KR100481208B1

KR100481208B1 - 세포 배양용 무혈청 배지

Info

Publication number: KR100481208B1
Application number: KR10-2002-0058982A
Authority: KR
Inventors: 박준영; 임병필; 조의철; 박두홍
Original assignee: 재단법인 목암생명공학연구소
Priority date: 2002-09-27
Filing date: 2002-09-27
Publication date: 2005-04-08
Also published as: KR20040027204A

Abstract

본 발명은 숙주 세포 배양용 무혈청 배지에 관한 것으로, 보다 상세하게는 재조합 의약품을 생산하는 인간 배아 신장세포를 최적의 조건으로 성장시킬수 있는 조성성분을 함유하는 무혈청 배지에 관한 것이다. 본 발명의 무혈청 배지를 이용하여 인간 배아 신장세포를 배양하면 세포의 증식이 뛰어나고 세포가 최적의 조건으로 성장할 수 있어 상기 세포 배양을 통해 유전자 치료용 전달체인 재조합 바이러스를 생산하여 재조합 바이러스 의약품을 제조하는데 유용하게 쓰일수 있으며, 또한 배지에 혈청이 포함되어 있지 않아 목적 단백질의 분리 및 정제가 용이하므로 숙주세포를 이용하여 재조합 의약품을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포 배양용 무혈청 배지{Serum-free media for cell culturing}

본 발명은 동물세포 배양용 무혈청 배지에 관한 것으로, 보다 상세하게는 재조합 의약품을 생산하는 숙주 세포의 배양에 적합한 무혈청 배지에 관한 것이다.

재조합 의약품은 생리활성을 갖는 것으로 밝혀진 유전자를 단백질 또는 유전자 자체로 재조합하여 생체내에 투여하여 치료 효과를 보여 줄 수 있는 의약품을 말한다. 현재까지 대부분의 재조합 의약품은 유효 유전자를 각종 숙주세포에 클로닝하여 그 유전자가 코딩하는 단백질을 대량생산하여 제품화한 것이다. 동물 세포를 숙주 세포로 하는 재조합 단백질 의약품의 예로써는 혈전용해제인 티슈 플라스미노젠 엑티베이터(Tissue Plasminogen Activator), 빈혈치료제인 에리스로포이에틴(Erythropoietin) 및 허셉틴(Herceptin)등과 같은 치료용 항체가 있다. 상기와 같은 의약품들을 제조하기 위해서는 해당 유전자를 잘 발현할 수 있는 발현 벡터에 클로닝하여 CHO, BHK와 같은 숙주 세포에 영구적으로 형질전환함으로써 목적 단백질을 생산하는 세포주를 만들고 이를 각 의약품의 대량 생산에 이용하는 방법과 해당 유전자가 클로닝된 발현 벡터를 숙주 세포에 일시적으로 형질도입하여 목적 단백질을 생산하는 방법이 있는데 두 번째 방법은 많은 수의 유효 단백질을 빠른 시간내에 수 밀리그램 이상 생산하여 그 단백질의 활성을 면밀히 분석하는 하이 쓰루풋 스크리닝(High Throughput Screening)의 목적으로 최근에 많이 이용되고 있다.

HEK 293 세포주는 각종 발현 벡터의 발현이 잘되는 세포주로 상기와 같은 재조합 단백질 의약품 생산의 목적으로 쓰기에 적합하며, 현재 HEK 293 세포가 재조합 단백질 의약품 생산보다 더욱 중요한 것은 유전자를 직접 투여하는 재조합 의약품, 즉 유전자 치료제 생산에 가장 널리 쓰이고 있다는 점이다(Nadeau, I. et al., Biotechnol. Bioeng., 1996, 51, 613-623; Jordan, M. et al., Cytotechnology, 1998, 26, 39-47; Schlaeger, E. J. and Christensen, K., Cytotechnology, 1999, 30, 71-83).

유전자 치료제를 제조하는 방법은 유효 유전자를 바이러스 벡터나 리포솜과 같은 유전자 전달체에 삽입하여 주사하는 것이 효과적인데, 바이러스 벡터로 널리 사용되는 것으로 아데노 바이러스와 아데노 부속 바이러스 등이 있다. 유전자 전달체 벡터로 이러한 바이러스를 이용하기 위해서는 야생형의 바이러스 자체가 스스로 복제하지 못하도록 바이러스 유전자 중 핵심 유전자를 제거하고 그 위치에 치료용 유전자를 삽입하여야 하는데 그 제거된 유전자를 다른 플라스미드나 세포주가 보완해 주어야만 유전자 치료제로 쓰이는 재조합 바이러스가 만들어진다. HEK 293 세포주는 아데노 바이러스의 형성에 필요한 E1 유전자를 가지고 있어 재조합 아데노 바이러스와 재조합 아데노 부속 바이러스의 제조에 가장 많이 사용되고 있다 (Nadeau, I. et al., Biotechnol. Bioeng., 1996, 51, 613-623; Cote, J. et al., Biotechnol. Bioeng., 1998, 59, 567-575). 유전자 치료제로 현재 상품화된 것은 없으나, 현재 개발 중인 대표적인 예로 p53 유전자를 함유하는 아데노 바이러스 유전자 전달체, 선택적으로 증식하여 암세포를 살상하는 아데노 바이러스 유전자 전달체, 혈우병 치료용 아데노 부속 바이러스 유전자 전달체 등이 있다.

재조합 단백질 또는 재조합 바이러스 의약품을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포로는 대장균, 효모 및 동물세포 등이 있으며, 상기 숙주 세포 중에서 동물 세포를 숙주로 하여 제조하는 재조합 의약품의 비중이 나날이 증가하고 있다. 이러한 동물 세포로는 CHO(Chinese Hamster Ovary), BHK(Baby Hamster Kidney), NS0 골수종 세포 등이 널리 이용되고 있다.

동물세포 유래의 재조합 의약품을 산업적으로 생산하기 위해서는 동물 세포를 배양해야 하는데, 최근에는 동물 세포를 배양하는 방법으로 무혈청 배지를 사용하는 배양 방법이 널리 보편화되고 있다. 이는 주로 동물세포를 숙주로 하는 의약품의 생산에 대한 허가 감독과정에서 배지 중 혈청 유래 단백질과 숙주세포에 대한 각종 병원균의 감염 여부로 인해, 동물 유래의 혈청 배지를 사용하여 제조한 재조합 의약품을 까다롭게 조사, 규제하고 있기 때문이다.

