DE4337629A1 - Antimikrobiell wirkende Oasomycin-Derivate, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Makrolactone, die Derivate der natürlichen Oasomycine A und B sind, ein Herstellungsverfahren für diese Verbindungen sowie deren Verwendung als pharmakologische Wirkstoffe.

Antimikrobiell wirkende Makrolactone sind als Metaboliten des Sekundärstoffwechsels von Streptomyceten bekannt. Ein Beispiel hierfür ist das klinisch vielfach angewandte Makrolid-Antibiotikum Amphotericin B, das zur Klasse der Heptaene innerhalb der Makrolactone gehört. Es wird zur Behandlung schwerer Pilzinfektionen, insbesondere bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem, verwendet.

Die therapeutische Verwendung dieses Naturstoffes ist jedoch durch schwerwiegende Nebenwirkungen, insbesondere eine ausgeprägte Nephrotoxizität, sowie seine Schwerlöslichkeit stark eingeschränkt. Ursache hierfür ist die geringe Selektivität des Antibiotikums in seinem Wirkmechanismus. Es wirkt durch Störung des Steroidstoffwechsels in Zellmembranen. Zahlreiche Versuche wurden unternommen, die toxischen Nebenwirkungen durch chemische Derivatisierung zu beheben, doch führten diese Strukturvariationen wiederum zu toxischen Effekten oder zu stark reduzierter antifungischer Wirksamkeit.

Zahlreiche weitere Antibiotika aus Streptomyceten- oder Streptoverticillium- Stämmen, die eine große Ringstruktur besitzen und auf vielfältige Weise zu verwenden sind, sind seit längerem bekannt.

In EP 921 18 516.1 ist beschrieben, daß Streptoverticillium- und Streptomyces- Stämme neue makrocyclische Lactone, die Oasomycine A und B, produzieren. Diese Verbindungen besitzen pharmakologische und damit therapeutische Wirksamkeit und können insbesondere als antibakterielle Mittel sowie als Inhibitoren der Cholesterin-Biosynthese mit entsprechendem pharmakologischen Nutzen eingesetzt werden.

Weiterhin sind aus DE-P-43 03 513.2 die Naturstoffe Oasomycin C, D, E und F bekannt, welche von den Mikroorganismen Streptoverticillium sp. und/oder Streptomyces sp. während der Fermentation synthetisiert und in den Kulturüberstand abgegeben werden, ihr Herstellungsverfahren und die Verwendung von Oasomycin C, D, E, F als pharmakologische Wirkstoffe.

Beispiele für Antibiotika aus Streptomyceten sind außerdem die antifungischen Amycine (EP 02 72 668) sowie die von J. V. Uri (Acta Microbiologica 33, 271 (1986)) beschriebenen Desertomycine. Diese nicht polygenen Makrolid- Antibiotika besitzen ausgeprägte antifungische Aktivitäten. Die mit den Desertomycinen eng in ihrer Struktur verwandten Oasomycine (EP 04 82 543) besitzen pharmakologische Wirksamkeit und können insbesondere als antibakterielle Mittel sowie als Inhibitoren der Cholesterin-Biosynthese mit therapeutischem Nutzen eingesetzt werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, nach Derivaten von Oasomycin A oder B mit verbesserten pharmakologischen Eigenschaften und neuen Wirkmechanismen zu suchen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Derivatisierung der Oasomycine A oder B, indem man funktionelle Seitenketten unter nucleophiler Öffnung des 5-Ringlactons in die Oasomycine A oder B ohne Verwendung einer Schutzgruppe selektiv einführt und dadurch einen Makrocyclus erhält.

Die Erfindung betrifft somit:

• 1. Eine Verbindung der Formel (I) in der R¹ Wasserstoff oder α-Mannosyl und R² einen Rest der allgemeinen Formel (II) bedeutet, wobei R³ einen einfachen oder verzweigten, gegebenenfalls selbst funktionelle Gruppen tragenden Alkylrest mit 1 bis 22 C-Atomen und R⁴ Wasserstoff bedeutet,
  oder R³ und R⁴ einfache oder verzweigte, gegebenenfalls selbst funktionelle Gruppen tragende Alkylreste mit 1 bis 22 C-Atomen bedeuten, die gleich oder verschieden sowie Bestandteil eines gesättigten cyclo-aliphatischen oder heterocycloaliphatischen Systems sein können.
• 2. Eine Verbindung der Formel (III) in der R¹ Wasserstoff oder α-Mannosyl und R² eine gemäß Anspruch 1 definierte Bedeutung haben.
• 3. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) oder (III) gemäß den Ansprüchen 1 und 2, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (IV) in der R¹ Wasserstoff oder die Gruppe bedeutet, mit einem primären oder sekundären Amin der allgemeinen Formel (V) wobei R³ und R⁴ die vorgenannten Bedeutungen haben, umsetzt.
• 4. Eine Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder (III) nach Anspruch 1 oder 2 als pharmakologisch wirksamen Stoff, insbesondere als antimikrobiellen Wirkstoff zur Vorbeugung oder Heilung von Infektionen mit Pilzen, Bakterien oder Protozoen sowie zur Bekämpfung von Nematoden und Helminthen.

Im folgenden wird die Erfindung detailliert beschrieben, insbesondere in ihren bevorzugten Ausführungsformen. Ferner wird die Erfindung durch den Inhalt der Patentansprüche bestimmt.

