DE4127908A1 - Verfahren zur induktion der rhamnolipid-produktion in pseudomonas aeruginosa staemmen mit hilfe von glycerinsaeureether-lipiden und ihre verwendung - Google Patents
Verfahren zur induktion der rhamnolipid-produktion in pseudomonas aeruginosa staemmen mit hilfe von glycerinsaeureether-lipiden und ihre verwendungInfo
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Description
Im Rahmen der Suche nach Mikroorganismen, die in der Lage sind,
Glycerinsäureether-Lipide mit mehrfach ungesättigter und verzweigter
Lipidkomponente zu modifizieren, wurden Pseudomonas aeruginosa Stämme
gefunden, die durch Zugabe von Glycerinsäureether-Lipiden zur Nährlösung die
Produktion verschiedener Rhamnolipide induzieren. Eines dieser Rhamnolipide
wurde als Rhamnolipid I (Wagner et al., Eur. Congr. Biotechnol., 3rd Vol. 1, S. 3-8,
Verlag Chemie, Weinheim, 1984) identifiziert.
Die Synthese von Rhamnolipiden gewinnt wirtschaftlich immer mehr an Bedeutung,
da aus Rhamnolipiden durch die saure Hydrolyse Rhamnose entsteht und diese für
die Synthese optisch aktiver Verbindungen nach der sog. "chiral pool" Methode
verwendet wird.
Prinzipiell können optisch aktive Substanzen auch aus einem Racemat durch
Trennung des (+) und (-) Enantiomers gewonnen werden. Es zeigte sich jedoch,
daß sich in der Praxis eine chemisch saubere Trennung der beiden Enantiomere
äußerst schwierig gestaltet, so daß eine gezielte Synthese reiner Enantiomere
vorteilhaft ist.
Für die Synthese von optisch aktiven Verbindungen wurden zwei Wege
weiterentwickelt:
- - die optisch aktive Synthese ausgehend von achiralen Grundkörpern und
- - die "chiral pool" Methode.
Bei der "chiral pool" Methode werden chemisch gut zugängliche, optisch aktive
Edukte eingesetzt, deren Chiralität während des gesamten Syntheseverfahrens
erhalten bleibt.
Ein Beispiel für optisch aktive Edukte sind die Monosaccharide, zu denen auch die
Rhamnose zählt.
Aufgrund der großen Einsatzmöglichkeiten der optisch aktiven Verbindungen und
damit auch der optisch aktiven Edukte besteht wirtschaftlicher Bedarf an einem
Verfahren, welches eine kostengünstige, verfahrenstechnisch einfache und im
industriellen Maßstab durchführbare Synthese von optisch aktiven Edukten
ermöglicht, insbesondere von Rhamnose aus Rhamnolipiden.
In der Literatur sind mehrere Verfahren zur Induktion der Rhamnolipidsynthese
beschrieben. Der erste Hinweis, daß Rhamnolipide aus Pseudomonas aeruginosa
isoliert werden können, kommt von Garvis et al. (J. Am. Chem. Soc. 71, S. 4124,
1990).
Als Induktoren für die Rhamnolipid-Synthese sind bisher nur solche Stoffe
literaturbekannt, die während der Fermentation des Mikroorganismus abgebaut und
deshalb immer wieder neu zugesetzt werden müssen. In DE 21 50 375 wird z. B.
die Produktion von Rhamnolipid I mit Hilfe von Pseudomonas aeruginosa in
Nährlösungen mit 10% (v/v) n-Paraffinen beschrieben.
Pasra et al. (Tenside Surfactants, Deterg. 27, 302, 1990) beschreibt die Produktion
von Rhamnolipid I, indem die Nährlösung mit Olivenöl statt Paraffin versetzt wird.
Es wurde nun gefunden, daß in Pseudomonas aeruginosa-Stämmen die Synthese
von Rhamnolipiden durch Zugabe des Glycerinsäureether-Lipids MA induziert
werden kann, ohne daß das als Induktor wirkende Glycerinsäureether-Lipid MA
während der Fermentation neu zugesetzt werden muß.
Das Glycerinsäureether-Lipid MA ist ein mikrobiologisch gewonnenes Abbauprodukt
des Antibiotikums Favomycin®. Die Herstellung von MA wird in EP 89 115 069
beschrieben.
Die Erfindung betrifft somit:
Ein Verfahren zur Synthese von Rhamnolipiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß mit Hilfe des Glycerinsäureether-Lipids MA die Synthese von Rhamnolipiden in Pseudomonas aeruginosa induziert wird.
