DE4341582C1 - Verfahren zur Boranalyse von suspendiertem biologischen Zellmaterial durch Atomabsorptionsspektroskopie - Google Patents
Verfahren zur Boranalyse von suspendiertem biologischen Zellmaterial durch AtomabsorptionsspektroskopieInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Boranalyse
von suspendiertem biologischen Zellmaterial
durch Atomabsorptionsspektroskopie unter Verwendung
eines Inertgasstroms durch eine Graphitküvette.
In den letzten Jahren hat die Analyse von Bor als Bestandteil
von chemischen Verbindungen für die Bor-Neutroneneinfangtherapie
[Boron Neutron Capture Therapy
(BNCT)] von Tumoren stark an Bedeutung gewonnen: Bei
dieser Behandlungstechnik wird Bor gekoppelt mit geeigneten
Carriermolekülen selektiv in Tumorzellen eingeschleust.
Bei einer nachfolgenden Bestrahlung mit
thermischen Neutronen erfolgt dann eine Kernreaktion
(¹⁰B(n.A)⁷Li) des im natürlichen Bor zu etwa 20% vorhandenen
¹⁰Bor-Isotops. Die ausgesandten Partikel
(A, ⁷Li) führen zu einer bevorzugten Abtötung der Tumorzellen,
während das gesunde Gewebe wegen der nur geringen
mittleren Reichweite von 10 Im (A) bzw. 5 Im
(Li) weitgehend geschont wird.
Für die Weiterentwicklung der BNCT ist daher die Auffindung
von möglichst selektiv tumorsuchenden Borverbindungen
besonders wichtig, was wiederum eine leistungsfähige
Methode zur Bestimmung des Bor-Anreicherungsgrades
in kultivierten Tumorzellen voraussetzt.
Bekannt sind Verfahren zur Visualisierung von Bor durch
relativ aufwendige Methoden: So erlaubt das Magnetic
Resonance Imaging eine exakte Lokalisierung von Bor
ohne weiteres in lebenden Organismen. An geeigneten histologischen
Präparaten ist ein Nachweis einzelner Boratome
im subzellulären Bereich mit Hilfe der Ionen-Mikroskopie
der Electron Energy Loss Spectroscopy und der
α-Track Autoradiography möglich.
Daneben sind chemische Nachweisverfahren zur quantitativen
Erfassung von Bor in biologischem Material bekannt,
wie die rein colorimetrischen Methoden, die eine
spektrophotometrische Borbestimmung mit Hilfe von komplexbildenden
Chemikalien wie 1,1′-Dianthrimid, Curcumin
oder Methylenblau erlauben. Die Nachweisgrenzen
liegen zwischen 0,1 und 1,0 mg Bor pro 1, wobei die
Proben allerdings als homogene Lösung vorliegen müssen
und die nachzuweisenden Borverbindungen zuvor zu Borsäure
oder ähnlichen, anorganischen Formen oxidiert
werden müssen.
Als Analysenmethoden für Serienanalysen bzw. Routine-Bestimmungen
von Bor haben sich vornehmlich die Direct
Current Plasma-Atomic Emission Spectroscopy [DCP-AES],
die Inductive Coupled Plasma-Atomic Emission Spectroscopy
[ICP-AES] und die Inductive Coupled Plasma-Mass
Spectrometry [ICP-MS] etabliert. Bei der DCP-AES
wird ein 6000-7000°K heißes Argon-Plasma mittels dreier
Elektroden erzeugt, wobei ein Plasma entsteht, dessen
Konfiguration einem umgedrehten "Y" entspricht. Die
(flüssigen) Proben werden dann mittels eines pneumatischen
Zerstäubers in das Plasma hineingebracht. Bei der ICP-AES
und bei der ICP-MS wird mit einem Hochfrequenzgenerator in einem
doppelwandigen Quarzkelch ein Argon-Plasma (T=8000°K)
erzeugt und die Proben werden auch hier mit einem Zerstäuber
vom Argonstrom in das Plasma transportiert. Die
Auswertung erfolgt über die Emissionsspektren oder mittels
eines Massenspektrometers.
