WO1993019764A1 - Verfahren zur gewinnung der inhaltsstoffe von arzneipflanzen - Google Patents

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WO1993019764A1
WO1993019764A1 PCT/DE1993/000322 DE9300322W WO9319764A1 WO 1993019764 A1 WO1993019764 A1 WO 1993019764A1 DE 9300322 W DE9300322 W DE 9300322W WO 9319764 A1 WO9319764 A1 WO 9319764A1
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plant
plants
juice
frosting
frozen
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PCT/DE1993/000322
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Inventor
Helmut Wilhelm
Ulrich Lohmann
Original Assignee
Waldheim Pharmatec Gmbh
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
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    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/28—Asteraceae or Compositae (Aster or Sunflower family), e.g. chamomile, feverfew, yarrow or echinacea

Definitions

  • Medicinal plants possibly enriched in certain parts of plants such as roots, leaves, flowers or fruits, contain ingredients with a pharmacological effect and form the basis for a considerable number of medicaments.
  • ingredients with a pharmacological effect and form the basis for a considerable number of medicaments.
  • There are various processes for obtaining these ingredients most of which work on the principle of an extraction of the plants of whatever kind with a suitable extraction agent and a more or less selective solution of certain herbal active ingredients or groups of active ingredients in the extractant give.
  • processes which are generally characterized by the plant cells breaking open (by pressing fresh plants) and resulting in a plant sap are becoming increasingly important.
  • the invention relates to the extraction of plant juices.
  • a fundamental problem in the production of Phytophar aka is the contamination inevitably contained in medicinal plants - be they collected wild or cultivated for agriculture - due to environmental influences.
  • other loads from the environment are absorbed and enriched by the plants, for example heavy metals by contact of the plants with rain and dust or by absorption of the ions from soils containing heavy metals.
  • proteins enzymes
  • polysaccharides which are larger than the cut-off mentioned
  • the invention achieves this goal in that the plants are grown to maturity under sterile conditions and in that the cell walls of the plants or the parts of the plants required for obtaining the constituents are destroyed by frost while maintaining the sterile conditions to release the plant sap.
  • the invention is based on the knowledge that even if it should be possible to develop considerably improved analysis and separation methods, the decontamination of plant juices will always remain a problem, ie always with effort and / or an impairment of the active principle zips will be connected. In consistent pursuit of this knowledge, the invention therefore leaves the path taken so far to accept contamination of the plants as inevitable and to look for possibilities for subsequent seek the elimination of the contamination. Instead, the invention now proposes growing the plants until they are ready for harvesting under sterile conditions and thus keeping them free of any contaminants from the outset, so that a crop-specific juice which is not adulterated by external influences is present in the plant .
  • This sterile cultivation of the plants is sharply differentiated from the known in vitro cultures in which callus or cell cultures are induced to form very specific active substances with the aid of suitable substrates.
  • in vitro cultures can even be used to produce active ingredients that do not occur in the natural plant at all.
  • the invention does not depend on individual active substances or their enrichment, but rather on the contrary the maintenance of the species-specific pattern of all the substances contained in a natural plant, both in qualitative and in quantitative material composition. With in vitro cultures, no species-specific pattern of all ingredients of the underlying plant can be generated.
  • the invention is not limited to the proposal to grow the plants in a sterile manner, but rather combines this proposal with a special process step for releasing the juice from the plant cell, namely with a frosting of the plants or the required plant parts . It is only through this combination that the aim of the invention of obtaining a natural plant juice from the plant is achieved.
  • the plant sap has been released by pressing the plants, ie by mechanically crushing the cells at room temperature. Since this also destroys subcellular compartments (e.g. microsomes with the degrading enzymes contained therein, the cell nucleus with building enzymes, mitochondria as the site of carbon degradation and chloroplasts as the site of carbon buildup) of the plant cell, enzyme systems and their substrates can suddenly appear in the resulting juice meet, which are normally separated from each other by membranes. This leads to uncontrolled internal reactions in the juice (in particular their enzymatic catalysis, but also non-specific radical reactions) that do not occur at all in the normal metabolism of the cell.
  • subcellular compartments e.g. microsomes with the degrading enzymes contained therein, the cell nucleus with building enzymes, mitochondria as the site of carbon degradation and chloroplasts as the site of carbon buildup
  • the gentle release is achieved in the context of the invention by freezing the plants or the plant parts required for juice extraction.
  • the water contained in the cells forms fine, needle-shaped ice crystals, which penetrate the cell walls and cut from the inside.
  • the subcellular compartments are also cut, at least in part, but the compressive and shear forces which are unavoidable during pressing and which may introduce considerable additional energy (heat) into the system and thus to accelerate the internal reactions are eliminated contribute.
  • the cracking of the cell walls by frost represents a pronounced "low-energy" process, the main advantage of which is that it can be used at temperatures below takes place at half the freezing point and thus at temperatures at which the internal reactions are largely or completely inhibited.
  • the second step of the method according to the invention also follows the leitmotif of the invention, namely "avoiding harmful influences instead of eliminating their consequences”.