Die Verbindung der Formel (IV) in der R¹ Wasserstoff bedeutet, wird Oasomycin A genannt. Bedeutet R¹ einen Mannoserest, wird diese Verbindung Oasomycin B genannt.

Unter funktionellen Gruppen versteht man Gruppen, die chemisch modifiziert werden können. Diese funktionellen Gruppen werden hauptsächlich von einem Kohlenwasserstoffgerüst getragen. Hierzu zählen vorzugsweise Aminogruppen und basische Heterocyclen.

Der Begriff "multifunktionell" beschreibt die Reaktionsfähigkeit eines Amins, welches in der Seitenkette weitere basische Aminofunktionen trägt. Entsprechend versteht man unter "bifunktionell" solche Amine, die in der Seitenkette zwei basische Aminofunktionen tragen.

Heterocyclische Verbindungen sind Verbindungen mit ringbildenden Atomen aus mindestens zwei verschiedenen Elementen. Der Fachmann verwendet diesen Begriff für Verbindungen, deren Ringstruktur neben Kohlenstoffatomen noch Heteroatome aus mindestens einem anderen Element (Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel usw.) enthalten.

Zu den cyclo-aliphatischen Verbindungen zählt man grundsätzlich die alicyclischen Verbindungen. Hierbei handelt es sich um ringförmige organische Verbindungen, zu denen wiederum die Cycloalkane, -alkene und alkine zählen.

Die Oasomycine A oder B (Schema 1) reagieren mit Nucleophilen erwartungsgemäß irreversibel unter Öffnung des Makrocyclus. So entsteht beispielsweise mit Natriummethylat nach Neutralisieren der Reaktionslösung selektiv der am Makrocyclus geöffnete Methylester, wobei die Bildung eines Tetrahydropyrans als Nebenreaktion beobachtet wird (Schema 2).

Überraschenderweise reagieren primäre und sekundäre Amine der allgemeinen Formel (V)

wobei R³ in primären Aminen einen einfachen oder verzweigten, gegebenenfalls selbst funktionelle Gruppen tragenden Alkylrest mit 1-22 C-Atomen und R⁴ = H bedeuten, und R³ und R⁴ in sekundären Aminen einfache oder verzweigte, gegebenenfalls selbst funktionelle Gruppen tragende Alkylreste mit 1-22 C-Atomen bedeuten, die gleich oder verschieden sowie Bestandteil eines gesättigten cyclo- oder heterocyclo-aliphatischen Systems sein können.

Beispiele für solche Verbindungen, die bei der Umsetzung der Oasomycine A oder B mit Aminen der allgemeinen Formel (V) entstehen, finden sich in Schema 3. Diese Produkte können je nach Wahl der Ausgangsverbindung Oasomycin A oder Oasomycin B sowohl in der in Position 22 freien Hydroxylform (R¹ = H) als auch in der α-mannosylierten Form (R¹ = α-Mannosyl) erhalten werden.

Schema 1

Strukturen der Makrolactone Oasomycin A und B

Schema 2

Selektive nucleophile Öffnung des Makrolactons

Schema 3

Selektive nucleophile Öffnung des 5-Ringlactons (Beispiele)

Schema 4

Nucleophile Öffnung des 5-Ringlactons unter Ringerweiterung (Beispiel für R¹ = H und R² = 2-Aminoethylamino)

Weiterhin kann überraschenderweise in einigen Fällen, und zwar in Abhängigkeit vom Reaktionspartner der allgemeinen Formel (V) und von den gewählten Reaktionsbedingungen, zusätzlich zur selektiven Öffnung des 5-Ringlactons noch Reaktion unter Erweiterung des 42-gliedrigen Makrocyclus um 2 C-Atome zu neuen 44-gliedrigen Makrolactonen erfolgen. Schema 4 beschreibt ein Beispiel für diesen Reaktionsverlauf.

Die Ausgangsverbindungen Oasomycin A und B werden wie in den Anmeldungen EP 04 82 543 sowie in Liebigs Ann. Chem. 1993, Seite 573, beschrieben durch Fermentation von Streptoverticillium sp. oder Streptomyces sp., insbesondere DSM 5989 oder 5990 aus dem Kulturfiltrat isoliert, gereinigt und charakterisiert.

Die Amine der allgemeinen Formel (V) sind entweder käuflich oder lassen sich mittels vielfältiger, dem Chemiker geläufigen Verfahren nach Literaturmethoden herstellen. Beispiele für primäre Amine, mit denen sich die entsprechenden Produkte der Formeln (I) und (III) herstellen lassen, sind Benzylamin, n-Hexylamin, Anilin, ringsubstituierte Amine wie z. B. 4-Methoxbenzylamin und 4-Methoxyanilin und dgl. Beispiele für sekundäre Amine der allgemeinen Formel (V), die zu den erfindungsgemäßen Verbindungen (I) oder (III) reagieren, sind Morpholin, Piperazin, Dimethylamin und N-Methyl-n-hexylamin. Bevorzugt unter milden Bedingungen reagieren hinreichend nucleophile, sterisch wenig gehinderte Amine, wie z. B. 1,2-Diaminoethan, Propylamin oder Dimethylamin. Sterisch stark gehinderte sekundäre Amine, wie z. B. Diisopropylamin, und elektronisch desaktivierte aromatische Amine, wie z. B. 2,4-Dinitroanilin, sind keine geeigneten Reaktionspartner.