Ein Verfahren zur Synthese von Rhamnolipiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß mit Hilfe des Glycerinsäureether-Lipids MA die Synthese von Rhamnolipiden in Pseudomonas aeruginosa induziert wird.
Ein Verfahren zur Synthese von Rhamnolipiden, das dadurch gekennzeichnet ist,
daß das als Induktor wirkende Glycerinsäureether-Lipid MA während der
Fermentation nicht neu zugesetzt wird.
Eine Verwendung der nach o. g. Verfahren hergestellten Rhamnolipide zur
Herstellung von Rhamnose.
Eine Verwendung der nach o.g. Verfahren hergestellten Rhamnose für die
Synthese optisch aktiver Verbindungen.
Das Verfahren gestaltet sich kostengünstig und arbeitssparend, da das
Glycerinsäureether-Lipid MA nur einmal zu der Fermentation der Mikroorganismen
zugegeben wird (Induktorwirkung) und es nach Beendigung des Verfahrens
wiedergewonnen werden kann.
Im folgenden wird die Erfindung detailliert beschrieben, insbesondere in ihren
bevorzugten Ausführungsformen. Ferner wird die Erfindung in den
Patentansprüchen definiert.
Prozentangaben beziehen sich, wenn nicht anders angegeben, auf das Gewicht.
Die Pseudomonas aeruginosa-Stämme ATCC 21996 und ATCC 10145 sind bei der
internationalen Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection (USA)
erhältlich. Pseudomonas aeruginosa NCTC 10701 ist von der internationalen
Hinterlegungsstelle National Collection of Type Cultures zu beziehen.
Das Wachstum der Pseudomonas aeruginosa-Stämme ist besonders gut auf einem
festen Nährboden mit den Bestandteilen: Glucose, Caseinpepton, Fleischextrakt,
Hefeextrakt, Leberextrakt und NaCl. Der pH-Wert des Nährbodens beträgt pH 6,2-7,6,
insbesondere pH 6,8.
Der Nährboden wird in noch flüssigem Zustand sterilisiert.
Nach dem Abkühlen wird die Kultur mit dem Stamm inokuliert und mehrere Tage
bei 25-32°C, insbesondere 28°C, inkubiert.
Die Bestandteile der Hauptkultur sind:
Glucose, Pepton, Hefeextrakt, Maiswasser (flüssig) und das Glycerinsäureether- Lipid MA. In der europäischen Patentanmeldung 8911 5069 wird ein Verfahren zur Synthese des Glycerinsäureether-Lipids MA beschrieben.
Glucose, Pepton, Hefeextrakt, Maiswasser (flüssig) und das Glycerinsäureether- Lipid MA. In der europäischen Patentanmeldung 8911 5069 wird ein Verfahren zur Synthese des Glycerinsäureether-Lipids MA beschrieben.
Die Fermentation der Pseudomonas aeroginosa-Stämme erfolgt aerob, also
beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder
Fermentern, gegebenenfalls unter Einführen von Luft oder Sauerstoff. Die
Fermentation erfolgt bis zu 7 Tagen bei 25-32°C, insbesondere 28°C, unter
gleichmäßigem Rühren.
Das Glycerinsäureether-Lipid MA wird in Mengen von 0,2 bis 1,5 g/L, insbesondere
in einer Konzentration von 0,2 g/L, vor oder während der Fermentation der
Hauptkultur zugegeben.
Die Rhamnolipidinduktion und -bildung wird dünnschichtchromatographisch
während der gesamten Fermentation verfolgt.
Die Kulturlösung der Hauptkultur wird zentrifugiert, sodaß die Bakterienzellen und
Zellfragmente sedimentieren. Der Überstand wird zur Isolierung des Rhamnolipids
mit Essigsäureethylester, vorzugsweise mit gleichem Volumen Essigsäureethylester,
extrahiert und die organische Phase fast bis zur Trockenheit eingeengt.
Die Aufreinigung des Rückstandes aus der organischen Phase erfolgt mittels
Säulenchromatographie.
Die Aufreinigung zeigt als Hauptbestandteil Rhamnolipid I, sowie drei weitere
Rhamnolipide in geringeren Mengen.
Mittels dem Standardverfahren der Hydrolyse kann das Rhamnolipid in Rhamnose
gespalten werden. Vorzugsweise erfolgt die Spaltung mittels dem
Standardverfahren der sauren Hydrolyse.
