkürliche Oligonukleotidbibliothek (ROL) wurde zunächst mit einem Rohkernextrakt, enthaltend Faktoren, die wahlweise in bestimmten Pflanzengeweben vorliegen, hybridisiert. Anschließend an wiederholte Hybridisierungen von sowohl dem interessierenden Gewebe als auch dem "nichtspezifischen" Gewebe, das einzig und allein verwendet wurde, um Oligonukleotide, die an Kernfaktoren sowohl des interessierenden Gewebes als auch dem nichtspezifischen Gewebe binden, zu subtrahieren, wurde eine gewebebevorzugte ROL erzeugt. Diese gewebebevorzugte ROL bildet mutmaßliche gewebebevorzugte Promotorelemente, die an Kernfaktoren des interessierenden Gewebes binden. Die Population an mutmaßlichen gewebebevorzugten Promotorelementen wurde dann in Expressionsvektoren derartig inkorporiert, dass ein mutmaßliches gewebebevorzugtes Promotorelement funktionell an ein Gen, codierend für ein analysierbares Produkt, gebunden wurde. An die Transektion in Zellen- oder Gewebepräparaten anschließend, wurde die Fähigkeit eines mutmaßlichen gewebebevorzugten Elements oder Elemente, die gewebebevorzugte Genexpression zu steuern, bestimmt. Bestimmte Konstrukte wurden dann zum weiteren Testen in spezifischen Gewebeproben ausgewählt, einschließlich transgener Organismen.
  • Der Stand der Technik lehrt eine begrenzte Anwendung einer ROL zur Identifikation von spezifischen DNA/Proteininteraktionen. Dennoch sind die im Stand der Technik offenbarten Verfahren auf die Verwendung von geklonten, gereinigten Kernproteinen beschränkt, im Gegensatz zu den Rohmischungen der Kernproteine wie hier beschrieben (Norby, et al. Nuc. Acids Res. 20: 6317; Catron, et al. Mol. Cell. Biol. 13: 2354; Ko, et al. Mol. Cell. Bill. 13: 4011; Shiraishi, et al. Plant J. 4: 385; Huang, et al. Nuc. Acids Res. 21: 4769). Ouellette, M. M., et al. (Oncogene 7: 1075–1081) lehrt die Anwendung einer ROL auf eine Rohmischung von Kernproteinen um Oligonukleotide, die spezifisch Rb-Familien-Polypeptide binden, zu identifizieren. Eine bedeutende Beschränkung der Lehre von Ouellette et al. ist jedoch, dass ein Antikörper, der spezifisch für eine Klasse von Retinoblastoma (Rb)-Proteinen ist, benötigt wird, um jene Oligonukleotide zu identifizieren, die spezifisch Rb-Familienpolypeptide binden. Ein Hauptnachteil der im Stand der Technik beschriebenen Methodologien ist, dass entweder ein geklontes, gereinigtes Kernprotein oder ein Antikörper zu einem DNA-bindenden Protein benötigt wird. Weder ein kloniertes Protein noch ein Antikörper irgendeines Typs wird benötigt um die Verfahren, die wir beschrieben, zu nutzen.
  • Bisher war es notwendig Gene die ein gewebebevorzugtes Muster der Expression in Pflanzen zeigen, zu identifizieren, um transkriptionale Regulationsregionen, die zum Steuern von gewebebevorzugte Expression von Effektorgenen in Pflanzen nützlich sind, zu isolieren. Ein Verfahren zur Identifikation ist eine auf PCR beruhende differenzielle Display-Analyse (Liang, et al. Science 257: 967). Diese Methodologie involviert die Verwendung von willkürlichen Oligonukleotidprimern, PCR-Amplifikation von RT-cDNA und den Vergleich von Expressionsmustern zwischen mindestens zwei Proben. Besagte Proben können einschließen aber sind nicht beschränkt auf verschiedene Zellen- oder Gewebetypen, Zellen oder Gewebe in verschiedenen Entwicklungsstadien oder Zellen oder Gewebe, die verschiedenen Chemikalien oder Bedingungen ausgesetzt wurden und zu einer Veränderung der Genexpression in besagten Zellen oder Gewebe führen können. Nicht identische DNA-Bandenmuster von DNA, die von diesen Proben amplifiziert wurde, zeigt einen Unterschied der Genexpression zwischen den Proben. Eine zu den Banden korrespondierende DNA, welche besagte nichtidentische DNA-Bandenmuster aufweist, wurde kloniert und zur Identifizierung der Gene, die zu den DNA-Banden korrespondieren, genutzt. Ein alternatives Verfahren involviert die Verwendung von subtraktiver Hybridisierung (Lee, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 2825). Diese Methodologie involviert die Hybridisierung von cDNA (Antisense) der Probe A und biotinylierter-RNA der Probe B. Biotinylierte RNA-Moleküle der Probe B, die Gene ausweisen, die in beiden Proben exprimierte wurden, werden mit den komplementären cDNA-Molekülen der Probe A hybridisiert und werden durch anschließende enzymatische Behandlung zerstört werden. Anschließend an die Aufreinigung der verbleibenden biotinylierten RNA-Moleküle der Probe B wird, unter Verwendung besagter verbleibender biotinylierter RNA der Probe B eine cDNA-Bibliothek konstruiert. Die Klone besagter cDNA-Bibliothek weisen Gene auf, die vorzugsweise in Probe B exprimiert werden. Ein weiteres Verfahren ist das Screening einer cDNA-Bibliothek einer ersten Probe unter Verwendung von markierter RNA, die eine zweite Probe bildet. Klone dieser besagten cDNA-Bibliothek der besagten ersten Probe, die nicht mit besagter markierter RNA der besagten zweiten Probe hybridisieren, verkörpern mRNA-Arten, die nicht in besagter zweiter Probe exprimiert werden. Alternativ können mehrere Bibliotheken einzeln gescreent werden unter Verwendung markierter RNA von mehreren unterschiedlichen Proben. Falls besagte Proben unterschiedliche Pflanzengewebe aufweisen, zeigt ein geändertes Hybridisierungsmuster in einer Probe im Vergleich zu einer anderen Probe ein gewebebevorzugtes Muster der Genexpression. cDNA-Klone, die in der oben beschriebenen Art und Weise isoliert wurden, werden mRNA-Arten verkörpern, die vorzugsweise in einer Probe oder einer Gruppe von Proben exprimiert werden.
