DE4115029A1 - Hochdichtes, hochkonzentriertes medium fuer die zuechtung von tierischen zellen - Google Patents
Hochdichtes, hochkonzentriertes medium fuer die zuechtung von tierischen zellenInfo
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Description
Diese Erfindung betrifft ein hochdichtes bzw. ein
hochkonzentriertes Medium zur Kultivierung und
Züchtung von tierischen Zellen.
In den letzten Jahren hat der Fortschritt in ver
schiedenen Techniken der Zellzüchtung, die meist
auf der Anwendung von Ruhigstellungsmethoden
beruhten, es ermöglicht, daß hochdichte Kulturen
von Säugetierzellen in vitro künstlich angelegt
werden konnten (Merten, O. W. Concentrating Mam
malian Cells. I. Large Scale Animal Cell Culture.
Trends Biotechnol. 5, 230-237 (1987); Altshuler,
G. L. et al. Continuous Hybridoma Growth and
Monoclonal Antibody Production in Hollow Fiber
Reactors-Separators. Biotechnol. Bioeng. 28,
646-658 (1986); Jarvis, A. P. et al. Cell Growth
and Hemoglobing Synthesis in Murine Erythro
leukemic Cells propagated in High Density Micro
capsule Culture. In Vitro 22 (10), 589-596 (1986);
Velez, D. et al. Comparison of Cell Propagation
Methods for Their Effect on Monoclonal Antibody
Yield in Fermenters. J. Immunol. Methods 86, 61-69
(1986); Shirai, Y. et al. Continuous Production of
Monoclonal Antibody with Immobilized Hybridoma
Cells in an Expanded bed fermenter. Appl. Micro
biol. Biotechnol. 26, 495-499 (1987); Konrad, W. G.
& Hubertus, A. Medium für die Züchtung von mensch
lichen und/oder tierischen Zellen in einem
Fermenter. European Patent EP 02 05 790 (Dec. 30.
1986); Putnam, J. E. Monoclonal Antibody Production
in a Ceramic Matrix. In: Commercial Production of
Monoclonal Antibodies, Seaver, S. S. (Ed.). Marcel
Dekker, New York, pp. 119-138 (1986)).
Indessen waren diese Techniken insbesondere ent
wickelt worden, um die zugrundeliegenden komplexen
Probleme der Zellen in vitro zu umgehen.
Andererseits haben diese Techniken grundlegend
einige Probleme mit der Fluid-Dynamik. Auf der
anderen Seite bietet die Suspensionsmethode der
Züchtung solche Probleme relativ gesehen nicht und
hat viele grundlegende Vorteile für die industri
elle Anwendung von Zellkulturen von Säugetieren.
Außerdem ist es vielleicht eine bessere Methode,
einige Probleme dadurch zu kontrastieren, daß man
in vivo Zellmerkmale in vitro realisiert und daß
es vielleicht ein besseres Mittel für die Lösung
dieser Probleme ist (Dodge, T. C. et al. Loss of
viability in Hybridoma Cell Culture - A Kinetic
Study. Enzyme Microb. Technol. 9, 607-611 (1987);
Backer, M. P. et al. Large-Scale Production of
Monoclonal Antibodies in Suspension Culture. Bio
technol. Bioeng. 32, 993-1000 (1988)).
Viele früheren Versuche wurden mit der Erwartung
durchgeführt, daß der kombinierte Zusatz von Ener
giequellen, Aminosäuren und Vitaminen zu einer
Steigerung der maximalen lebensfähigen Zelldichte
über die entscheidende Konzentration führen würde,
d. h. um (1-3)·106 Zellen/ml in Batch-Kulturen
(Birch, J. R. & Boraston, R. G. Animal Cell Culture.
PCT Patent WO 87/00 195 (Jan. 15, 1987); Luan, Y. T.
et al. Strategies to Extend Longevity of Hybrido
mas in Culture and Promote Yield of Monoclonal
Antibodies. Biotechnol. Lett. 9 (10), 691-696
(1987); Howarth, W. et al. Cell Culture Medium for
Enhanced Cell Growth, Culture Longevity and
Product Expression. PCT Patent WO 90/03 430 (April
5, 1990)).