Für die Analyse nach diesen Verfahren ist ein Aufschluß
der Proben notwendig, da selbst kleinste Partikel die
Zerstäuberkapillare verstopfen können.
Für die Bestimmung von Bor in biologischen Proben allgemein
wurde auch die Atomabsorptionsspektrometrie
(AAS) herangezogen: So wird eine Analyse von Bor in pflanzlichem
Material beschrieben
(Analytical Proceedings, 25 (1988), 233-235),
bei der nach
Verkoken und Vermahlen der Proben eine Atomisierung im
pyrolytisch beschichteten Graphitrohr des Atomabsorptionsspektrographen
(GF-AAS) erfolgt, in das die Proben
manuell eingebracht werden.
Selbst über ein Verfahren zur Borverteilungsanalyse an
mit unterschiedlichen Borverbindungen behandelten Tumorzellen
mittels Atomabsorptionsspektroskopie (AAS)
wurde kürzlich berichtet (Proceedings
of the Fourth International Symposium on Neutron
Capture Therapy for Cancer, Dec. 4-7, 1990, in Sydney,
Australia; B. J. Allen et al. (Eds.), Plenum Press, New
York (1992), 381-385). Die Nachweismethode wird nicht
näher beschrieben. Es wird lediglich angegeben, daß gesammelte
Zellen (Pellets) unter Zusatz von Wasser durch
Ultraschall aufgeschlossen und in den Spektrographen
injiziert wurden.
Auch diese Vorschläge zur Borbestimmung in biologischem
Material mit AAS gehen von aufgeschlossenem Zellmaterial
aus. Versuche zur Ermittlung von Bor unmittelbar
in Zellsuspension mit Hilfe der GF-AAS mit verfügbaren
Mitteln erweisen sich als problematisch, da bei
hohen Zelldichten ein Verklumpen oder Verkleben auftritt,
während die Nachweisempfindlichkeit bei hoher
Verdünnung nicht ausreicht.
Aufgabe der Erfindung ist daher ein Verfahren, mit
dessen Hilfe eine verläßliche und genügend empfindliche
Boranalyse in biologischem Probenmaterial relativ
einfach mit wenig kostspieligen Geräten erreicht werden
kann und das für Routineuntersuchungen tauglich ist.
Das zu diesem Zweck entwickelte erfindungsgemäße Verfahren
betrifft die Boranalyse von suspendiertem
biologischem Zellmaterial durch Atomabsorptionsspektroskopie
unter Verwendung eines Inertgasstromes durch
eine Graphitküvette, wobei nicht aufgeschlossenes,
nicht gemahlenes Probenmaterial mit einer Zelldichte
von 5×10⁶ bis 2×10⁷ Zellen/ml mit einer Dosierpipette
mit einer Spitze von 0,5 bis 2,5 mm lichter
Weite der Auslaßöffnung in eine Probeneinlaßöffnung von
1 bis 3 mm Durchmesser der Graphitküvette mit pyrolytisch
beschichteter Innenwand einpipettiert wird, wobei
während des Dosiervorgangs eine Unterbrechung des
Inertgasstroms mittels eines zeitgesteuerten Bypasses
durchgeführt wird, und wobei nach der Dosierung die
eigentliche Messung erfolgt.
Basis dieses Verfahrens ist die Feststellung, daß die
Borbestimmung in Zellsuspensionen mit Hilfe der GF-AAS
bei entsprechender Ausgestaltung
hinsichtlich der
Nachweisgrenze zu den oben genannten aufwendigen Methoden
durchaus konkurrenzfähig ist, wobei insbesondere
Serienanalysen auf einfache Weise durchgeführt werden
können. Dabei ist insbesondere zwischen den für eine
ausreichende Empfindlichkeit notwendigen Zelldichten
und ihrer genügenden Handhabung zu optimieren.