상기의 동물세포 외에 최근에 많이 사용되는 숙주 세포주로 외래 유전자의 도입 효율이 높은 사람 유래 세포주인 HEK 293 세포주(인간 배아 신장 293 세포, Human Embryonic Kidney 293 cell; ATCC CRL-1573)가 널리 쓰이고 있다(Graham, F. L. et al., J. Gen. Virol., 1977, 36, 59-72). 상기 세포는 기존의 숙주 세포를 이용하는 경우와 같이 재조합 단백질을 생산하는 목적(Nadeau, I. et al., Biotechnol. Bioeng., 1996, 51, 613-623; Jordan, M. et al., Cytotechnology, 1998, 26, 39-47; Schlaeger, E. J. and Christensen, K., Cytotechnology, 1999, 30, 71-83)과 더불어 유전자 치료에 많이 쓰이는 아데노 바이러스(adeno virus), 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus) 유전자 전달체들의 입자를 효과적으로 생산하는 포장세포로서의 역할을 하는 목적으로도 중요하게 사용된다(Nadeau, I. et al., Biotechnol. Bioeng., 1996, 51, 613-623; Cote, J. et al., Biotechnol. Bioeng., 1998, 59, 567-575).

따라서, HEK 293 세포주의 무혈청 배양에 적합한 무혈청 배지를 개발하는 것은 각종 재조합 의약품 및 유전자 치료제의 산업화에 대단히 중요한 요소라고 할 수 있다. 또한, 대부분의 동물세포주는 배양 표면에 부착하는 형태로 생장하는 특성을 가지고 있는데, 이런 상태에서 생산 규모를 확장하려면 일반적으로 수백, 수만개의 배양 용기가 필요하지만, 부유배양이 가능하게 되면 1 내지 2대의 생물반응기(bioreactor)를 원래의 설계대로 확장하기만 하면 되기 때문에(Epstein, D.A. et al., Focus, 1999, 21, 22-24), 재조합 단백질이나 유전자 전달체를 실험실 규모에서 산업적 생산 규모로 증가시키기 위해서는 부유배양이 가능한 무혈청 배지가 특히 필요하다.

이러한 이유로 혈청 배지에서 부유 배양이 가능한 HEK 293 세포주로 293N3S (Microbix, Canada), 293S 등이 먼저 수립되었고(Graham, F.L., J. Gen. Virol., 1987, 68, 937-940), 상기 세포주로부터 클론을 골라내는 방식으로 무혈청 배양에 적응된 293 세포에 대해 보고된 바 있다(Schlaeger, E. J. and Christensen, K., Cytotechnology, 1999, 30, 71-83; 4-6; Nadeau, I. et al., Biotechnol. Bioeng. , 1996, 51, 613-623; Cote, J. et al., Biotechnol. Bioeng., 1998, 59, 567-575). 상기와 같은 방식은 1) 배지 성분의 경험적 선택, 2) 장기간의 반복적 적응 또는 세포를 무혈청 상태로 전환하여 적응시키는 과정(weaning)의 단계, 3) 클론의 선택, 4) 세포의 생장 등 여러 가지 기준에 의한 클론 스크리닝 등 수 개월에 걸친 클론 선택 과정을 거쳐 경험적으로 조성된 무혈청 배지에서 증식할 수 있는 클론을 골라내는 개념을 원칙으로 한다(Cote, J. et al., Biotechnol. Bioeng., 1998, 59, 567-575; Maurer, H.R., Animal cell culture:a practical approch. 2nd ed, 1995, 15-46). 하지만, 이러한 방법은 지극히 경험에 의존하게 되기 때문에 전체적인 방법 자체는 일반적으로 잘 알려져 있기는 하지만, 이러한 일에 종사하는 작업자 누구나가 성취할 수 있는 것이라고 할 수 없을 뿐만 아니라 많은 시간과 반복적인 과정을 거쳐야 한다는 문제점이 있다. 또한, 동물 세포가 요구하는 무기 이온, 아미노산, 비타민 등의 영양 성분 및 생장에 필수적인 각종 생장인자, 호르몬 등은 다른 성분의 존재 유무나 농도에 따라 최적 생장 촉진 농도가 달라지기 때문에 많은 변수가 동시에 하나의 세포주에 대해 최적화되어야하고, 어떤 성분들은 상호간에 세포의 생장에 상승 효과가 있기도 하고 그 반대의 결과를 가져오기도 하기 때문에 무혈청 배지를 조성하는데 많은 문제점이 있다.

따라서, 이러한 수많은 변수들을 경험에 의해 조정하기 보다는 이미 수학적으로 확립되어 있는 최적 실험 설계법에 의해 최적화하는 것이 합리적인 결과를 얻어내는 진전된 접근법이라고 할 수 있다. 최적화의 방법으로 잘 알려져 있는 것으로는 플래케트-버만(Plackett-Burman)법과 반응 표면 분석법(Response Surface Modification Method, 이하 'RSM'이라 약칭한다)이 있다(Montgomery, D.C. Design and Analysis of Experiments. 4th ed., 1997, 575-610; Lee, G. M. et al., J. Biiotechnol., 1999, 69, 85-93). 플래케트-버만 방법은 특정 성분의 대상 세포주에 대한 효과의 유무를 알 수 있는 방법인데, RSM 방법은 플래케트-버만 방법에 비해 많은 성분을 포괄하지 못하는 단점은 있으나, 어떤 성분의 대상 세포주에 대한 효과 유무만을 알 수 있는 플래케트-버만 방법에 비해 각 농도별로 미치는 영향의 정도를 차별화할 수 있으며, 또한 각 성분 상호간의 상승 효과도 알아 볼 수 있기 때문에 실제로 유효한 배지 성분의 최적 농도를 정확히 알아낼 수 있는 장점을 가지고 있다.

이에, 본 발명자들은 기존의 경험에 의존하는 실험 방식을 탈피하여 RSM 방법과 세포 생장 분석법을 결합시켜 합리적인 실험 설계법을 도입하였으며, 상기 방법을 이용하여 재조합 단백질 의약품을 생산하는 숙주 세포로 산업적으로 폭넓게 쓰이는 HEK 293 세포의 배양에 적합한 무혈청 배지를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 재조합 의약품을 생산하는 숙주 세포 배양에 적합한 무혈청 배지를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 재조합 의약품을 생산하는 숙주 세포 배양용 무혈청 배지를 제공한다.

본 발명의 무혈청 배지는 재조합 의약품을 생산하는데 널리 이용되고 있는 숙주세포를 배양하는데 용이하고 상기 숙주세포는 인간 배아 신장 세포인 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 인간 배아 신장 세포로 HEK 293 세포(human embryonic kidney 293 cell)를 배양하기 위한 무혈청 배지를 제조하였다.

본 발명의 무혈청 배지를 이용하여 제조하는 재조합 의약품은 숙주세포가 생산하는 재조합 단백질을 이용하여 제조하는 재조합 단백질 의약품 또는 숙주세포에 유전자 전달체로써 바이러스를 도입하여 제조한 재조합 바이러스 의약품을 포함하며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서는 혈청이 없어도 세포의 성장에 영향을 받지 않게 하기 위해 현재까지 세포의 성장을 촉진하는 것으로 알려진 성장인자 및 유효성분을 선정하고 각각의 농도 범위를 결정하여 세포가 성장을 할 수 있는 최적의 무혈청 배지 조성성분을 결정하였다.

