DE4127908C2 - - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description
Im Rahmen der Suche nach Mikroorganismen, die in der Lage sind,
Glycerinsäureether-Lipide mit mehrfach ungesättigter und verzweigter
Lipidkomponente zu modifizieren, wurden Pseudomonas aeruginosa Stämme
gefunden, die durch Zugabe von Glycerinsäureether-Lipiden zur Nährlösung die
Produktion verschiedener Rhamnolipide induzieren. Eines dieser Rhamnolipide
wurde als Rhamnolipid I (Wagner et al., Eur. Congr. Biotechnol., 3rd Vol. 1, S. 3-8,
Verlag Chemie, Weinheim, 1984) identifiziert.
Die Synthese von Rhamnolipiden gewinnt wirtschaftlich immer mehr an Bedeutung,
da aus Rhamnolipiden durch die saure Hydrolyse Rhamnose entsteht und z. B. das
L-Enantiomer dieses Desoxyzuckers eine breite Anwendung findet (beispielsweise
in der Synthese von pharmazeutischen Erzeugnissen und Pflanzenschutzmitteln).
In der Literatur sind mehrere Verfahren zur Induktion der Rhamnolipidsynthese
beschrieben. Der erste Hinweis, daß Rhamnolipide aus Pseudomonas aeruginosa
isoliert werden können, kommt von Garvis et al. (J. Am. Chem. Soc. 71, S. 4124,
1990).
Als Induktoren für die Rhamnolipid-Synthese sind bisher nur solche Stoffe
literaturbekannt, die während der Fermentation des Mikroorganismus abgebaut und
deshalb immer wieder neu zugesetzt werden müssen. In DE 21 50 375 wird z. B.
die Produktion von Rhamnolipid I mit Hilfe von Pseudomonas aeruginosa in
Nährlösungen mit 10% (v/v) n-Paraffinen beschrieben.
Pasra et al (Tenside Surfactants, Deterg. 27, 302 1990) beschreibt die Produktion
von Rhamnolipid I, indem die Nährlösung mit Olivenöl statt Paraffin versetzt wird.
Es wurde nun gefunden, daß in Pseudomonas aeruginosa-Stämmen die Synthese
von Rhamnolipiden und insbesondere von Rhamnolipid I mit Hilfe des
Glycerinsäureester-Lipids MA induziert werden kann, ohne daß das als Induktor
wirkende Glycerinsäureester-Lipid MA während der Fermentation neu zugesetzt
wird.
Das Glycerinsäureether-Lipid MA ist ein mikrobiologisch gewonnenes Abbauprodukt
des Antibiotikums Flavomycin®. Die Herstellung von MA wird in EP 8 91 15 069
beschrieben.
Die Erfindung betrifft somit:
Ein Verfahren nach Anspruch 1 zur Synthese von Rhamnolipiden durch Induktion in Pseudomonas
aeruginosa-Stämmen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß mit Hilfe des
Glycerinsäureether-Lipids MA die Synthese von Rhamnolipiden, insbesondere von
Rhamnolipid I, induziert und der Induktor MA während der Fermenation nicht neu
zugesetzt wird. Die Ansprüche 2 bis 4 betreffen Ausgestaltungen
dieses Verfahrens.
Eine Verwendung des nach dem o. g. Anspruch hergestellten Rhamnolipids,
insbesondere Rhamnolipid I, zur Herstellung von Rhamnose (Anspruch 5).
Das Verfahren gestaltet sich kostengünstig und arbeitssparend, da das
Glycerinsäureester-Lipid MA nur einmal zu der Fermentation der Mikroorganismen
zugegeben wird (Induktorwirkung) und es nach Beendigung des Verfahrens
wiedergewonnen werden kann.
Im folgenden wird die Erfindung detailliert beschrieben, insbesondere in ihren
bevorzugten Ausführungsformen. Ferner wird die Erfindung in den
Patentansprüchen definiert.
Prozentangaben beziehen sich, wenn nicht anders angegeben, auf das Gewicht.
Das Pseudomonas aeruginosa-Stamm ATCC 10145 ist bei der internationalen
Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection (USA) erhältlich.
Pseudomonas aeruginosa NCTC 10701 ist von der internationalen
Hinterlegungsstelle National Collection of Type Cultures zu beziehen.
Das Wachstum der Pseudomonas aeruginosa-Stämme ist besonders gut auf einem
festen Nährboden mit den Bestandteilen: Glucose, Caseinpepton, Fleischextrakt,
Hefeextrakt, Leberextrakt und NaCl. Der pH-Wert des Nährbodens beträgt pH 6,2-7,6,
insbesondere pH 6,8.
Der Nährboden wird in noch flüssigem Zustand sterilisiert.
Nach dem Abkühlen wird die Kultur mit dem Stamm inokuliert und mehrere Tage
bei 25-32°C, insbesondere 28°C, inkubiert.
Die Bestandteile der Hauptkultur sind:
Glucose, Pepton, Hefeextrakt, Maiswasser (flüssig) und das Glycerinsäureether-Lipid
MA. In der europäischen Patentanmeldung 8 91 15 069 wird ein Verfahren zur
Synthese des Glycerinsäureether-Lipids MA beschrieben.
Die Fermentation der Pseudomonas aeruginosa-Stämme erfolgt aerob, also
beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder
Fermentern, gegebenenfalls unter Einführen von Luft oder Sauerstoff. Die
Fermenation erfolgt bis zu 7 Tagen bei 25-32°C, insbesondere 28°C, unter
gleichmäßigem Rühren.
