DE9320771U1 - Anordnung zur Bestimmung von Bor in biologischen Proben - Google Patents

Anordnung zur Bestimmung von Bor in biologischen Proben

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Description

Forschungszentrum Jülich GmbH
Amtl. AZ: G 93 20 771.9
Beschreibung
Anordnung zur Bestimmung von Bor in biologischen Proben
Die Neuerung bezieht sich auf eine Anordnung zur Boranalyse von suspendiertem biologischen Material, insbesondere von suspendiertem Zellmaterial, durch Atomabsorptionsspektroskopie
In den letzten Jahren hat die Analyse von Bor als Bestandteil von chemischen Verbindungen für die Bor-Neutroneneinfangtherapie [Boron Neutron Capture Therapy (BNCT)] von Tumoren stark an Bedeutung gewonnen: Bei dieser Behandlungstechnik wird Bor gekoppelt mit geeigneten Carriermolekülen selektiv in Tumorzellen eingeschleust. Bei einer nachfolgenden Bestrahlung mit thermischen Neutronen erfolgt dann eine Kernreaktion
1&Pgr; 7
(iUB(n.a) Li) des im natürlichen Bor zu etwa 20 % vorhandenen Bor-Isotops. Die ausgesandten Partikel (a, Li) führen zu einer bevorzugten Abtötung der Tumorzellen, während das gesunde Gewebe wegen der nur geringen mittleren Reichweite von 10 &mgr;&idiagr;&eegr; (&agr;) bzw. 5 &mgr;&iacgr;&tgr;&igr; (Li) weitgehend geschont wird.
Für die Weiterentwicklung der BNCT ist daher die Auffindung von möglichst selektiv Tumor-suchenden Borverbindungen besonders wichtig, was wiederum eine leistungsfähige Methode zur Bestimmung des Bor-Anreicherungsgrades in kultivierten Tumorzellen voraussetzt.
T 1.1180 Gbm
nö/ha
Bekannt sind Verfahren zur Visualisierung von Bor durch relativ aufwendige Methoden: So erlaubt das Magnetic Resonance Imaging eine exakte Lokalisierung von Bor ohne weiteres In lebenden Organismen. An geeigneten histologischen Präparaten ist ein Nachweis einzelner Boratome im subzellulären Bereich mit Hilfe der Ionen-Mikroskopie der Electron Energy Loss Spectroscopy und der &agr;-Track Autoradiography möglich.
Daneben sind chemische Nachweisverfahren zur quantitativen Erfassung von Bor in biologischem Material bekannt, wie die rein colorimetrischen Methoden, die eine spektrophotometrische Borbestimmung mit Hilfe von komplexbildenden Chemikalien wie 1,1'-Dianthrimid, Curcumin oder Methylenblau erlauben- Die Nachweisgrenzen liegen zwischen 0,1 und 1,0 mg Bor pro 1, wobei die Proben allerdings als homogene Lösung vorliegen müssen und die nachzuweisenden Borverbindungen zuvor zu Borsäure oder ähnlichen, anorganischen Formen oxidiert werden müssen.
Als Analysenmethoden für Serienanalysen bzw. Routine-Bestimmungen von Bor haben sich vornehmlich die Direct Current Plasma-Atomic Emission Spectroscopy [DCP-AES], die Inductive Coupled Plasma-Atomic Emission Spectroscopy [ICP-AES] und die Inductive Coupled Plasma-Mass Spectrometry [ICP-MS] etabliert. Bei der DCP-AES wird ein 6000-70000K heißes Argon-Plasma mittels dreier Elektroden erzeugt, wobei ein Plasma entsteht, dessen Konfiguration einem umgedrehten "Y" entspricht. Die (flüssigen) Proben werden dann mittels eines pneumatischen Zerstäubers in das Plasma hineingebracht. Bei der ICP-AES und der ICP-MS wird mit einem Hochfrequenzgenerator in einem doppelwandigen Quarzkelch ein Argonplasma (T = 8000 K)
erzeugt und die Proben werden auch hier mit einem Zerstäuber vom Argonstrom in das Plasma transportiert. Die Auswertung erfolgt über die Emissionsspektren oder mittels eines Massenspektrometers.
Für die Analyse nach diesen Verfahren ist ein Aufschluß der Proben notwendig, da selbst kleinste Partikel die Zerstäuberkapillare verstopfen können.
Für die Bestimmung von Bor in biologischen Proben allgemein wurde auch die Atomabsorptionsspektrometrie (AAS) herangezogen: So beschreiben N.W. Barnett et al. (Analytical Proceedings, 25. (1988), 233-235) eine Analyse von Bor in pflanzlichem Material, bei der nach Verkoken und Vermählen der Proben eine Atomisierung im pyrolytisch beschichteten Graphitrohr des Atomabsorptionsspektrographen (GF-AAS) erfolgt, in das die Proben manuell eingebracht werden.