Zwar wird über die Bestimmung von Metallspuren in
biologischen Proben durch AAS schon seit längerer Zeit
berichtet: So wird im Int. Arch. Occup. Environ. Hlth. 39
(1977) 121-126 über die Bestimmung von Blei in Blutproben
in unterschiedlichen Techniken berichtet, wobei
auch verdünnte Blutproben unmittelbar in den Graphitofen
pipettiert werden. Letztere Technik wird als
nicht absolut zuverlässig deklariert. So verwundert es
nicht, daß diese Technik keinen Eingang in die Boranalytik
von Zellmaterial gefunden hat, zumal zum einen
die Zellgrößen der verdünnten Blutproben gering und zum
anderen das Risiko eines Verklumpens durch Zusätze wie
Erdalkaliionen (anders beim Bor) bei der Bleibestimmung
entfällt.
Gemäß Anal. Chem. 58 (1986) 2614-2617 werden Blei- und
Cadmiumspuren durch AAS in Pflanzenzellen nachgewiesen, indem
pulverisiertes Pflanzenmaterial als Aufschlämmung
in ein pyrolytisch beschichtetes Graphitrohr pipettiert
werden. Ferner wird gefriergetrocknetes tierisches
Gewebematerial in methanolischer Suspension analysiert,
wobei eine Mischung von Glycerin, Methanol und
Salpetersäure sowie ein sogenannter "Matrixmodifikator"
zur Anwendung kommen.
Nach Fresenius Z. Anal. Chem. 328 (1987) 346-353 werden Cd,
Cu, Mn, Pb, Zn in Gemüse (Spinat) und Einzell-Protein durch
AAS nachgewiesen, indem eine Suspension von feingemahlenem
Material (1-6 h in einer Zentrifugal-Kugelmühle)
insbesondere unter Zumischung eines Thixotropiemittels
homogenisiert und dann mittels eines Autosamplers der
pyrolytisch beschichteten Graphitküvette zugeführt
werden, in der dann Trocknung, Veraschung und Atomisierung
nacheinander gemäß bekannter Steuerung
ablaufen.
Auch gemäß Fresenius Z. Anal. Chem. 335 (1989) 195-199
erfolgt die Einführung von Probenmaterial in suspendierter
Form unmittelbar in das Graphitrohr mit Hilfe
eines Autosamplers, wobei die Proben unmittelbar vor
der Injektion nochmals einem insbes. durch Ultraschall
hervorgerufenen Mischvorgang unterzogen werden. In
dieser Weise werden Mo, Ru, Rh, Pd in Kernbrennstoffabfall
ohne chemische Vorbehandlung nachgewiesen.
Eine für die vorbeschriebene Prozeßtechnik geeignete
Vorrichtung wird in der DE 39 24 839 A1 beschrieben, wobei
eine Graphitrohrküvette mit innerem und äußerem
Schutzgasstrom näher erläutert wird, deren Besonderheit
in der Einregelung eines festen Verhältnisses der beiden
Schutzgasströme zueinander besteht, so daß der
Expansion der Gaswolke während der Atomisierung (bei
der mit Gasstop oder Gasminderung gearbeitet wird)
Grenzen gesetzt sind.
Auch bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Borbestimmung erweist
sich eine Anordnung mit einer heizbaren rohrförmigen
Küvette zur Atomisierung der Proben als zweckmäßig, die
eine inerte Innenwand oder innere Oberfläche - ggf. in
Form einer eingeschobenen Hülse - aufweist, mit der
die Bildung temperaturstabiler Borverbindungen vermieden
werden kann. Diese Anordnung besitzt für den Serienbetrieb
einen Autosampler mit Probengefäßen und Einrichtungen
zur Probenbewegung, um ein Sedimentieren o. dgl.
zu vermeiden, was insbesondere mit einem Magnetrührer
und Rührstäbchen in den Probengefäßen erreicht werden
kann.
