KR20020022458A

KR20020022458A - 수정란의 체외배양법

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Publication number: KR20020022458A
Application number: KR1020000055241A
Authority: KR
Inventors: 이철상; 이경광; 구덕본; 방남수; 신상태; 유대열
Original assignee: 복성해; 한국생명공학연구원
Priority date: 2000-09-20
Filing date: 2000-09-20
Publication date: 2002-03-27

Abstract

본 발명은 수정란의 체외배양법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 일반적으로 체외에서는 8 ∼ 16 세포기 이상으로는 발달하지 않는 산양의 1 ∼ 2 세포기 수정란을 글루타티온(glutathione) 항산화제를 첨가한 배지에서 6일간 체외배양함으로써 90%이상의 초기 수정란을 체내에서 발달시켰을 때와 유사한 발생능력을 가지는 양질의 배반포기배로 정상 발달시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.

따라서 소태아혈청이 포함된 기본 배지(mSOF)에 글루타티온(glutathione)을 첨가하여 수정란을 체외배양하는 방법은 체내에서의 수정란 발달과 유사한 배발생능력을 제공하며, 기존의 수정란 배양방법인 공동배양법보다 매우 간편할 뿐만 아니라, 그 효율도 뛰어난 수정란 체외배양방법을 제공하고 있다.

Description

수정란의 체외배양법{in vitro cultivation method of fertilized egg}

본 발명은 수정란의 체외배양법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 일반적으로 체외에서는 8 ∼ 16세포기 이상으로는 발달하지 않는 산양의 1 ∼ 2 세포기 수정란을 GSH 항산화제를 첨가한 배지에서 6일간 체외배양함으로써, 90%이상의 초기 수정란을 체내에서 발달시켰을 때와 유사한 발생능력을 가지는 양질의 배반포기배로 정상발달시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.

가축의 수정란을 체외에서 배양할 수 있다는 것은 가축의 증식 및 개량에 있어서 매우 유용한 기술이 된다. 특히 최근 동물 형질전환기술 및 복제동물 생산 기술의 유용성이 전세계적으로 인정되면서 가축의 수정란을 체외에서 조작하는 것이 필수적인 과정이 되었다. 상기 체외조작은 체외배양을 전제로 하여 이루어지는 과정이기에, 보다 간편하고 안정적인 체외배양기법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 이들 가축 중에서도 산양은 유용한 단백질성 의약품을 대량 생산하는 형질전환 동물 생체반응기로서 널리 활용되고 있으며, 앞으로 그 유용성은 더욱 확대될 것이므로, 산양 수정란을 효율적이고 간편하게 배양할 수 있는 체외배양방법을 개발한다는 것은 매우 중요한 기술적 진보를 이루는 것이 될 것이다.

그러나 산양을 포함하는 가축의 수정란은 체외에서 배양했을 때, 배의 발생이 8 ∼ 16 세포기에서 중지되어 결국 사멸하는 체외발생정지현상(In vitro developmental block)이 있다[Wright 와 Bondioli, Journal of Animal Science 53, 702-729. (1981)]. 따라서, 이러한 현상을 극복하고 착상 전단계인 배반포기배(blastocyst)로 발달시키기 위한 여러 연구가 있었으며 그 결과, 현재까지 가장 일반적으로 널리 이용되고 있는 방법은 난관상피세포와 함께 공동 배양하는 방법이다 [Sakkas 등, Journal of Reproduction and Fertilization 87, 359-365. (1989)]. 그러나 상기 방법은 난관 적출물에서 분리한 난관상피세포를 별도로 분리ㆍ준비해야 하는 불편함이 있을 뿐만 아니라, 상기 준비과정에서의 오염문제가 크게 우려되고 있다. 또한, 다수의 상피세포를 공동 배양해야 하는 이유로 상피세포들의 대사산물에 의한 독성효과를 없애기 위해 배지를 최소 이틀에 한 번씩은 교체해 주어야 하는 불편함도 따른다. 더욱이 공동배양을 통해 발달시킨 배반포기배의 상태도 체내발달한 배반포기배에 비해 현저히 불량함이 배반포기배의 세포수 검사를 통하여 확인되었다[Sakkas 등, Journal of Reproduction and Fertilization 87, 359-365. (1989)].

이에, 본 발명자들은 상기 공동배양에 의한 문제점을 해결하기 위하여 산양 초기 수정란을 상피세포 등과 공동배양을 하지 않고 기존의 기본 배지[modified synthetic oviduct fluod, 이하 'mSOF'라 칭함, Takahashi와 First, Theriogenology 37, 963-978. (1992)]에 항산화제로 알려져 있는 펩타이드 성분인 GSH(1 mM)을 첨가함으로써, 체외에서 90% 이상의 수정란을 착상 전 배반포기배까지 발생시킬 수 있었을 뿐만 아니라, 이들 배반포기배는 그 세포수가 체내발달시킨 배반포기배의 세포수와 유사한 양호한 발달상태를 보여 주었다. 또한, 이들을 이식하여 정상적인 임신 및 분만을 보여줌으로써, 체외 및 체내에서의 정상적인 배발생을 유도할 수 있는 산양 수정란의 간편한 체외배양 방법과 배양액을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 산양의 초기 수정란을 체외에서 정상적인 배반포시배로 발달시킬 수 있는 간편하고 효율적인 방법을 제공하여 산양 수정란의 체외조작을 통한 형질전환 및 체세포 복제동물의 생산에 활용하는 것이다.