Selbst über ein Verfahren zur Borverteilungsanalyse an mit unterschiedlichen Borverbindungen behandelten Tumorzellen mittels Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) wurde kürzlich berichtet (T. Nguyen et al. in Proceedings of the Fourth International Symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer, Dec. 4-7, 1990, in Sydney, Australia, B.J. Allen et al. (Eds.), Plenum Press, New York (1992), 381-385). Die Nachweismethode wird nicht näher beschrieben. Es wird lediglich angegeben, daß gesammelte Zellen (Pellets) unter Zusatz von Wasser durch Ultraschall aufgeschlossen und in den Spektrographen injiziert wurden.
Auch diese Vorschläge zur BorbeStimmung in biologischem Material mit AAS gehen von aufgeschlossenem Zellmaterial aus. Versuche zur Ermittlung von Bor unmittel-
bar in Zellsuspension mit Hilfe der GF-AAS mit verfügbaren Mitteln erweisen sich als problematisch, da bei hohen Zelldichten ein Verklumpen oder Verkleben auftritt, während die Nachweisempfindlichkeit bei hoher Verdünnung nicht ausreicht.
Ziel der Neuerung ist daher eine
Anordnung, mit deren Hilfe eine verläßliche und genügend empfindliche Boranalyse in biologischem Probenmaterial relativ einfach mit wenig kostspieligen Geräten erreicht werden kann und die für Routineuntersuchungen tauglich ist.
Die zu diesem Zweck entwickelte neuerungsgemäße Anordnung ist gekennzeichnet durch eine Dosierpipette mit einer Spitze von 0j5 - 2,5 mm, insbesondere um 0,8 mm, lichter Weite, eine Probeneinlaßöffnung der Küvette von 1-3 nun J&, insbesondere um 2 mm &, und eine im Hinblick auf die Bildung temperaturstabiler Borverbindungen inerce Innenfläche der Küvette sowie Rühreinrichtungen zur Egalisierung der Proben in den Probengefäßen des Autosampiers.
Mit so geringen öffnungsweiten werden Empfindlichkeitsverluste durch ein Abblasen von Probenmaterial aus dieser Öffnung vermieden.
Mit dieser Anordnung kann nicht aufgeschlossenes Proben material mit einer Teilchen- bzw. Zelldichte von
fs 7
5 x 10 bis 2 &khgr; 10' Zellen/ml in die heizbare Küvette eines Atomabsorptionsspektrographen eingebracht und analysiert werden.
Basis dieses Vorschlages ist die Feststellung, daß die Borbestinxmung in Zellsuspensionen mit Hilfe der GF-AAS bei entsprechender Ausgestaltung
der dafür notwendigen Gerätschaften hinsichtlich der Nachweisgrenze zu den oben genannten aufwendigen Methoden durchaus konkurrenzfähig ist, wobei insbesondere Serienanalysen auf einfache Weise durchgeführt werden können. Dabei ist insbesondere zwischen den für eine ausreichende Empfindlichkeit notwendigen Zelldichten und ihrer genügenden Handhabung zu optimieren.
Als zweckmäßig hat sich eine Anordnung mit einer heizbaren rohrförmigen Küvette zur Atomisierung der Proben erwiesen, die eine inerte Innenwand oder innere Oberfläche - ggf. in Form einer eingeschobenen Hülse aufweist, mit der die Bildung temperaturstabiler Borverbindungen vermieden werden kann. Diese Anordnung hat für den Serienbetrieb einen Autosampier mit Probengefäßen und Einrichtungen zur Probenbewegung, um ein Sedimentieren o.dgl. zu vermeiden, was insbesondere mit einem Magnetrührer und Rührstäbchen in den Probengefäßen erreicht werden kann.
Zusätzlich sind Mittel zweckmäßig für eine Unterbrechung des internen Inertgasstroms durch die Küvette während des Dosiervorganges, was insbesondere durch einen entsprechend zeitgesteuerten Bypass realisiert werden kann. Als Inertgasstrom dient insbesondere ein an sich bekannter Argonstrom.
Weitere Besonderheiten der Neuerung ergeben sich aus den Schutzansprüchen sowie der nachfolgenden Beschreibung eines Ausführungsbeispiels, die auf die angefügten Zeichnungen Bezug nimmt. Es zeigen im einzelnen:
Figur 1 ein Schema für das GF-AAS-Gerät mit
Autosampier und Bypass; Figur 2 Ausführungsdetail den Autosampier und
die Probennahme betreffend; und
Figur 3 e^n Kurvenbild für die Borbestimmung
in Zellmaterial.