  • the frosting in the absence of light in order to inhibit the phytochrome system of the plant and to avoid unspecific light-dependent subsequent reactions. It is also expedient to carry out the frosting with the exclusion of oxygen (e.g. under nitrogen, but preferably in vacuo), so that redox reactions are also avoided if possible.
  • oxygen e.g. under nitrogen, but preferably in vacuo
  • the plant frozen in this way is in principle a frozen porridge made from the desired plant sap and the remains of the cell walls and membranes.
  • This porridge is expediently kept frozen until the juice has been consumed, so that the undesired internal reactions remain inhibited not only when the cell is broken open but also without interruption until the juice is consumed.
  • all active proteins are preserved in their tertiary structure.
  • the porridge is carefully thawed (for example in the refrigerator at 2-8 ° C.) and the solids are removed by filtration, the thawing and filtration steps in turn being expediently carried out with the exclusion of light and oxygen become.
  • the juice obtained in this way represents a phytopharmaceutical with an unprecedented effectiveness with the highest purity.
  • This example describes the extraction of the ingredients of the Venus flytrap (Dionaea muscipula) and was chosen because the juice of carnivorous plants is mostly particularly contaminated. This is because, when digesting the insects they attract, carnivorous plants are forced to increase the permeability of their protective epidermis, so that e.g. microorganisms introduced by the insects can get particularly easily into the interior of the plant.
  • the seeds were stirred in 2% sodium hypochloride with a drop of a commercially available dishwashing detergent for about 5 minutes. The seeds were then washed several times with Aqua injectabilia. The seeds sterilized in this way were placed on agar in a petri dish. 2. Seed germination
  • the seedlings were incubated for 6 days at 25 'C with 2000 lux exposure for 16 h per day.
  • the plants were transferred to the culture medium according to step 2 for cultivation on further petri dishes and continuously incubated under the conditions according to step 2.
  • the reaction was repeated when the culture medium was exhausted (approximately every 3-4 weeks).
  • the plants were propagated to a suitable growth level by conventional methods by vegetative division. This ensures a uniform biomass with regard to the genetic and physiological properties.
  • Steps 4 and 5 were then carried out with the plants, which had grown on average, essentially the same, and always under the same conditions (standardization for the purpose of producing a homogeneous plant material).
  • the one-off implementation of steps 3 - 5 for the quantity of plants resulting from a seed batch can thus be regarded as the production of a batch of the vegetable sap.
  • the plants were transferred from the Petri dishes in flasks of 1 l content to a liquid culture medium of the following composition: 12 g sucrose / 800 ml
  • the plants were previously rinsed with aqua injectabilia to remove agar residues. The amount of plants transferred was weighed. The flasks were aerated with sterile air to mix the medium. Incubation was constant at 25 ° C with 4000 lux exposure for 16 h per day.
  • the plants were transferred to flasks of 2 l content under otherwise identical culture conditions.
  • the plants - again under otherwise the same culture conditions - were transferred to flasks of 10 l in which they were grown for a further 8 weeks. With each transfer, all plants with above-average or below-average growth were discarded.
  • step 4 The plants obtained according to step 4 were rinsed in the flask with aqua injectabilia until the culture medium had been completely removed. Then the flasks were frozen at -25 ° to -35 ° C and stored at -18 ° C until the juice was consumed. To consume the juice, the plants were thawed at -4 ° C. in a dark refrigerator, and then the juice was separated from the solids by sterile filtration (microfilter 0.2 ⁇ m). The result was a clear, light yellowish juice that was stable in the dark refrigerator, i.e. under these conditions, the extent of the internal processes taking place in the juice proved to be minimal.
  • the juice obtained according to step 5 was stored under sterile conditions in the dark at 4 ° C. for 5 days and then examined for some selected properties. The results found are given in the "Juice Step 5 (Invention)” column of Table 1.
  • a conventional press juice was also produced from the plants obtained in step 4, at room temperature using a hand press. The resulting juice was filtered and stored in the same way as the juice obtained according to step 5 (a relatively rapid darkening was observed during storage) and then examined for the same properties. The values found are given in the "Press juice (comparison)" column in Table 1.
  • the juice was decolorized using activated charcoal and filtered again with ⁇ -sterile for the mood of the test and the detection of the aldolase activity.
  • Table 1 shows considerable differences between the values of the juice obtained according to the invention in step 5 and those of the pressed juice.
  • the juice obtained according to step 5 has a clear aldolase activity, while no more aldolase activity can be determined in the pressed juice.
  • fresh plant material was processed according to step 4 by puree at 0 ° C. (ice bath) to a homogenate which, upon immediate examination, had an aldolase activity of 0.41 mU / ml and after 4 h storage in an ice bath had an Aldolase activity of 0.37 mU / ml, in each case based on 10 ⁇ g protein.
  • This example describes the production of the natural ingredients of the red coneflower (Echinacea p ⁇ rpurea), a non-carnivorous plant.
  • the procedure was essentially analogous to Example 1, but the germination (in the dark), the growth periods between the reactions (only about 3 weeks) and the incubation conditions (20 ° C. instead of 25 ° C.) were adapted to the plant-specific conditions .
  • the liquid culture also contained 0.1 mg / 1 ⁇ -naphthalene acetic acid and 0.1 mg / 1 benzyladenine.