Besonders bevorzugt werden multifunktionelle Amine eingesetzt, die zu basischen Derivaten (I) oder (III) mit primären, sekundären, tertiären oder heterocyclischen Aminresten in der Seitenkette R² führen. Liegen mehrere gleichwertige Aminofunktionen mit vergleichbarer Reaktivität vor, so setzt man den betreffenden Reaktionspartner im mindestens 1.5- bis 10-fachen Überschuß ein, um die mehrfache Addition an das 5-Ringlacton der Oasomycine A oder B zu vermeiden. Liegen verschiedenartige Aminofunktionen mit vergleichbarer Reaktivität vor, so können trennbare, regioisomere Additionsprodukte erhalten werden.

Repräsentative Beispiele für Produkte der Formeln (I) oder (III), die mit bifunktionellen Aminen entstehen, sind in Schema 3 und 4 aufgeführt und werden im folgenden erläutert:

1,2-Diaminoethan reagiert zu 2-Aminoethylamid-Derivaten der Strukturen I-1 und III-1;
1-(3-Aminopropyl)-imidazol reagiert selektiv an der primären Aminofunktion zu den Verbindungen I-4;
N-(2-aminoethyl)-morpholin reagiert zu den Amid-Derivaten I-6;
1,4-Dibenzylamin liefert die Amid-Derivate I-3;
N-(2-aminoethyl)-piperazin reagiert sowohl an der primären als auch an der sekundären Aminofunktion zu den regioisomeren Produkten I-5 und I-7.

Zur Synthese der Verbindungen (I) oder (III) geht man am besten so vor, daß man Oasomycin A oder B in äquimolaren Mengen oder in bis zu einem 50-fachen Überschuß, gegebenenfalls in einem Lösungsmittel wie Chloroform, Methylenchlorid, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid, Methanol, Dioxan, Dimethylsulfoxid oder Pyridin mit einer Verbindung der Formel (V) umsetzt. Die Reaktion kann, je nach Wahl des Lösungsmittels, der Lösungsmittelmenge und der Reaktionstemperatur in homogener oder heterogener Phase ablaufen. Vorzugsweise wird in homogener Phase mit Gemischen der obengenannten Lösungsmittel gearbeitet. Bei flüssigen Verbindungen der Formel (V) wird besonders bevorzugt ohne inertes Lösungsmittel gearbeitet, d. h. die Reaktionspartner werden in Substanz umgesetzt.

Die Reaktionstemperaturen liegen dabei zwischen 0°C und +180°C vorzugsweise zwischen 0°C und +120°C, beim Arbeiten mit oder ohne Lösungsmittel vorzugsweise zwischen 0°C und dem Siedepunkt des Lösungsmittels bzw. des Reaktionspartners der Formel (V), besonders bevorzugt zwischen +10°C und +100°C.

Die Reaktionszeiten betragen 10 Minuten bis 180 Stunden, bevorzugt, je nach Reaktionstemperatur, 10 Minuten bis 8 Stunden. Der Reaktionsverlauf bis zu Beendigung der Umsetzung kann vorteilhaft mittels Dünnschichtchromatographie (DC-Kontrolle) oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) verfolgt werden.

Die Reinisolierung der Verbindungen der Formeln (I) oder (III) erfolgt durch Chromatographie an geeigneten Trägermaterialen, vorzugsweise an Kieselgel, Aluminiumoxid, Ionenaustauschern oder Adsorberharzen, durch anschließende Elution mit organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Essigsäure-alkylester mit einem niederen Alkohol, Dichlormethan, bzw. Gemischen dieser Lösungsmittel mit niederen Alkanolen, gegebenenfalls auch mit Wasser, Pyridin, Acetonitril, bzw. einem für Ionenaustauscher-Harzen geeigneten pH- bzw. Salzgradienten, wie beispielsweise Kochsalz oder organischen oder anorganischen Puffersalzen.

Besonders bevorzugt erfolgt die Isolierung und Reinigung der Verbindungen der Formeln (I) oder (III) mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) an RP-Phasen (reversed phase), beispielsweise an RP-18 Material mit Korngrößen im Bereich von 30-70 µ durch Elution mit Lösungsmittelgemischen, beispielsweise unter Gradientenelution mit Methanol/Acetonitril/Wasser- Gemischen unter Zusatz organischer Säuren, wie z. B. mit Ameisensäure oder Trifluoressigsäure oder mit Pufferlösungen.

Besitzen die Verbindungen der Formeln (I) oder (III) funktionelle Gruppen in der Seitenkette R², wie z. B. in den Verbindungen (I-1) (Schema 3) und (III-1) (Schema 4), wobei R¹ Wasserstoff oder α-Mannosyl bedeuten kann, so ergeben sich weitere vielfaltige Möglichkeiten zur Anknüpfung weiterer organischer Reste, Wirkstoffmoleküle sowie löslicher oder fester Trägermoleküle.