  • Es ist dann notwendig zu bestätigen, dass eine cDNA, die durch irgendeine der oben beschriebenen Techniken oder irgendeiner anderen Technik isoliert wurde, zur Isolierung von potenziellen gewebebevorzugten Pflanzengenen führt, die in einer gewebebevorzugten Art und Weise exprimiert werden. RT-PCR ist ein Verfahren, bei welchem mRNA, dargestellt durch potenziell gewebebevorzugte cDNA, aus einer Zelle oder interessierendem Gewebe amplifiziert wird (Berchtold, et al. Nuc. Acids. Res. 17: 453). Die Amplifikation von besagter mRNA aus mehreren unterschiedlichen Geweben erlaubt einen zu machenden Vergleich und die Bestimmung des relativen Grades der Expression der mRNA des besagten potenziellen gewebebevorzugten Pflanzengens.
  • Ein anderes Verfahren, welches genutzt werden kann, um den Grad der Genexpression in einer Pflanzenzelle oder Pflanzengeweben zu bestimmen, sind RNase Schutzuntersuchungen (Melton, et al. Nuc. Acids Res. 12: 7035). RNA aus zu vergleichenden Proben wird mit einer markierten Antisense-RNA-Sonde hybridisiert, erzeugt aus einer cDNA, die eine mRNA eines Pflanzengens, das poten ziell in einer gewebespezifischen Art und Weise exprimiert wurde, darstellt. Dies wird gefolgt durch die Zugabe von RNase. Alle RNA die mit besagter markierter Antisense-RNA-Sonde hybridisiert wurde, wird vom Abbau (bezeichnet als geschützte Transkripte) durch die RNase geschützt, während die mRNA, die nicht mit besagter Antisense-markierter RNA-Sonde hybridisiert wurde, abgebaut wird. Die Produkte werden dann durch Gelelektrophorese getrennt und die geschützten Transkripte unter Verwendung von Detektionsverfahren einschließlich aber nicht beschränkt auf Autoradiographie, detektiert. Die relative Intensität der Banden, die zu besagten geschützten Transkripten korrespondieren, sind proportional zum Expressionsgrad der geschützten RNA-Arten in jedem Gewebe. Ein zusätzliches Verfahren, mit welchem gewebebevorzugte Expression bestimmt werden kann, ist die Northern-Blot-Analyse (Alwine, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 74: 5350). Die RNA, die aus den interessierenden Proben isoliert wurde, wird isoliert und mittels Gelelektrophorese getrennt. Die getrennten RNA-Arten werden dann auf eine Membran transferiert und mit einer markierten Nukleinsäuresonde, die komplementär ist zur RNA, die das interessierende Gen darstellt, sondiert. Die Hybridisierung wird unter Verwendung eines Detektionsverfahrens einschließlich aber nicht begrenzt auf Autoradiographie, detektiert. Die Intensität der Bande, die zur RNA korrespondiert, die ein interessierendes Gen darstellt, wird bestimmt und ist proportional zum Grad der Genexpression in jeder Probe. Ein gewebebevorzugtes Gen wird durch erhöhte Hybridisierung in einem Gewebe im Vergleich zu einem zweiten Gewebe der Pflanze identifiziert.
  • Es ist dann wünschenswert, die transkriptionale Regulationsregion, die für die Steuerung der Expression der besagten interessierenden Gene in einer gewebebevorzugten Art und Weise verantwortlich ist, zu isolieren. Diese Region kann durch mehrere Verfahren isoliert werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf die Amplifikation der Region der DNA, die besagte transkriptionale Regulationsregion umfasst. Besagte DNA wird von genomischer DNA amplifiziert, die als genomische DNA-Bibliothek in einem Klonierungsvektor aufrechterhalten wird, einschließlich aber nicht beschränkt auf Phage, Plasmide, Kosmide, hefeartifizielle Chromosome (YAC) oder irgendein anderen Vektor, der in der Lage ist, Fragmente der chromosomalen DNA zu beherbergen. Besagte transkriptionale Regulationsregion des besagten Genes, exprimiert in einer gewebebevorzugten Art und Weise, kann durch Amplifikation der genomischen Sequenzen, die die DNA-Sequenz codieren, isoliert werden. Zwei Oligonukleotidprimer werden in einer PCR-Reaktion genutzt, der erste davon umfasst eine Sequenz, die zu einer Region innerhalb der Nukleotidsequenz des besagten Klonierungsvektors komplementär ist und die zweite davon umfasst eine Sequenzkomplementarität zur 5'-Region der besagten cDNA, die ein Gen codiert, das in einer gewebebevorzugten Art und Weise exprimiert wird. Das Templat für besagte PCR-Reaktion umfasst einen Teil der besagten genomischen DNA-Bibliothek. Amplifikationsprodukte können einschließen aber sind nicht beschränkt auf eine DNA, umfassend eine 5'-transkriptionale Regulationsregion des besagten interessierenden Genes, die verbleibende 3'-Sequenz der besagten cDNA, die eine 3'-nichttranslatierte Region oder Fragmente davon umfasst. DNA-Sequenzierung von jedem amplifizierten Produkt führt zur Identifikation von jenen Klonen, die eine potenzielle transkriptionale Regulationsregion umfassen (Frohmann, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8998). Ein weiteres Verfahren zur Isolierung einer transkriptionalen Region eines Gens, das in einer gewebebevorzugten Art und Weise exprimiert wird, schließt die Nutzung einer cDNA oder eines Fragmentes davon ein, die das interessierende Gen als cDNA-Sonde codieren, um besagte genomische DNA-Bibliothek durch Hybridisierung zu screenen. Klone, die eine Hybridisierung zu besagter DNA-Sonde zeigen, werden isoliert und charakterisiert durch Restriktionsenzymkartierung und Nukleinsequenzanalyse.