  • the plants can also be frosted (and subsequently stored) in a particularly expedient manner in vacuo. To do this, it is sufficient to seal the bags under vacuum before freezing.

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Abstract

Beansprucht wird ein Verfahren zur Gewinnung der Inhaltsstoffe von Arzneipflanzen, welches sich dadurch kennzeichnet, daß die Pflanzen bis zur Erntereife unter sterilen Bedingungen aufgezogen werden, und daß anschließend die Zellwände der Pflanzen bzw. der für die Gewinnung der Inhaltsstoffe benötigten Pflanzenteile unter Beibehaltung der sterilen Bedingungen durch Frostung zerstört werden, um den Pflanzensaft freizusetzen. Mit diesem Verfahren wird ein 'natur-originaler' Pflanzensaft gewährleistet, der frei von Kontaminationen aus der Umwelt ist und darüber hinaus sowohl in qualitativer als auch in quantitativer Hinsicht das für die intakte Arzneipflanze typische (artspezifische) Muster der Inhaltsstoffe aufweist. Ein weiterer wichtiger Vorteil der Erfindung besteht noch darin, daß von einem standardisierten, hinsichtlich der genetischen und physiologischen Eigenschaften einheitlichen Pflanzenmaterail ausgegangen werden kann, das unter standardisierten Bedingungen aufgezogen und gefrostet wird. Die Frostung stellt ein 'Low -Energy'-Verfahren zur Zerstörung der Zellwände und Membranen der Pflanze dar. Dieses 'Low-Energy'-Prinzip kann noch unterstützt werden dadurch, daß die Frostung in völliger Dunkelheit und/oder unter Sauerstoff-Ausschluß (z.B. im Vakuum) durchgeführt wird. Zweckmäßig wird der bei der Frostung entstandene tiefgefrorene Pflanzenbrei bis zum Verbrauch des Saftes tiefgefroren gehalten, für den Verbrauch schonend aufgetaut und durch Filtration von den Feststoffen befreit.

Description

Verfahren zur Gewinnung der Inhaltsstoffe von Arzneipflanzen
Arzneipflanzen enthalten, ggfs. in bestimmten Pflanzenteilen wie Wur¬ zeln, Blättern, Blüten oder Früchten angereichert, Inhaltsstoffe mit phar- makologischer Wirkung und bilden die Grundlage für eine beachtliche Anzahl von Arzneimitteln. Zur Gewinnung dieser Inhaltsstoffe gibt es unterschied¬ liche Verfahren, von denen die meisten nach dem Prinzip einer wie auch immer gearteten Extraktion der Pflanzen mit einem geeigneten Extraktions¬ mittel arbeiten und eine mehr oder weniger selektive Lösung bestimmter pflanzlicher Wirkstoffe oder Wirkstoffgruppen in dem Extraktionsmittel er¬ geben. Daneben gewinnen aber Verfahren, die sich allgemein durch ein Auf¬ brechen der Pflanzenzellen (durch Verpressen frischer Pflanzen) auszeichnen und zu einem Pflanzensaft führen, zunehmend an Bedeutung. Die Erfindung be¬ faßt sich mit der Gewinnung von Pflanzensäften.
Ein grundsätzliches Problem bei der Herstellung von Phytophar aka bilden die in Arzneipflanzen - seien sie wild gesammelt oder landwirt¬ schaftlich angebaut - unvermeidlich enthaltenen Kontaminationen aufgrund von Umgebungseinflüssen. Hierzu sei zunächst auf die zahlreichen Herbizide, Fungizide und Pestizide hingewiesen, die bei den heutigen Anbaumethoden allgemein als unverzichtbar angesehen werden, aber selbst bei sorgfältiger Anwendung zu Rückständen in den Pflanzen führen und auch in Wildpflanzen enthalten sein können. Weiterhin werden von den Pflanzen auch andere Be¬ lastungen aus der Umwelt aufgenommen und angereichert, beispielsweise Schwer etalle durch Kontakt der Pflanzen mit Regen und Staub oder durch Aufnahme der Ionen aus schwermetallhaltigen Böden.
Neben diesen mehr "passiven" (d.h. nach der Aufnahme im wesentlichen als solche unverändert bleibenden) Kontaminationen gibt es noch die große Gruppe von Kontaminationen durch Befall der Pflanze mit Krankheitserregern (Viren, Bakterien, Pilzen) oder Parasiten. Derartige Kontaminationen können als "aktiv" bezeichnet werden, weil sie zusätzliche Stoffwechselprodukte in die Pflanze einbringen und außerdem in der Pflanze Abwehr- oder andere Se¬ kundärreaktionen auslösen, durch die sekundäre toxische Schadstoffe wirksam werden können. Insbesondere sind Endotoxine (vornehmlich Lipopolysaccharide aus Zellwänden von Mikroorganismen) und Phytoalexine (Produkte des pflanz¬ lichen Sekundärstoffwechsels bei Abwehrreaktionen) die Folge einer Kon¬ tamination durch Krankheitserreger oder Parasiten.
