DE4211296A1

DE4211296A1 - Verfahren zur Gewinnung der Inhaltsstoffe von Arzneipflanzen

Info

Publication number: DE4211296A1
Application number: DE19924211296
Authority: DE
Inventors: Erfinder Wird Nachtraeglich Benannt Der
Original assignee: Waldheim Pharmaceutika GmbH
Current assignee: Sanochemia Pharmazeutika AG
Priority date: 1992-04-03
Filing date: 1992-04-03
Publication date: 1993-10-07
Also published as: AU3887393A; EP0587852A1; WO1993019764A1

Description

Arzneipflanzen enthalten, ggfs. in bestimmten Pflanzenteilen wie Wur zeln, Blättern, Blüten oder Früchten angereichert, Inhaltsstoffe mit phar makologischer Wirkung und bilden die Grundlage für eine beachtliche Anzahl von Arzneimitteln. Zur Gewinnung dieser Inhaltsstoffe gibt es unterschied liche Verfahren, von denen die meisten nach dem Prinzip einer wie auch immer gearteten Extraktion der Pflanzen mit einem geeigneten Extraktions mittel arbeiten und eine mehr oder weniger selektive Lösung bestimmter pflanzlicher Wirkstoffe oder Wirkstoffgruppen in dem Extraktionsmittel ergeben. Daneben gewinnen aber Verfahren, die sich allgemein durch ein Auf brechen der Pflanzenzellen (durch Verpressen frischer Pflanzen) auszeichnen und zu einem Pflanzensaft führen, zunehmend an Bedeutung. Die Erfindung befaßt sich mit der Gewinnung von Pflanzensäften.

Ein grundsätzliches Problem bei der Herstellung von Phytopharmaka bilden die in Arzneipflanzen - seien sie wild gesammelt oder landwirt schaftlich angebaut - unvermeidlich enthaltenen Kontaminationen aufgrund von Umgebungseinflüssen. Hierzu sei zunächst auf die zahlreichen Herbizide, Fungizide und Pestizide hingewiesen, die bei den heutigen Anbaumethoden allgemein als unverzichtbar angesehen werden, aber selbst bei sorgfältiger Anwendung zu Rückständen in den Pflanzen führen und auch in Wildpflanzen enthalten sein können. Weiterhin werden von den Pflanzen auch andere Belastungen aus der Umwelt aufgenommen und angereichert, beispielsweise Schwermetalle durch Kontakt der Pflanzen mit Regen und Staub oder durch Aufnahme der Ionen aus schwermetallhaltigen Böden.

Neben diesen mehr "passiven" (d. h. nach der Aufnahme im wesentlichen als solche unverändert bleibenden) Kontaminationen gibt es noch die große Gruppe von Kontaminationen durch Befall der Pflanze mit Krankheitserregern (Viren, Bakterien, Pilzen) oder Parasiten. Derartige Kontaminationen können als "aktiv" bezeichnet werden, weil sie zusätzliche Stoffwechselprodukte in die Pflanze einbringen und außerdem in der Pflanze Abwehr- oder andere Sekundärreaktionen auslösen, durch die sekundäre toxische Schadstoffe wirk sam werden können. Insbesondere sind Endotoxine (vornehmlich Lipopolysac charide aus Zellwänden von Mikroorganismen) und Phytoalexine (Produkte des pflanzlichen Sekundärstoffwechsels bei Abwehrreaktionen) die Folge einer Kontamination durch Krankheitserreger oder Parasiten.

Wenn aus Arzneipflanzen bestimmte Wirkstoffe oder Wirkstoffgruppen gewonnen werden sollen, lassen sich die Kontaminationen meistens ausrei chend gut beherrschen. In diesem Fall handelt es sich nämlich in der Regel um bekannte Wirkstoffe, die mit den jeweiligen Aufbereitungsmethoden so isoliert oder angereichert werden, daß sie weitgehend bis vollständig frei von Kontaminationen sind. Gänzlich anders ist die Lage jedoch, wenn die Pflanzeninhaltsstoffe nicht auf bestimmte Wirkstoffe oder Wirkstoffgruppen aufgearbeitet, sondern als solche in Form von Pflanzensäften angeboten werden sollen. Pflanzensäfte enthalten eine Vielfalt von Wirkstoffen, die häufig noch nicht einmal alle im einzelnen bekannt sind: und in ihrer Ge samtheit ein sogenanntes "Wirkprinzip" bilden. Es ist offensichtlich, daß sich unter diesen Inhaltsstoffen auch die eingangs beschriebenen Kontamina tionen befinden können, wodurch das Wirkprinzip nachteilig beeinflußt wird.