Nichtsdestoweniger gelang mit diesen Versuchen
nur, die stationäre Phase des Hybridoma-Wachstums
zu verlängern, was zu einem relativen Anstieg in
der Gesamt-Produktergiebigkeit führte. Man schloß
überstürzt, daß die Nichtübereinstimmung mit der
anfänglichen Erwartung unangemessen war, ohne jede
wissenschaftliche Erklärung. Angesichts des in
vivo aufrechterhaltenen Ernährungsgleichgewichts
scheinen indessen jene Methoden das Gleichgewicht
und verschiedene wichtige grundlegende Bedingungen
für die Zellvermehrung in vitro unbeachtet zu
lassen und sie benötigen ein nährstoffverstärktes
Medium, das für hochdichte Kulturen geeignet ist.
Im Prinzip entwickeln sich komplexe Wechselwirkun
gen zwischen Komponenten, die den individuellen
Wachstumsanforderungen eines gegebenen Zelltyps
entsprechen. Unter Bedingungen eines fast optima
len Wachstums wird der Umfang der Zellmultiplika
tion bestimmt durch einen ersten Begrenzungsfaktor
(Ham, R. G. Formulation of Basal Nutrient Media.
In: Cell Culture Methods for Molecular and Cell
Biology. Vol. 1. Barnes, D. W., Sirbasku, D. A. &
Sato, G. H. (Eds.) Alan R. Liss Inc., New York, pp.
3-21 (1984)) . Daher glauben wir, daß der gesamten
Nährstoffbetrachtung die Verwirklichung der Zell
merkmale in vivo, einer in vitro vorausgehen soll
te. Indessen könnte dies eine zu starke Verein
fachung sein, wenn wir uns nur auf einige Nähr
stoffe oder auf empirische Regeln bei der Unter
suchung verschiedener Kombinationen von Nährstoff
zusätzen verlassen. Schließlich ist es entschei
dend, alle Komponenten für den Bau eines hochdich
ten Kulturen-Mediums in ein Gleichgewicht zu
bringen.
In dieser Erfindung haben wir schlagende Beweise
offengelegt, daß Säugetierzellen mit typischen
Merkmalen eines Zellenwachstums kultiviert bzw.
gezüchtet werden können bis fast 1·107 Zellen/ml
durch die Verstärkung aller Komponenten eines
konventionellen Zellkulturmediums. Unsere Ver
suchsbeispiele, die im einzelnen in bevorzugten
Ausführungsarten der Erfindung beschrieben werden,
weisen nach, daß eine zeitgemäße Formel eines
Zellkulturmediums neu formuliert und weiter ausge
wogen für hochdichte/hochkonzentrierte Kulturen
verstärkt werden könnten, wenn die Unwirksamkeit
der Nährstoffverwendung in vitro erkannt ist. Auch
kann die Mediumverstärkung uns in die Lage ver
setzen, die physiologischen Aspekte von Säugetier
zellen in vivo durch Simulierung eines realen
Systems zu untersuchen. Zum Beispiel sollte die
zweifelhafte Wirkung sog. Hemm-Metaboliten, wie
Milchsäure und das Ammonium-Ion, neu mit Hilfe der
Anwendung dieses realen Systems durchforscht
werden. Unsere Versuchsergebnisse zeigen, daß der
schlüssige Faktor, der die Zellen hindert, über
die kritische Dichte hinaus zu wachsen, nicht jene
hemmenden Metaboliten sind, weil die kritische
Zelldichte durch die ausgewogene, verstärkte
Nährstoffzugabe überwunden wird.
Die Suspensionskulturmethode bietet viele grund
legende Vorteile im scale-up. Weitere Studien und
die Anwendung dieser Nährstoffverstärkungs
methode beim scale-up mit den Vorteilen der Sus
pensionskulturmethode würden einen einfachen und
verbesserten Weg für die industrielle Anwendung
des hochdichten Suspensionskultursystems schaffen.
Diese Erfindung betrifft die Entwicklung von aus
gewogen verstärkten hochdichten Medien für tieri
sche Zellkulturen und für die Erzielung einer
hochdichten Suspensionskultur unter Verwendung
besagter Medien.
Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstel
lung einer Reihe von hochdichten Medien (MBRI
40-01, 40-02 und 40-03), in denen alle Nährstoff
komponenten des herkömmlichen RPMI 1640 Mediums
außer (den) inorganischen Salzen verstärkt wurden,
wie in Tabelle 1 zusammengefaßt, und sie betrifft
Verfahren der hochdichten Suspensionszellkulturen,
die besagte Medien verwenden.
Diese Erfindung bringt höhere Werte für die Her
stellung verschiedener Pharmazeutika und biolo
gisch aktiver Substanzen, die über tierische Zell
kulturen produziert werden, dadurch, daß hoch
dichte Zellkulturen in diesen Verfahren verwendet
werden.
Diese Erfindung minimiert in vorteilhafter Weise
die Probleme während des scale-up für großtechni
sche Verfahren, indem sie die Vereinfachung und
die Reduzierung von herkömmlichen Züchtungsprozes
sen und Reinigungsschritten hiervon ermöglichen.
Diese Erfindung unterscheidet sich von den her
kömmlichen hochdichten Züchtungsprozessen wie dem
Perfusions-Verfahren dadurch, daß die Erfindung
nur die Serie besagter hochdichter Medien verwen
det und daher eine hochdichte Zellzüchtung ohne
jede anderen Geräte möglich macht und speziell für
die hochdichte Zellzüchtung bestimmt sind.
Infolgedessen ist eine bemerkenswerte Reduzierung
von Investitionen und Unterhaltungskosten für
Spezialgeräte durchaus erklärlich.
Fig. 1 zeigt Wachstumsprofile von Hybridoma 2c3.1
in einem RPMI 1640 Medium und in den nährstoffver
stärkten MBRI 40-01 & 40-02 Medien.
Fig. 2 zeigt Produktionsprofile von monoklonalen
Anti-HBs-Antikörpern, hergestellt durch Hybridoma
2c3.1 in einem RPMI 1640 Medium und in den
nährstoffverstärkten MBRI 40-01 Medien.
Fig. 3 zeigt Wachstumsprofile eines menschlichen
akuten lymphoblastischen Leukämie-CCRF-CEM in
einem RPMI 1640 Medium und in den nährstoffver
stärkten MBRI 40-01 & 40-02 Medien.
Fig. 4 zeigt Wachstumsprofile eines menschlichen
Myelom RPMI 8226 in einem RPMI 1640 Medium und in
den nährstoffverstärkten MBRI 40-01 & 40-02
Medien.
Fig. 5 zeigt das Rest-Glukose-Konzentrationsprofil
während der "fed-batch"-Züchtung von Hybridoma
2c3.1 unter Verwendung von MBRI 40-02 & 40-03
Medien und des Ernährungsplans des Ernährungs
mediums dabei.
Fig. 6 zeigt ein Wachstumsprofil von Hybridoma
2c3.1 während der "fed-batch"-Züchtung unter
Verwendung von MBRI 40-02 & 40-03 Medien.
Fig. 7 zeigt ein Produktionsprofil von Anti-HBs,
hergestellt während der "fed-batch"-Züchtung von
Hybridoma 2.c3.1 unter Verwendung von MBRI 40-02 &
40-03 Medien.
Beim ersten Schritt in Richtung einer ausgewogenen
Verstärkung des RPMI 1640 Medium für eine hoch
dichte Hybridoma-Kultur nahmen wir die ursprüng
lichen Molar-Anteile einer jeden Komponente wie
sie waren, denn das Medium war bereits durch Ver
fahren zur Nährstoffoptimierung entwickelt worden
(Ham, R. G. Formulation of Basal Nutrient Media.
In: Cell culture Methods for Molecular and Gell
Biology. Vol. 1. Barnes, D. W., Sirbasku, D. A. &
Sato, G. H. (Eds.) Alan R. Liss Inc., New York, pp.
3-21 (1984); Moore, G. E. et al. Culture of Normal
Human Leukocytes. J. Amer. Med. Assoc. 199,
519-524 (1967)).
Zusätzlich zu den molaren Mengen einer jeden Kom
ponente wurden mehrere andere Aspekte für wichtig
erachtet. Dies sind die Konzentrationen der jewei
ligen Nährstoffe im Serum, hemmende Konzentratio
nen einiger Komponenten gegen Zellwachstum, molare
Anteile von eng verwandten Komponenten und inorga
nische Salze und die Osmolalität des hergestellten
Endmediums, usw. (Schwartz, W. B. et al. Part XX.