Wenn aus Arzneipflanzen bestimmte Wirkstoffe oder Wirkstoffgruppen gewonnen werden sollen, lassen sich die Kontaminationen meistens ausrei¬ chend gut beherrschen. In diesem Fall handelt es sich nämlich in der Regel um bekannte Wirkstoffe, die mit den jeweiligen Aufbereitungsmethoden so isoliert oder angereichert werden, daß sie weitgehend bis vollständig frei von Kontaminationen sind. Gänzlich anders ist die Lage jedoch, wenn die Pflanzeninhaltsstoffe nicht auf bestimmte Wirkstoffe oder Wirkstoffgruppen aufgearbeitet, sondern als solche in Form von Pflanzensäften angeboten werden sollen. Pflanzensäfte enthalten eine Vielfalt von Wirkstoffen, die häufig noch nicht einmal alle im einzelnen bekannt sind und in ihrer Ge¬ samtheit ein sogenanntes "Wirkprinzip" bilden. Es ist offensichtlich, daß sich unter diesen Inhaltsstoffen auch die eingangs beschriebenen Kontamina¬ tionen befinden können, wodurch das Wirkprinzip nachteilig beeinflußt wird.
Eine Abtrennung der Kontaminationen aus Pflanzensäften, die als sol¬ che zur pharmazeutischen Anwendung kommen sollen, ist äußerst problema¬ tisch. Wenn eine Abtrennung überhaupt möglich ist, geht sie häufig mit einem Eingriff in das Wirkprinzip einher. Dies gilt insbesondere für die Endotoxine, die speziell für den Menschen eine hohe toxische Wirkung be¬ sitzen und deshalb insbesondere in Injectabilia nicht (oder allenfalls nur in äußerst geringen Spuren) enthalten sein dürfen. Aufgrund ihrer Molekül¬ größe lassen sie sich verhältnismäßig einfach und sicher durch Ultrafiltra¬ tion bei 20.000 Dalton oder mit speziell dafür entwickelten Ultrafiltern aus Pflanzensäften entfernen. Dabei muß aber in Kauf genommen werden, daß alle W rkstoff-Moleküle wie Proteine (Enzyme) oder Polysaccharide, die größer als die genannte Trenngrenze (cut-off) sind, ebenfalls eliminiert werden, also ein Teil des Wirkprinzips verlorengeht.
Die Abtrennung der anderen Kontaminationen ist schwieriger und mit¬ unter überhaupt nicht möglich. Hinzu kommt dabei, daß manche der anderen Kontaminationen noch nicht einmal richtig erkannt werden können, weil für die Vielzahl an Kontaminierungsmöglichkeiten (und darunter allein die An¬ zahl von ca. 600 im ArzneiPflanzenbau zugelassenen Pflanzenschutzmitteln) weder ausreichende Trennverfahren noch analytische Detektierungsverfahren zur Verfügung stehen. Somit besteht die Gefahr, daß viele schädliche Kon¬ taminationen erst durch unerwünschte Wirkungen bei klinischen Studien am Menschen zutage treten.
Nicht zuletzt diese Probleme haben dazu geführt, daß an die Reinheit von Phytoparmaka immer höhere Anforderungen gestellt werden, die jedenfalls für Pflanzensäfte mit den herkömmlichen Methoden nicht mehr erfüllt werden können. Mit der Erfindung soll diesen Anforderungen nunmehr entsprochen werden, indem der pharmazeutischen Technik ein Verfahren zur Verfügung ge¬ stellt wird, das die Gewinnung von natur-originalen Pflanzensäften ge¬ stattet. Der Begriff "natur-original" soll hierbei bedeuten, daß der Saft nicht nur frei von den Kontaminationen aus der Umwelt ist, sondern darüber hinaus auch sowohl in qualitativer (stofflicher) als auch in quantitativer (mengenmäßiger) Hinsicht das für die intakte Arzneipflanze typische (art¬ spezifische) Muster der Inhaltsstoffe aufweist.
Dieses Ziel erreicht die Erfindung dadurch, daß die Pflanzen bis zur Erntereife unter sterilen Bedingungen aufgezogen werden und daß anschlie¬ ßend die Zellwände der Pflanzen bzw. der für die Gewinnung der Inhaltsstof¬ fe benötigten Pflanzenteile unter Beibehaltung der sterilen Bedingungen durch Frostung zerstört werden, um den Pflanzensaft freizusetzen.
Die Erfindung geht von der Erkenntnis aus, daß selbst dann, wenn es gelingen sollte, erheblich verbesserte Analysen- und Trennmethoden zu ent¬ wickeln, die Dekontaminierung von Pflanzensäften immer ein Problem bleiben wird, d.h. immer mit Aufwand und/oder einer Beeinträchtigung des Wirkprin¬ zips verbunden sein wird. In konsequentem Verfolg dieser Erkenntnis verläßt die Erfindung daher den bislang eingeschlagenen Weg, Kontaminationen der Pflanzen als unvermeidlich hinzunehmen und nach Möglichkeiten zur nachheri- gen Beseitigung der Kontaminationen zu suchen. Stattdessen wird mit der Er¬ findung nunmehr vorgeschlagen, die Pflanzen bis zur Erntereife unter ste¬ rilen Bedingungen aufzuziehen und damit von vornherein frei von jeglichen Kontaminationen zu halten, sodaß bei der Ernte ein artspezifischer, nicht durch äußere Einflüsse verfälschter Saft in der Pflanze enthalten ist.