  • Elemente oder Regionen der DNA, die für eine gewebebevorzugte Genexpression verantwortlich sind, wurden unter Verwendung von Methoden isoliert, einschließlich aber nicht beschränkt auf die folgenden Vorgehensweisen. Die Nukleotidsequenz und Restriktionsenzymkarten der besagten genomischen Klone, die eine Hybridisierung mit besagten cDNA-Sonden zeigen, wurden bestimmt. Unter Verwendung von Restriktionsenzymverdauung und Subklonierungsverfahren, die den Fachleuten gut bekannt sind, wurden Expressionsvektoren konstruiert, die verschiedene Regionen der besagten genomischen Klone umfassen, cis an ein Gen codierend für besagte analysierbare Produkte gebunden sind, um einen Expressionsvektor, in welchem die Expression von analysierbaren Produkten durch besagte verschiedene Regionen der besagten genomischen Klone gesteuert wird, zu generieren. Ein weiteres Verfahren schließt die Verwendung einer Oligonukleotid umfassenden Nukleotidsequenz, die zur 5'-Region der besagten transkriptionalen Kontrollregion des besagten Genes, exprimiert in einer gewebebevorzugten Art und Weise und eine Oligonukleotid umfassende Nukleotidsequenz, die komplementär zu einer 3'-transkriptionalen Kontrollregion des besagten Gens ist, exprimiert in einer gewebebevorzugten Art und Weise, synthetisiert wird, komplementär ist. Vorzugsweise umfasst jedes Oligonukleotid weiter eine Nukleotidsequenz, korrespondierend zu den aktiven Stellen eines Restriktionsenzyms, das kompatibel für die Klonierung in einen Expressionsvektor ist, der ein analysierbares Produkt codiert. Im Anschluss an eine Amplifikation der DNA umfassend eine transkriptionale Kontrollregion, wird die Klonierung der besagten Region in besagtem Expressionsvektor unter Verwendung von, im Stand der Technik bekannten Techniken begleitet. Die Verwendung der oben beschriebenen Methodologien führt zu dem Konstrukt des Expressionsvektors, umfassend getrennte potenzielle transkriptionale Kontrollregionen die in cis an ein Gen, das für ein analysierbares Genprodukt codiert, gebunden ist.
  • Expressionsvektoren, die nützlich sind zum Testen eines potenziell gewebebevorzugten transkriptionalen Regulationselements oder Region, isoliert durch irgendeine der Methodologien, die in dieser Anmeldung beschrieben werden, können dann konstruiert werden. Besagte Elemente werden in die transkriptionale Kontrollregion eines Expressionsvektors derart insertiert, dass besagte transkriptionale Kontrollregion funktionell in cis an ein Gen codierend für ein analysierbares Produkt gebunden ist. Besagtes analysierbares Produkt kann einschließen ist aber nicht beschränkt auf Beta-Glucuronidase (GUSTm), Luciferase, Beta-Galactosidase, grünes Fluoreszenzprotein (GFP) oder Chloramphenicoltransferase (CAT). Um zu bestätigen, dass besagte transkriptionale Kontrollregionen in einer gewebebevorzugten Art und Weise in Pflanzengeweben funktionieren, wird besagter Expressionsvektor umfassend eine transkriptionale Kontrollregion eines Gens, exprimiert in einer gewebebevorzugten Art und Weise in Pflanzen, die funktionell in cis an ein analysierbares Produkt in Pflanzenzellen oder Gewebe gebunden sind, transfektiert. Das zur Transektion genützte Verfahren von verschiedenen Typen von Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben kann einschließen aber sind nicht beschränkt auf Partikelbombardement, Liposom-vermittelte Transektion, Kalziumphosphat-vermittelte Transektion, bakteriell- oder viral-vermittelter Gentransfer und Elektroporation. Besagte verschiedene Zellen oder Gewebe können in vitro nach Exzision von besagter Pflanze transfektiert werden. Im Anschluss an eine definierte Zeitspanne nach Transektion des besagten Konstrukts in besagte Gewebe, werden die Gewebe geerntet und eine Untersuchung, der in der Lage ist, besagte analysierbare Produkte zu detektieren, durchgeführt. Die Menge an analysierbarem Produkt, die in besagten Zellen oder Geweben detektiert wird, ist proportional zur Fähigkeit der besagten transkriptionalen Kontrollregion in dieser Zelle oder Gewebe zu funktionieren. Auf diese Art und Weise wird die Fähigkeit der besagten transkriptionalen Regulationsregion bestimmt, die gewebebevorzugte Genexpression zu steuern. Alternativ können besagte Zellen oder Gewebe genutzt werden, um transgene Pflanzen zu generieren. Besagte transgene Pflanzen weisen mindestens eine Kopie des besagten Expressionsvektors, umfassend besagte transkriptionale Kontrollregion, in cis gebunden an ein Gen, codierend ein analysierbares Produkt, das in ein Genom der Pflanze inkorporiert ist. Besagte Kopie liegt deshalb in jeder Zelle und Gewebe der besagten transgenen Pflanze vor. Die Ernte der besagten Gewebe wird gefolgt von einer Untersuchung der besagten Gewebe zur Expression des gesagten analysierbaren Produkts. Die Menge von besagtem analysierbarem Produkt in jeder der besagten Gewebe wird bestimmt und ist proportional zum Expressionsgrad des besagten Gens, codierend besagtes analysierbares Produkt in jedem der besagten Gewebe. Auf diese Art und Weise wird die Fähigkeit der transkriptionalen Kontrollregion der besagten cDNA, die gewebebevorzugte Genexpression zu steuern, bestimmt.
  • Die Fähigkeit der besagten transkriptionalen Kontrollregion, die gewebebevorzugte Expression der Gene zu steuern, kann ebenso durch die Generierung von transgenen Pflanzen, in welchen das Transgen eine gewebebevorzugte transkriptionale Kontrollregion umfasst, die die Expression eines Effektorgens steuert, das diesen Pflanzen einen selektiven Vorteil verleiht, umfassend besagtes Transgen, getestet werden. Besagten transgenen Pflanzen wird erlaubt zu reifen und werden dann durch einen Schädling herausgefordert, welcher eine Antwort der Expression des besagten Effektorgens in einer Pflanze aufweist. Vorzugsweise ist der Schädling ausgewählt aus der Gruppe von Schädlingen, welche für mindestens einen Teil ihrer Lebensspanne in einem Gewebe, in welchem besagte transkriptionale Kontrollregion die Genexpression steuert, vorliegen. Es wird gezeigt, dass das Verhalten des besagten Schädlings in jenen Geweben verändert wird, in welchen das Effektorgen exprimiert wird. Der Wechsel in besagtem Verhalten des besagten Schädlings schließt ein aber ist nicht beschränkt auf veränderte Wachstumseigenschaften, Unfähigkeit zu gedeihen oder Tod.