Ein Beispiel hierfür ist die Anknüpfung weiterer organischer Reste an die Verbindungen der Formel (I-1), wobei R¹ Wasserstoff oder α-Mannosyl bedeuten kann, insbesondere die nach den geläufigen Methoden der Peptidsynthese erfolgende Anknüpfung einer geeignet aktivierten Carbonsäure oder geschützten Aminosäure, wobei die Aminoschutzgruppen im letzten Schritt der Synthesesequenz unter milden Bedingungen abgespalten werden können.

So lassen sich beispielsweise die Verbindungen der Formeln (I) oder (III), wobei R¹ Wasserstoff oder α-Mannosyl bedeutet, mit dem N-Hydroxysuccinimidester der FMOC-Carbonsäure kuppeln. Die FMOC-Schutzgruppe wird dann mit milden Basen, z. B. mit Morpholin abgespalten. Aus den Verbindungen der Formel (I-1), wobei R¹ Wasserstoff oder α-Mannosyl bedeuten kann, erhält man so z. B. die Verbindungen (I-2) (Schema 3).

Weiterhin lassen sich endständige primäre Aminogruppen in den Verbindungen der Formel (I) oder (III), wobei R¹ Wasserstoff oder α-Mannosyl bedeutet, in bekannter Weise mit den hierfür üblichen Reagenzien, beispielsweise mit Amino-imino-methansulfonsäure (J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 3179, 1992) zu Guanidino-Funktionen derivatisieren.

Im vorliegenden Fall bedeutet der Begriff "heterocycloaliphatisch", daß das N- Atom einer Verbindung der Formel (II) oder (V) über R³ bzw. R⁴ in einen Heterocyclus integriert ist, wie z. B. in Piperidin, Piperazin, Morpholin etc.

Im vorliegenden Fall handelt es sich bei cyclo-aliphatischen Verbindungen um Kohlenstoffringe mit 3 bis 9 C-Atomen (z. B. Cyclopropyl oder Cyclononyl) oder polycyclische Ringe, wie z. B. Adamantyl- oder Norbornylringe.

Die Verbindungen der Formeln (I) und (III) sind amorph. Sie lösen sich bevorzugt in polaren Lösungsmitteln, wie z. B. Wasser, Methanol und DMF sowie in Mischungen derselben, ferner in Mischungen polarer Lösungsmittel mit höheren Alkanolen oder unpolaren Lösungsmitteln, wie z. B. n-Butanol, Essigester oder Dichlormethan.

Die Verbindungen der Formeln (I) und (III) sind im festen Zustand und in Lösungen im pH-Bereich zwischen 4 und 8, insbesondere 5 und 7, stabil und lassen sich damit in übliche galenische Zubereitungen einarbeiten. Besitzen die Verbindungen der Formeln (I) oder (III) basische Gruppen, beispielsweise Aminogruppen in den Seitenketten R², z. B. wie in den Produkten der Formeln (I) und (III) in den Schemata 3 bzw. 4, so lassen sich mit geeigneten Säuren physiologisch verträgliche Salze herstellen, die z. B. zu einer verbesserten Wasserlöslichkeit und Bioverfügbarkeit der Verbindungen beitragen. Beispiele für geeignete Säuren sind Essigsäure, Weinsäure, Salicylsäure, Äpfelsäure, Ascorbinsäure, Zitronensäure sowie anorganische Säuren wie Phosphorsäure, Chlorwasserstoff oder Bromwasserstoff.

Eine erfindungsgemäße Verbindung der Formeln (I) oder (III) sowie - beim Vorliegen basischer Gruppen in den Seitenketten R² - das Salz eignet sich aufgrund der wertvollen pharmakologischen Eigenschaften zur Anwendung als Arzneimittel.

Insbesondere zeigt eine erfindungsgemäße Verbindung der Formeln (I) oder (III) bzw. das Salz antimikrobielle Wirkung, insbesondere gegen bakterielle Keime, sowie gegen Protozoen und humanpathogene bzw. phytopathogene Pilze, und kann darüber hinaus auch zur Bekämpfung von Ektoparasiten und Helminthen eingesetzt werden.

Sowohl zur Prophylaxe als auch zur Behandlung entsprechender Erkrankungen kann eine Verbindung der Formeln (I) und/oder (III) entweder allein oder mit physiologisch verträglichen Hilfs- oder Trägerstoffen angewandt werden. Als Trägermaterial können bei Tierarzneimitteln die üblichen Futtermittelmischungen bzw. beim Menschen alle pharmakologisch verträglichen Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffe verwendet werden.

Eine erfindungsgemäße Verbindung wird im allgemeinen oral oder parenteral verabreicht, aber auch eine rektale Anwendung ist prinzipiell möglich. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Tabletten, Dragees, (Mikro-)Kapseln, Zäpfchen, Sirupe, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole, Tropfen oder injizierbare Lösungen in Ampullenform sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung üblicherweise Trägerstoffe und Zusätze und/oder Hilfsmittel wie Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel oder Lösungsvermittler Verwendung finden. Als häufig verwendete Träger oder Hilfsstoffe seien Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Lactose, Mannit und andere Zucker, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Vitamine, Cellulose und ihre Derivate, tierische pflanzliche Öle, Polyethylenglykole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser, Alkohole, Glycerin und mehrwertige Alkohole genannt. Gegebenenfalls können die Dosierungseinheiten für die orale Verabreichung mikroverkapselt werden, um die Abgabe zu verzögern oder über einen längeren Zeitraum auszudehnen, wie beispielsweise durch Überziehen oder Einbetten des Wirkstoffes in Teilchenform in geeignete Polymere, Wachse und dergleichen.

Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Präparate in Dosierungseinheiten hergestellt und verabreicht, wobei jede Einheit als aktiven Bestandteil eine bestimmte Dosis einer Verbindung der Formel (I) oder (III) enthält. Bei festen Dosierungseinheiten wie Tabletten, Kapseln oder Suppositorien kann diese Dosis bis zu 200 mg, bevorzugt jedoch etwa 0.1 bis 100 mg, und bei Injektionslösungen in Ampullenform bis zu etwa 200 mg, vorzugsweise aber etwa 0.5 bis 100 mg, pro Tag betragen. Die zu verabreichende Tagesdosis ist abhängig vom Körpergewicht, Alter, Geschlecht und Zustand des Säugers. Unter Umständen können jedoch auch höhere oder niedrigere Tagesdosen angebracht sein. Die Verabreichung der Tagesdosis kann sowohl durch Einmalgabe in Form einer einzelnen Dosierungseinheit oder aber in mehreren kleinen Dosierungseinheiten als auch durch Mehrfachgabe unterteilter Dosen in bestimmten Intervallen erfolgen.

Die erfindungsgemäßen Arzneien werden dadurch hergestellt, daß man eine oder mehrere Verbindungen der Formeln (I) und/oder (III) mit üblichen Träger- sowie gegebenenfalls Zusatz- und/oder Hilfsstoffen in die bzw. eine geeignete Darreichungsform bringt.

In den sich anschließenden Beispielen wird die Erfindung weiter erläutert. Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht. Mischungsverhältnisse bei Flüssigkeiten beziehen sich auf das Volumen, wenn keine anderen Angaben gemacht wurden.

Beispiel 1 Nucleophile Öffnung des Makrocyclus in Oasomycin A (Schema 2, R¹ = H)

1.08 g (1.05 mmol) Oasomycin A werden in 150 ml wasserfreiem Methanol und 30 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst, mit 3.2 ml einer 30-proz. Natriummethylat-Lösung versetzt und 6.5 Stunden auf 65°C erwärmt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird mit saurem Ionenaustauscher Dowex 50 W × 2, 50-100 mesh, in der H⁺-Form bei pH 3 insgesamt 45 Minuten gerührt, filtriert, das Filtrat erst mit festem Natriumhydrogencarbonat und dann zusätzlich mit Triethylamin neutralisiert. Nach Einengen mit Toluol erhält man 1.87 g Rückstand, der mit präparativer HPLG (Waters Prep Pak, RP-Phase, 400 ml) gereinigt wird (Methanol/0.01 M Ammoniumacetat in Wasser (1/1) mit steigendem Methanolgradienten).
Ausbeute: 495 mg (44.5%)
FAB-MS: m/e = 1081.5 (M + Na⁺); C₅₆H₉₈O₁₈ = 1059.4.

Beispiel 2 Synthese der Verbindungen der Formel I-1 (R¹ = H) und III-1 (R¹ = H)

1.20 g (1.17 mmol) Oasomycin A werden in 10 ml Ethylendiamin 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abziehen des Ethylendiamins im Vakuum wird der Rückstand noch mehrmals mit Toluol/Methanol eingeengt und getrocknet. Das Rohprodukt (1.36 g) besteht aus zwei Komponenten, die mittels präparativer HPLC an RP-18 (40-63 µ) getrennt werden. Die Produkte eluieren mit einer Mischung aus 70 Teilen Methanol und 3 Teilen einer 0.075-proz. Trifluoressigsäurelösung.
Verbindung I-1 (R¹ = H) Ausbeute: 747 mg (59%)
FAB-MS: m/e = 1087.6 (M + H⁺); C₅₇H₁₀₂N₂O₁₇ = 1087.4
IR(KBr): 1680, 1650, 1550 cm^-1
Verbindung III-1 (R¹ = H) Ausbeute: 300 mg (24%)
FAB-MS: m/e = 1087.6 (M + H⁺) und 1109.7 (M + Na⁺); C₅₇H₁₀₂N₂O₁₇ = 1087.4
IR(KBr): 1680, 1650, 1550 cm^-1.

Beispiel 3 Synthese der Verbindung I-2 (R¹ = H)

84 mg (0.24 mmol) FMOC-6-Aminocapronsäure, 41 mg (0.36 mmol) N-Hydroxysuccinimid und 74 mg (0.36 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid in 2 ml wasserfreiem Pyridin werden 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Filtration werden 200 mg (0.184 mmol) der Verbindung I-1 (R¹ = H) aus Beispiel 2 zugegeben und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Einengen wird der Rückstand (241 mg) mittels HPLC gereinigt (Nucleosil RP- 18/7 µ, 21 × 250 mm Säule, Gradient 75-100% Methanol/Wasser, Flußrate 25 ml/min).
Ausbeute: 114 mg (33%) FMOC-geschützte Verbindung I-2 (R¹ H;
C₇₉H₁₂₄O₂₁N₃). Davon werden 104 mg (0.07 mmol) in 4 ml Dichlormethan und 2 ml Morpholin 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird dann in eiskaltes Dichlormethan getropft. Nach Stehenlassen im Kühlschrank wird das Produkt abfiltriert.
Ausbeute: 69 mg (82%)
FAB-MS: m/e = 1200.5 (M + H⁺), 1222.5 (M + Na⁺); C₆₃H₁₁₃O₁₈N₃ = 1200.6

