DE4334104A1 - Verfahren zur Gewinnung der Inhaltsstoffe von Arzneipflanzen - Google Patents

Description

Arzneipflanzen enthalten, ggfs. in bestimmten Pflanzenteilen wie Wur­ zeln, Blättern, Blüten oder Früchten angereichert, Inhaltsstoffe mit phar­ makologischer Wirkung und bilden die Grundlage für eine beachtliche Anzahl von Arzneimitteln. Zur Gewinnung dieser Inhaltsstoffe gibt es unterschied­ liche Verfahren, von denen die meisten nach dem Prinzip einer wie auch immer gearteten Extraktion der Pflanzen mit einem geeigneten Extraktions­ mittel arbeiten und eine mehr oder weniger selektive Lösung bestimmter pflanzlicher Wirkstoffe oder Wirkstoffgruppen in dem Extraktionsmittel er­ geben. Daneben gewinnen aber Verfahren, die sich allgemein durch ein Auf­ brechen der Pflanzenzellen (z. B. durch Verpressen frischer Pflanzen) aus­ zeichnen und zu einem Pflanzensaft führen, zunehmend an Bedeutung. Die Er­ findung befaßt sich mit der Gewinnung von Pflanzensäften.

Bei Pflanzensäften, die als Phytopharmaka oder für andere Zwecke, z. B. im Pflanzenschutz verwendet werden sollen, kommt es nicht auf einzelne Wirkstoffe oder deren Anreicherung an, sondern im Gegenteil auf die Auf­ rechterhaltung des für die betreffende Pflanze typischen (artspezifischen) Musters der Inhaltstoffe in qualitativer (stofflicher) und quantitativer (mengenmäßiger) Hinsicht. Die intakten Pflanzen enthalten normalerweise eine Vielfalt von Wirkstoffen, die häufig noch nicht einmal alle im einzel­ nen bekannt sind und in ihrer Gesamtheit ein sogenanntes "Wirkprinzip" bilden, das in der Form des Pflanzensaftes möglichst unverändert bereitge­ stellt werden soll.

Ein grundsätzliches Problem bei der Gewinnung von Pflanzensäften durch Aufbrechen von Pflanzenzellen besteht jedoch darin, daß der Saft, bedingt durch das in den Pflanzen enthaltene Gewebewasser, ein im wesentli­ chen wäßriges Milieu besitzt, in dem zwar die hydrophilen Inhaltsstoffe gut in Lösung gehen, nicht aber die lipophilen Inhaltsstoffe. Vielmehr verbleibt mindestens ein Teil der lipophilen Inhaltsstoffe in dem Fest­ stoff-Anteil (Zellwandfragmente u. dgl.), der nach dem Aufbrechen der Zel­ len abgetrennt, im allgemeinen abfiltriert wird. Dadurch weisen solche Säfte häufig eine geringere Konzentration an lipophilen Inhaltsstoffen auf, als dem Wirkprinzip der betreffenden Pflanze entspricht.

Mit der Erfindung soll dieser Nachteil beseitigt werden, und zwar dadurch, daß das Aufbrechen der Pflanzenzellen in Gegenwart von lipophil wirksamen Lösungsvermittlern erfolgt. Als Lösungsvermittler kommen im ein­ fachsten Fall lipophile Lösungsmittel wie z. B. Ethanol in Betracht, die dem Pflanzenmaterial vor dem Aufbrechen der Zellen zugesetzt werden und durch verbesserte Lösungsbedingungen den Gehalt der lipophilen Inhaltsstoffe im Saft erhöhen. Bevorzugt werden als Lösungsvermittler jedoch solche Stoffe eingesetzt, die zugleich in der Lage sind, in dem beim Aufbrechen der Zel­ len gebildeten Saft örtliche Bereiche mit unterschiedlichen Lösungsbedin­ gungen zu schaffen. Mit solchen Stoffen, die nachfolgend auch als "Kompar­ timentierungsmittel" bezeichnet werden, ergeben sich nämlich zusätzliche wichtige Vorteile, die nachfolgend erläutert werden.