무혈청 배지에 첨가될 수 있는 성분으로는 인슐린형 성장인자 Ⅰ(Insulin like growth factor Ⅰ, IGF-Ⅰ), 변형 표피성장인자(Long epidermal growth factor, Long EGF), 소듐 셀레니트(Sodium selenite), 퓨트레신(Putrescine), 에탈올아민(Ethanolamine), 글루타치온(Glutathione), 레티노익산(Retinoic acid), 전환성장인자 β1(Human transforming growth factor β1, hTGF-β1), 페릭 클로라이드(Ferric chloride) 및 플루로닉 F68(Pluronic F68)이 포함될 수 있다.

또한, 최적의 조건으로 세포를 성장할 수 있게 하기 위해 무혈청 배양배지에 첨가될 상기 조성 성분들의 바람직한 농도 범위는 인슐린형 성장인자 Ⅰ은 5 내지 100 ng/㎖, 변형 표피성장인자는 6.4 내지 16 ng/㎖, 소듐 셀레니트는 50 내지 5000 nM, 퓨트레신은 10 내지 100 ㎍/㎖, 에탄올아민은 0.5 내지 5 mM, 글루타치온은 50 내지 200 ㎎/ℓ, 레티노익산은 0.15 내지 5.5 μM, 전환 성장 인자 β1은 5 내지 10 ng/㎖, 페릭 클로라이드는 125 내지 1,000 μM, 플루로닉 F68은 0.05 내지 1 중량%이다. 더욱 바람직하게는 인슐린형 성장인자 Ⅰ은 100 ng/㎖, 변형 표피성장인자는 6.4 ng/㎖, 소듐 셀레니트는 2969 nM, 퓨트레신은 61 ㎍/㎖, 에탈올아민은 0.5 mM, 글루타치온은 200 ㎎/ℓ, 레티노익산은 5.5 μM, 전환 성장 인자 β1은 8.2 ng/㎖, 페릭 클로라이드는 342 μM, 플루로닉 F68은 0.79 중량%이다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기에 나열한 배지 첨가물 및 그의 첨가 농도 범위를 이용하여 세포를 최적의 상태로 성장할수 있게 하는 무혈청 배지 첨가물을 결정하여 인간 배아 신장 세포 배양용 배지를 제조하였으며(표 5 참조), 상기 배지를 'MBRI 40-40-01', 'MBRI 40-40-02', 'MBRI 40-40-03', 'MBRI 40-40-04' 및 'MBRI 40-40-05'라 명명하고 상기 배지들을 이용하여 세포 증식 효과 및 바이러스 생산성을 조사하였다. 그 결과, 인슐린형 성장인자 Ⅰ은 100 ng/㎖, 변형 표피성장인자는 6.4 ng/㎖, 소듐 셀레니트는 2969 nM, 퓨트레신은 61 ㎍/㎖, 에탈올아민은 0.5 mM, 글루타치온은 200 ㎎/ℓ, 레티노익산은 5.5 μM, 전환 성장 인자 β1은 8.2 ng/㎖, 페릭 클로라이드는 342 μM, 플루로닉 F68은 0.79 중량%의 조성 성분을 첨가물로 하는 MBRI 40-40-01 배지의 경우 세포 증식 효과도 뛰어나고(도 3 참조) 바이러스 생산성도 높아(표 6 참조) 인간 배아 신장 세포주를 배양하는데 적합한 무혈청 배지임을 알 수 있었다.

상기 결과로부터, 본 발명의 무혈청 배지는 재조합 의약품을 생산하는 숙주세포, 특히 인간 배아 신장 세포의 배양에 적합한 무혈청 배지임을 알 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 무혈청 배지 첨가 성분 물질 결정

본 발명자들은 인간 배아 신장세포(Human embryonic kidney cell, 이하 'HEK'라 약칭함)인 HEK 293 세포를 무혈청 배양하기 위해 첨가할 성분을 결정하였다.

<1-1> HEK 293 세포의 배양

본 발명자들은 HEK 293 세포(ATCC CRL-1573)의 무혈청 배지를 제조하기에 앞서 먼저 HEK 293 세포를 혈청 배지에서 배양하였다. 구체적으로, HEK 293 세포는 기본적으로 5% 우혈청(fetal bovine serum, 이하 'FBS'라 약칭함)(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)가 포함된 DMEM(Dulbeccos Modified of Eagle's Media, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) 배지를 이용하여 세포 배양용 T-75 플라스크(Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 계대 배양하였으며, 37℃, 5% CO₂로 유지되는 세포 배양기에서 배양하였다. 상기 HEK 293 세포는 72시간에 한번씩 1:3의 비율로 계대 배양해 주었으며, 계대시 상기 세포의 생존능력은 90% 이상이었다. 일반적인 부유 배양은 스피너(spinner) 플라스크에서 2% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 실시하였으며, 생존능력이 95% 이상이 되도록 유지하였다.

<1-2> 무혈청 배지 첨가 성분의 결정

본 발명자들은 HEK 293 세포를 배양하는 무혈청 배지에 첨가될 성분을 결정하기 위해 인슐린(Insulin), 제 1형 인슐린형 성장인자(IGF I), 제 2형 인슐린형 성장인자(IGF Ⅱ), 제 1형 인슐린형 성장인자의 변형인자(LR3 IGF I), 내피세포 성장 인자(ECGF), 혈소판 성장 인자(PDGF), 페릭 시트레이트(Ferric citrate) 및 아프로티닌(Aprotinin) 등 현재까지 각종 세포주의 생장을 촉진하는 것으로 알려진 20여 가지의 성장 인자 및 유효 성분(Jenkins, N., Mammalian cell biotechnology, 1991, 39-54)의 농도 범위를 선정하였다(표 1).