Eine Abtrennung der Kontaminationen aus Pflanzensäften, die als sol che zur pharmazeutischen Anwendung kommen sollen, ist äußerst problema tisch. Wenn eine Abtrennung überhaupt möglich ist, geht sie häufig mit einem Eingriff in das Wirkprinzip einher. Dies gilt insbesondere für die Endotoxine, die speziell für den Menschen eine hohe toxische Wirkung besitzen und deshalb insbesondere in Injectabilia nicht (oder allenfalls nur in äußerst geringen Spuren) enthalten sein dürfen. Aufgrund ihrer Molekülgröße lassen sie sich verhältnismäßig einfach und sicher durch Ul trafiltration bei 20 000 Dalton oder mit speziell dafür entwickelten Ul trafiltern aus Pflanzensäften entfernen. Dabei muß aber in Kauf genommen werden, daß alle Wirkstoff-Moleküle wie Proteine (Enzyme) oder Polysac charide, die größer als die genannte Trenngrenze (cut-off) sind, ebenfalls eliminiert werden, also ein Teil des Wirkprinzips verlorengeht.

Die Abtrennung der anderen Kontaminationen ist schwieriger und mit unter überhaupt nicht möglich. Hinzu kommt dabei, daß manche der anderen Kontaminationen noch nicht einmal richtig erkannt werden können, weil für die Vielzahl an Kontaminierungsmöglichkeiten (und darunter allein die An zahl von ca. 600 im Arzneipflanzenbau zugelassenen Pflanzenschutzmitteln) weder ausreichende Trennverfahren noch analytische Detektierungsverfahren zur Verfügung stehen. Somit besteht die Gefahr, daß viele schädliche Kon taminationen erst durch unerwünschte Wirkungen bei klinischen Studien am Menschen zutage treten.

Nicht zuletzt diese Probleme haben dazu geführt, daß an die Reinheit von Phytoparmaka immer höhere Anforderungen gestellt werden, die jedenfalls für Pflanzensäfte mit den herkömmlichen Methoden nicht mehr erfüllt werden können. Mit der Erfindung soll diesen Anforderungen nunmehr entsprochen werden, indem der pharmazeutischen Technik ein Verfahren zur Verfügung gestellt wird, das die Gewinnung von natur-originalen Pflanzensäften ge stattet. Der Begriff "natur-original" soll hierbei bedeuten, daß der Saft nicht nur frei von den Kontaminationen aus der Umwelt ist, sondern darüber hinaus auch sowohl in qualitativer (stofflicher) als auch in quantitativer (mengenmäßiger) Hinsicht das für die intakte Arzneipflanze typische (artspezifische) Muster der Inhaltsstoffe aufweist.

Dieses Ziel erreicht die Erfindung dadurch, daß die Pflanzen bis zur Erntereife unter sterilen Bedingungen aufgezogen werden und daß anschlie ßend die Zellwände der Pflanzen bzw. der für die Gewinnung der Inhaltsstof fe benötigten Pflanzenteile unter Beibehaltung der sterilen Bedingungen durch Frostung zerstört werden, um den Pflanzensaft freizusetzen.

Die Erfindung geht von der Erkenntnis aus, daß selbst dann, wenn es gelingen sollte, erheblich verbesserte Analysen- und Trennmethoden zu ent wickeln, die Dekontaminierung von Pflanzensäften immer ein Problem bleiben wird, d. h. immer mit Aufwand und/oder einer Beeinträchtigung des Wirkprin zips verbunden sein wird. In konsequentem Verfolg dieser Erkenntnis verläßt die Erfindung daher den bislang eingeschlagenen Weg, Kontaminationen der Pflanzen als unvermeidlich hinzunehmen und nach Möglichkeiten zur nachheri gen Beseitigung der Kontaminationen zu suchen. Statt dessen wird mit der Erfindung nunmehr vorgeschlagen, die Pflanzen bis zur Erntereife unter sterilen Bedingungen aufzuziehen und damit von vornherein frei von jegli chen Kontaminationen zu halten, so daß bei der Ernte ein artspezifischer, nicht durch äußere Einflüsse verfälschter Saft in der Pflanze enthalten ist.