Neben dem Problem der Löslichkeit der lipophilen Inhaltsstoffe be­ steht bei der Freisetzung von Pflanzensäften ein weiteres grundsätzliches Problem darin, daß durch das Aufbrechen der Pflanzenzellen auch subzellulä­ re Kompartimente (z. B. Mikrosomen mit den darin enthaltenen abbauenden En­ zymen, der Zellkern mit aufbauenden Enzymen, Mitochondrien als Ort des Koh­ lenstoffabbaus und Chloroplasten als Ort des Kohlenstoffaufbaus) der Zelle zerstört werden, mit der Folge, daß in dem so entstandenen Saft Enzymsyste­ me und deren Substrate zusammentreffen können, die normalerweise durch Mem­ branen voneinander getrennt sind. Dadurch kommt es im Saft mehr oder weni­ ger schnell zu unkontrollierten internen Reaktionen (insbesondere enzymati­ schen Katalysen, aber auch unspezifischen Radikalreaktionen), wie sie im normalen Stoffwechsel der Zelle überhaupt nicht auftreten. Auf diese Weise können interne degenerative Prozesse in Gang gesetzt werden, durch die die gewünschten Inhaltsstoffe möglicherweise modifiziert oder sogar ganz abge­ baut werden, und durch die eventuell sogar schädliche, d. h. toxische Meta­ bolite gebildet werden.

Infolge dieser unkontrollierten internen Prozesse ist es bislang nicht möglich gewesen, Pflanzensäfte über längere Zeiträume aufzubewahren. Vielmehr müssen sie möglichst frisch verbraucht werden und können nicht auf Vorrat produziert werden, was die Möglichkeiten der Verwendung von Pflan­ zensäften in der Praxis stark einschränkt.

Die Erfindung geht hinsichtlich dieses Problems von der Überlegung aus, daß eine verbesserte Haltbarkeit der Pflanzensäfte (im Sinne einer längeren Aufrechterhaltung des Wirkprinzips) erreichbar sein kann, wenn es gelingt, die in der intakten Pflanze durch Membranen oder Zellwände vonein­ ander getrennten Systeme auch nach dem Aufbrechen der Zellen möglichst weitgehend voneinander getrennt zu halten. In diesem Sinne wirken die durch die Kompartimentierungsmittel geschaffenen Bereiche örtlich unterschiedli­ cher Lösungsbedingungen wie Aufenthaltsräume, in denen sich einzelne In­ haltsstoffe entsprechend ihrer Löslichkeit bevorzugt ansammeln können, so daß sie nicht mehr - oder jedenfalls nicht mehr in hoher Konzentration - mit anderen Inhaltsstoffen zusammentreffen und reagieren können. Vielmehr kommt es bereits während des Aufbrechens der Zellen zu einer Vermischung der Zellmasse mit den Kompartimentierungsmitteln und damit zu einer sofor­ tigen Verteilung der Inhaltsstoffe entsprechend ihrer Löslichkeit auf die unterschiedlichen Aufenthaltsräume, bevor unerwünschte Folgereaktionen einsetzen können. Im Ergebnis wird dadurch im Pflanzensaft gewissermaßen eine Sekundär-Kompartimentierung gebildet, welche die ursprüngliche Kom­ partimentierung der Zelle imitiert.

Als Kompartimentierungsmittel werden bevorzugt solche Stoffe einge­ setzt, die in dem wäßrigen Milieu des Pflanzensaftes örtlich lipophile Bedingungen schaffen, ohne die Homogenität des Saftes zu zerstören. Typi­ sche Beispiele für geeignete Kompartimentierungsmittel umfassen solche Stoffe, die als Schutzkolloide, Micellenbildner oder Emulgatoren wirken, wie beispielsweise Polyethylenglykole, Cremophore (Warenzeichen der BASF für Ethoxylate von Fettalkoholen bzw. hydriertem Ricinusöl bzw. Nonylphe­ nol) oder Phospholipide. Auch Cyclodextrine (Cycloamylosen, Cycloglucane), sind aufgrund ihrer Eigenschaft, hydrophobe Gastmoleküle verkapseln zu können, gut als Kompartimentierungsmittel geeignet. Diese Kompartimentie­ rungsmittel können einzeln oder im Gemisch miteinander zum Einsatz kommen und auch gemeinsam mit lipophilen Lösemitteln, wobei es sich um Lösemittel handeln kann, die (wie Ethanol) im Pflanzensaft (Wasser) löslich sind, oder aber auch um Lösemittel, die im Pflanzensaft eine getrennte Phase ausbilden und damit eine gewisse Wirkung als Extraktionsmittel besitzen.