Diseases of Metablism. In: Textbook of Medicine.
Beeson, P. B., McDermott, W. & Wyngaarden, J. B.
(Eds.). W. B. Saunders, Philadelphia, pp. 1949-1997
(1979)). All diese Aspekte für die Verstärkung des
Mediums zusammen ergeben die endgültigen Rezeptu
ren, wie in Tabelle 1 beschrieben. Zusammengefaßt
wurde das RPMI 1640 Medium fünfmal verstärkt in
Aminosäuren, Vitaminen und Glutathion-Konzentra
tionen und 2,5mal in einer Glukose-Konzentration
in einem MBRI 40-01 Medium. Die Konzentrationen
inorganischer Salze wurden überhaupt nicht geän
dert, ausgenommen Natriumchlorid (reduziert von 6 g/l
auf 4 g/l). Daher wurde die sich ergebende
End-Osmolalität bei 270 mos/kg Wasser gemessen.
Alle gleichen Nährstoffkomponenten im RPMI 1640
Medium wurden zehnmal im MBRI 40-02 Medium ver
stärkt, während die Konzentrationen an Glukose,
Glutamin und an inorganischen Salzen so blieben
wie im MBRI 40-01 Medium.
Das MBRI 40-03 Medium wurde entwickelt, um für ein
Nährmedium in einer "fed-batch"-Züchtung verwendet
zu werden. Es war aus Nährstoffkomponenten des
RPIMI 1640 Medium, fünfzigmal verstärkt, zusammen
gesetzt, während die Konzentrationen an inorgani
schen Salzen die des RPMI 1640 Medium waren. Durch
Reduktion der Konzentrationen von NaCl (von 6 g/l
auf 4 g/l für MBRI 40-01 & 40-02 Medien und her
unter auf 2 g/l für das MBRI 40-03 Medium) wurden
die Osmolaten aller hochdichten Medien zwischen
270-320 mos/kg Wasser gemessen.
Eine hochdichte Züchtung einer großen Zahl veran
kerungs-unabhängiger Zellen ist möglich bei Ver
wendung der Serie von hochdichten Kulturmedien
dieser Erfindung. Im allgemeinen können veranke
rungs-unabhängige Zellen für hochdichte Kulturen
untersucht werden. Auf diese Weise kann die Erfin
dung verwendet werden, um das Zellwachstum und die
Produktion von Biochemikalien für bestimmte veran
kerungs-unabhängige Zellen zu erhöhen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele
erläutert.
Das Hybridoma 2c3.1 wurde durch Fusion der CRL
1580 Myeloma-Zellen (P3 63.Ag.8.653) an die/mit
den Milz-Zellen der immunisierten Balb c Maus mit
gereinigten menschlichen HBsAg (200 mg/ml, Produkt
des Koreanischen Grünen Kreuzes) geklont. Die
Hybridoma-Zellreihe wurde beim Koreanischen Kul
turen-Center für Mikroorganismen (KCCM) gemäß dem
Budapester Abkommen hinterlegt und als KCCM-10003
bezeichnet. Die Hybridoma-Zellen wurden in einem
RPMI 1640 Medium gezüchtet, ergänzt mit 10% FBS
bei 37°C in einer 5% CO2 Luftatmosphäre, die
ständig Anti-HBs monoklonale Antikörper des IgG 1
Untertyps absonderte. Das "Seed-lot"-System wurde
angewandt für eine Rührer-Kolben-Kultur jedesmal,
um die Zellreihe stabil zu halten.
Für eine quantitative Bestimmung der Rest-Glukose
konzentration wurde ein YSI Glukoseanalysator ver
wendet.
Der produzierte monoklonale Antikörper wurde durch
eine ELISA-Methode quantifiziert, wovon das Stan
dardprotokoll folgendes ist: das Standard-Anti-HBs
wurde in HBsAg-überzogenen Polystyrenstreifen bei
37°C 2 Stunden lang inkubiert. Der affinitäts
gereinigte Standard-Anti-HBs wurde mit 0,15M PBS
(pH 7,2) verdünnt, das 5% Rinderserum-Albumin
enthielt, um Standardlösungen von 4,5 bis 300 IU/ml
herzustellen. Nach der Inkubation wurde der
Polysteren-Streifen dreimal mit 0,1 ml einer
0,1%igen PBST gewaschen und bei 37°C 1 Stunde lang
inkubiert, mit 100 ng HBsAG-HRP konjugiert und mit
0,1 ml eines normalen menschlichen Serums verdünnt.