Diese sterile Aufzucht der Pflanzen, wie sie bei der Erfindung vor gesehen ist, grenzt sich scharf ab gegen die bekannten in-vitro-Kulturen, bei denen Kallus- oder Zellkulturen mit Hilfe geeigneter Substrate dazu veranlaßt werden, ganz bestimmte Wirkstoffe zu bilden. Dabei wird ausge nutzt, daß sich diese Wirkstoffe normalerweise in den Kulturen stärker anreichern als in der natürlichen Pflanze. In einzelnen Fällen können mit in-vitro-Kulturen sogar Wirkstoffe erzeugt werden, die in der natürlichen Pflanze überhaupt nicht vorkommen. Demgegenüber kommt es bei der Erfindung nicht auf einzelne Wirkstoffe oder deren Anreicherung an, sondern im Gegen teil auf die Aufrechterhaltung des artspezifischen Musters sämtlicher In haltsstoffe einer natürlichen Pflanze sowohl in qualitativer als auch in quantitativer stofflicher Zusammensetzung. Mit in-vitro-Kulturen läßt sich kein artspezifisches Muster sämtlicher Inhaltsstoffe der zugrundeliegenden Pflanze erzeugen.

Die Erfindung erschöpft sich aber nicht in dem Vorschlag, die Pflan zen steril aufzuziehen, sondern kombiniert diesen Vorschlag mit einem be sonderen Verfahrensschritt zur Freisetzung des Saftes aus der Pflanzenzel le, nämlich mit einer Frostung der Pflanzen bzw. der benötigten Pflanzen teile. Erst durch diese Kombination wird das Ziel der Erfindung, aus der Pflanze einen natur-originalen Pflanzensaft zu erhalten, erreicht.

Bisher erfolgte die Freisetzung des Pflanzensaftes durch Verpressen der Pflanzen, also durch ein mechanisches Zerdrücken der Zellen bei Raum temperatur. Da dabei auch subzelluläre Kompartimente (z. B. Mikrosomen mit den darin enthaltenen abbauenden Enzymen, der Zellkern mit aufbauenden Enzymen, Mitochondrien als Ort des Kohlenstoffabbaus und Chloroplasten als Ort des Kohlenstoffaufbaus) der Pflanzenzelle zerstört werden, können in dem so entstandenen Saft plötzlich Enzymsysteme und deren Substrate zusam mentreffen, die normalerweise durch Membranen voneinander getrennt sind.

Dadurch kommt es im Saft zu unkontrollierten internen Reaktionen (insbeson dere enzymatischen Katalysen, aber auch unspezifischen Radikalreaktionen), wie sie im normalen Stoffwechsel der Zelle überhaupt nicht auftreten. Auf diese Weise können interne degenerative Prozesse in Gang gesetzt werden, durch die die gewünschten Inhaltsstoffe möglicherweise modifiziert oder sogar ganz abgebaut werden, und durch die eventuell sogar schädliche, d. h. toxische Metabolite gebildet werden, die sich nur durch eine weitere Reini gung des Saftes eliminieren lassen. Wegen der nahen Verwandtschaft von Wirkstoff und Metabolit muß für eine solche Reinigung häufig ein erhöhter Aufwand getrieben werden, und in jedem Fall ist dabei, wie schon im Zusam menhang mit der Abtrennung der Endotoxine erläutert, auch wieder mit einem Verlust an Wirkprinzip zu rechnen.

Diesen unkontrollierten internen Prozessen hat man bisher verhältnis mäßig wenig Aufmerksamkeit geschenkt, möglicherweise deshalb, weil die bisher durch Verpressen gewonnenen Säfte ohnehin (allein schon wegen der Endotoxine) einer Nachbehandlung unterworfen werden mußten. Nachdem das erfindungsgemäße Verfahren aber nunmehr zu kontaminationsfreien Pflanzen säften führt, die keiner Nachbehandlung mehr bedürfen, hat sich gezeigt, daß auch diese nach der Zerstörung der Zellwände und Membranen einsetzenden Prozesse die Qualität des gewonnenen Saftes im erheblichen Ausmaß beein trächtigen können und ebenso beachtet werden müssen wie die eingangs geschilderten Einflüsse von außen, die zur Kontamination des Saftes führen. Es gehört daher mit zur Erfindung, die kontaminationsfreie Erzeugung der Pflanzensäfte zu ergänzen durch eine möglichst schonende Freisetzung der Pflanzensäfte aus der Zelle.