도 1a는 산양의 초기수정란을 글루타티온(이하 "GSH"라 칭함)을 첨가한 배지에서 6일간 배양하여 배반포기배로 발달한 상태를 실제 현미경(40배)으로 관찰한 것이다.

도 1b는 도 1a에서 화살표로 표시한 배반포의 세포수를 관찰한 사진이다.

본 발명은 기본배지(mSOF)에 글루타티온(GSH)을 첨가하여 체외에서 초기수정란을 배반포기배로 배양하는 수정란 체외배양법을 그 특징으로 한다.

이와 같이 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 1 ∼ 2세포기의 산양 초기수정란을 착상 전단계인 배반포기배까지 배양할 수 있는 간편하고 효율적인 방법에 관한 것이다.

일반적으로 산양 초기 수정란을 혈청이나 혈청알부민이 포함된 기본배지(mSOF)에서 배양하면 대부분 배반포기배로 발달하지 않고 8 ∼ 16세포기에 발달을 중단하는 체외발달정지현상을 보인다. 그러나 본 발명에서는 배양액에 항산화제의 일종인 GSH를 첨가한 결과, 90%이상의 수정란이 이를 극복하고 착상 전단계인 배반포기배로 정상 발달하는 결과를 보인다. 이는 기존에 주로 이용되고 있는 난관상피세포 공동배양방법의 발달 결과(60%)보다 뛰어날 뿐만 아니라, 그 세포수도 평균 185개로써 공동배양법으로 얻은 배반포기배의 세포수(127개)보다 현저히 많았다. 더욱이 GSH처리 하에서 발달한 배반포기배를 대리모에 이식하였을 때, 67%의 대리모에서 정상적인 임신과 분만을 통하여 정상적인 산자가 태어났다.

따라서 소태아혈청이 포함된 기본 배지(mSOF)에 GSH를 첨가하여 수정란을 체외배양하는 방법은 체내에서의 수정란 발달과 유사한 배발생능력을 제공한다. 결국 이러한 방법은 기존의 수정란 배양방법인 공동배양법보다 매우 간편할 뿐만아니라, 그 효율도 뛰어난 수정란 체외배양법을 제공하고 있다.

이하, 이와 같은 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 다음 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: GSH의 처리에 따른 배발달상태 비교

1. 산양 수정란의 회수

먼저 발정동기화 및 과배란 유기를 위하여 프로게스테론 합성제재인 노르세스토멧(norgestomet) 6 mg이 함유되어 있는 이어-임플란트(ear-implant)를 산양 귀의 피하에 주입하였으며, 이어-임플란트를 제거하기 60 시간 전부터 12 시간 간격으로 4 일간 0.7 mg의 FSH를 투여하였다. 또한, 이어-임플란트를 제거 후 24 시간째 hCG 100 IU를 투여함과 동시에 4 시간 간격으로 4 회 이상 자연교배를 유도하였다. 전핵기단계의 수정란은 이어-임플란트를 제거 후 62 ∼ 70 시간 사이에 외과적 수술을 실시한 다음 난관 관류를 통해 회수하였다.

2. 체외배양용 배지의 준비 및 배양 조건

산양의 수정란의 체외배양을 위하여 기본 배양액으로 mSOF(modified synthetic oviduct fluid)용액을 사용하였다. 이때, 배양조건은 38.5℃, 5% CO₂를포함한 습한 공기 상태로 유지하였다.

3. 초기 수정란의 체외 배양시 GSH의 처리 효과

산양 초기 수정란을 0.4%의 소혈청알부민(bovine serum albumin, 이하 BSA, 시그마사 A6003) 또는 10%의 소태아혈청(fetal bovine serum, 이하 FBS, 깁코비알엘사 26140-079)이 든 mSOF 기본 배양액에서 6일간 배양하였을 때, 대부분이 수정란은 기존에 알려진 8 ∼ 16 세포기 체외발달정지현상에 의해 배 발생을 중지하고 이후 사멸되었으나, 이 배지에 GSH를 첨가하여 6일간 배양하였을 때는 소혈청알부민 또는 혈청이 든 배지에서 상당한 비율의 초기 수정란이 체외발달정지현상을 극복하고 상실배기 이상으로 발달하였으며, 특히 10% 혈청이 든 배지에서 이러한 현상은 더욱 현저하여, 모든 초기 수정란이 체외발달정지현상을 극복하였을 뿐만 아니라, 이들 중 80%가 배반포기배로 발달하였다.