Dann wurde es erneut fünfmal mit 0,1% PBST gewa
schen. Die chromogene Substratlösung wurde bei
Raumtemperatur auf 0,1 ml/well/Behälter erhöht;
dann folgte der Zusatz von 0,1 ml einer Stopp-
Lösung für jeden Behälter eine Stunde später.
Schließlich wurde die Farbentwicklung durch einen
"plate reader" (SLT Lab.) bei 405 µm überwacht.
Der für die Ouantifizierung produzierte MAb
verwendete Standard Anti-HBs wurde affinitäts
gereinigt mit Kultur-Supernatants von Hybridoma
2c3.1 (Adachi, H. et al. Sandwich Enzymoimmuno
assay of HBsAg antigen. In: Enzyme Immunoassay,
Ishikawa, E., Kawai, T. & Miyai, K. (Eds.) IGAKU-
SHOIN, Tokio, pp. 212-216 (1981)).
In 100 ml von nährstoffverstärkten oder ursprüng
lichen RPMI 1640 Medien wurden die Hybridoma-
Zellen mit Inoculum-Dichten von 1·105 Zellen/ml
und 10·106 Zellen/ml in 250 ml Bellco Rührer-
Kolben kultiviert; gerührt wurde mit 50 UpM in
einem biologischen Rührer (Techne) bei 37°C in
einem befeuchteten CO2-Inkubator. Das Medium wurde
ergänzt durch 10% Rinderfötus-Serum (Hyclone). Der
pH-Wert wurde während der Züchtung bei etwa 7,0
gehalten, mit diskontinuierlicher Zugabe einer
sterilen 0,4 N Natriumhydroxidlösung. Die Lebens
fähigkeit wurde durch die Farbstoffausschlußmetho
de unter Verwendung von Trypanblau bestimmt.
Mit einem MBRI 40-01 Medium wurde eine Hybridoma
zellreihe 2c3.1 erfolgreich bis zu einer Konzen
tration von 9,3·106 Zellen/ml kultiviert, ange
fangen von 1·106 Zellen/ml, während in dem
normalen RPMI 1640 Medium kultivierte Zellen
schnell nach nur 22 Stunden Kultivierung abstarben
(Fig. 1). Mit dem MBRI 40-02 Medium war die
maximale Zelldichte 1,2·107 Zellen/ml, die um
30% erhöht wurde, verglichen mit der im MBRI 40-01
Medium. Diese Daten zeigen deutlich, daß die
ausgewogen verstärkten Nährstoffmedien viel zur
Zelltätigkeit beitragen, um die in vitro Zell
wachstumsbeschränkung durch Schaffung eines
geeigneten Umfeldes für diese Hybridoma-Zellen zu
überwinden.
Wenn die anfängliche Zellkonzentration 1·105
Zellen/ml betrug, was die übliche Inoculum-Dichte
ist, wuchsen die Zellen bis 8·106 Zellen/ml in
einem MBRI 40-01 Medium (Fig. 1). Der Wert ist
auch vergleichbar mit dem bei höherem Inoculum.
Die Ergebnisse beweisen, daß hochdichte Batch-
Kulturen möglich sind, unabhängig von der
Inoculum-Dichte.
Als Ergebnis der mit dem nährstoffverstärkten
Medium erreichten hochdichten Kultur haben wir
eine 6- bis 8mal höhere Produktion des monoklo
nalen Antikörpers erzielt (Anti-HBs, IgGl; Fig. 2).