성장 인자 및 유효성분의 농도 범위

성분	공급원	제품 번호	농도 범위
인슐린	Sigma	I 5500	0.01-10 ㎍/㎖
제 1형 인슐린형 성장인자(IGFⅠ)	Roche	1048 058	1-100 ng/㎖
IGF I의 변형인자(LR3 IGFⅠ)	Sigma	I 1271	1-200 ng/㎖
제 2형 인슐린형 성장인자(IGF Ⅱ)	Roche	1183 141	5-200 ng/㎖
표피 성장 인자(hEGF)	PeproTech	100-15	1-20 ng/㎖
EGF의 변형 인자(Long EGF)	GroPep	NM 010	0.06-6 ㎍/㎖
내피세포 성장 인자(ECGF)	Roche	1033-476	100-300 ㎍/㎖
섬유아세포 성장 인자(bFGF)	Roche	1123 149	0.1-10 ng/㎖
혈소판 성장 인자(PDGF)	Roche	1276 956	0.5-10 ng/㎖
전환 성장 인자(hTGF-β1)	PeproTech	100-21R	0.1-10 ng/㎖
트랜스페린	Sigma	T 5391	1-100 ㎍/㎖
페릭 시트레이트(Ferric citrate)	Sigma	F 6129	0-2 mM
페릭 클로라이드(Ferric chloride)	Sigma	F 2877	0-2 mM
소듐 셀레니트(Sodium selenite)	Sigma	S 1382	1-50 ng/㎖
소 뇌하수체 추출(Bovine pituitary extract)	Calbiochem	CC 4009	0-0.4%
레티노익산(Retinoic acid)	Sigma	R 2625	0-22 μM
에탄올아민(Ethanolamine)	Sigma	E 0135	0-10 mM
퓨트레신(Putrescine)	Sigma	P 7505	0-100 μM
글루타치온(Glutathione)	Sigma	G 4251	0-200 ㎎/㎖
아프로티닌(Aprotinin)	Calbiochem	616398	0-20 kIU/㎖
플루로닉 F68(Pluronic F68)	Sigma	P 7061	0-0.2%(w/v)
아스코빅 에시드(Ascorbic acid)	Wako	013 12061	0-20 mM

상기 첨가물 조성이 HEK 293 세포의 성장을 촉진시키는지 알아보기 위해 BrdU 결합 분석법(BrdU incorporation assay)을 이용하였다. BrdU 결합 분석법은 증식하는 세포의 DNA 합성기에 피리미딘 아날로그인 BrdU가 세포의 DNA에 끼어 들어가게 되고, 상기 세포에 BrdU에 대한 항체를 결합시켜 발색 반응을 일으키도록 고안된 면역 발색 정량법으로, 단순히 세포수를 측정하는 방법보다 훨씬 정량적이고 정밀한 측정법으로서 각종 생장 촉진 인자의 세포 생장에 기여하는 정도를 정확히 정량할 수 있는 방법일 뿐만 아니라, 비교적 짧은 시간에 많은 수의 생장 촉진 인자들의 촉진 효과를 정확히 알아낼 수 있다.

구체적으로, DMEM 배지(대조군) 또는 상기 표 1에서 지정한 농도 범위로 각 성분을 첨가한 DMEM 배지를 넣은 96-웰플레이트(Costar 3471 및 3473, Corning, Acton, MA, USA)에 HEK 293 세포를 2 ×10⁴ 세포수/㎖로 접종하여 37℃의 CO₂ 세포 배양기에서 24시간 배양한 후, BrdU를 첨가하고 다시 37℃의 CO₂ 세포 배양기에서 배양하여 BrdU가 분열 세포의 DNA에 끼어 들어가도록 4시간 동안 배양한 후, 상기 배지를 제거하고 상온에서 BrdU 결합 분석 킷트(Roche Molecular Biochemicals, Manheim, Germany)에 들어있는 픽스데나트(FixDenat^??, Roche Molecular Biochemicals, Germany)을 첨가하여 30분동안 배양하면서 세포를 고정시킴과 동시에 DNA를 변성시켰다. 상기 고정 및 변성후 픽스데나트를 제거하고 항-BrdU-POD 항체(Roche Molecular Biochemicals, Germany)를 첨가하여 상온에서 1시간동안 배양하면서 항체를 세포의 DNA에 결합시켰다. 상기 항체 결합후, 기질을 첨가하고 반응시켜 ELISA 판독기(Spectra Ⅱ SLT, Austria)로 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세포의 생장 정도를 정량적으로 측정하였다.

그 결과, 상기 표 1의 첨가물중에서 소듐 셀레니트(sodium selenite)의 경우, 대조군 웰의 흡광도가 약 0.58인데 비해 최고치를 보인 500 nM 이상의 농도에서 평균 0.91 정도의 흡광도를 보임으로서 대조군에 비해 약 57% 정도의 생장 촉진 활성을 나타내었다(도 1a). 또한, 표피 성장 인자(hEGF)의 경우, 대조군 웰의 흡광도가 약 0.63인데 비해 최고치를 보인 5 ng/㎖ 이상의 농도에서 평균 1.09 정도의 흡광도를 보임으로서 대조군에 비해 약 73% 정도의 생장 촉진 활성을 나타내었다(도 1b).

또한, 표 1에 제시된 나머지 성분에 대한 생장 촉진 활성 분석을 한 결과, 페릭 클로라이드, 제 1형 인슐린양 성장 인자, 표피 성장인자의 변형 인자, 소듐 셀레니트, 에탈올아민, 글루타치온, 퓨트레신, 레티노익산, 제 1형 전환 성장 인자 및 플루로닉 F68 등이 HEK 293 세포의 생장 촉진 비율을 높이는 것으로 확인하여 무혈청 배지 조성에 유용하게 사용될 후보 물질로 선정하고 각 성분의 구체적인 유효 농도 범위와 촉진비율을 다시 검정하였다(표 2).

무혈청 배지에 첨가할 유효 성분의 농도 범위와 생장 촉진 비율

성분	농도 범위	촉진 비율
제 1형 인슐린형 성장인자	5-100 ng/㎖	1.14
EGF의 변형 인자	6.4-16 ng/㎖	1.65
소듐 셀레니트	50-5000 nM	1.57
퓨트레신	10-100 ㎍/㎖	1.43
에탄올아민	0.5-5 mM	1.26
글루타치온	50-200 ㎍/㎖	1.50
레티노익산	0.15-5.5 μM	1.24
전환 성장 인자	5-10 ng/㎖	1.70
페릭 클로라이드	125-1000 μM	1.20
플루로닉 F68	0.15-1 %	1.22

<실시예 2> 무혈청 배지 첨가물 조성의 최적화

<2-1> 무혈청 배지 첨가용 유효성분의 세포 증식 경향분석

본 발명자들은 최적 무혈청 배지 첨가물의 조성을 알아내기 위해 상기 실시예 1에서 선정한 무혈청 배지에 사용할 10개의 유효 성분과 농도 범위(표 2)를 이용하여, 반응 표면 방법(RSM)을 도입한 D.o.E. 합성 소프트웨어를 이용하여 표 2에 나타낸 각 조성의 최고농도를 1로 하고 같은 비율로 나머지 값을 설정하여 153개의 실험을 설계하였다(표 3).