Die schonende Freisetzung wird im Rahmen der Erfindung erreicht durch Frostung der Pflanzen bzw. der für die Saftgewinnung benötigten Pflanzen teile. Bei der Frostung bildet das in den Zellen enthaltene Wasser feine nadelförmige Eiskristalle, welche die Zellwände durchdringen und von innen heraus zerschneiden. Dabei werden zwar auch die subzellulären Kompartimente - jedenfalls zum Teil - mit zerschnitten, aber es entfallen die beim Ver pressen unvermeidlichen Druck- und Scherkräfte, die u. U. erhebliche zusätz liche Energie (Wärme) in das System einführen und damit zur Beschleunigung der internen Reaktionen beitragen. Demgegenüber stellt das Aufbrechen der Zellwände durch Frostung ein ausgesprochenes "Low-Energy"-Verfahren dar, dessen wesentlicher Vorteil darin besteht, daß es bei Temperaturen unter halb des Gefrierpunktes abläuft und damit bei Temperaturen, bei denen die internen Reaktionen weitgehend bis vollständig gehemmt sind. Somit folgt auch der zweite Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens dem Leitmotiv der Erfindung, nämlich "Vermeidung schädlicher Einflüsse statt Beseitigung ihrer Folgen".

In weiterer Ausgestaltung des "Low-Energy"-Prinzips bei der Freiset zung der Pflanzensäfte ist es zweckmäßig, die Frostung unter Lichtausschluß durchzuführen, um das Phytochromsystem der Pflanze zu hemmen und unspezifi sche lichtabhängige Folgereaktionen zu vermeiden. Weiterhin ist es zweckmä ßig, die Frostung unter Sauerstoff-Ausschluß (z. B. unter Stickstoff, vor zugsweise aber im Vakuum) vorzunehmen, damit auch Redox-Reaktionen nach Möglichkeit unterbleiben.

Die solcherart gefrostete Pflanze ist im Prinzip ein tiefgefrorener Brei aus dem gewünschten Pflanzensaft und den Resten der Zellwände und Membranen. Dieser Brei wird zweckmäßig bis zum Verbrauch des Saftes tiefgefroren gehalten, damit die unerwünschten internen Reaktionen nicht nur beim Aufbrechen der Zelle, sondern ohne Unterbrechung weiter bis zum Verbrauch des Saftes gehemmt bleiben. Zugleich werden dadurch alle aktiven Proteine in ihrer Tertiärstruktur konserviert. Sobald der Verbrauch des Saftes ansteht, wird der Brei vorsichtig aufgetaut (z. B. im Kühlschrank bei 2-8°C) und durch Filtration von den Feststoffen befreit, wobei die Schritte des Auftauens und der Filtration zweckmäßig wiederum unter Lichtausschluß und Sauerstoff-Ausschluß ausgeführt werden. Der solcherart erhaltene Saft stellt ein Phytopharmakum mit einer bislang nicht erreichten Wirksamkeit bei höchster Reinheit dar.

Ein anderer wichtiger Aspekt bei allen Arzneimitteln ist das Erfor dernis einer Standardisierung, mit der dem Verbraucher eine vorgegebene konstante Wirkung garantiert wird. Diese Standardisierung ist insbesondere bei pflanzlichen Arzneimitteln mit unbekannten Wirkstoffen bisher ein er hebliches Problem gewesen, und zwar nicht nur wegen der Abhängigkeit des Wirkungsspektrums vom Herstellungsverfahren, sondern auch deshalb, weil die im Freiland aufgewachsenen Arzneipflanzen stark schwankende Gehalte an Inhaltsstoffen aufweisen, beispielsweise infolge von Wetter- und Klimaein flüssen, unterschiedlichen Bodenverhältnissen und Abweichungen in den An baumethoden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren stellt dagegen die Standardisie rung kein Problem mehr dar. Es ist ohne weiteres möglich, von einem hin sichtlich der genetischen und physiologischen Eigenschaften einheitlichen Pflanzenmaterial auszugehen (das z. B. durch vegetative Teilung konstant zur Verfügung bleiben kann), dieses Material unter für jede einzelne Pflanze stets gleichen Bedingungen aufzuziehen und auch die weitere Verarbeitung (Ernte, Frostung) unter konstanten Bedingungen durchzuführen, so daß pro blemlos ein hohes Maß an qualitativer und quantitativer Standardisierung gewährleistet werden kann. Dies ist ein weiterer wichtiger Vorteil der Erfindung.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von zwei Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Gewinnung der Inhaltsstoffe der Venus fliegenfalle (Dionaea muscipula) und wurde deshalb gewählt, weil der Saft fleischfressender Pflanzen meistens besonders stark kontaminiert ist. Dies liegt daran, daß fleischfressende Pflanzen bei der Verdauung der von ihnen angelockten Insekten gezwungen sind, die Permeabilität ihrer schützenden Epidermis zu erhöhen, so daß z. B. durch die Insekten eingeschleppte Mikroorganismen besonders leicht in das Pflanzeninnere gelangen können.