Das Glycerinsäureether-Lipid MA wird in Mengen von 0,2 bis 1,5 g/L, insbesondere
in einer Konzentration von 0,2 g/L, vor oder während der Fermentation der
Hauptkultur zugegeben.
Die Rhamnolipidinduktion und -bildung wird dünnschichtchromatographisch
während der gesamten Fermentation verfolgt.
Die Kulturlösung der Hauptkultur wird zentrifugiert, so daß die Bakterienzellen und
Zellfragmente sedimentieren. Der Überstand wird zur Isolierung des Rhamnolipids
mit Essigsäureethylester, vorzugsweise mit gleichem Volumen Essigsäureethylester,
extrahiert und die organische Phase fast bis zur Trockenheit eingeengt.
Die Aufreinigung des Rückstandes aus der organischen Phase erfolgt mittels
Säulenchromatographie.
Die Aufreinigung zeigt als Hauptbestandteil Rhamnolipid 1, sowie drei weitere
Rhamnolipide in geringeren Mengen.
Mittels dem Standardverfahren der Hydrolyse kann das Rhamnolipid in Rhamnose
gespalten werden. Vorzugsweise erfolgt die Spaltung mittels dem
Standardverfahren der sauren Hydrolyse.
Die untersuchten Pseudomonas-Stämme ATCC 10145 und NCTC 10701 werden
auf folgendem festen Nährboden gehalten:
| Glucose|1,0% | |
| Caseinpepton | 0,4% |
| Fleischextrakt | 0,4% |
| Hefeextrakt | 0,1% |
| Leberextrakt | 0,1% |
| NaCl | 0,25% |
| pH 6,8 |
Das Medium wird auf Reagenzgläser verteilt und 30 Min. bei 121°C sterilisiert,
anschließend abgekühlt, mit dem Stamm beimpft und 2-3 Tage bei 28°C inkubiert.
Eine Impföse dieser Kultur dient als Inokulum folgender, MA-haltiger, Hauptkultur:
| Glucose|1% | |
| Pepton | 1% |
| Hefeextrakt | 0,2% |
| Cornsteep, fl. | 0,2% |
| MA | 0,05% |
| pH 5,8 |
50 ml dieses Mediums pro 300 ml Erlenmeyerkolben werden nach dem Beimpfen
für bis zu 7 Tagen bei 28°C und 190 Upm inkubiert. Die Rhamnolipidbildung wird
dünnschichtchromatographisch verfolgt: HPTLC-Fertigplatten Kieselgel 60 F₂₅₄;
Chloroform-Methanol-Wasser 18 : 11 : 2,7; Detektion mit PMS-CerlV-Sulfat.
Von den untersuchten Pseudomonas-Spezies konnte in folgenden Pseudomonas
aeruginosa Stämmen eine Rhamnolipidbildung durch MA induziert werden:
In Kontrollansätzen ohne das Glycerinsäureether-Lipid MA wurde kein Rhamnolipid
gebildet.
Unter den im Beispiel 1 genannten Kulturbedingungen produziert Pseudomonas
aeruginosa das Rhamnolipid bei Glycerinsäureether-Lipid MA-Konzentration im
Bereich von 0,2-1,5 g/L Nährlösung. Das Maximum der Produktivität liegt bei 0,2 g/L,
Konzentrationen; < 1,5 g/L verhindern die Produktbildung.
140 ml Kulturlösung nach Beispiel 1 wurden zentrifugiert, der Überstand mit dem
gleichen Volumen Essigsäureethylester extrahiert und die organische Phase zur
Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie
zunächst an 40 ml Kieselgel (Eluent: Chloroform/Methanol/Essigsäure = 80/10/1)
und anschließend an RP-18 Material (50 ml, Eluent: Methanol/0,1%
Trifluoressigsäure 5/1) gereinigt, dabei wurden als Hauptkomponente 79 mg des
Rhamnolipid I sowie drei weitere Rhamnolipide erhalten. Die Identität der
Hauptkomponente mit Rhamnolipid I wurde durch spektroskopischen und
chromatographischen Vergleich mit einer authentischen Probe bewiesen.
Die Wiedergewinnung des Glycerinsäureether-Lipids aus der Fermentationsbrühe
erfolgt wie in EP 8 91 15 069 beschrieben.
Claims (5)
1. Verfahren zur Synthese von Rhamnolipiden durch Induktion in Pseudomonas
aeruginosa-Stämmen, dadurch gekennzeichnet, daß mit Hilfe des
Glycerinsäureether-Lipids MA die Synthese von Rhamnolipiden, insbesondere von
Rhamnolipid I, induziert und der Induktor MA während der Fermentation nicht neu
zugesetzt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Pseudomonas
aeruginosa ATCC 10145 und NCTC 10701 eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß MA in
einer Konzentration von 0,2 bis 1,5 g/L Nährlösung der Hauptkultur zugesetzt wird.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß MA in einer Konzentration von 0,2 g/L Nährlösung der
Hauptkultur eingesetzt wird.
5. Verwendung des nach einem der vorstehenden Ansprüche hergestellten
Rhamnolipids, insbesondere Rhamnolipid I, zur Herstellung von Rhamnose.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19914127908 DE4127908A1 (de) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | Verfahren zur induktion der rhamnolipid-produktion in pseudomonas aeruginosa staemmen mit hilfe von glycerinsaeureether-lipiden und ihre verwendung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19914127908 DE4127908A1 (de) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | Verfahren zur induktion der rhamnolipid-produktion in pseudomonas aeruginosa staemmen mit hilfe von glycerinsaeureether-lipiden und ihre verwendung |
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Family
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1991
- 1991-08-23 DE DE19914127908 patent/DE4127908A1/de active Granted
Also Published As
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