최적 무혈청 배지 첨가물 조성 설계

수행번호	페릭 클로라이드	제 1형 인슐린형 성장인자	EGF의 변형 인자	소듐 셀레니트	에탄올아민	글루타치온	퓨트레신	레티노익산	전환 성장 인자	플루로닉 F68
1	1	1	1	0.01	0.1	1	0.1	0.027	1	0.05
2	1	0.05	1	0.01	1	1	1	0.027	1	0.05
3	0.125	1	0.4	0.01	1	0.25	1	1	1	1
4	0.125	1	0.4	0.01	1	1	0.1	0.027	1	0.05
5	0.5625	0.525	0.7	0.505	0.55	0.625	0.55	0.514	0.75	0.525
6	1	1	1	1	0.1	0.25	1	1	0.5	0.05
7	1	0.525	0.7	0.505	0.55	0.625	0.55	1	0.75	0.525
8	1	0.05	1	1	0.1	1	1	0.027	1	1
9	1	0.05	0.4	1	1	1	0.1	0.027	1	0.05
10	0.125	0.05	1	0.01	0.1	0.25	0.1	1	0.5	1
11	1	1	0.4	1	1	1	1	0.027	0.5	0.05
12	0.125	1	0.4	1	0.1	0.25	1	1	1	0.05
13	1	1	0.4	1	0.1	1	1	0.027	1	0.05
14	0.125	0.05	0.4	0.01	1	1	0.1	1	0.5	0.05
15	0.125	0.05	1	0.01	0.1	1	0.1	0.027	0.5	1
16	1	1	1	0.01	1	0.25	1	1	0.5	1
17	0.125	1	1	0.01	0.1	0.25	1	0.027	1	0.05
18	0.5625	0.525	0.7	0.505	0.55	0.625	0.55	0.514	0.75	0.525
19	0.125	1	0.4	0.01	1	0.25	0.1	0.027	1	1
20	1	1	1	0.01	1	1	0.1	0.027	0.5	0.05
21	0.5625	0.525	0.7	0.505	0.55	0.625	0.55	0.027	0.75	0.525
22	0.125	1	1	0.01	1	0.25	1	0.027	0.5	0.05
23	1	0.05	1	1	0.1	0.25	1	0.027	1	0.05
24	1	1	1	1	0.1	0.25	0.1	0.027	0.5	0.05
-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
152	1	0.05	1	0.01	0.1	0.25	1	0.027	0.5	1
153	1	1	0.4	1	0.1	0.25	1	0.027	1	1

기본 배지인 DMEM에 상기 표 3의 서로 다른 농도로 조합되어 이루어진 유효성분을 포함하여 153개의 무혈청 배지를 제조하고, 각각의 배지로 HEK 293 세포를 96-웰 조직 세포 배양 플레이트에서 배양하여 세포의 생장 정도를 BrdU-결합 분석법을 수행하고, 상기 결과를 D.o.E. 합성 소프트웨어를 이용하여 반응 표면 분석법(response surface method, 이하 'RSM'이라 약칭함)을 응용하여 수행하였다. 반응 표면 분석법은 최적 조건을 모델링하는데 사용되는 통계 방법(Montgomery, D. C., Design and Analysis of Experiments. 4th ed., 1997, 575-610)이다.

구체적으로, RSM의 첫번째 단계로 결과(y)와 독립변수(x)사이의 함수관계를 아래와 같은 방법으로 찾았다.

대부분의 RSM은 일차-서열 모델(first-order model)에서

y = β₀ + β₁x₁ + β₂x₂+ ㆍㆍㆍㆍ + β_kx_k+ ε이고,

이차-서열 모델에서

y = β₀ + ∑β_ix_i + ∑β_ijx_i ² + ㆍㆍㆍㆍ + ∑∑β_ijx_ix_j+ ε으로 이루어지며 이 함수를 이용해 조건(독립변수)들의 최적화를 이루었다.

x_i : 독립 변수로 i= 1, 2, 3, ... , k,

y : 종속 변수,

β_j: 회귀 상수로 j= 0, 1, 2, ... , k,

β_l: 회귀 상수로 l= 0, i, ij, ... , ii 및

ε: 오류항

그 결과, 상기 표 3에서 제시한 10개의 유효 성분과 HEK 293 세포의 증식 사이에는 다음과 같은 함수관계가 있음을 확인하였다.

세포 증식= 0.75128 + 0.07704(X1) + 0.05103(X2) + 0.00117(X3) - 0.03202(X4) + 0.00102(X5) + 0.05137(X6) + 0.00483(X7) - 0.03571(X8) + 0.01091(X9) - 0.06276(X10) + 0.21850(X1)²- 0.32609(X2)²+ 0.25241(X3)²- 0.05809(X4) - 0.51933(X5)²- 0.19359(X6)²- 0.04709(X7)²+ 0.52634(X8) ²+ 0.01891(X9)²+ 0.26378(X10)²- 0.01517(X1 ×X2) - 0.00958(X1 ×X3) + 0.08034(X1 ×X4) + 0.01648(X1 ×X5) + 0.02595(X1 ×X6) + 0.01074(X1 ×X7) - 0.00584(X1 ×X8) - 0.01545(X1 ×X9) - 0.00335(X1 ×X10) - 0.01775(X2 ×X3) - 0.00669(X2 ×X4) - 0.01174(X2 ×X5) - 0.02986(X2 ×X6) - 0.02153(X2 ×X7) + 0.02591(X2 ×X8) + 0.01854(X2 ×X9) - 0.00253(X2 ×X10) + 0.02664(X3 ×X4) - 0.00522(X3 ×X5) - 0.09172(X3 ×X6) - 0.00747(X3 ×X7) - 0.03176(X3 ×X8) - 0.02791(X3 ×X9) + 0.03838(X3 ×X10) + 0.03227(X4 ×X5) + 0.01077(X4 ×X6) + 0.00055(X4 ×X7) - 0.02835(X4 ×X8) + 0.01127(X4 ×X9) + 0.00412(X4 ×X10) - 0.00027(X5 ×X6) - 0.04489(X5 ×X7) - 0.01580(X5 ×X8) + 0.04086(X5 ×X9) + 0.00978(X5 ×X10) - 0.02009(X6 ×X7) - 0.06398(X6 ×X8) + 0.03003(X6 ×X9)+ 0.04017(X6 ×X10) + 0.01224(X7 ×X8) - 0.02353(X7 ×X9) + 0.07175(X7 ×X10) - 0.02651(X8 ×X9)+ 0.02723(X8 ×X10)+ 0.00479(X9 ×X10)

X1 = 페릭클로라이드,

X2 = 제 1형 인슐린양 성장 인자,

X3 = EGF I의 변형 인자,

X4 = 소듐 셀레니트,

X5 = 에탄올아민,

X6 = 글루타치온,

X7 = 퓨트레신,

X8 = 레티노익산,

X9 = 전환 성장 인자 및

X10 = 플루로닉 F68

상기 함수관계를 통해 각 유효 성분 간의 반응 표면을 분석한 결과, 퓨트레신과 레티노익산의 농도를 각각 5 ㎍/㎖과 0.3 μM로 고정시키고 글루타치온과 에탄올아민을 50 내지 200 mg/ℓ와 0.5 내지 5 mM의 농도 범위에서 변화시킬 때, 글루타치온과 에탄올아민간에는 HEK 293 세포의 생장을 촉진하는 상관 관계가 존재하고 두 개의 성분이 일정한 조합으로 첨가될 때 최대 생장 촉진 효과를 나타내는 농도가 존재하였고, 상기 두 성분의 효과는 나머지 다른 성분이 존재하는 농도와는 무관하게 같은 경향을 보여 주었다(도 2a). 따라서, 상기 글루타치온과 에탄올아민은 서로 HEK 293 세포의 생장을 촉진하는 상승 효과를 보인다는 것을 알 수 있다.