Bevorzugt wird bei der Saftgewinnung von einem Pflanzenmaterial aus­ gegangen, das bis zur Erntereife unter sterilen Bedingungen aufgezogen wurde. Wild gesammelte oder landwirtschaftlich angebaute Pflanzen enthalten nämlich unvermeidliche Kontaminationen, die durch Umwelteinflüsse (z. B. durch Pflanzenschutzmittel) oder durch Befall der Pflanze mit Krankheits­ erregern (Viren, Bakterien, Pilzen) oder Parasiten verursacht sein können. Dabei sind die durch Befall hervorgerufenen Kontaminationen besonders unan­ genehm, weil sie zusätzliche Stoffwechselprodukte in die Pflanze einbringen und außerdem in der Pflanze Abwehr- oder andere Sekundärreaktionen auslö­ sen, durch die sekundäre toxische Schadstoffe wirksam werden können. Ins­ besondere sind Endotoxine (vornehmlich Lipopolysaccharide aus Zellwänden von Mikroorganismen- und Phytoalexine (Produkte des pflanzlichen Sekundär­ stoffwechsels bei Abwehrreaktionen) die Folge einer Kontamination durch Krankheitserreger oder Parasiten.

Eine Abtrennung der Kontaminationen aus Pflanzensäften, die als sol­ che zur Pharmazeutischen Anwendung kommen sollen, ist äußerst problema­ tisch. Wenn eine Abtrennung überhaupt möglich ist, geht sie häufig mit einem Eingriff in das Wirkprinzip einher. Dies gilt insbesondere für die Endotoxine, die speziell für den Menschen eine hohe toxische Wirkung be­ sitzen und deshalb insbesondere in Injectabilia nicht (oder allenfalls nur in äußerst geringen Spuren) enthalten sein dürfen. Aufgrund ihrer Molekül­ größe lassen sie sich verhältnismäßig einfach und sicher durch Ultrafiltra­ tion bei 20 000 Dalton oder mit speziell dafür entwickelten Ultrafiltern aus Pflanzensäften entfernen. Dabei muß aber in Kauf genommen werden, daß alle Wirkstoff-Moleküle wie Proteine (Enzyme) oder Polysaccharide, die größer als die genannte Trenngrenze (cut-off) sind, ebenfalls eliminiert werden. Wenn die Pflanzen dagegen steril aufgezogen worden sind, entfällt die Notwendigkeit einer Abtrennung von Kontaminationen.

Das Aufbrechen der Pflanzenzellen kann in herkömmlicher Weise durch Verpressen erfolgen, in welchem Fall die Lösungsvermittler (Lösungsmittel und/oder Kompartimentierungsmittel) der Pflanzenmasse unmittelbar vor dem Verpressen zugesetzt werden. Besser ist jedoch eine schonende Freisetzung des Pflanzensaftes durch Frostung in Gegenwart der unmittelbar vorher zu­ gesetzten Lösungsvermittler. Bei der Frostung bildet das in den Zellen ent­ haltene Wasser feine nadelförmige Eiskristalle, welche die Zellwände und - jedenfalls zum Teil - auch die subzellulären Kompartimente durchdringen und von innen heraus zerschneiden. Dabei entfallen die beim Verpressen unver­ meidlichen Druck- und Scherkräfte, die u. U. erhebliche zusätzliche Energie (Wärme) in das System einführen und damit zur Beschleunigung der internen Reaktionen beitragen. Die Frostung stellt also ein ausgesprochenes "Low-Energy"-Verfahren dar, dessen weiterer Vorteil darin besteht, daß es bei Temperaturen unterhalb des Gefrierpunktes abläuft und damit bei Temperatu­ ren, bei denen die internen Reaktionen bereits während des Aufbrechens der Zellwände weitgehend bis vollständig gehemmt sind.