Bei 1·106 Zellen/ml Inoculum, wurden 340 µg/ml
der Anti-HBs nach 118 Stunden Kultivierung erreicht
im Vergleich zu 56 µg/ml in einem normalen RPMI
1640 Medium. Sogar noch höhere Konzentrationen des
monoklonalen Antikörpers, d. h. 450 µg/ml, wurden
in der Kultur bei 1·105 Zellen/ml Inoculum nach
161 Stunden Kultivierung erreicht. Diese bedeuten
de Steigerung monoklonaler Antikörper-Produktion
ergab sich aus der Tatsache, daß die Produktion
von monoklonalen Antikörpern mit der lebensfähi
gen Hybridoma-Zelldichte und der Lebensdauer der
Zellen in linearer Beziehung steht. In dieser
Hinsicht ist es gewiß, daß die Hybridoma 2c3.1 mit
ausreichenden Arten und Konzentrationen an Nähr
stoffen geliefert worden ist, die für hochdichte
Kulturen im Batch-Verfahren geeignet sind und
genügen, um eine signifikante Steigerung des
Anti-HBs monoklonalen Antikörpers zu erreichen.
Die humanen Zellen mit akuter Lymphoblasten-
Leukämie (CCRF-CEM; ATCC CCL 119) wurden in einem
RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10% FBS bei 37°C in
einer 5% CO2 enthaltenden Luft vorkultiviert. In
100 ml RPMI 1640, MBRI 40-01 und MBRI 40-02 Medien
wurden die Zellen jeweils mit Inoculum-/Impfstoff
-Dichten von (1,3-1,5)·106 Zellen/ml in 250 ml
Bellco Rührer-Kolben kultiviert; gerührt wurde mit
50 Upm mit einem biologischen Rührer (Techne) bei
37°C in einem befeuchteten CO2 Inkubator. Das
Medium wurde ergänzt durch 10% Rinderfötus-Serum
(Hyclone). Der pH-Wert wurde während der Züchtung
mit diskontinuierlichem Zusatz einer sterilen 0,4 N
Natriumhydroxidlösung etwa bei 7,0 gehalten. Eine
lebensfähige Zellkonzentration wurde durch die
Farbstoffausschlußmethode unter Verwendung von
Trypanblau bestimmt.
Bei den nährstoffverstärkten MBRI 40-01 und MBRI
40-02 Medien wurden die Zellen bis zu Konzentra
tionen von 8,1·106 Zellen/ml und 8,9·106
Zellen/ml nach 96 Stunden Züchtung kultiviert,
während die in dem normalen RPMI 160 Medium
kultivierten Zellen schnell abstarben, nachdem sie
3,9·106 Zellen/ml nach 42 Stunden Züchtung
erreicht hatten (Fig. 3). Die Versuchsergebnisse
(Fig. 3) zeigen im Gegensatz hierzu, daß die
ausgewogen verstärkte Nährstoffzufuhr viel zur
Zellenaktivität beiträgt, um die Zellenwachstums
begrenzung in vitro zu überwinden, indem man ein
geeignetes Umfeld für diese Zellen schafft. Die
Ergebnisse beweisen, daß die hochdichten Kulturen
auch für die humanen Zellen mit akuter Lympho
blasten-Leukämie geeignet sind.
Die humanen Myolema-Zellen (RPMI 8226; ATCC CCL
155) wurden in einem RPMI 1640 Medium, ergänzt mit
10% FBS bei 37°C in 5% CO2 enthaltender Luft
vorkultiviert. Jeweils in 100 ml RPMI 1640, MBRI
40-01 und MBRI 40-02 Medien wurden die Zellen
jeweils mit Inoculum/Impfstoffdichten von (1,3·106
Zellen/ml in 250 ml in Bellco Rührer-Kolben
kultiviert; gerührt wurde mit 50 Upm mit einem
biologischen Rührer (Techne) bei 37°C in einem
befeuchteten CO2 Inkubator. Das Medium wurde
ergänzt mit 10% Rinderfötus-Serum (Hyclone). Der
pH-Wert wurde während der Züchtung mit diskonti
nuierlichem Zusatz einer sterilen 0,4 N Natrium
hydroxydlösung etwa bei 7,0 gehalten. Eine lebens
fähige Zellkonzentration wurde durch die Farb
stoffausschlußmethode unter Verwendung von
Trypanblau bestimmt.