Diese sterile Aufzucht der Pflanzen, wie sie bei der Erfindung vor¬ gesehen ist, grenzt sich scharf ab gegen die bekannten in-vitro-Kulturen, bei denen Kallus- oder Zell ulturen mit Hilfe geeigneter Substrate dazu veranlaßt werden, ganz bestimmte Wirkstoffe zu bilden. Dabei wird ausge¬ nutzt, daß sich diese Wirkstoffe normalerweise in den Kulturen stärker anreichern als in der natürlichen Pflanze. In einzelnen Fällen können mit in-vitro-Kulturen sogar Wirkstoffe erzeugt werden, die in der natürlichen Pflanze überhaupt nicht vorkommen. Demgegenüber kommt es bei der Erfindung nicht auf einzelne Wirkstoffe oder deren Anreicherung an, sondern im Gegen¬ teil auf die Aufrechterhaltung des artspezifischen Musters sämtlicher In¬ haltsstoffe einer natürlichen Pflanze sowohl in qualitativer als auch in quantitativer stofflicher Zusammensetzung. Mit in-vitro-Kulturen läßt sich kein artspezifisches Muster sämtlicher Inhaltsstoffe der zugrundeliegenden Pflanze erzeugen.
Die Erfindung erschöpft sich aber nicht in dem Vorschlag, die Pflan¬ zen steril aufzuziehen, sondern kombiniert diesen Vorschlag mit einem be¬ sonderen Verfahrensschritt zur Freisetzung des Saftes aus der Pflanzenzel¬ le, nämlich mit einer Frostung der Pflanzen bzw. der benötigten Pflanzen¬ teile. Erst durch diese Kombination wird das Ziel der Erfindung, aus der Pflanze einen natur-originalen Pflanzensaft zu erhalten, erreicht.
Bisher erfolgte die Freisetzung des Pflanzensaftes durch Verpressen der Pflanzen, also durch ein mechanisches Zerdrücken der Zellen bei Raum¬ temperatur. Da dabei auch subzelluläre Kompartimente (z.B. Mikroso en mit den darin enthaltenen abbauenden Enzymen, der Zellkern mit aufbauenden Enzymen, Mitochondrien als Ort des Kohlenstoffabbaus und Chloroplasten als Ort des Kohlenstoffaufbaus) der Pflanzenzelle zerstört werden, können in dem so entstandenen Saft plötzlich Enzymsysteme und deren Substrate zusam¬ mentreffen, die normalerweise durch Membranen voneinander getrennt sind. Dadurch kommt es im Saft zu unkontrollierten internen Reaktionen (insbeson- dere enzymatischen Katalysen, aber auch unspezifischen Radikalreaktionen), wie sie im normalen Stoffwechsel der Zelle überhaupt nicht auftreten. Auf diese Weise können interne degenerative Prozesse in Gang gesetzt werden, durch die die gewünschten Inhaltsstoffe möglicherweise modifiziert oder sogar ganz abgebaut werden, und durch die eventuell sogar schädliche, d.h. toxische Metabolite gebildet werden, die sich nur durch eine weitere Reini¬ gung des Saftes eliminieren lassen. Wegen der nahen Verwandtschaft von Wirkstoff und Metabolit muß für eine solche Reinigung häufig ein erhöhter Aufwand getrieben werden, und in jedem Fall ist dabei, wie schon im Zusam¬ menhang mit der Abtrennung der Endotoxine erläutert, auch wieder mit einem Verlust an Wirkprinzip zu rechnen.
Diesen unkontrollierten internen Prozessen hat man bisher verhältnis¬ mäßig wenig Aufmerksamkeit geschenkt, möglicherweise deshalb, weil die bisher durch Verpressen gewonnenen Säfte ohnehin (allein schon wegen der Endotoxine) einer Nachbehandlung unterworfen werden mußten. Nachdem das erfindungsgemäße Verfahren aber nunmehr zu kontaminationsfreien Pflanzen¬ säften führt, die keiner Nachbehandlung mehr bedürfen, hat sich gezeigt, daß auch diese nach der Zerstörung der Zellwände und Membranen einsetzenden Prozesse die Qualität des gewonnenen Saftes im erheblichen Ausmaß beein¬ trächtigen können und ebenso beachtet werden müssen wie die eingangs ge¬ schilderten Einfüsse von außen, die zur Kontamination des Saftes führen. Es gehört daher mit zur Erfindung, die kontaminationsfreie Erzeugung der Pflanzensäfte zu ergänzen durch eine möglichst schonende Freisetzung der Pflanzensäfte aus der Zelle.