Für den Transport der Proben des Autosamplers in die
Küvette sorgt eine Dosierpipette mit ausreichender Öffnungsweite
der Spitze, die dafür im Bereich von 0,5-2,5 mm
und insbesondere bei ca. 0,8 mm liegen soll. Dem
angepaßt hat die Probeneinlaßöffnung der Küvette einen
Durchmesser von 1-3 mm, insbesondere einen solchen von etwa 2 mm. Mit diesen
geringen Öffnungsweiten werden Empfindlichkeitsverluste
durch ein Abblasen von Probenmaterial aus der Öffnung
vermieden.
Zusätzlich wird für eine Unterbrechung des internen
Inertgasstroms durch die Küvette während des Dosiervorganges
gesorgt, was insbesondere mittels eines
entsprechend zeitgesteuerten Bypasses erreicht werden
kann. Als Inertgasstrom dient insbesondere ein
Argonstrom.
Weiterbildungen des Verfahrens ergeben sich aus
den Unteransprüchen. In der nachfolgenden Beschreibung
eines Ausführungsbeispiels einer Vorrichtung zur Durchführung des
Verfahrens zeigen:
Fig. 1 ein Schema des GF-AAS-Geräts mit
Autosampler und Bypass;
Fig. 2 ein Ausführungsdetail des Autosamplers zur
Probennahme;
Fig. 3 ein Schema der Probenzubereitung;
Fig. 4-7 Analyseergebnisse der Borbestimmung
in Zellmaterial.
Für die Borbestimmungen wurde ein Perkin-Elmer Atomabsorptionsspektrophotometer
(AAS) Modell 4000 verwendet,
das mit einer Perkin-Elmer HGA-500 Graphitrohrküvette
ausgerüstet war. In diesem Fall ist die Küvette rohrförmig,
aber selbstverständlich können auch andere
Geometrien vorgesehen werden.
Mit Hilfe eines Autosamplers (Fig. 2; Perkins-Elmer AS-1)
wurden 20 µl der zu untersuchenden Zellsuspension durch
ein Dosierloch in die Mitte des elektrisch beheizbaren
Graphitrohres pipettiert. Hier wurde die Zellsuspension
in einem mehrstufigen Heizprogramm bei 120°C getrocknet,
bei 1000°C verascht und bei 2500°C atomisiert, wie
in Tabelle 1 wiedergegeben ist.
Fig. 1 zeigt ein Schema für den verwendeten modifizierten
Atomabsorptionsspektrographen mit dem Autosampler
und der Graphitrohrküvette 1 in Aufsicht.
Der Probenteller 2 kann bis zu 30 Probenbecher aufnehmen
und zur Position des Dosierrüssels 3 transportieren.
Unterhalb des Drehtisches des Probentellers
sind zwei Magnetrührer 4 zum Antrieb der Rührstäbchen
angebracht. In Position 5 befindet sich der (nicht näher
ausgeführte) Schalter für die beiden 3-Wege-Magnetventile
6, die über ein Zeitverzögerungsrelais 7 gesteuert
werden. Die Strömungsrichtungen des internen
Argonstromes sind durch Pfeilspitzen angedeutet. Die Dosieröffnung
8 des Graphitrohrs 1 befindet sich innerhalb
der Ofeneinheit. Zum Betrieb der Magnetventile
dient ein 24-V-Netzteil (9).
Während des gesamten Prozesses wurde das Graphitrohr
ständig von 300 ml Argon pro Minute um- bzw. durchströmt.
Um die Verweildauer der Atomwolke im Strahlengang
zu verlängern, wurde der interne Argonstrom für
die Dauer der Atomisierung unterbrochen. Durch pyrolytische
Beschichtung der Innenwand der Graphitrohre
wurde die Bildung von Borcarbiden beim Atomisieren vermieden,
die sich in der Graphitrohrküvette praktisch
nicht mehr atomisieren lassen und sich somit der Analyse
mittels der Atomabsorptionsspektrometrie entziehen
würden.