Es wurden die folgenden Verfahrensschritte ausgeführt, und zwar jeweils in steriler Atmosphäre.

1. Sterilisation der Samen

Die Samen wurden in 2% Natriumhypochlorid, versetzt mit einem Tropfen eines handelsüblichen Geschirrspülmittels, etwa 5 min lang gerührt. Anschließend erfolgte ein mehrmaliges Waschen der Samen mit Aqua injectabi lia. Die so sterilisierten Samen wurden in einer Petrischale auf Agar aufgelegt.

2. Keimung der Samen

Die Keimung erfolgte in der Petrischale bei 20°C in auf folgendem Medium:

15 g Sucrose/1000 ml
2,4 g Murashige/Skoog-Medium (M+S-Medium)
6 g Agar
1 mg Gibberellinsäure
5 ml Staba-Vitamine.

Die Keimlinge wurden 6 Tage lang bei 25°C mit 2000 Lux Belichtung 16 h pro Tag inkubiert.

3. Anzucht und Teilung der Pflanzen

Nach erfolgter Keimung wurden die Pflanzen zur Anzucht auf weitere Petrischalen in das Kulturmedium gemäß Schritt 2 umgesetzt und unter den Bedingungen gemäß Schritt 2 fortlaufend inkubiert. Die Umsetzung wurde bei Erschöpfung des Kulturmediums (etwa alle 3-4 Wochen) wiederholt. Zu einem geeigneten Wachstumsstand wurden die Pflanzen bei einer dieser Umsetzungen nach üblichen Methoden durch vegetative Teilung vermehrt. Dadurch wird eine hinsichtlich der genetischen und physiologischen Eigenschaften einheitliche Biomasse gewährleistet.

Nach erfolgter Anzucht und Vermehrung wurden alle Pflanzen mit einem überdurchschnittlichen oder unterdurchschnittlichen Anzuchtwachstum ver worfen. Mit den durchschnittlich, also im wesentlichen gleich gewachsenen Pflanzen wurden dann die Schritte 4 und 5 durchgeführt, und zwar immer unter den gleichen Bedingungen (Standardisierung zum Zwecke der Produktion eines homogenen Pflanzenmaterials). Damit kann die einmalige Durchführung der Schritte 3-5 für die aus einem Samenansatz hervorgegangene Pflanzen menge als Herstellung einer Charge des Pflanzensaftes betrachtet werden.

4. Aufzucht der Pflanzen in Flüssigkultur

Aus den Petrischalen wurden die Pflanzen in Kolben von 1 l Inhalt in ein flüssiges Kulturmedium folgender Zusammensetzung überführt:

12 g Sucrose / 800 ml
1,8 g M+S-Medium (pH 5,8)
0,8 ml Indolessigsäure
0,8 ml Benzylaminopurin
4 ml Staba-Vitamine.

Vorher wurden die Pflanzen zwecks Entfernung von Agar-Resten mit Aqua injectabilia gespült. Die überführte Pflanzenmenge wurde gewogen. Zur Durchmischung des Mediums wurden die Kolben mit steriler Luft belüftet. Die Inkubation erfolgte konstant bei 25°C mit 4000 Lux Belichtung 16 h pro Tag.