Beispiel 4 Synthese der Verbindung I-1 (R¹ = α-Mannosyl)

500 mg (0.42 mmol) Oasomycin B werden bei ca. +10°C mit 4 ml Ethylendiamin 1.5 Stunde gerührt. Die mit 5 ml Methanol verdünnte Lösung wird in 50 ml Diethylether eingetropft. Das Rohprodukt wird abgesaugt, getrocknet (Ausbeute 394 mg = 75%) und mittels HPLC weiter gereinigt. Säule: µ-Bondapak Waters RP-18/10 µ, 19 × 150 mm, Gradient 80-100% Methanol/Wasser, Flußrate 22 ml/min.
Ausbeute: 223 mg (43%)
FAB-MS: m/e = 1271.6 (M + Na⁺); C₆₃H₁₁₂N₂O₂₂ = 1249.5

Beispiel 5 Synthese der Verbindung I-3 (R¹ = H)

1.00 g (7.34 mmol) 4-(Aminomethyl)-benzylamin und 0.50 g (0.48 mmol) Oasomycin A werden 4 Stunden bei 70°C gerührt. Nach Abkühlen wird die Reaktionsmischung mit 5 ml Methanol verdünnt und in 75 ml Wasser getropft. Nach Zentrifugieren wird der Überstand verworfen. Diese Prozedur wird dreimalig wiederholt. In Methanol unlöslicher Feststoff wird abgetrennt und verworfen. Rohausbeute: 163 mg (29%). Das Produkt wird mittels HPLC weiter gereinigt. Säule: µ-Bondapak Waters C18/10 µ, 19 × 150 mm, Gradient 80-100% Methanol/Wasser, Flußrate 22 ml/min.
Ausbeute: 223 mg (43%)
FAB-MS: m/e = 1271.6 (M + Na⁺); C₆₃H₁₁₂N₂O₂₂ = 1249.5

Beispiel 6 Synthese der Verbindung I-3 (R¹ = α-Mannosyl)

1.00 g (7.34 mmol) 4-(Aminomethyl)-benzylamin und 0.50 g (0.42 mmol) Oasomycin B werden 45 Minuten bei 70°C gerührt. Nach Abkühlen wird die Reaktionsmischung mit 5 ml Methanol verdünnt und in 75 ml Wasser getropft. Nach Zentrifugieren wird der Überstand verworfen. Diese Prozedur wird dreimalig wiederholt. In Methanol unlöslicher Feststoff wird abgetrennt und verworfen. Rohausbeute: 222 mg (40%).

Das Produkt wird mittels HPLC weiter gereinigt. Säule: µ-Bondapak Waters RP- 18/10 µ, 19 × 150 mm, Gradient 75-100% Methanol/Wasser, Flußrate 11 ml/min.
Ausbeute: 130 mg (23%)
FAB-MS: m/e = 1347.6 (M + Na⁺); C₆₉H₁₁₆N₂O₂₂ = 1325.6
IR(KBr): 1690, 1645, 1500 cm^-1

Beispiel 7 Synthese der Verbindung I-4 (R¹ = H)

500 mg (0.48 mmol) Oasomycin A und 1.5 ml (12.6 mmol) 1-(3-Aminopropyl)­ imidazol werden 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Verdünnen der Reaktionsmischung mit 5 ml Methanol wird das Rohprodukt mit Di-n-propylether und Diethylether ausgefällt, abgesaugt und getrocknet. Das erhaltene Rohmaterial (0.57 g) wird mittels HPLC gereinigt. Säule:
Prep Pak Cartridge Waters RP-18/15 µ, 19 × 150 mm, Gradient 85-100% Methanol/Wasser, Flußrate 100 ml/min. Ausbeute: 348 mg (65%). Die Substanz kann weiter durch Ausrühren in Dichlormethan/Diethylether (1/1) gereinigt werden.
Ausbeute: 262 mg (47%)
FAB-MS: m/e = 1152.9 (M + H⁺) und m/e = 1174.9 (M + Na⁺); C₆₁H₁₀₅N₃O₁₇ = 1152.47
IR(KBr): 1700, 1650, 1555, 1530 cm^-1

Beispiel 8 Synthese der Verbindung I-4 (R¹ = α-Mannosyl)

500 mg (0.42 mmol) Oasomycin B und 1.5 ml (12.6 mmol) 1-(3-Aminopropyl)­ imidazol werden 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Rohprodukt (386 mg = 70%) wird analog wie in Beispiel 7 beschrieben isoliert und weiter gereinigt. Säule: Nucleosil RP-18/7 µ von Machery & Nagel, Gradient 65-100% Methanol/Wasser, Flußrate 25 ml/min.
Ausbeute: 253 mg (44%)
FAB-MS: m/e = 1314.5 (M + H⁺) und m/e = 1336.5 (M + Na⁺); C₆₇H₁₁₅N₃O₂₂ = 1314.6
IR(KBr): 1700, 1650, 1550, 1530 cm^-1