Bei den nährstoffverstärkten MBRI 40-01 und MBRI
40-02 Medien wurden die Zellen bis zu Konzentra
tionen von 3,8·106 Zellen/ml und 3,9·106
Zellen/ml nach 76 Stunden Züchtung kultiviert,
während in dem normalen RPMI 1640 Medium kulti
vierte Zellen schnell abstarben, nachdem sie 1,3·106
Zellen/ml nach 28 Stunden Züchtung erreicht
hatten (Fig. 4). Die Versuchsergebnisse (Fig. 4)
zeigen im Gegensatz hierzu, daß die ausgewogen
verstärkte Nährstoffzufuhr erheblich zur Zellen
aktivität beiträgt, um die Zellenwachstumsbegren
zung in vitro durch die Schaffung eines geeigneten
Umfeldes für diese Zellen zu überwinden. Die
Ergebnisse beweisen, daß die hochdichte Serien-
Kultur auch für humane Zellen mit akuter Lympho
blasten-Leukämie geeignet ist.
In 100 ml dieses verstärkten bzw. ursprünglichen
RPMI 1640 Medium wurden die Hybridomazellen mit
Inoculum/Impfstoffdichten von 1·106 Zellen/ml in
250 ml Bellco Rührer-Kolben kultiviert; gerührt
wurde mit 50 Upm mit einem biologischen Rührer
(Techne) bei 37°C in einem befeuchteten CO2-Inkubator.
Das Medium wurde mit 10% Rinderfötus-
Serum (Hyclone) angereichert/ergänzt. Der pH-Wert
wurde während der Kultivierung etwa bei 7,0
gehalten; diskontinuierlich wurde eine sterile
0,4 N Natriumhydroxydlösung beigegeben. Die Lebens
fähigkeit wurde durch die Färbausschlußmethode
unter Verwendung von Trypanblau bestimmt.
Bei dem MBRI 40-02 Medium wurde eine "fed-batch"
Kultur der Hybridoma-Zellen 2c3.1 initiiert, mit
einer Inoculum-Dichte von 1·106 Zellen/ml (Fig.
6). Nährmedium war das MBRI 40-03 Medium ergänzt
durch Glukose, Glutamin und 10% FBS. Die Konzen
trationen von Glukose und Glutamin betrugen 2,5 g/l
und bzw. 750 mg/l. Der "fed-batch"-Vorgang
verlief abhängig von der Restglukosekonzentration
während der Kultivierung, wie in Fig. 5 angegeben.
Das heißt die Restglukosekonzentration wurde durch die
Zufuhr des "fed-batch"-Medium über 1 g/l gehalten.
Das Volumen der Nährmedien betrug ca. 10% des
Arbeitsvolumens zum Zeitpunkt der (Nährstoff)-
Zufuhr. Die lebensfähige Zellkonzentration er
reichte 1,2·107 Zellen/ml bei etwa 70 Stunden
Kultivierung und sie wurde um (0,7-1,0)·107
Zellen/ml während mehr als 1500 Stunden Kultivie
rung aufrechterhalten, wie in Fig. 6 erläutert.
Als Ergebnis wurde die monoklonale Antikörper
produktion bemerkenswert verbessert und die hohe
Produktion wurde für ca. 2000 Stunden aufrecht
erhalten, nachdem 1 g/l der monoklonale Produktion
erreicht war (siehe Fig. 7). Die Höchstkonzentra
tion des produzierten MAb betrug 1,5 g/l. Diese
signifikante Steigerung der monoklonalen Antikör
perproduktion kann der Tatsache zugeschrieben
werden, daß die Produktion von monoklonalen Anti
körpern mit der lebensfähigen Hybridoma Zelldichte
und der Lebensdauer der Zellen linear verwandt
ist. Daraus folgert, daß die Hybridoma 2c3.1
reichlich mit den erforderlichen Arten und Konzen
trationen von Nährstoffen versorgt wurden, die für
eine hochdichte Kultur im "fed-batch"-Mode geeig
net sind, ausreichend, um eine signifikante
Steigerung des Anti-HBs monoklonalen Antikörpers zu
erreichen.