Als Strahlungsquelle diente eine Bor-dotierte Hohlkathodenlampe
(Perkin-Elmer), die ein für Bor charakteristisches
Linienspektrum emittiert. Bei einer Wellenlänge
von 249,7 nm und einer Eintrittsspaltbreite von
0,7 nm wurde die Absorption der im Graphitrohr erzeugten
Atomwolke gemessen. Die Untergrundkompensation erfolgte
kontinuierlich durch eine Deuterium-Lampe.
Gemäß Fig. 2 arbeitet der Probenteller 2 des zum Autosampler
gehörenden Probenwechslers 10 mit dem Dosierrüssel
3 zusammen, der Probenmaterial aus den Probengefäßen
11 zur (nicht dargestellten) Graphitküvette
befördert. Das Handrad 12 dient zur manuellen Bewegung
des Dosierrüssels 3 zur Justierung der Pipettenspitze
in Bezug auf das Dosierloch 8 des Graphitrohres 1. Die
Drehknöpfe 13, 14 dienen zur Justierung der Pipettenspitze
in Richtung der Längs- bzw. Querachse des
Graphitrohres. Die Rändelscheibe 15 dient zur Justierung
der Eintauchtiefe der Pipettenspitze im
Graphitrohr.
Die Dosierkapillare des Dosierrüssels hatte einen Innendurchmesser
von 0,80 mm, so daß auch Suspensionen
mit einer hohen Zelldichte problemlos in das Graphitrohr
pipettiert werden konnten. Der notwendigerweise
möglichst geringe Durchmesser des Dosierlochs der Küvette
(im vorliegenden Fall 2,00 mm) führt zu einem
schmalen Spalt zwischen der Außenwand der Kapillare
(Außendurchmesser: 1,55 mm) und der Wand des Graphitrohrs
und damit Problemen beim Dosiervorgang, wobei
ggf. ein großer Teil der Probe aus dem Graphitrohr herausgetrieben
wird. Um dies zu vermeiden, wird entweder
der interne Argonstrom während des Dosiervorganges unterbrochen
oder, wie in Fig. 1 dargestellt, mit Hilfe
von zwei 3-Wege-Magnetventilen über einen Bypaß geleitet.
Diese Ventile sind so installiert, daß sie in stromlosem
Zustand den Argonstrom nicht beeinflussen. Während
des Dosiervorgangs wird vom Dosierrüssel 3 der Endschalter
5 betätigt, der beide Ventile 6 so schaltet, daß
der Spülgasstrom unterbrochen wird bzw. das Argon ins
Freie entweicht. Die Unterbrechungsdauer kann über das
Zeitverzögerungsrelais 7 variiert werden. Unter den im
vorliegenden Beispiel gewählten Bedingungen erwies sich
eine Verzögerung von 5 Sekunden als gut geeignet.
Um ein Sedimentieren der Zellen in den Probenbechern zu
verhindern, waren neben und unter dem Probenteller je
ein Magnetrührer 4 (Variomag Micro), die beide zusammen
7×2 mm große Magnetrührstäbchen in den Probenbechern
antreiben. Dadurch konnten gleichzeitig bis zu 10 der
insgesamt 30 auf dem Probenteller befindlichen Becherchen
gleichmäßig gerührt und die Zellen somit in
Suspension gehalten werden.
Um zu zeigen, daß zwischen der Menge an Bor in den
Zellsuspensionen und der gemessenen Atomabsorption ein
proportionales Verhältnis besteht, wurden zunächst
Eichmessungen sowohl mit Borsäure als auch mit Bor-phenylalanin
(BPA) durchgeführt. Dazu wurde bei der Probenzubereitung,
wie folgt, verfahren (vgl. Fig. 3):
In 1 ml AAS-Probenbecher wurden zuerst 50 µl 125 mM
CaCl₂-Lösung und dann 10 µl konzentrierte 9,5 M HCl
vorgelegt. Nach Zugabe von je 0,5 ml Bezugslösung bzw.
doppelt destilliertem Wasser wurden alle Probengefäße
auf einen Magnetrührer gestellt und je ein 7×2 mm
Rührstäbchen eingesetzt. Je 0,45 ml der vorher mit AAS-Medium
(handelsübliches Zellkulturmedium ohne Serum und
ohne Natriumhydrogencarbonat mit EDTA - oder Wasser)
verdünnten und mit einer Pasteurpipette gut gemischten
Zellsuspension wurden in die Probenbecher pipettiert.