Beispiel 9 Synthese der Verbindungen I-5 (R¹ = H) und I-7 (R¹ = H)

500 mg (0.48 mmol) Oasomycin A und 1.5 ml (11.4 mmol) N-(2-Aminoethyl)­ piperazin werden 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Verdünnen der Reaktionsmischung mit 10 ml Dichlormethan wird das Produkt mit Diethylether ausgefällt, abgesaugt und getrocknet. Das Rohmaterial (0.58 g) wird mittels HPLC gereinigt. Säule: Nucleosil RP-18/7 µ-Material, 21 × 150 mm, Gradient 65-100% Methanol/Wasser, Flußrate 25 ml/min.
Ausbeute Verbindung I-5 (R¹ = H): 265 mg (48%) mit folgenden analytischen Daten:
FAB-MS: m/e = 1156.9 (M + H⁺) und m/e = 1178.9 (M + Na⁺); C₆₁H₁₀₉N₃O₁₇ = 1156.5
IR(KBr): 1705, 1650, 1550 cm^-1
Ausbeute Verbindung I-7 (R¹ = H): 125 mg (23%) mit folgenden analytischen Daten:
FAB-MS: m/e = 1156.9 (M + H⁺) und m/e = 1178.9 (M + Na⁺); C₆₁H₁₀₉N₃O₁₇ = 1156.5
IR(KBr): 1705, 1625 cm^-1

Beispiel 10 Synthese der Verbindungen I-5 (R¹ = α-Mannosyl) und I-7 (R¹ = α-Mannosyl)

750 mg (0.63 mmol) Oasomycin B und 2.0 ml (15.2 mmol) N-(2-Aminoethyl)­ piperazin werden 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Verdünnen der Reaktionsmischung mit 3 ml Methanol wird das Rohprodukt mit 40 ml Diethylether ausgefällt und abgesaugt. Diese Prozedur wird noch 3mal wiederholt. Das getrocknete Rohmaterial (694 mg) wird mittels HPLC gereinigt. Säule: Nucleosil RP-18/7 µ, 21 × 150 mm, Gradient 75-100% Methanol/Wasser, Flußrate 25 ml/min.
Ausbeute Verbindung I-5 (R¹ = α-Mannosyl): 198 mg (24%) mit folgenden analytischen Daten:
FAB-MS: m/e = 1318.9 (M + H⁺) und m/e = 1340.9 (M + Na⁺); C₆₇H₁₁₉N₃O₂₂ = 1318.7
IR(KBr): 1700, 1650, 1550 cm^-1
Ausbeute Verbindung I-7 (R¹ = α-Mannosyl): 188 mg (23%) mit folgenden analytischen Daten:
FAB-MS: m/e = 1318.9 (M + H⁺) und m/e = 1340.9 (M + Na⁺); C₆₇H₁₁₉N₃O₂₂ = 1318.7
IR(KBr): 1700, 1625 cm^-1

Beispiel 11 Synthese der Verbindungen I-6 (R¹ = H) und III-6 (R¹ = H)

500 mg (0.48 mmol) Oasomycin A und 1.0 ml (7.62 mmol) N-(2-Aminoethyl)­ morpholin werden 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Verdünnen der Reaktionsmischung mit 10 ml Dichlormethan wird das Rohprodukt mit Diethylether ausgefällt, abgesaugt und getrocknet. Das erhaltene Rohmaterial (0.57 g) wird mittels HPLC gereinigt. Säule: Waters Prep Pak RP-18/15 µ, 47 × 300 mm, Gradient 75-100% Methanol/Wasser, Flußrate 100 ml/min.
Ausbeute Verbindung I-6 (R¹ = H): 366 mg (66%) mit folgenden analytischen Daten:
FAB-MS: m/e = 1157.9 (M + H⁺) und m/e = 1179.9 (M + Na⁺); C₆₁H₁₀₈N₂O₁₈ = 1157.5
IR(KBr): 1700, 1650, 1550 cm^-1
Ausbeute Verbindung III-6 (R¹ = H): 44 mg (8%) mit folgenden analytischen Daten:
FAB-MS: m/e = 1157.9 (M + H⁺) und m/e = 1179.9 (M + Na⁺); C₆₁H₁₀₈N₂O₁₈ = 1157.5

Beispiel 12 Synthese der Verbindung I-6 (R¹ = α-Mannosyl)

750 mg (0.63 mmol) Oasomycin B und 2.0 ml (15.2 mmol) N-(2-Aminoethyl)­ morpholin werden 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Verdünnen der Reaktionsmischung mit 4 ml Methanol wird das Rohprodukt mit 25 ml Diethylether ausgefällt und abgesaugt. Der Feststoff wird durch Rühren in 8 ml Dichlormethan/Diethylether (1/2), Lösen in Dichlormethan/Methanol und Ausfällen in Diethylether weiter gereinigt und dann getrocknet. Das Rohprodukt (594 mg) wird mittels HPLC gereinigt. Säule: Nucleosil RP-18/7 µ, 21 × 150 mm, Gradient 65-100% Methanol/Wasser, Flußrate 25 ml/min.
Ausbeute Verbindung I-6 (R¹ = α-Mannosyl): 386 mg (46.4%) mit folgenden analytischen Daten:
FAB-MS: m/e = 1341.9 (M + Na⁺); C₆₇H₁₁₈N₂O₂₃ = 1319.67
IR(KBr): 1700, 1650, 1550 cm^-1