Die untersuchten Pseudomonas-Stämme ATCC 21996, ATCC 10145 und
NCTC 10701 werden auf folgendem festen Nährboden gehalten:
| Glucose|1,0% | |
| Caseinpepton | 0,4% |
| Fleischextrakt | 0,4% |
| Hefeextrakt | 0,1% |
| Leberextrakt | 0,1% |
| NaCl | 0,25% |
| pH 6,8 |
Das Medium wird auf Reagenzgläser verteilt und 30 Min. bei 121°C sterilisiert,
anschließend abgekühlt, mit dem Stamm beimpft und 2-3 Tage bei 28°C inkubiert.
Eine Impföse dieser Kultur dient als Inokulum folgender, MA-haltiger, Hauptkultur:
| Glucose|1% | |
| Pepton | 1% |
| Hefeextrakt | 0,2% |
| Cornsteep, fl. | 0,2% |
| MA | 0,05% |
| pH 5,8 |
50 ml dieses Mediums pro 300 ml Erlenmeyerkolben werden nach dem Beimpfen
für bis zu 7 Tagen bei 28°C und 190 Upm inkubiert. Die Rhamnolipidbildung wird
dünnschichtchromatographisch verfolgt: HPTLC-Fertigplatten Kieselgel 60 F254;
Chloroform-Methanol-Wasser 18:11:2,7; Detektion mit PMS-CerIV-Sulfat.
Von den untersuchten Pseudomonas-Spezies konnte in folgenden Pseudomonas
aeruginosa Stämmen eine Rhamnolipidbildung durch MA induziert werden:
| Stamm | |
| Rhamnolipidbildung | |
| Pseudomonas aeruginosa ATCC 21996 | |
| positiv | |
| Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 | positiv |
| Pseudomonas aeruginosa NCTC 10701 | positiv |
In Kontrollansätzen ohne das Glycerinsäureether-Lipid MA wurde kein Rhamnolipid
gebildet.
Unter den im Beispiel 1 genannten Kulturbedingungen produziert Pseudomonas
aeruginosa das Rhamnolipid bei Glycerinsäureether-Lipid MA-Konzentration im
Bereich von 0,2-1,5 g/L Nährlösung. Das Maximum der Produktivität liegt bei 0,2
g/L, Konzentrationen
< 1,5 g/L verhindern die Produktbildung.
< 1,5 g/L verhindern die Produktbildung.
140 ml Kulturlösung nach Beispiel 1 wurden zentrifugiert, der Überstand mit dem
gleichen Volumen Essigsäureethylester extrahiert und die organische Phase zur
Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie
zunächst an 40 ml Kieselgel (Eluent: Chloroform/Methanol/Essigsäure = 80/10/1)
und anschließend an RP-18 Material (50 ml, Eluent: Methanol/0.1%
Trifluoressigsäure 5/1) gereinigt, dabei wurden als Hauptkomponente 79 mg des
Rhamnolipid I sowie drei weitere Rhamnolipide erhalten. Die Identität der
Hauptkomponente mit Rhamnolipid I wurde durch spektroskopischen und
chromatographischen Vergleich mit einer authentischen Probe bewiesen.
Die Wiedergewinnung des Glycerinsäureether-Lipids aus der Fermentationsbrühe
erfolgt wie in EP 89 115 069 beschrieben.
Claims (10)
1. Verfahren zur Synthese von Rhamnolipiden, dadurch gekennzeichnet, daß
mit Hilfe eines Glycerinsäureether-Lipids die Synthese von Rhamnolipiden, in
Pseudomonas aeruginosa-Stämmen induziert wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Hilfe des
Glycerinsäureether-Lipids die Synthese von Rhamnolipid I in Pseudomonas
aeruginosa-Stämmen induziert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß während der
Fermentation der Pseudomonas aeruginosa-Stämme kein weiterer Induktor
zugegeben wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der
Induktor vor oder während der Fermentation zu der Hauptkultur hinzugegeben
wird.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der oben genannten Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß mit Hilfe des Glycerinsäureether-Lipids MA die
Synthese von Rhamnolipiden, insbesondere von Rhamnolipid I, in Pseudomonas
aeruginosa-Stämmen induziert und der Induktor MA während der Fermentation
nicht neu zugesetzt wird.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der oben genannten Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß Pseudomonas aeruginosa ATCC 21996, ATCC
10145 und NCTC 10701 eingesetzt werden.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der oben genannten Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß MA in einer Konzentration von 0,2-1,5 g/L
Nährlösung der Hauptkultur eingesetzt wird.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der oben genannten Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß MA in einer Konzentration von 0,2 g/L Nährlösung
der Hauptkultur eingesetzt wird.
9. Verwendung des nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-8
hergestellten Rhamnolipids, insbesondere Rhamnolipid I, zur Herstellung von
Rhamnose.
10. Verwendung der nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-8
hergestellten Rhamnose für die Synthese optisch aktiver Verbindungen.
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