Alle Ergebnisse wurden in Tabelle 2 zusammenge
faßt. Die höchsten Zellkonzentrationen in allen
Kulturen erhöhten sich um das 2,1- bis 5,2fache
verglichen mit denen in der Kontrollkultur im RPMI
1640 Medium. Die monoklonale Antikörperproduktion
wurde um einen Faktor 6-8 im Vergleich zu der
Kontrollkultur erhöht. Durch die Schaffung einer
"fed-batch"-Kultur eines Hybridoma 2c3.1 wurden
die Zellkultur und die Antikörperproduktion um das
3,0- bis 5,2fache bzw. das 27fache erhöht, verglichen
mit den Werten in der Kontroll-Serienkultur. Die
Möglichkeit von langfristigen Arbeiten wurde
bestätigt durch Bearbeitung der Kultur bis zu
2500 Stunden.
Claims (18)
1. Konzentrationsverstärktes Kulturmedium für
Zellen von Säugetieren, in dem alle Nährstoff
komponenten eines herkömmlichen Mediums ausge
wogen verstärkt sind zur Kultivierung von ver
ankerungsunabhängigen Säugetierzellen.
2. Kulturmedien nach Anspruch 1, gekennzeichnet
durch ein Medium, hergestellt unter Berücksich
tigung von Faktoren, wie die molaren Mengen
einer jeden Komponente, die Konzentrationen der
entsprechenden Nährstoffe im Serum, die hemmen
den Konzentrationen einiger Komponenten gegen
Zellwachstum, die molaren Anteile von eng ver
wandten Komponenten und der inorganischen Salze
und der Osmolalität in den hergestellten
Medien.
3. Kulturmedien nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß Glukose und Glutamin um das
2,5fache bzw. 5fache verstärkt wurden und die
anderen Nährstoffkomponenten 5fach im
Vergleich zu den Konzentrationen im RPMI 1640
Medium.
4. Kulturmedien nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß Glukose und Glutamin um das
2,5fache bzw. 5fache verstärkt wurden; und
andere Nährstoffkomponenten der Medien 10fach
im Vergleich zu den Konzentrationen im RPMI
1640 Medium.
5. Zellkulturmedien nach Anspruch 1, in denen
Glukose und Glutamin 2,5fach bzw. 5fach ver
stärkt sind; und die anderen Nährstoffkompo
nenten der Medien 50fach im Vergleich zu den
Konzentrationen im RPMI 1640 Medium.
6. Zellkulturmedien nach Anspruch 3, 4 und 5, da
durch gekennzeichnet, daß eine Osmolalität
zwischen 250-320 mos/kg Wasser durch Regulie
rung der Konzentration mit Natriumchlorid ein
gehalten wird, ohne die Konzentrationen ande
rer inorganischer Salze im Vergleich zu denen
im RPMI 1640 Medium zu ändern.
7. Zellkulturmedien nach Anspruch 1, dadurch ge
kennzeichnet, daß die Kultivierungen von ver
ankerungsunabhängigen Säugetierzellen, wie
murine Hybridoma, humane lymphoblastoide
Zellen und humane Myeloma-Zellen eingesetzt
sind.
8. Verfahren zur Kultivierung von Zellen durch
Kontaktierung besagter Zellen mit dem Zellkul
turmedium nach Anspruch 3.
9. Verfahren zur Kultivierung von Zellen in einem
Medium nach Anspruch 4.
10. Verfahren zur Kultivierung von Zellen in einem
Medium nach Anspruch 5.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 3, 4 oder 5, da
durch gekennzeichnet, daß die besagte Zellen
antikörperabsondernde Zellen sind.
12. Biochemikalien produziert durch in den Medien
des Anspruchs 3 gezüchtete Zellen.
13. Biochemikalien produziert durch in den Medien
des Anspruchs 4 gezüchtete Zellen.
14. Biochemikalien produziert durch Zellen,
gezüchtet in den Medien des Anspruchs 5.
15. Verfahren zur Züchtung von Zellen nach
Anspruch 8, 9 und 10, durch Verwendung von
Kombinationen besagter Medien, um Biochemi
kalien durch Säugetierzellen kontinuierlich zu
produzieren.
16. Verfahren zur Züchtung von Zellen nach
Anspruch 15, in dem die Zufuhr einer Kombina
tion besagter Medien vorgenommen wird, um die
Restglukosekonzentration von 1 g/l aufrechtzu
erhalten.
17. Verfahren zur Züchtung von Zellen nach
Anspruch 15, daß es bis zu 2500 Stunden
wirksam ist.
18. Verfahren zur Züchtung von Zellen nach
Anspruch 15, in der besagte Media bis zu ca.
10% eines Arbeitsvolumens einer Kultur
zugeführt werden.
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