Nach einem Monat wurden die Pflanzen unter sonst gleichen Kulturbe dingungen in Kolben von 2 l Inhalt überführt. Am Ende der sich anschließen den Wachstumsperiode von 6-8 Wochen wurden die Pflanzen - wiederum unter sonst gleichen Kulturbedingungen - in Kolben von 10 l Inhalt überführt, in denen sie weitere 8 Wochen aufgezogen wurden. Bei jeder Überführung wurden alle Pflanzen mit überdurchschnittlichem oder unterdurchschnittlichem Wachstum verworfen.

5. Saftgewinnung

Die gemäß Schritt 4 gewonnenen Pflanzen wurden in den Kolben mit Aqua injectabilia gespült, bis das Kulturmedium restlos entfernt war. Dann wurden die Kolben bei -25°C gefrostet und bei -18°C bis zum Verbrauch des Saftes gelagert. Für den Verbrauch des Saftes wurden die Pflanzen bei -4°C im dunklen Kühlschrank aufgetaut, und dann wurde der Saft durch Filtration (Mikrofilter 0,2 µm) von den Feststoffen getrennt. Es ergab sich ein klarer heller Saft, der im dunklen Kühlschrank haltbar war, d. h. unter diesen Be dingungen erwies sich das Ausmaß der im Saft ablaufenden internen Prozesse als nur gering.

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt die Gewinnung der natur-originalen Inhaltsstoffe des roten Sonnenhuts (Echinacea purpurea), einer nicht fleischfressenden Pflanze. Dazu wurde im wesentlichen analog Beispiel 1 vorgegangen, jedoch wurden die Keimung (in Dunkelheit), die Wachstums perioden zwischen den Umsetzungen (nur etwa 3 Wochen) und die Inkubations bedingungen (20°C statt 25°C) an die pflanzenspezifischen Gegebenheiten angepaßt. Außerdem enthielt die Flüssigkultur in diesem Fall neben dem M+S- Medium und der Sucrose (15 g/l) noch 0,1 mg/l α-Naphthalenessigsäure und 0,1 mg/l Benzyladenin.

Zur Frostung und Lagerung wurden die Pflanzen in diesem Fall nach der letzten Spülung aus den Kolben in Gefäße überführt, die die Bedingung erfüllen mußten, sowohl sterilisierbar zu sein (also hohen Temperaturen von mindestens 100°C standhalten zu können) als auch tiefe Temperaturen bis etwa -50°C ertragen zu können. Hierbei haben sich Beutel aus hochwertigem Polypropylen bewährt. Solche Beutel haben den Vorteil, daß sie im tiefge frorenen Zustand transportiert werden können, so daß das Auftauen und Filtrieren am Ort des Verbrauchs statt am Ort der Herstellung erfolgen kann. Dadurch wird das Ausmaß der im Saft ablaufenden internen Prozesse zusätzlich vermindert.

Mit solchen Beuteln aus Polypropylen läßt sich auch auf besonders zweckmäßige Weise eine Frostung (und anschließende Lagerung) der Pflanzen im Vakuum vornehmen. Dazu genügt es, die Beutel vor der Frostung unter Vakuum zu verschweißen.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung der Inhaltsstoffe von Arzneipflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanzen bis zur Erntereife unter sterilen Bedingungen aufgezogen werden und daß anschließend die Zellwände der Pflan zen bzw. der für die Gewinnung der Inhaltsstoffe benötigten Pflanzenteile unter Beibehaltung der sterilen Bedingungen durch Frostung zerstört werden, um den Pflanzensaft freizusetzen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Frostung in einem Temperaturbereich von -15°C bis -30°C durchgeführt wird, bis sich ein tiefgefrorener Brei gebildet hat, der aus dem die natur originalen Inhaltsstoffe enthaltenden Saft und den Zellwand- und Mem branresten besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Frostung in völliger Dunkelheit durchgeführt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeich net, daß die Frostung unter Sauerstoff-Ausschluß durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeich net, daß von einem standardisierten, hinsichtlich der genetischen und phy siologischen Eigenschaften einheitlichen Pflanzenmaterial ausgegangen wird, das unter standardisierten Bedingungen aufgezogen und gefrostet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeich net, daß der bei der Frostung entstandene tiefgefrorene Pflanzenbrei bis zum Verbrauch des Saftes tiefgefroren gehalten, für den Verbrauch schonend aufgetaut und durch Filtration von den Feststoffen befreit wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Auftauen und die Filtration in völliger Dunkelheit und/oder unter Sauer stoff-Ausschluß durchgeführt wird.