  • Besagte transkriptionale Kontrollregion kann ebenso genutzt werden, um die Expression der Gene zu steuern, welche in anderen Aspekten der Pflanzenphysiologie involviert sind, einschließend aber nicht beschränkt auf Resistenz gegen andere Schädlinge als Insekten, Resistenz gegen Herbizide, Wachstum einer Pflanze, Resistenz gegen Verderb von Früchten oder Gemüse, oder Resistenz gegen ungünstige Wetterbedingungen. Besagte andere Schädlinge als Insekten können ebenso einschließen sind aber nicht beschränkt auf Bakterien, Parasiten, Pilze, virale Agenzien und Viroide einschließlich aber nicht beschränkt auf Pilze, Fusarium und Fumonsin, oder den Virus, bekannt als der Tabakmosaik-Virus. Die Wachstumseigenschaften der Pflanze schließen ein aber sind nicht beschränkt auf solche, die zu einer Produktion von gesteigerten Mengen an Früchten, gesteigerten Mengen an Samen, Wachstum bei entweder einer schnelleren oder einer langsameren Rate, oder Wachstum in einer anderen Jahreszeit als die, die für besagte Pflanze für gewöhnlich angesehen wird, führt. Ungünstige Wetterbedingungen gegen die die Pflanze resistent wird, schließen ein aber sind nicht beschränkt auf Temperaturen oberhalb oder unterhalb derer, bei welcher die Pflanze gewöhnlich nicht in der Lage ist zu überleben, Überschwemmung und Trockenheit.
  • Die innerhalb dieser Anmeldung offenbarten Methodologien beseitigen viele der umfangreichen und zeitaufwändigen Klonierungs- und Mutationsanalysen, die zur Identifizierung von Promotorelementen notwendig sind, wie im Stand der Technik gelehrt. Zusätzlich führt die Nutzung der hierin beschriebenen Verfahren eher zur Generierung einer Bibliothek von Promotorelementen als das eine oder die wenigen Elemente, die wahrscheinlich aus der Nutzung von konventionellen Ansätzen resultieren, wie denjenigen, die im Stand der Technik beschrieben sind. Die hierin beschriebene Methodologie ist anwendbar auf irgendein Gewebe in irgendeinem entwicklungs- und umweltinduziertem Stadium, das Kernextraktpräparationen zugänglich ist.
  • Die folgenden Beispiele erläutern besondere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und sind nicht in irgendeiner Weise beschränkend für die Beschreibung und Ansprüche.
  • BEISPIEL 1. Isolierung von Elementen, die wurzelbevorzugte Genexpression verleihen
  • A. Generation einer willkürlichen Oligonukleotid-Bibliothek (ROL)
  • Die Grundstruktur der Oligonukleotide jeder ROL wird unten erläutert [unten dargestellt als #1 und SEQ ID NR: 1 (bezeichnet N24) und #2 und SEQ ID NR: 2 (bezeichnet N20)]. Die flankierenden Sequenzen besagter Oligonukleotide wurden bezeichnet um von irgendwelchen bekannten pflanzlichen cis-wirkenden Elementen verschieden zu sein. Die flankierende Sequenz jedes Oligonukleotids in jeder ROL schließt eine BamHI Erkennungsstelle zur Klonierung in einem Vektor ein, nach der Isolation der Kandidatenoligonukleotide. Die N24 ROL (unten dargestellt als #1) umfasst ungefähr 2,8 × 1014 verschiedene Oligonukleotide. Die N20 ROL (unten dargestellt als #2) umfasst ungefähr 1,1 × 1012 verschiedene Oligonukleotide. PCR-Primer wurden zur Amplifikation der ROL entworfen (Primer N7913 und N8516, wie unten dargestellt als #3 und #4 unten entsprechend). Die gewebebevorzugten Elemente der vorliegenden Erfindung wurden von der N20 ROL-Bibliothek isoliert. Einzelsträngige synthetische Oligonukleotide aus der ROL wurden doppelsträngig gemacht und mittels Standardtechniken markiert, umfassend die Verwendung von Klenow-Fragment, dNTP und 32P-dCTP.