Nach dem Aufbrechen der Pflanzenzellen - sei es durch Verpressen oder durch Frostung und anschließendes Auftauen - ergibt sich ein Brei, der aus dem gewünschten Pflanzensaft und den Resten der Zellwände und Membranen besteht. Dieser Brei wird durch Filtration bei möglichst niedrigen Tempera­ turen (etwa bei 2-8°C) von den Feststoffen befreit, und der dadurch gewonnene Saft kann portioniert und verpackt werden. Natürlich sollten auch diese Schritte unter Beibehaltung der sterilen Bedingungen ausgeführt wer­ den. Im übrigen ist es zweckmäßig, das Aufbrechen der Zellen und alle an­ schließenden Schritte unter Lichtausschluß durchzuführen, um das Phyto­ chromsystem der Pflanze zu hemmen und unspezifische lichtabhängige Folgere­ aktionen zu vermeiden, und auch unter Sauerstoff-Ausschluß (z. B. unter Stickstoff, vorzugsweise aber im Vakuum), damit auch Redox-Reaktionen nach Möglichkeit unterbleiben.

Untersuchungen haben gezeigt, daß ein Aufbrechen der Pflanzenzellen in Gegenwart von lipophilen Lösungsvermittlern zu einer wesentlich höheren Ausbeute an lipophilen Inhaltsstoffen und damit zu einem mehr natur-origi­ nalen Wirkprinzip des Pflanzensaftes führt, und daß durch Lösungsvermittler in Form von Kompartimentierungsmitteln dieses natur-originale Wirkprinzip auch über längere Zeiträume aufrechterhalten bleibt. Dies wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Ausgegangen wurde als Pflanzenmaterial von der Venusfliegenfalle (Dionaea muscipula), und zwar von Pflanzen mit identischer Zellinie. Die Pflanzen wurden mit einem Lösungsvermittler (bzw. zum Vergleich mit Wasser) ver­ setzt. Ein Teil dieser Pflanzen wurde sofort bei etwa -35°C gefrostet und nach 24 h bei niedriger Temperatur aufgetaut, und ein anderer Teil dieser Pflanzen wurde sofort in einer Handpresse verpreßt (ebenfalls bei niedri­ ger Temperatur). Der angefallene Brei wurde dann durch Sterilfiltration (Mikrofilter 0,2 µm) von den Feststoffen getrennt. Es ergab sich ein klarer hell-gelblicher Saft, der anschließend auf den Gehalt an Plumbagin (einem lipophilen Wirkstoff) untersucht wurde. Die Ergebnisse (Mittelwerte aus mehreren Bestimmungen) sind in den nachfolgenden Tabellen 1 und 2 zusammen­ gefaßt.

Tabelle 1

Zellen durch Verpressen aufgebrochen

Tabelle 2

Zellen durch Frostung aufgebrochen

Claims (4)

1. Verfahren zur Gewinnung der Inhaltsstoffe von Arzneipflanzen durch Aufbrechen der Pflanzenzellen und anschließende Abtrennung des Pflanzensaftes, dadurch gekennzeichnet, daß das Aufbrechen der Pflan­ zenzellen in Gegenwart eines lipophil wirkenden Lösungsvermittlers erfolgt.

2. Verfahren zur Gewinnung der Inhaltsstoffe von Arzneipflanzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsvermittler ein lipophiles Lösemittel eingesetzt wird.

3. Verfahren zur Gewinnung der Inhaltsstoffe von Arzneipflanzen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsver­ mittler ein Kompartimentierungsmittel eingesetzt wird, das in der Lage ist, beim Aufbrechen der Zellen in dem Saft örtliche Bereiche mit unterschiedlichen Lösungsbedingungen zu schaffen.

4. Verfahren zur Gewinnung der Inhaltsstoffe von Arzneipflanzen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Kompartimentierungs­ mittel einen oder mehrere Stoffe aus der Gruppe der Polyethylenglyko­ le, Cremophore, Phospholipide und Cyclodextrine umfaßt.