Die schonende Freisetzung wird im Rahmen der Erfindung erreicht durch Frostung der Pflanzen bzw. der für die Saftgewinnung benötigten Pflanzen¬ teile. Bei der Frostung bildet das in den Zellen enthaltene Wasser feine nadeiförmige Eiskristalle, welche die Zellwände durchdringen und von innen heraus zerschneiden. Dabei werden zwar auch die subzellulären Kompartimente - jedenfalls zum Teil - mit zerschnitten, aber es entfallen die beim Ver¬ pressen unvermeidlichen Druck- und Scherkräfte, die u.U. erhebliche zusätz¬ liche Energie (Wärme) in das System einführen und damit zur Beschleunigung der internen Reaktionen beitragen. Demgegenüber stellt das Aufbrechen der Zellwände durch Frostung ein ausgesprochenes "Low-Energy"-Verfahren dar, dessen wesentlicher Vorteil darin besteht, daß es bei Temperaturen unter- halb des Gefrierpunktes abläuft und damit bei Temperaturen, bei denen die internen Reaktionen weitgehend bis vollständig gehemmt sind. Somit folgt auch der zweite Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens dem Leitmotiv der Erfindung, nämlich "Vermeidung schädlicher Einflüsse statt Beseitigung ihrer Folgen".
In weiterer Ausgestaltung des "Low-Energy"-Prinzips bei der Freiset¬ zung der Planzensäfte ist es zweckmäßig, die Frostung unter Lichtausschluß durchzuführen, um das Phytochromsystem der Pflanze zu hemmen und unspezifi¬ sche lichtabhängige Folgereaktionen zu vermeiden. Weiterhin ist es zweckmä¬ ßig, die Frostung unter Sauerstoff-Ausschluß (z.B. unter Stickstoff, vor¬ zugsweise aber im Vakuum) vorzunehmen, damit auch Redox-Reaktionen nach Möglichkeit unterbleiben.
Die solcherart gefrostete Pflanze ist im Prinzip ein tiefgefrorener Brei aus dem gewünschten Pflanzensaft und den Resten der Zellwände und Membranen. Dieser Brei wird zweckmäßig bis zum Verbrauch des Saftes tief¬ gefroren gehalten, damit die unerwünschten internen Reaktionen nicht nur beim Aufbrechen der Zelle, sondern ohne Unterbrechung weiter bis zum Ver¬ brauch des Saftes gehemmt bleiben. Zugleich werden dadurch alle aktiven Proteine in ihrer Tertiärstruktur konserviert. Sobald der Verbrauch des Saftes ansteht, wird der Brei vorsichtig aufgetaut (z.B. im Kühlschrank bei 2 - 8 °C) und durch Filtration von den Feststoffen befreit, wobei die Schritte des Auftauens und der Filtration zweckmäßig wiederum unter Licht¬ ausschluß und Sauerstoff-Ausschluß ausgeführt werden. Der solcherart erhal¬ tene Saft stellt ein Phytopharmakum mit einer bislang nicht erreichten Wirksamkeit bei höchster Reinheit dar.
Ein anderer wichtiger Aspekt bei allen Arzneimitteln ist das Erfor¬ dernis einer Standardisierung, mit der dem Verbraucher eine vorgegebene konstante Wirkung garantiert wird. Diese Standardisierung ist insbesondere bei pflanzlichen Arzneimitteln mit unbekannten Wirkstoffen bisher ein er¬ hebliches Problem gewesen, und zwar nicht nur wegen der Abhängigkeit des Wirkungsspektrums vom Herstellungsverfahren, sondern auch deshalb, weil die im Freiland aufgewachsenen Arzneipflanzen stark schwankende Gehalte an In¬ haltsstoffen aufweisen, beispielsweise infolge von Wetter- und Klimaein¬ flüssen, unterschiedlichen Bodenverhältnissen und Abweichungen in den An- baumethoden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren stellt dagegen die Standardisie¬ rung kein Problem mehr dar. Es ist ohne weiteres möglich, von einem hin¬ sichtlich der genetischen und physiologischen Eigenschaften einheitlichen Pflanzenmaterial auszugehen (das z.B. durch vegetative Teilung konstant zur Verfügung bleiben kann), dieses Material unter für jede einzelne Pflanze stets gleichen Bedingungen aufzuziehen und auch die weitere Verarbeitung (Ernte, Frostung) unter konstanten Bedingungen durchzuführen, so daß pro¬ blemlos ein hohes Maß an qualitativer und quantitativer Standardisierung gewährleistet werden kann. Dies ist ein weiterer wichtiger Vorteil der Erfindung.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von zwei Ausführungsbeispielen näher erläutert.
BEISPIEL 1:
Dieses Beispiel beschreibt die Gewinnung der Inhaltsstoffe der Venus¬ fliegenfalle (Dionaea muscipula) und wurde deshalb gewählt, weil der Saft fleischfressender Pflanzen meistens besonders stark kontaminiert ist. Dies liegt daran, daß fleischfressende Pflanzen bei der Verdauung der von ihnen angelockten Insekten gezwungen sind, die Permeabilität ihrer schützenden Epidermis zu erhöhen, so daß z.B. durch die Insekten eingeschleppte Mikro¬ organismen besonders leicht in das Pflanzeninnere gelangen können.
Es wurden die folgenden Verfahrensschritte ausgeführt, und zwar jeweils in steriler Atmosphäre.