또한, HEK 293 세포의 생장을 촉진함을 확인한 글루타치온과 에탄올아민의 농도를 0.5 mg/ℓ와 50 mM로 고정시키고 소듐 셀레니트와 EGF의 변형인자의 농도를 각각 100 내지 5,000 nM과 6.4 내지 16 ng/㎖ 농도 범위에서 변화시킬 때, 소듐 셀레니트는 특정한 두 성분의 농도에서 최대 촉진 효과를 보이는 최적 농도가 존재하지만 EGF의 변형인자의 경우는 나머지 세 성분의 농도와는 뚜렷한 상관관계가 없었다(도 2b).

<2-2> 무혈청 배지 첨가용 유효 성분 최적 농도 확정

상기 실시예 <2-1>에서 유효 성분 상호간의 경향을 관찰한 후, 무혈청 배지 성분으로 유용한 각 성분의 최적 농도를 찾아내고자 표 3의 10개 성분을 각기 다른 농도로 시작 지점으로 잡아 D.o.E. 합성 소프트웨어를 이용하여 최적화 분석을 다시 시행하였다.

그 결과, 1.21330과 3.50437 사이의 오차 범위 내에 존재하는 흡광도 값 2.36을 가져 대조군에 비해 세포 증식이 약 2.3배 증가한 결과를 가지는, 9개의 시작 지점에서 그 최적농도가 일치하고 나머지 한 개의 시작 지점에서 찾은 최적 농도도 그와 유사한 결과를 보이는 최적 첨가물 농도를 찾아내었다(표 4).

무혈청 배지에 첨가될 최적 유효 성분 농도

성분	농도 범위	최적 농도
제 1형 인슐린형 성장인자	5-100 ng/㎖	100 ng/㎖
EGF의 변형 인자	6.4-16 ng/㎖	6.4 ng/㎖
소듐 셀레니트	50-5000 nM	2969 nM
퓨트레신	10-100 ㎍/㎖	61 ㎍/㎖
에탄올아민	0.5-5 mM	0.5 mM
글루타치온	50-200 ㎍/㎖	200 ㎍/㎖
레티노익산	0.15-5.5 μM	5.5 μM
전환 성장 인자	5-10 ng/㎖	8.2 ng/㎖
페릭 클로라이드	125-1,000 μM	342 μM
플루로닉 F68	0.05-1 %	0.79 %

<실시예 3> 최적 유효성분을 포함하는 무혈청 배지의 제조

본 발명자들은 상기 실시예 <2-2>에서 무혈청 배지 첨가용 유효 성분의 농도 범위를 선정한것에 기인하여 D.o.E. 합성 소프트웨어를 이용하여 반복하여 최적화 분석을 하여 최적화된 무혈청 배지를 선정하였다.

D.o.E. 합성 소프트웨어 분석 결과, 시작 지점 9개에서 일치된 값을 보여준 표 4의 조성과 함께 각각 시작 지점 1개, 6개, 3개 및 1개에서 일치된 값을 보여준 유효 성분을 DMEM 배지에 첨가하여 무혈청 배지를 제조하고, 이를 'MBRI 40-40-01', 'MBRI 40-40-02', 'MBRI 40-40-03', 'MBRI 40-40-04 '및 'MBRI 40-40-05'로 명명하였다(표 5).

무혈청 배지 첨가물의 조성

성분	MBRI 40-40-01	MBRI 40-40-02	MBRI 40-40-03	MBRI 40-40-04	MBRI 40-40-01
페릭 클로라이드(μM)	342	410	1000	1000	125
제 1형 인슐린형 성장인자(ng/㎖)	100	100	56	54	59
EGF의 변형 인자(ng/㎖)	6.4	6.4	6.4	16	6.4
소듐 셀레니트(nM)	2969	3.25	3955	4993	428
에탄올아민(mM)	0.5	0.5	3	3	2.9
글루타치온(㎍/㎖)	200	200	173	138	159
퓨트레신(㎍/㎖)	61	57	10	10	10
레티노익산(μM)	5.5	0.15	0.15	0.15	0.15
전환 성장 인자(ng/㎖)	8.2	9.9	10	10	10
플루로닉 F68(%)	0.79	0.84	0.05	0.05	0.05
최적 흡광도 결과(O.D)	2.36	2.15	2.44	2.34	2.30

<실시예 3> 무혈청 배지 첨가물을 이용한 세포 증식 분석

<3-1> 무혈청 배지 첨가물을 이용한 세포 증식의 비교

본 발명자들은 무혈청 배지 첨가물이 세포 증식에 미치는 영향을 분석하기 위해 96-웰 조직 세포 배양 플레이트에서 상기 표 5의 무혈청 배지를 이용하여 HEK 293 세포를 흡착 배양 및 부유 배양한 뒤, BrdU-결합 분석을 하여 각 조성에 따른 세포 증식 효과를 분석하였다.

그 결과, 표 5의 무혈청 배지를 이용하여 흡착 배양한 경우 첨가물이 포함되지 않은 DMEM 배지에서 배양한 대조군에 비해 뚜렷한 증식 촉진 효과가 있었으며, DMEM 배지에 2% FBS 또는 5% FBS을 첨가하여 배양한 비교군에 비해서도 손색이 없는 증식 효과를 보여 주었으며, MBRI 40-40-01 배지에서 배양한 실험군이 가장 높은 증식 효과를 보여 주었다(도 3a). 또한, 표 5의 무혈청 배지를 이용하여 부유 배양한 경우 첨가물이 포함되지 않은 DMEM 배지에서 배양한 대조군에 비해 뚜렷한 증식 촉진 효과가 있었으며, HEK 293 세포 배양용 상용화 배지인 293 SFMⅡ에서 배양한 비교군에 비해서도 손색이 없는 증식 효과를 보여 주었으며, MBRI 40-40-01 배지로 배양한 실험군이 가장 높은 증식 효과를 보여 주었다(도 3b)

따라서, 본 발명에서 제조한 무혈청 배지는 세포의 증식 효과를 높여주며, 그중에서 MBRI 40-40-01 배지가 가장 효과가 뛰어남을 알 수 있다.