  • Figure 00220001
  • B. Herstellung der Kernproteinextrakte
  • Das Verfahren zur Isolierung der Zellkerne und die Herstellung der Kernextrakte ist modifiziert von dem von Green, P. J., et al. (1989. In Vitro DNA Footprinting. In "Plant Molecular Biology Manual" B11: 1–22. Gelvin, S. B., Schilperoort, R. A., und Verma, D. P. S. (Eds.) Kluwer Acad. Publishers). Kurzum wurden B73 Maissetzlinge in einem Gewächshaus für 23 Tage aufgezogen. Wurzel und Blattgewebe wurden geerntet und bis sie sauber waren mit Hahnenwasser gewaschen, gefolgt durch Waschen mit doppelt destilliertem Wasser und letztendlich mit dem Homogenisierungspuffer (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl, 0,3 M Sucrose, 0,25% (v/v) Triton X-100, 5 mM Beta-Mercaptoethanol, 1 mM PMSF). Frisches Gewebe wurde in einem Waring-Mischer, ausgestattet mit neuen Rasierklingen, homogenisiert, 400 ml kalter (4°C) Homogenisierungspuffer wurde für jede 100 g der Gewebe verwendet. Vier Pulse von 10 Sekunden bei Hochgeschwindigkeit wurden den Wurzelgeweben zugeführt. Das Homogenisat wurde durch zwei Lagen Miracloth, 1 Lage Nylonnetz (120 Mikrons) und letztendlich durch ein 70 Mikron Nylonnetz filtriert. Das Filtrat wurde in einem Sorvall GSA Rotor bei 3500 × g für 15 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag wurde sachte mit einer großen Mundplastikpipette in 50 ml des eiskalten Homogenisierungspuffers resuspendiert. Die Zellkerne wurden bei 3500 × g für 10 Minuten pelletiert. Die Zellkerne wurden zwei weitere Male gewaschen und in 20% Glycerol bei –80°C nach Einfrieren mit flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
  • C. Anreicherung für wurzelspezifische Oligonukleotide
  • Ein modifizierte Version der Southwestern-Blot-Untersuchung beruhend auf dem Verfahren von Miskimins, W. K. et al. (1985. "Use of a protein-blotting procedure and a specific DNA probe to identify nuclear proteins that recognize the promotor region of the transferrin receptor gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6741–6744) wurde verwendet, wie schematisiert in 1 dargestellt. In Kürze, sowohl Wurzel als auch Blattprotein wurde durch 10% SDS-PAGE nebeneinander getrennt (30 μg Protein/Bahn). Das resultierende Gel wurde auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Die N20 ROL wurde auf 104 Moleküle/μl verdünnt und mittels PCR markiert (94°C, 30 Sekunden; 45°C, 1 Minute; 72°C, 1 Minute 20 Sekunden; 35 Zyklen dann 72°C, 10 Minuten) in der Gegenwart von α-32P-dCTP und auf einem 2% Agarosegel gereinigt. Die Einheit, mit denen Mitgliedern einer ROL markiert werden können, schließt ein aber ist nicht beschränkt auf ein Enzym, ein Enzymsubstrat, ein Enzymkofaktor, ein Enzyminhibitor, eine Fluoreszenzmarkierung, ein Chromophor, ein Biolumineszensierer, ein spezifisch bindbarer Ligand wie beispielsweise Biotin oder ein Hapten und Radioisotope einschließlich aber nicht beschränkt auf 3H, 14C, 35S und 125I. Die Proteinblots wurden unter Verwendung der markierten Oligonukleotide (108 cpm/μg) in einem Bindepuffer (10 mM Hepes, pH 7,0 enthaltend 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA mit 10 μg Poly dldC/ml) für 4 Stunden bei RT sondiert. Die Blots wurden dann in Bindepuffer mit 3 Wechseln zu jeweils 15 Minuten gewaschen. Die Oligonukleotide wurden beobachtet, ob sie an 14–20 kDa und 30–45 kDa Polypeptide des Wurzelextrakts, nicht aber an den Blattextrakt, binden (2A). Besagte Oligonukleotide wurden aus der Membran eluiert durch Inkubieren der Membran in 10 mM Tris – 1 mM EDTA enthaltend 1,5 M NaCl bei 65°C für 1 Stunde. Die eluierten Oligonukleotide wurden nach einer einmaligen Chloroformextraktion durch EtOH-Präzipitation mit 2 μg Glykogen wiedergewonnen. Besagte eluierte Oligonukleotide wurden reamplifiziert, mittels PCR markiert und als Sonde in einem zweiten Satz von Blots verwendet, enthaltend Kernextraktproteine aus Wurzelgewebe (2B). Bestimmte der besagten eluierten Oligonukleotide wurden beobachtet, ob sie an Polypeptide im Größenbereich von 30 bis 69 kDa binden. Diese Oligonukleotide wurden anschließend eluiert, amplifiziert und mittels PCR markiert. Die eluierten, markierten Oligonukleotide wurden dann als Sonde in einem dritten Satz von Kernproteinblots verwendet (2C) und wurden beobachtet, ob sie an 69 kDa, 36 kDa und 30–45 kDa Polypeptide binden. Gebundene Oligonukleotide wurden einzelne wiedergewonnen, PCR amplifiziert und in einen TA-Klonierungsvektor (Clontech) ligiert. Anschließend an die Klonierung in den TA-Vektor, wurden dann beide Stränge der besagten Oligonukleotide unter Verwendung eines ABI 373 DNA-Sequenzierautomaten sequenziert.
  • E. Isolation der Seq6 und minSeq6 Wurzelgewebe bevorzugten Promotorelemente
  • Ein neue DNA-Sequenz, Seq6 wurde isoliert unter Verwendung der oben beschriebenen Methodologien (dargestellt als #5 unten und SEQ ID NR. 5).
  • Figure 00240001
  • Ein Maispromotorelement, das wurzelbevorzugte Genexpression verleiht, wurde weder identifiziert noch in irgendwelchen synthetischen Promotorexpressionsvektoren, die im Stand der Technik berichtet wurden, verwendet. Relativ kurze Promotorelemente wie beispielsweise Seq6 oder deren Derivate sind Veränderungen, Multimerisierungen, etc., zugänglich und verbessern folglich experimentelle Kontrollen, welche nicht einfach mit großen Promotorsequenzen, wie bisher bei vielen Pflanzenarten identifiziert, durchgeführt werden. Die bisher beschriebenen Promotoren müssen einer mutations- oder differenziellen Analyse unterzogen werden, um die relativ kurzen Promotorelemente, die Genregulation verleihen, zu bestimmen.
  • F. Band-Shift-Untersuchung
  • Band-Shift-Untersuchungen wurden gemäß McKendree et al. (1990. Plant Cell 2: 207–214) durchgeführt. Jede Reaktion beinhaltete 1 μg poly(dldC), 2 μg tRNA und 50 mM KCl. In konkurrierenden Band-Shift-Studien, wurde ein 200-facher Überschuss an Kompetitor-DNA zuerst mit Kernextrakten gemischt, gefolgt von der Zugabe der Sonde. Die Proben wurden durch Elektrophorese in 5% nativen Po lyacrylamidgelen bei 30 mA für 1,5 Stunden getrennt. Die Gele wurden in Lösung enthaltend 20% Ethanol und 5% Essigsäure für 20 Minuten fixiert und unter Vakuum getrocknet. Getrocknete Gele wurden mit einer Verstärkungsfolie einem BTM-Film bei –80°C über Nacht ausgesetzt.