1. Sterilisation der Samen
Die Samen wurden in 2 % Natriumhypochlorid, versetzt mit einem Tropfen eines handelsüblichen Geschirrspülmittels, etwa 5 min lang gerührt. Anschließend erfolgte ein mehrmaliges Waschen der Samen mit Aqua injectabi- lia. Die so sterilisierten Samen wurden in einer Petrischale auf Agar auf¬ gelegt. 2. Keimung der Samen
Die Keimung erfolgte in der Petrischale bei 20° C in auf folgendem Medium:
15 g Sucrose / 1000 ml 2,4 g Murashige/Skoog-Medium (M+S-Medium) 6 g Agar
1 mg Gibberellinsäure 5 ml Staba-Vita ine
Die Keimlinge wurden 6 Tage lang bei 25 'C mit 2000 Lux Belichtung 16 h pro Tag inkubiert.
3. Anzucht und Teilung der Pflanzen
Nach erfolgter Keimung wurden die Pflanzen zur Anzucht auf weitere Petrischalen in das Kulturmedium gemäß Schritt 2 umgesetzt und unter den Bedingungen gemäß Schritt 2 fortlaufend inkubiert. Die Umsetzung wurde bei Erschöpfung des Kulturmediums (etwa alle 3 - 4 Wochen) wiederholt. Zu einem geeigneten Wachstumsstand wurden die Pflanzen bei einer dieser Umsetzungen nach üblichen Methoden durch vegetative Teilung vermehrt. Dadurch wird eine hinsichtlich der genetischen und physiologischen Eigenschaften einheitliche Biomasse gewährleistet.
Nach erfolgter Anzucht und Vermehrung wurden alle Pflanzen mit einem überdurchschnittlichen oder unterdurchschnittlichen Anzuchtwachstum ver¬ worfen. Mit den durchschnittlich, also im wesentlichen gleich gewachsenen Pflanzen wurden dann die Schritte 4 und 5 durchgeführt, und zwar immer unter den gleichen Bedingungen (Standardisierung zum Zwecke der Produktion eines homogenen Pflanzenmaterials). Damit kann die einmalige Durchführung der Schritte 3 - 5 für die aus einem Samenansatz hervorgegangene Pflanzen¬ menge als Herstellung einer Charge des Pflanzensaftes betrachtet werden.
4. Aufzucht der Pflanzen in Flüssigkultur
Aus den Petrischalen wurden die Pflanzen in Kolben von 1 1 Inhalt in ein flüssiges Kulturmedium folgender Zusammensetzung überführt: 12 g Sucrose / 800 ml
1,8 g M+S-Medium (pH 5,8)
0,8 ml Naphthylessigsäure
0.8 ml Benzylaminopurin
4 ml Staba-Vitamine
Vorher wurden die Pflanzen zwecks Entfernung von Agar-Resten mit Aqua injectabilia gespült. Die überführte Pflanzenmenge wurde gewogen. Zur Durchmischung des Mediums wurden die Kolben mit steriler Luft belüftet. Die Inkubation erfolgte konstant bei 25° C mit 4000 Lux Belichtung 16 h pro Tag.
Nach einem Monat wurden die Pflanzen unter sonst gleichen Kulturbe¬ dingungen in Kolben von 2 1 Inhalt überführt. Am Ende der sich anschließen¬ den Wachstumsperiode von 6 - 8 Wochen wurden die Pflanzen - wiederum unter sonst gleichen Kulturbedingungen - in Kolben von 10 1 Inhalt überführt, in denen sie weitere 8 Wochen aufgezogen wurden. Bei jeder Überführung wurden alle Pflanzen mit überdurchschnittlichem oder unterdurchschnittlichem Wachstum verworfen.
5. Saftgewinnung
Die gemäß Schritt 4 gewonnenen Pflanzen wurden in den Kolben mit Aqua injectabilia gespült, bis das Kulturmedium restlos entfernt war. Dann wurden die Kolben bei -25° bis -35° C gefrostet und bei -18° C bis zum Verbrauch des Saftes gelagert. Für den Verbrauch des Saftes wurden die Pflanzen bei -4° C im dunklen Kühlschrank aufgetaut, und dann wurde der Saft durch Sterilfiltration (Mikrofilter 0,2 μm) von den Feststoffen getrennt. Es ergab sich ein klarer hell-gelblicher Saft, der im dunklen Kühlschrank haltbar war, d.h. unter diesen Bedingungen erwies sich das Ausmaß der im Saft ablaufenden internen Prozesse als nur gering.
6. Prüfung des gewonnenen Saftes
Der gemäß Schritt 5 gewonnene Saft wurde 5 Tage lang unter sterilen Bedingungen im Dunkeln bei 4° C gelagert und dann auf einige ausgewählte Eigenschaften untersucht. Die gefundenen Ergebnisse sind in der Spalte "Saft Schritt 5 (Erfindung)" der Tabelle 1 angegeben. Zum Vergleich wurde aus den gemäß Schritt 4 gewonnenen Pflanzen auch ein herkömmlicher Preßsaft hergestellt, und zwar bei Raumtemperatur mittels einer Handpresse. Der dabei anfallende Saft wurde in gleicher Weise filtriert und gelagert wie der gemäß Schritt 5 gewonnene Saft (wobei während der Lagerung eine verhältnismäßig rasche Nachdunkelung zu be¬ obachten war) und dann auf die gleichen Eigenschaften untersucht. Die gefundenen Werte sind in der Spalte "Preßsaft (Vergleich)" der Tabelle 1 angegeben.