<3-2> 무혈청 배지 MBRI 40-40-01을 이용하여 96-웰 조직세포 배양 플레이트에서 배양한 세포의 증식 비교

상기 실시예 <3-1>에서 확인한 세포 증식 효과를 더욱 확실히 확인하기 위해 293 SFM Ⅱ 배지로 부유 배양한 HEK 293 세포와 5% FBS을 첨가한 DMEM 배지에서 세포 배양용 플라스크에 부착하여 배양하던 HEK 293 세포를 96-웰 조직세포 배양 플레이트에서 MBRI 40-40-01 배지에서 24시간 배양한뒤 BrdU결합 분석을 이용하여 HEK 293 세포의 증식 정도를 조사하였다.

그 결과, 부착 배양에 적응된 세포를 MBRI 40-40-01 배지에 배양한 실험군의 경우 무혈청 DMEM에 배양한 대조군에 비해 세포의 증식이 약 42.7% 더 증가하였으며(도 4a), 부유 배양에 적응된 세포를 MBRI 40-40-01 배지에 배양한 실험군의 경우 무혈청 DMEM에 배양한 대조군에 비해 세포의 증식이 약 47.9% 더 증가하고, 293 SFM Ⅱ에 배양한 비교대조군과는 동등한 정도의 증식 효과를 보여 주었다(도 4b).

<3-3> 무혈청 배지 MBRI 40-40-01을 이용하여 6-웰 조직세포 배양 플레이트에서 배양한 세포의 증식 비교

상기 실시예 <3-2>의 결과를 바탕으로 좀 더 배양 규모가 큰 6-웰 조직 세포 배양용 플레이트를 이용하여, 293 SFM Ⅱ 배지로 부유 배양한 HEK 293 세포와 5% FBS을 첨가한 DMEM 배지에서 세포 배양용 플라스크에 부착하여 배양하던 HEK 293 세포를 MBRI 40-40-01 배지로 초기 세포 농도를 3 ×10⁵ 세포수/㎖로 하는 회분식 배양을 5번 이상 연속적으로 반복 실시해, BrdU결합 분석을 이용하여 HEK 293 세포의 증식 정도를 조사하였다.

그 결과, 흡착 배양한 세포를 MBRI 40-40-01 배지로 연속 배양한 세포는 평균 최고 농도 8 ×10⁵ 세포수/㎖을 유지하며 반복적으로 잘 증식하였고(도 5a), 부유 배양한 세포를 MBRI 40-40-01 배지로 연속 배양한 세포는 평균 최고 농도 10 ×10⁵ 세포수/㎖을 유지하며 반복적으로 잘 증식하였으며(도 5b), 상기 각각은 대조군이 무혈청 배지에 비해 뚜렷이 향상된 결과를 보여 주었다.

또한, MBRI 40-40-01 배지에서 배양한 세포의 증식을 상용화 배지인 HyQ PF293(Hyclone, SH30356.01), 293 SFM Ⅱ(Life Technologies, 11686-011), Pro293S(Bio whittaker, 12-765Q), Ex-cell 520(JRH, 14520-78P)를 사용하여 배양한 세포의 증식과 비교하였다.

그 결과, MBRI 40-40-01 배지에서 배양한 세포는 3 내지 8 ×10⁵ 세포수/㎖ 까지 반복적으로 잘 증식한데 반해 상용화 배지 Ex-cell 520(도 6a)을 제외한 나머지 상용화 배지 Pro293S(도 6b), 293 SFM Ⅱ(도 6c), HyQ PF293(도 6d)에서는 세포가 제대로 증식하지 못하였다. 또한, MBRI 40-40-01 배지에서 배양한 세포는 처음부터 제대로 증식하는 것에 비해 Ex-cell 520 배지에서 배양한 경우 약 13일이 지나서 세포가 배지에 적응하였고(도 6a), 293 SFM Ⅱ 배지에서 배양한 경우는 약 40 내지 50일이 지나서 세포가 배지에 적응하는 결과를 보였다(도 6c).

<3-4> 무혈청 배지 MBRI 40-40-01을 이용하여 125 ㎖ 엘렌메이어 플라스크에서배양한 세포의 증식 비교

상기 실험예 <3-3>의 결과를 바탕으로 배양 규모를 더 크게하였을때의 본 발명의 무혈청 배지가 세포 배양에 적합한지 알아보기 위해 5% FBS을 첨가한 DMEM 배지에서 부착식으로 배양하던 세포를 MBRI 40-40-01 배지를 이용하여 125 ㎖ 엘렌메이어 플라스크(Erlenmeyer flask)에서 부착 배양하여 세포의 증식을 비교하였다. 이때, 무혈청 DMEM 배지를 대조군으로 하고, 2% FBS을 포함하는 DMEM 배지를 비교군으로 하여 세포 증식을 비교하였다.

그 결과, HEK 293 세포는 무혈청 DMEM 배지에서는 전혀 자라지 못하는 데 비해 MBRI 40-40-01 배지에서는 비교군인 2% FBS을 첨가한 DMEM 배지에서와 유사하게 접종 3일만에 6 ×10⁵ 세포수/㎖까지 증식하였다(도 7a).

또한, 상용 배지인 293 SFM Ⅱ 배지에서 부유 배양하던 세포를 초기 세포 농도 3 ×10⁵ 세포수/㎖로 MBRI 40-40-01 배지를 이용하여 125 ㎖ 엘렌메이어 플라스크(Erlenmeyer flask)에서 부유 배양을 실시하여 세포의 증식을 비교하였다. 이 때 무혈청 DMEM 배지를 대조군으로 하고 2% FBS을 첨가한 DMEM 배지를 비교군으로 하여 세포의 증식을 비교하였다.

그 결과, 무혈청 DMEM 배지에서 배양한 세포는 거의 생장을 못한데 반해 MBRI 40-40-01 배지에서 배양한 세포는 최고 세포 농도 8 ×10⁵ 세포수/㎖로 5 회 이상의 회분 배양이 가능하였다(도 7b).