  • Band-Shift-Untersuchungen, die Kernextrakte von 3 Wochen alten oder 4 Tage alten Geweben verwenden, zeigen, dass Seq6 mit einem bestimmten Faktoren) von Wurzelkernextrakten, die nicht in Blattkernextrakten vorliegen (3), interagieren. Die Minimalsequenz von Seq6 wurde unter Verwendung einer Serie von Kompetitorexperimenten, die in 4 erklärt sind, bestimmt. Es wurde gezeigt, dass die ungefähre 5'-Hälfte von Seq6 spezifisch an Faktoren bindend, die in Wurzelgewebe vorliegen, verschieden von denen, die in Blattgewebe vorliegen, (3-wk Kernextrakte, 5; 4-d Kernextrakte, 6 und 7), was zur Identifikation von minSeq6 führt (wie in #6 unten dargestellt und in SEQ ID NR. 6).
  • Figure 00250001
  • BEISPIEL 2. Seq6 gesteuerte wurzelbevorzugte Genexpression
  • A. Seq6 Expressionsvektorkonstruktion
  • Das Seq6 Element wurde auf die Fähigkeit hin getestet, gewebebevorzugte Genexpression durch Inkorporation in Expressionsvektoren und Transfektion der besagten Expressionsvektoren in Pflanzengeweben zu steuern. Die Oligonukleotide wurden in einem TA-Klonierungsvektor kloniert und PCR amplifiziert unter Verwendung von T7 und Sp6 Primern. Die PCR-Produkte wurden mit BamHI verdaut und die ~40 bp DNA-Fragmente wurden aus einem 1% Agarosegel isoliert. Diese 40 bp Fragmente umfassen Seq6 oder Seq22, die entweder in einen BamHI-verdauten DP6341 Vektor (8) oder einem BamHI-verdauten DP 9342 Vektor ligiert wurden, der den ubi-I Verstärker und die synCORE Minimalpromotorsequenz, die ein AdhI::GUS::PinII Gen steuert, enthält. In den Expressionsvektoren, umfassend die Seq6 oder Seq22 Elemente, wurden besagte Elemente zwischen den ubi-I Verstärker und das synCORE minimale Promotorelement positioniert.
  • Ein negatives Kontrollplasmid, umfassend das Seq22 Element, funktionell gebunden an das GUS-Reportergen ist in 9 erklärt. Die Verstärkerregion (-865- bis -54) des Mais-Ubiquitin I Promotors (ubi-I) wurde stromaufwärts des Seq6 Elements in das Plasmid PHP8880 kloniert (10) oder das Seq22 Element (Kontrolle) in das Plasmid PHP8887, um den Basisgrad der Genexpression zu verbessern. Die resultierenden Plasmide umfassend den ubi-I Verstärker stromaufwärts entweder der Seq6 oder der Seq22 potenzielle gewebespezifische transkriptionale Elemente wurden UbiEnh.-Seq6-synCORE::GUS (PHP8888) oder und UbiEnh.-Seq22-synCORE::GUS (PHP8889) entsprechend entworfen. Einschlägige Sequenzen dieser GUS-Vektoren wurden durch Endonuklease-restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • B. Kurzzeit-Untersuchungen
  • Samen von zwei Maiszüchtungen, B73 und W22 Stadler, wurden oberflächensterilisiert durch Eintauchen in Bleichflüssigkeit für 1 Minute, gefolgt von mehreren Waschungen mit sterilem Wasser und pflanzen auf angefeuchtetem 20 lb-Gewicht Keimungspapier, gefolgt durch Inkubation bei 26°C im Dunkeln. Drei Tage alte Setzlinge wurden als Ziele der Partikelbombardement-Transformation verwendet und auf Luciferase (LUC) Aktivität getestet, wie im Wesentlichen durch Klein, et al. beschrieben (1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6681–6685). Sechs μg des CRC-Repotergens (ein chimärischer DNA-Bindungsfaktor abgeleitet von Mais C1 und R-Genprodukt) wurde gemeinsam mit 3 μg des Zielgens BzI::LUC gefällt und 1 μg des positiven Kontrollplasmids, DP3953 (Ubi-Ubi::GUS) auf Wolframpartikel. In dieser Untersuchung stellt die Luciferaseaktivität (von dem BzI::LUC Plasmid) eine indirekte Messung der Aktivität des CRC-Konstrukts dar. Acht μg des GUS-Reporterplasmids wurden gemeinsam mit 2 μg der internen Kontrolle PHP4992 (Ubi-Ubi::LUC) auf Wolframpartikel gefällt. Im Anschluss an die Transfektion wurde die GUS-Aktivität unter Verwendung des GUS-LightTM Kits (TROPIX) gemessen, gemäß dem Protokoll des Herstellers. Ganze Setzlinge wurden bombardiert und 1,5 cm Trieb als auch Wurzelgewebe wurden einzeln geerntet, gefolgt von einer 20-stündigen Inkubation bei 26°C. Die geernteten Gewebe wurden in 200 μl 100 mM Kaliumphosphat (pH 7,8), 1 mM EDTA homogenisiert. Nach Schleudern bei 4000 rpm für 30 Minuten wurde der Überstand direkt für sowohl GUS als auch LUC-Untersuchungen verwendet. Die Gen-Promotoraktivität wurde als LUC/GUS/2 μl Extrakte oder GUS/LUC/2 μl Extrakte ausgedrückt, abhängig von dem Testkonstrukt.
  • Das neue Sequenzelement Seq6 wurde beobachtet, ob es hohe Grade an wurzelbevorzugter Expression von sowohl GUS als auch CRC in Kurzzeit-Untersuchungen steuert (11 und 12 entsprechend). Kontrollsequenzelemente wie beispielsweise Seq15 und Seq22 änderten die Expressionsgrade nicht. Bedeutsamerweise wurden die Aktivitätsgrade des auf Seq6 beruhenden Expressionsvektors 100-fach erhöht durch Zugabe des Ubiquitin-Verstärkerelements stromaufwärts (2-fach über dem ubi-I Promotor alleine) unter Beibehaltung seiner Vorliebe für die Wurzelexpression. Wurzelbevorzugte Expression von GUS, gesteuert durch den Promotor, enthaltend das Seq6 Element (entworfen U/Seq6) ist weiter in 13 dargestellt. Die Daten zeigen, dass das Seq6 DNA-Element in Verbindung mit einem Minimalpromotor nützlich ist, die Genexpression in einer wurzelbevorzugten Art und Weise zu steuern.