TABELLE 1
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{*) Für die Protβinb-Stimmung und den Nachweis der Aldolase-Aktivität wurde der Saft mittels Aktivkohle entfärbt und nochmals βterilfiltriert.
Aus der Tabelle 1 sind erhebliche Unterschiede zwischen den Werten des erfindungsgemäß gemäß Schritt 5 gewonnenen Saftes und denen des Pre߬ saftes zu erkennen. So ist beispielsweise bei dem gemäß Schritt 5 gewon¬ nenen Saft eine deutliche Aldolase-Aktivität vorhanden, während bei dem Preßsaft keine Aldolase-Aktivität mehr feststellbar ist. Um die bei dem Saft gemäß Schritt 5 ermittelte Aktivität bewerten zu können, wurde frisches Pflanzenmaterial gemäß Schritt 4 durch Pürieren bei 0° C (Eisbad) zu einem Homogenat verarbeitet, das bei sofortiger Untersuchung eine Aldo¬ lase-Aktivität von 0,41 mU/ml und nach 4 h Lagerung im Eisbad eine Aldola¬ se-Aktivität von 0,37 mU/ml aufwies, jeweils bezogen auf 10 μg Protein. Somit ist in dem erfindungsgemäß gewonnenen Saft die in den Pflanzen ur¬ sprünglich enthaltene Aldolase-Aktivität nahezu vollständig erhalten ge- blieben, während sie bei dem Preßsaft, offenbar bedingt durch Folgereaktio¬ nen, auf nicht mehr meßbare Werte abgesunken ist. Dies veranschaulicht die Überlegenheit der Erfindung.
BEISPIEL 2:
Dieses Beispiel beschreibt die Gewinnung der natur-originalen Inhaltsstoffe des roten Sonnenhuts ( Echinacea pυrpurea) , einer nicht¬ fleischfressenden Pflanze. Dazu wurde im wesentlichen analog Beispiel 1 vorgegangen, jedoch wurden die Keimung (in Dunkelheit), die Wachstums¬ perioden zwischen den Umsetzungen (nur etwa 3 Wochen) und die Inkubations¬ bedingungen (20° C statt 25° C) an die pflanzenspezifischen Gegebenheiten angepaßt. Außerdem enthielt die Flüssigkultur in diesem Fall neben dem M+S- Medium und der Sucrose (15 g/1) noch 0,1 mg/1 α-Naphthalenessigsäure und 0,1 mg/1 Benzyladenin.
Zur Frostung und Lagerung wurden die Pflanzen in diesem Fall nach der letzten Spülung aus den Kolben in Gefäße überführt, die die Bedingung erfüllen mußten, sowohl sterilisierbar zu sein (also hohen Temperaturen von mindestens 100° C standhalten zu können) als auch tiefe Temperaturen bis etwa -50° C ertragen zu können. Hierbei haben sich Beutel aus hochwertigem Polypropylen bewährt. Solche Beutel haben den Vorteil, daß sie im tiefge¬ frorenen Zustand transportiert werden können, so daß das Auftauen und Filtrieren am Ort des Verbrauchs statt am Ort der Herstellung erfolgen kann. Dadurch wird das Ausmaß der im Saft ablaufenden internen Prozesse zusätzlich vermindert.
Mit solchen Beuteln aus Polypropylen läßt sich auch auf besonders zweckmäßige Weise eine Frostung (und anschließende Lagerung) der Pflanzen im Vakuum vornehmen. Dazu genügt es, die Beutel vor der Frostung unter Vakuum zu verschweißen.

Claims

. -~Ϊ2 "P A T E NT A N S P R Ü C H E
1.) Verfahren zur Gewinnung der Inhaltsstoffe von Arzneipflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanzen bis zur Erntereife unter sterilen Bedingungen aufgezogen werden und daß anschließend die Zellwände der Pflan¬ zen bzw. der für die Gewinnung der Inhaltsstoffe benötigten Pflanzente le unter Beibehaltung der sterilen Bedingungen durch Frostung zerstört werden, um den Pflanzensaft freizusetzen.
2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Frostung in einem Temperaturbereich von * -15 °C bis » -30 °C durchgeführt wird, bis sich ein tiefgefrorener Brei gebildet hat, der aus dem die natur¬ originalen Inhaltsstoffe enthaltenden Saft und den Zellwand- und Mem¬ branresten besteht.
3.) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Frostung in völliger Dunkelheit durchgeführt wird.
4.) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 3, dadurch gekennzeich¬ net, daß die Frostung unter Sauerstoff-Ausschluß durchgeführt wird.
5.) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeich¬ net, daß von einem standardisierten, hinsichtlich der genetischen und phy¬ siologischen Eigenschaften einheitlichen Pflanzenmaterial ausgegangen wird, das unter standardisierten Bedingungen aufgezogen und gefrostet wird.
6.) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 5, dadurch gekennzeich¬ net, daß der bei der Frostung entstandene tiefgefrorene Pflanzenbrei bis zum Verbrauch des Saftes tiefgefroren gehalten, für den Verbrauch schonend aufgetaut und durch Filtration von den Feststoffen befreit wird.
7.) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Auftauen und die Filtration in völliger Dunkelheit und/oder unter Sauer¬ stoff-Ausschluß durchgeführt wird.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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