Beispiel
Für die Borbestimmungen wurde ein Perkin-Elmer Atomabsorptionsspektrophotometer (AAS) Modell 4000 verwendet, das mit einer Perkin-Elmer HGA-500 Graphitrohrküvette ausgerüstet war. In diesem Fall ist die Küvette rohrförmig, aber selbstverständlich können auch andere Geometrien vorgesehen werden.
Mit Hilfe des Autosampiers (Fig. 2; Perkin-Elmer AS-I) wurden 20 &mgr;&idiagr; der zu untersuchenden Zellsuspension durch ein Dosierloch in die Mitte des elektrisch beheizbaren Graphitrohres pipettiert. Hier wurde die Zellsuspension in einem mehrstufigen Heizprogramm bei 1200C getrocknet, bei 10000C verascht und bei 25000C atomisiert
Fig. 1 zeigt ein Schema für den neuerungsgemäß modifizierten Atomabsorptionsspektrographen mit Autosampier und der Graphitrohrküvette 1 in Aufsicht. Der Probenteller 2 kann bis zu 30 Probenbecher aufnehmen und zur Position des Dosierrüssels 3 transportieren. Unterhalb des Drehtisches des Probentellers sind zwei Magnetrührer 4 zum Antrieb der Rührstäbchen angebracht. Tn Position 5 befindet sich der (nicht näher ausgeführte) Schalter für die beiden 3-Wege-Magnetventile 6, die über ein Zeitverzögerungsrelais 7 gesteuert werden. Die Strömungsrichtungen des internen Argonstroms sind durch Pfeilspitzen angedeutet. Die Dosieröffnung 8 des Graphitrohrs 1 befindet sich innerhalb der Ofeneinheit. Zum Betrieb der Magnetventile dient ein 24 V-Netzteil (9) .
Während des gesamten Prozesses wurde das Graphitrohr ständig von 300 ml Argon pro Minute um- bzw. durchströmt. Um die Verweildauer der Atomwolke im Strahlengang zu verlängern, wurde der interne Argonstrom für die Dauer der Atomisierung unterbrochen. Durch pyrolytische Beschichtung der Innenwand der Graphitrohre wurde die Bildung von Borcarbiden beim Atomisieren vermieden, die sich in der Graphitrohrküvette praktisch nicht mehr atomisieren lassen und sich somit der Analyse mittels der Atomabsorptionsspektrometrie entziehen würden.
Als Strahlungsquelle diente eine Bor-dotierte Hohlkathodenlampe (Perkin-Elmer), die ein für Bor charakteristisches Linienspektrum emittiert. Bei einer Wellenlänge von 249,7 nm und einer Eintrittsspaltbreite von 0,7 nm wurde die Absorption der im Graphitrohr erzeugten Atomwolke gemessen. Die Untergrundkompensation erfolgte kontinuierlich durch eine Deuterium-Lampe.
Gemäß Fig. 2 arbeitet der Probenteller 2 des zum Autosampler gehörenden Probenwechslers 10 mit dem Dosierrüssel 3 zusammen, der Probenmaterial aus den Probengefäßen 11 zur (nicht dargestellten) Graphitküvette befördert. Das Handrad 12 dient zur manuellen Bewegung des Dosierrüssels 3 zur Justierung der Pipettierspitze in Bezug auf das Dosierloch 8 des Graphitrohres 1. Die Drehknöpfe 13, 14 dienen zur Justierung der Pipettenspitze in Richtung der Längs- bzw. Querachse des Graphitrohres. Die Rändelschraube 15 dient zur Justierung der Eintauchtiefe der Pipettierspitze im Graphitrohr.
Die Dosierkapillare des Dosierrüssels hatte einen Innendurchmesser von 0,80 mm, so daß auch Suspensionen mit einer hohen Zelldichte problemlos in das Graphitrohr pipettiert werden konnten. Der notwendigerweise möglichst geringe Durchmesser des Dosierlochs der Küvette (im vorliegenden Fall 2,00 mm) führt zu einem schmalen Spalt zwischen der Außenwand der Kapillare (Außendurchmesser: 1,55 mm) und der Wand des Graphitrohrs und damit Problemen beim Dosiervorgang, wobei ggf. ein großer Teil der Probe aus dem Graphitrohr herausgetrieben wird. Um dies zu vermeiden, wird entweder der interne Argonstrom während des Dosiervorganges unterbrochen oder, wie in Fig. 1 dargestellt, mit Hilfe von zwei 3-Wege-Magnetventilen über einen Bypaß geleitet.