  • BEISPIEL 3. Wurzelgewebebevorzugte Genexpression in transgenen Pflanzen
  • Es ist notwendig darzustellen, dass besagte wurzelgewebebevorzugte transkriptionale Regulationselemente die Genexpression in einer gewebebevorzugten Art und Weise in vivo steuern. Ein Modellsystem, das das Testen von potenziell wurzelgewebebevorzugter Genexpressionsvektoren erlaubt, ist die Entwicklung von transgenem Mais. Ein Expressionsvektor, umfassend potenziell wurzelgewebebevorzugte transkriptionale Regulationssequenzen, funktionell gebunden an ein GUS-Reportergen wird verwendet, um regenerierbare Maiskulturen durch die Partikelbombardement-Methode dauerhaft zu transformieren. Das Verfahren, das zur Transfektion von verschiedenen Typen von Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe verwendet wird, kann weiter einschließen aber ist nicht beschränkt auf Liposomvermittelte Transfektion, Kalziumphosphat-vermittelte Transfektion, bakteriell- oder viral-vermittelten Gentransfer oder Elektroporation. Ein zweiter Vektor, der ein auswählbares Markergen hinter einem Promotor trägt, der Aktivität in Pflanzen zeigt, wird gemeinsam bombardiert und verwendet um transformierte Ereignisse auszuwählen. Sofort nach dem Bombardement werden die Kulturereignisse bei 27°C im Dunkeln für 6 Tage inkubiert, gefolgt durch den Transfer in selektive Medien, enthaltend 3 mg/l Bialophos (Meiji Seika, Japan). Ungefähr 6 Wochen später werden mutmaßlich transformierte Kolonien in Regenerationsmedien transferiert. Nach mehreren Wochen, werden sich entwickelnde Embryos oder skutellare Strukturen transferiert und separat bei Licht kultiviert und die transgenen Maispflänzchen werden wiedergewonnen.
  • Im Anschluss an die Regeneration der Pflänzchen in Teströhrchen der Kalluskulturen, werden vier Setzlinge jedes Ereignisses in McCabe's Färbemittel gefärbt, um positive Ereignisse auszuwählen, die ins Gewächshaus gebracht werden. Für alle Ereignisse, die eine GUS-Färbung in den Setzlingen aufweisen, werden die Geschwisterpflanzen eingetropft und bis zur Reife im Gewächshaus aufgezogen. Im Anschluss an die Wiedergewinnung von bis zu 15 transgenen (TO) Pflanzen pro Ereignis, werden die Kolben befruchtet und im Gewächshaus reifen gelassen. An 5–9 Tagen nach der Befruchtung (dap) werden Proben von verschiedenen Regionen der Pflanzen einschließlich des Wurzelgewebes und mindestens eines Nichtwurzelgewebes gesammelt und verarbeitet. Zur visuellen Analyse der Promotoraktivität werden die Pflanzengewebe der Transgenen für 18–36 Stunden in McCabe's Färbelösung inkubiert. Kleine Segmente der Maisgewebe werden gemahlen, geschleudert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und für quantitative GUS-Untersuchungen durch das GUS-LightTM Chemilumineszenz-Detektionssystem verwendet, unter Verwendung der Bedingungen und Lösungen, die durch den Hersteller spezifiziert werden (Tropix, Inc., Bedford, MA). Komplett lösliche Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung von dem Fachmann wohl bekannten Verfahren, gemessen. Proben des Extrakts von mindestens zwei Gewebeproben, gesammelt von zwei Pflanzen jedes Ereignisses, wurden für jede Bestimmung verwendet. Die GUS-Expression ist aufgezeigt als ng GUS/mg Protein (ppm) und für alle analysierten transgenen Ereignisse gezeichnet. T1 Samen, gesammelt von Geschwisterpflanzen, die man vollständig entwickeln ließ, wurden bis zur Reife in einem Gewächshaus aufgezogen und Proben gesammelt und wieder wie für die T0 Pflanzen analysiert.
  • In allen positiven Setzlingsereignissen, die mit McCabe's Färbelösung gefärbt und visuell beobachtet werden, wird eine herausragende GUS-Expression vornehmlich im Wurzelgewebe beobachtet. Das GUS-LightTM Chemilumineszenz-Detektionssystem und die BCA-Proteinuntersuchung wurde anschließend verwendet, um die Menge der GUS-Proteinexpression in verschiedenen Geweben zu quantifizieren. Die Abweichungen in den Expressionsgraden zwischen den Ereignissen wird beobachtet, wie sie in Pflanzentransformationsexperimenten verwendeten Verfahren, wie beispielsweise dem Partikelbombardement, typischerweise beobachtet wird. Diese Abweichung kann multiplen oder variierenden Integrationsstellen (Positionseffekte), DNA-Rearrangement während der Integration oder ereignisspezifische Transgen-Stilllegung oder einer Instabilität zugeordnet werden. Diese Daten zeigen, dass das potenzielle wurzelgewebebevorzugte transkriptionale Regulationselement wurzelgewebebevorzugte Gene steuert. Folglich werden transkriptional regulatorische Elemente definiert, die wurzelgewebebevorzugte Genexpression in planta steuern.