Zuletzt wurden noch 20 µl einer 10%igen Triton-X-100-
Lösung zugegeben. Die Eichlösungen wurden mit Borkonzentrationen
von 0,5, 1,0 und 1,5 mg/l angesetzt. Für
die AAS-Messungen wurden je 20 µl mit dem Dosierrüssel
in die Küvette pipettiert.
Fig. 4 zeigt die beiden Eichgeraden in vollständiger
Koinzidenz zwischen 0 und 0,75 mg Bor/l Probenlösung.
Die Werte sind in Tab. 2 wiedergegeben.
Wie man sieht, spielt es für Absorptionsmessungen in
diesem Bereich keine Rolle, in welcher der beiden chemischen
Formen das Bor vorliegt. Ebenfalls konnte unter
diesen Bedingungen keine Isopendiskriminierung zwischen
¹⁰Bor (BPA) und natürlichem Bor (H₃BO₃;
80% ¹¹Bor und 20% ¹⁰Bor) festgestellt werden.
Anschließend wurde die Inkorporation von Bor via BPA
bzw. Borsäure in Zellen mit Hilfe der GF-AAS bestimmt:
Zellen, die 24 Std. lang mit je 1; 2,5; 5 und 10 mMol
BPA entsprechend 10, 50 und 100 mg Bor/l Medium
kultiviert worden waren, wurden, wie anhand von Fig. 3
beschrieben, für die GF-AAS vorbereitet. Dabei wurde
mit Verdünnungsfaktoren für die untersuchten Zellsuspensionen
gearbeitet, wie in Tab. 3 angegeben ist.
In Fig. 5 sind die Ergebnisse der Standardadditionsmessungen
graphisch dargestellt: Bei allen Diagrammen erkennt
man sofort den linearen Verlauf der Bezugsgeraden.
An dem Schnittpunkt der über die Ordinate hinaus
verlängerten Bezugsgeraden mit dem negativen Ast der
Abszisse wurde der Betrag der Borkonzentration der betreffenden
Probe abgelesen. In Tabelle 4 sind die
graphisch bestimmten Borkonzentrationen ± Größtfehler
aufgeführt, sowie die durch Multiplikation mit den Verdünnungsfaktoren
aus Tab. 3 errechneten Borkonzentrationen
pro ml Ausgangszellsuspension und die Borkonzentrationen
bezogen auf die Proteinmenge.
Tabelle 5 zeigt Mittelwerte (± Standardabweichung) aus
drei Versuchsreihen, die - wie Tab. 6 zeigt - in Borkonzentrationen
in nmol pro 10³ Zellen, Anzahl Boratome
pro Zelle, sowie Borkonzentrationen bezogen auf 1 g
B16F1-Melanomzellen umgerechnet wurden.
Zur Ermittlung der Präzision der Borbestimmung wurde
bei einer einzelnen Probe aus einer Zellsuspension des
BPA-Versuchs Nr. 1 (2,5 mmol BPA/l, 24 h Inkubationsdauer)
die optische Absorption mit 3 und mit
9 Dosierungen bestimmt. Ein Vergleich beider Mittelwerte
und der relativen (prozentualen) Standardabweichungen
(s. D.) bei 3 Analysen gegenüber 9 Analysen pro Probe
ergab folgendes Ergebnis:
Wie man sieht, wird bereits mit 3 Analysen eine Präzision
erreicht, die durch Steigung der Analysenzahl
auf 9 nur noch geringfügig verbessert wird.
Bei Variation der Zelldichte in den Zellsuspensionen
der Probenlösung wurde eine Zelldichte von etwa 5×10⁷
B16-Zellen/2 ml Probenlösung als oberer Grenzwert ermittelt.