Diese Ventile sind so installiert, daß sie in stromlosem Zustand den Argonstrom nicht beeinflussen. Während des Dosiervorgangs wird vom Dosierrüssel 3 der Endschalter 5 betätigt, der beide Ventile 6 so schaltet, daß der Spülgasstrom unterbrochen wird bzw. das Argon ins
Freie entweicht. Die Unterbrechungsdauer kann über das Zeitverzögerungsrelais 7 variiert werden. Unter den im vorliegenden Beispiel gewählten Bedingungen erwies sich eine Verzögerung von 5 Sekunden als gut geeignet.
Um ein Sedimentieren der Zellen in den Probenbechern zu verhindern, waren neben und unter dem Probenteller je ein Magnetrührer 4 (Variomag Micro), die beide zusammen 7x2 mm große Magnetrührstäbchen in den Probenbechern antreiben. Dadurch konnten gleichzeitig bis zu 10 der insgesamt 30 auf dem Probenteller befindlichen Becherchen gleichmäßig gerührt und die Zellen somit in Suspension gehalten werden.
Um zu zeigen, daß zwischen der Menge an Bor in den Zellsuspensionen und der gemessenen Atomabsorption ein proportionales Verhältnis besteht, wurden zunächst Eichmessungen sowohl mit Borsäure als auch mit Bor-phenylalanin (BPA) durchgeführt. Dazu wurde bei der Probenzubereitung, wie folgt, verfahren:
In 1 ml AAS-Probenbecher wurden zuerst 50 &mgr;&idiagr; 125 mM CaCl2~Lösung und dann 10 &mgr;&idiagr; konzentrierte 9,5 M HCl vorgelegt. Nach Zugabe von je 0,5 ml Bezugslösung bzw. doppelt destilliertem Wasser wurden alle Probengefäße auf einen Magnetrührer gestellt und je ein 7x2 mm Rührstäbchen eingesetzt. Je 0,45 ml der vorher mit AAS-Medium (handelsübliches Zellkulturmedium ohne Serum und ohne Natriumhydrogencarbonat mit EDTA - oder Wasser) verdünnten und mit einer Pasteurpipette gut gemischten Zellsuspension wurden in die Probenbecher pipettiert. Zuletzt wurden noch 20 &mgr;&idiagr; einer 10%igen Triton X-100-Lösung zugegeben. Die Eichlösungen wurden mit Borkonzentrationen von 0,5, 1,0 und 1,5 mg/1 angesetzt. Für die AAS-Messungen wurden je 20 &mgr;&idiagr; mit dem Dosierrüssel
in die Küvette pipettiert.
Fig. 3 zeigt die beiden Eichgeraden in vollständiger Koinzidenz zwischen 0 und 0,75 mg Bor/l Probenlösung. Die Werte sind in Tab. 1 wiedergegeben.
Tabelle 1
Borkonzentration
in mg/1		 Borsäure
K/Abs. ± S.D.		 BPA
E/Abs. ± S.D.
0,25 0,059 ±0,0010 0,059 ±0,0012
0,50 0,118 ±0,0010 0,118 ±0,0006
0,75 0,174 ± 0,0020 0,175 ±0,0010
Wie man sieht/ spielt es für Absorptionsmessungen in diesem Bereich keine Rolle, in welcher der beiden chemischen Formen das Bor vorliegt. Ebenfalls konnte unter diesen Bedingungen keine Isotopendiskriminierung zwischen 10Bor (BPA) und natürlichem Bor (H3BO3; 80 % 11BOr und 20 % 10Bor) festgestellt werden.
Mit der beschriebenen Anordnung können zuverlässige Ergebnisse bis herab zu einer Borkonzentration von 0,05 mg Bor/l AAS-ProbenlÖsung erhalten werden.

Claims (3)

Forschungszentrum Julien GmbH Amtl. AZ: G 93 20 771.9 Schutzansprüche
1. Anordnung zur Atomabsorptionsspektroskopie von borhaltigen Proben mit einer heizbaren Küvette zur Atomisierung der Proben und Autosampier mit Dosierpipette,
gekennzeichnet durch
eine Dosierpipette mit einer Spitze von 0,5 - 2,5 mm, insbesondere um 0,8 mm, lichter Weite, eine Probeneinlaßöffnung der Küvette von 1 - 3 mm JSi, insbesondere um 2 mm &, und eine im Hinblick auf die Bildung teraperaturstabiler Borverbindungen inerte Innenfläche der Küvette sowie Rühreinrichtungen zur Egalisierung der Proben in den Probengefäßen des Autosampiers.
2. Anordnung nach Anspruch 1,
gekennzeichnet durch Mittel zur Unterbrechung des internen Inertgasstroms, insbesondere Argonstroms, durch die Küvette während des Dosiervorganges, insbesondere in Form eines entsprechend zeitgesteuerten Bypasses .
3. Anordnung nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch zumindest einen Magnetrührer für mit Rührstäbchen versehene Probengefäße des Autosampiers.
'T 1.1180 Gbm
nö
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