Beispiel 13 Synthese von I-8 (R¹ = H, R² = HN-CH₂C₆H₅)

0.80 g (0.78 mmol) Oasomycin A und 10 ml Benzylamin werden 3 Stunden bei 55°C gerührt. Nach Verdünnen mit Essigsäure-ethylester/Dichlormethan wird mit 0.1 N Salzsäure ausgeschüttelt. Dabei bildet sich in der wäßrigen Phase ein Niederschlag, der nach 12 Stunden abfiltriert und getrocknet wird.
Ausbeute: 859 mg (97%)
FAB-MS: m/e = 1156.9 (M + Na⁺); C₆₂H₁₀₃NO₁₇ = 1134.49
IR(KBr): 1700, 1650, 1605, 1500 cm^-1

Beispiel 14 Synthese der Verbindung I-9 (R² = NH-C₂H₄-NH(C=NH)-NH₂ und R¹ = α-Mannosyl)

125 mg (0.10 mmol) der Verbindung I-1 (R¹ = α-Mannosyl) aus Beispiel 4 werden 24 Stunden mit 13.7 mg (0.10 mmol) Amino-imino-methansulfonsäure bei Raumtemperatur in 4 ml trockenem Methanol gerührt. Nach Einengen wird das Produkt analog wie in Beispiel 4 beschrieben gereinigt. Ausbeute: 90 mg (70%). Das ¹³C-NMR-Spektrum entspricht dem Spektrum der Ausgangsverbindung. Zusätzlich wird das charakteristische Signal für die Guanidinogruppe bei 158.8 ppm beobachtet (vgl. 1. Antibiotics 1990, 438).

Beispiel 15 Antifungische Aktivitäten und Wirkung gegen Protozoen einiger Verbindungen der Formel (I) im Vergleich zu Oasomycin A, Oasomycin B und Desertomycin

Die Aktivität wird in einem Standardscreeningverfahren mittels Mikrotitertest bestimmt. Als Nährmedium (antifungischer Test) diente eine Neopepton- Dextrose-Lösung bei pH 6.5 bzw. ein Tryptose-Trypticase-Hefemedium (Anti-Protozoen-Test). Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHKs in µg/ml) gegen repräsentative Erreger wurden in Verdünnungsreihen bestimmt:
(1) Trichophyton mentagrophytes; (2) Trichophyton rubrum; (3) Microsporum canis; (4) Candida albicans; (5) Aspergillus niger; (6) Trichonomas vaginalis.

Beispiel 16 Antibakterielle Aktivitäten einiger Verbindungen der Formel (I) im Vergleich zu Oasomycin A und Oasomycin B

Die Aktivitäten werden in einem Standardscreeningverfahren mittels Agarverdünnungstest auf dem Medium Mueller Hinton Agar bestimmt. Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHKs) in µg/ml gegen folgende Keime sind aufgelistet:
(1) Staph. aureus SG 511, (2) Staph. aureus 285, (3) Staph. aureus 503, (4) Strept. pyrogenes 308 A, (5) Strept. pyrogenes 77 A, (6) Strept. faecium D.

Claims (10)

1. Verbindung der allgemeinen Formel (I) in der R¹ Wasserstoff oder α-Mannosyl und R² eine Verbindung der allgemeinen Formel (II) bedeuten, wobei R³ einen einfachen oder verzweigten, gegebenenfalls selbst funktionelle Gruppen tragenden Alkylrest mit 1-22 C-Atomen und R⁴ Wasserstoff bedeutet,
oder R³ und R⁴ einfache oder verzweigte, gegebenenfalls selbst funktionelle Gruppen tragende Alkylreste mit 1-22 C-Atomen bedeuten, die gleich oder verschieden sowie Bestandteil eines gesättigten cyclo-aliphatischen oder heterocycloaliphatischen Systems sein können.

2. Verbindung der allgemeinen Formel (III) in der R¹ und R² eine gemäß Anspruch 1 definierte Bedeutung haben.

3. Verbindung der Formel (I) oder (III) oder ein Salz einer Verbindung der Formel (I) oder (III) zur Verwendung als Arzneimittel.

4. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung der Formel (I) oder (III) oder ein Salz einer Verbindung der Formel I oder III und gegebenenfalls einen oder mehrere pharmazeutische Träger.

5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) oder (III) gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (IV) in der
R¹ Wasserstoff oder die Gruppe bedeutet,
mit einem primären oder sekundären Amin der allgemeinen Formel (V) wobei R³ und R⁴ die in Anspruch 1 genannten Bedeutungen haben, umsetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung zwischen 0°C und +180°C und innerhalb von 10 Minuten bis 180 Stunden erfolgt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung zwischen 0°C und +120°C und innerhalb von 10 Minuten bis 8 Stunden erfolgt.

8. Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder (III) nach Anspruch 1 oder 2 oder ein Salz einer Verbindung der Formel I oder III als pharmakologisch wirksamen Stoff.

9. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine antimikrobielle Wirksamkeit zur Vorbeugung oder Heilung von Infektionen mit Pilzen, Bakterien oder Protozoen vorhanden ist.

10. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Wirksamkeit gegen Nematoden und Helminthen vorhanden ist.