<실시예 4> 무혈청 배지 첨가물을 이용한 세포 배양시 바이러스 생산 분석

본 발명자들은 혈청 배지를 사용한 배양과 비교하여 무혈청 배지를 사용하여 배양한 세포가 바이러스를 생산하는데 어떤 차이가 있는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, 무혈청 배지를 사용하여 배양한 HEK 293 세포를 초기 농도 3 ×10⁵ 세포수/㎖로 MBRI 40-40-01 배지에 접종하여 3일간 배양하여 7 ×10⁵ 세포수/㎖까지 3 차례 반복 배양이 가능함을 확인한뒤, 세포 초기 농도를 다시 3 ×10⁵ 세포수/㎖로 맞추어 4번째 반복 배양을 시작하여, 세포가 다시 6 ×10⁵ 세포수/㎖로 증식하였을 때, 아데노바이러스(American Type Culture Collection VR-5)를 M.O.I 10으로 감염시켰다. 대조군으로 2% FBS을 포함하는 DMEM/F12 배양배지에서 배양하여 9.43 ×10⁵ 세포수/㎖로 증식하였을 때, 아데노바이러스를 M.O.I 10으로 감염시켰다. 상기 아데노바이러스 감염후 한시간뒤 세포를 수득하여 원심 분리한 뒤 새로운 배지로 교환하여 이틀간 배양하였다. 감염한지 40 시간 후 세포의 배양을 종료하고 세포 배양액을 원심분리하여 세포를 수획하였다. 상기 수득한 세포의 일부를 이용해 3차례 반복하여 동결, 해동시키는 과정을 수행 한 후, 플락 분석을 수행하여 상기 세포로부터 생산된 아데노 바이러스의 양을 정량하였다.

그 결과, MBRI 40-40-01 배지에서 배양한 HEK 293 세포가 생산한 바이러스의 양은 8.3 ×10⁹ PFU/㎖로 혈청을 함유하는 배지에서 배양한 세포가 생산한 바이러스의 양 5.2 ×10⁸ PFU/㎖에 비해 많은 양의 바이러스를 생산하였다(표 6). 따라서, 본 발명의 MBRI 40-40-01 배지는 바이러스 생산용 배지로도 유용함을 알 수 있었다.

MBRI 40-40-01 배지를 사용하는 무혈청 부유 배양시 아데노 바이러스의 생산량

생산 조건	혈청 배양	무혈청 배양
배지	2% FBS ＋ DMEM/F12	MBRI 40-40-01
세포	HEK 293	HEK 293
배양기	스피너 플라스크	엘렌메이어 플라스크
회전 속도(rpm)	70	30
감염시 세포 농도(세포수/㎖)	9.43 ×10⁵	6 ×10⁵
배양 부피(㎖)	900	40
40 시간후 바이러스 생산량(PFU/㎖)	5.2 ×10⁸	8.3 ×10⁹

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 무혈청 배양용 배지는 세포의 증식 뿐만 아니라 바이러스 생산성도 높아 재조합 의약품을 생산하기 위한 숙주 세포 배양에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 소듐 셀레니트(sodium selenite)(a) 및 표피성장인자(hEGF)(b)의 농도에 따른 세포 생장 촉진 효과를 흡광도로 나타낸 그래프로 두차례 반복 실험의 평균치와 표준편차를 나타낸 것이고,

도 2는 퓨트레신(putrescine)과 레티노익산(retinoic acid)의 농도를 각각 5 ㎍/㎖과 0.3 μM로 고정시키고 글루타치온(glutathione)과 에탄올 아민(ethanol amine)의 농도를 각각 50 내지 200 ㎎/ℓ와 0.5 내지 5 mM의 범위에서 변화시킬때(a) 및 글루타치온과 에탄올 아민의 농도를 각각 0.5 ㎎/ℓ와 50 mM로 고정시키고 소듐 셀레니트와 변형표피성장인자(long EGF)의 농도를 각각 100 내지 5000 nM과 6.4 내지 16 ng/㎖의 범위에서 변화시킬때(b)의 세포 증식 반응 표면을 나타낸 D.o.E 합성 그래프이고,

도 3은 각종 시험 배지를 이용하여 HEK 293 세포를 흡착 배양(a) 또는 부유 배양(b)하여 BrdU-결합 분석법을 수행해 세포 증식 효과를 나타낸 그래프이고,

도 4는 DMEM 배지에 첨가물 MBRI 40-40-01을 사용하여 HEK 293 세포를 흡착 배양(a) 또는 부유 배양(b)하여 BrdU-결합 분석법을 수행해 세포 증식 효과를 나타낸 그래프이고,

도 5는 DMEM 배지에 첨가물 MBRI 40-40-01을 사용하여 HEK 293 세포를 회분식 흡착 배양(a) 또는 회분식 부유 배양(b)하여 BrdU-결합 분석법을 수행해 세포 증식 효과를 나타낸 그래프이고,

도 6은 DMEM 배지에 첨가물 MBRI 40-40-01을 사용하여 배양한 HEK 293 세포의 세포 증식을 상용세포 배양 배지인 Ex-cell 520 배지(a), Pro293S 배지(b), 293 SFMⅡ 배지(c) 또는 HyQ-PF293 배지(d)를 사용하여 배양한 HEK 293 세포의 세포 증식과 비교하여 나타낸 그래프이고,

도 7은 125 ㎖ 엘렌메이어 플라스크에 DMEM 배지에 첨가물 MBRI 40-40-01을 사용하여 HEK 293 세포를 부착 배양(a) 또는 회분식 부유 배양(b)하여 혈청 함유 배지, 상용 배지 또는 무혈청 배지에서 배양한 세포의 증식과 비교한 그래프이다.

Claims

인슐린형 성장인자 Ⅰ, 변형 표피성장인자, 소듐 셀레니트, 퓨트레신, 에탈올아민, 글루타치온, 레티노익산, 전환성장인자 β1, 페릭 클로라이드 및 플루로닉 F68으로 구성된 배지성분을 포함하는, 재조합 단백질 의약품 또는 재조합 바이러스 의약품을 생산하는, 인체 외부에서 확립된 신장 세포주의 배양용 무혈청 배지.
제 1항에 있어서, 상기 인체 외부에서 확립된 신장 세포주는 HEK 293 세포(Human Embryonic Kidney 293 cell)인 것을 특징으로 하는 배지.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 인슐린형 성장인자 Ⅰ은 5 내지 100 ng/㎖, 변형 표피성장인자는 6.4 내지 16 ng/㎖, 소듐 셀레니트는 50 내지 5000 nM, 퓨트레신은 10 내지 100 ㎍/㎖, 에탄올아민은 0.5 내지 5 mM, 글루타치온은 50 내지 200 ㎎/ℓ, 레티노익산은 0.15 내지 5.5 μM, 전환 성장 인자 β1은 5 내지 10 ng/㎖, 페릭 클로라이드는 125 내지 1000 μM, 플루로닉 F68은 0.05 내지 1 중량%인 것을 특징으로 하는 배지.
제 4항에 있어서, 인슐린형 성장인자 Ⅰ은 100 ng/㎖, 변형 표피성장인자는 6.4 ng/㎖, 소듐 셀레니트는 2969 nM, 퓨트레신은 61 ㎍/㎖, 에탄올아민은 0.5 mM, 글루타치온은 200 ㎎/ℓ, 레티노익산은 5.5 μM, 전환 성장 인자 β1은 8.2 ng/㎖, 페릭 클로라이드는 342 μM, 플루로닉 F68은 0.79 중량%인 것을 특징으로 하는 배지.