Die Inkorporation von Bor in Zellen via Borsäure wurde
analog zu den BPA-Messungen ermittelt. Fig. 6 zeigt das
erhaltene Ergebnis.
Das Verfahren zur Borbestimmung in Zellmaterial ist
von erheblicher Leistungsfähigkeit und läßt z. B. Unterschiede
in Meßergebnissen erkennen, die ausgehend von
borinkorporierten Zellen ermittelt werden, die vom
Kulturträger mechanisch entfernt oder mit Trypsin/EDTA
abgelöst wurden (siehe Fig. 7).
Die vorstehenden Versuche und Ergebnisse machen
deutlich, daß auf relativ einfache
Weise und mit sehr viel geringerem Aufwand Borinkorporationen
in Zellmaterialien überwacht werden
können als nach den bislang dafür akzeptierten
Verfahren der DCP-AES, ICP-AES.
Das hier beschriebene Verfahren liefert zuverlässige
Ergebnisse bis zu einer Borkonzentration von 0,05 mg/Bor/l
AAS-Probenlösung. Im Vergleich dazu werden mit
der DCP-AES 0,1 mg Bor/l Zellsuspension
(Anal. Chem. 63 (1991) 890-93) und mit der ICP-AES 0,05 mg
Bor/l erreicht
(Proceedings of the Fourth International Symposium on Neutron
Capture Therapy for Cancer, Dec. 4-7, 1990, in
Sydney, Australia, B. J. Allen, ital.
(Eds.), Plenum Press, New York (1992),
297-300.
Durch Anwendung des Standardadditionsverfahrens erhöht
sich wegen des Verdünnungsfaktors von 2,29 der untere
Grenzwert für die Borkonzentration in den Zellsuspensionen
auf 0,115 mg Bor/l. Zusätzlich zu der per
definitionem festgelegten Nachweisgrenze kann dieser
Wert als die in der Routine erreichte Bestimmungsgrenze
betrachtet werden.
Um die Richtigkeit des hier angewendeten Analyseverfahrens
zu überprüfen, wurden definierte Mengen an
Bor in Form von Borsäure bzw. BPA im selben Verhältnis,
wie für die Eichmessungen beschrieben, den Zellsuspensionen
zugesetzt. Danach wurde der Borgehalt von
denjenigen Suspensionen bestimmt, zu denen vorher schon
0,25 mg Bor/l hinzugegeben worden waren. In allen
Fällen wurden 100±5% des hinzugefügten Bors wiedergefunden.
Claims (5)
1. Verfahren zur Boranalyse von suspendiertem
biologischen Zellmaterial durch Atromabsorptionsspektroskopie
unter Verwendung eines Inertgasstromes
durch eine Graphitküvette, wobei nicht
aufgeschlossenes, nicht gemahlenes Probematerial
mit einer Zelldichte von 5×10⁶ bis 2×10⁷
Zellen/ml mit einer Dosierpipette mit einer Spitze
von 0,5 bis 2,5 mm lichter Weite der Auslaßöffnung
in eine Probeneinlaßöffnung von 1 bis 3 mm Durchmesser
der Graphitküvette mit pyrolytisch beschichteter
Innenwand einpipettiert wird, wobei
während des Dosiervorgangs eine Unterbrechung des
Inertgasstroms mittels eines zeitgesteuerten
Bypasses durchgeführt wird, und wobei nach der
Dosierung die eigentliche Messung erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
wobei das Zellmaterial vor dem Dosiervorgang
mittels eines Magnetrührers vergleichmäßigt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
wobei die Zellsuspension mit einer Ca2+-Lösung
versetzt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
wobei eine weitere Unterbrechung des Inertgasstromes
während der Atomisierung erfolgt.
5. Verwendung eines Verfahrens nach einem der
Ansprüche 1 bis 4 zur Analyse von Tumorgewebe.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19934341582 DE4341582C1 (de) | 1993-12-07 | 1993-12-07 | Verfahren zur Boranalyse von suspendiertem biologischen Zellmaterial durch Atomabsorptionsspektroskopie |
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