  • BEISPIEL 4. Wurzelgewebebevorzugte Expression der Effektorgene, die Mais einen selektiven Vorteil verleihen
  • Wurzelgewebebevorzugte Genexpression bietet den Nutzen, dort keine starke Expressionen der Transgene in allen Pflanzengeweben zu haben, wo es wünschenswert ist. Zusätzlich können höhere Expressionsgrade wie beispielsweise mit dem CaMV 35S Promotor oder dem Mais-Ubiquitin-Promotor (Christensen et al., 1992) in bestimmten Anwendungen nicht benötigt oder gewünscht werden, wie mit Expression von höchster Effizienz [z. B. crylA(b)] oder potenzieller zytotoxischen (z. B. RNase) Genprodukten. Wurzelgewebebevorzugte transkriptionale Regulationselemente stellen eine geeignete Alternative zum Exprimieren von Genen in Pflanzen dar. Wurzelbevorzugte Genexpression stellt einer Pflanze verschiedene Vorteile zur Verfügung einschließlich aber nicht beschränkt auf die Veränderung der Wachstumsrate oder Funktion des Wurzelgewebes, Resistenz gegen wurzelbevorzugte Pathogene, Schädlinge, Herbizide oder ungünstige Wetterbedingungen als auch eine Erweiterung des Bereichs der Böden oder Umgebungen in welchen besagte Pflanzen gedeihen kann. Wurzelbevorzugte Gen expression kann ebenso ein Mechanismus zur Verfügung stellen, indem Wurzelmorphologie- und Metabolismus verändert sein können, um den Ertrag zu verbessern (d. h., direkte Expression der Transporterproteine). Weitere Vorteile der wurzelbevorzugten Genexpression schließen die Herstellung von nützlichen Proteinen in einem industriellen Rahmen ein. Vorteile schließen ein aber sind nicht beschränkt auf die Herstellung von lichtsensitiven Proteinen in Wurzelgewebe und dass besagte Proteine nicht dem Licht ausgesetzt werden.
  • Ein Beispiel schließt die Lieferung des Blattkäferlarven-(CRW)-Resistenzgens und folglich eine beschränkte Expression gegenüber Geweben, die zur CRW-Kontrolle notwendig sind, ein. Ein Expressionsvektor, umfassend Transgene umfassend ein wurzelgewebebevorzugtes transkriptionales Regulationselement funktionell gebunden an ein CRW-Resistenzgen wird in eine Kallusmaiskultur transfektiert. Ein zweiter Vektor umfasst einen auswählbaren Marker wird ebenso in besagte Kalluskulturen transfiziert, um ein Verfahren zur Selektion von transformierten Zellen zur Verfügung zu stellen. Die Transfektion und Isolation der transformierten Zellen einschließlich der Expansion und Wachstum in reife transgene Pflanzen, wird durchgeführt. Im Anschluss an die Identifikation der so transformierten Pflanzen, die besagte Transgene tragen, werden die Pflanzen durch Aussetzung der Blattkäferlarve herausgefordert. Pflanzen, die das CRW-Resistenzgen in Wurzelgeweben exprimieren, sind gegenüber der Herausforderung durch die Blattkäferlarve resistent. Folglich stellt besagte wurzelgewebebevorzugtes transkriptionales Regulationselement ein Werkzeug dar, mit dem wurzelbevorzugte Genexpression eines Effektorgens der Pflanze einen selektiven Vorteil verleiht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine beachtliche Verbesserung in der Methodologie dar, die zur Isolation und Nutzung von gewebebevorzugten Promotorelementen genutzt wird. Die vorliegende Erfindung wird von den Fachleuten als bedeutsam und neu angesehen. Besagte Erfindung stellt ein schnelles Mittel zur Identifizierung von Promotorelementen für eine Anzahl von regulierten Expressionsbedürfnissen, durch Umgehung der langatmigen Klonierungs-, Charakterisierungs- und Promotorpräparations-Techniken des Standes der Technik dar. Darüber hinaus ist die Methodologie dieser Erfindung anwendbar auf irgendein Organismus oder Gewebe, aus denen Kernextrakte zubereitet werden können und ist nicht in irgendeiner Weise beschränkt auf die Identifikation von Pflanzengewebe bevorzugten transkriptionalen Elementen. Während eine bevorzugte Form der Erfindung in den Zeichnungen gezeigt und beschrieben wurde, soll die Erfindung nicht als beschränkend auf die spezifisch gezeigte und beschriebene Form ausgelegt werden, aber stattdessen wie in den Ansprüchen dargelegt, da Abweichungen in der bevorzugten Form den Fachleuten ersichtlich sein wird.
  • SEQUENZAUFLISTUNG
    Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001

Claims (18)

  1. Isolierte Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfasst, wie sie in SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt ist.
  2. Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Sequenz wie in SEQ ID NO: 5 gezeigt ist.
  3. Vektor, der eine Nukleinsäure, wie sie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 definiert ist, umfasst.
  4. Vektor nach Anspruch 3, wobei die Nukleinsäure funktionell an ein Reporter- oder Effektorgen gebunden ist.
  5. Vektor nach Anspruch 4, wobei das Reportergen GUS ist.
  6. Vektor nach Anspruch 4, wobei das Effektorgen ausgewählt ist aus: einem Gen, das Resistenz gegen Schädlinge verleiht, einem Gen, das Resistenz gegen Pestizide verleiht, einem Gen, das beim Wachstum einer Pflanze involviert ist, einem Gen, das Resistenz gegen Verderb verleiht, und einem Gen, das Resistenz gegen ungünstige Wetterbedingungen verleiht.
  7. Vektor nach Anspruch 6, wobei das Effektorgen das Gen für Resistenz gegenüber der Blattkäferlarve der Gattung Diabrotica von Mais ist.
  8. Pflanzenzelle, die mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 3 bis 7 transformiert ist.
  9. Pflanzenzelle nach Anspruch 8, die eine Maiszelle ist.
  10. Pflanzenzelle nach Anspruch 8 oder 9, die eine Wurzelzelle ist.
  11. Transgene Pflanze, die mit einer Nukleinsäure transformiert ist, welche eine Nukleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt ist, funktionell an ein Reporter- oder Effektorgen gebunden hat.
  12. Transgene Pflanze nach Anspruch 11, wobei die Pflanze eine Maispflanze ist.
  13. Verfahren zur Erzeugung einer transgenen Pflanze, umfassend Transformieren einer regenerierbaren Pflanzenzellkultur mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 3 bis 7 und Regenerieren transformierter Pflanzen.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Pflanze eine Maispflanze ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Vektor eine gewebebevorzugte Genexpression steuert.
  16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei der Vektor eine Expression zu Wurzelgewebe steuert.
  17. Verfahren zum Exprimieren eines Effektorgens, vorzugsweise in Wurzelgewebe, umfassend funktionelles Verknüpfen einer Sequenz nach Anspruch 1 mit einem Effektorgen.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Effektorgen wie in Anspruch 6 definiert ist.
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