실시예 2: 배지에 첨가된 단백질의 함량이나 종류에 따른 GSH의 처리 효과

상기 실시예 1에서 GSH의 처리효과는 mSOF 기본배지에 포함되는 단백질, 즉 혈청알부민 또는 혈청에 따라 차이를 보이고 있었기에, 최적의 배양 조건을 확립하고자 기본배지에 포함되는 혈청알부민 또는 혈청의 함량이나 종류를 달리하면서 GSH의 처리효과를 비교하였으며, 더불어 지금까지 산양 수정란의 체외배양을 위해 널리 이용되고 있는 방법인 난관상피세포와의 공동배양방법과 그 결과를 비교하였다.

1. 산양 난관상피세포의 준비와 공동배양

산양의 난관상피세포는 전핵기 수정란과 동시에 난관 관류를 통해 회수하였다. 이렇게 회수된 세포는 10% FBS가 함유된 PBS용액(인산완충용액)으로 2 ∼ 3 회 세척한 후, 실온에서 15 분간 정치하였다. 상층액을 제거한 후 신선용액으로 세포를 부유하여 4-웰 배양 플레이트에 첨가한 다음, CO₂배양기에서 24 시간 배양하였다. 수정란과의 공동배양을 위하여 10% FBS가 함유된 mSOF 용액으로 교체하여 배양을 실시하였다.

2. 혈청알부민 또는 혈청의 함량이나 종류에 따른 GSH의 처리 효과

GSH처리 하에서 기본배지에 첨가하는 혈청알부민 또는 혈청의 함량이나 종류에 따른 수정란의 체외발달 성적을 비교하였다. 혈청알부민 또는 혈청을 첨가하지 않고 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol, PVA)을 1 mg/ml 농도로 첨가한 대조구에서는 전혀 배발생이 이루어지지 않았으며, 소혈청알부민을 0.4%에서 3.2%까지 첨가하였을 때는 함량에 따른 유의할 만한 차이가 없이 42 ∼ 64 %가 배반포기 배로 발달하였으며, 산양혈청(goat serum, GS)을 10% 첨가하였을 때는 21%의 수정란만이 배반포기로 발달하였다. 반면, 소태아혈청을 10% 첨가한 실험군에서는 91%의 수정란이 배반포기 배로 발달하는 월등한 결과를 보였다. 더욱이 상기 발달 결과는 지금까지 일반적으로 사용되고 있는 공동배양의 발달율(60%)보다도 현저히 좋은 결과였다.

실시예 3: GSH의 처리 하에서 발달한 배반포기 배의 발생상태

GSH의 처리 하에서 발달한 배반포기 배의 세포 수를 조사하여 난관상피세포와의 공동배양 또는 체내에서 발달한 배반포기 배의 세포 수와 비교함으로써, GSH의 처리 하에서 발달한 배반포기 배의 발생상태를 평가하였다.

1. 체내에서 발달한 배반포기 배의 회수

배반포기 배의 회수를 위해 전핵기 수정란의 회수와 동일한 방법으로 발정동기화와 과배란 유기 및 자연교배를 유도하였다. 배반포 단계의 수정란은 이어-임플란트를 제거 후 8.5 일째 외과적 수술을 실시한 다음 자궁 관류를 통해 회수하였다.

2. 형광 염색법을 이용한 세포 수 조사

배반포기 배의 총 세포수를 조사하기 위하여 먼저 1% 포르말린(formalin) 용액에서 10 분간 고정한 후, 2.5 mg/㎖의 소디움 아지드(sodium azide)와 2.5 ㎍/㎖의 Hoechst 33342가 함유된 글리세롤:PBS(3:1) 용액으로 염색하였다. 형광현미경 하에서 세포 수를 관찰하였다.

3. 배반포기 배의 세포 수 비교

상기 실시예 2에서 체외 발달한 배반포기배의 세포수를 조사하였을 때, 혈청알부민이나 산양혈청이 든 배지에 GSH를 첨가한 조건에서 발달한 배반포기배의 세포수는 108개에서 124개 정도로 공동배양한 배반포기배의 세포수(127개)와 유사하였으나, 소태아혈청하에서 GSH를 처리하였을 때의 세포수는 185개로 공동배양 조건보다 현저히 많은 세포수를 나타내었으며, 더욱이 상기와 같은 세포수는 체내 정상 발달한 배반포기배의 세포수(191개)와 차이가 없었다. 이는 소태아혈청 하에서 GSH를 처리하는 체외배양 조건은 기존의 공동배양 조건보다도 질적으로 양호하며, 체내에서 발달하는 수정란과 유사한 수준의 배반포기 배를 생산할 수 있음을 보여 주고 있다.

실시예 4: 체외발달한 배반포기배의 발생능력

상기 실시예 1, 2, 3을 통하여 산양 수정란은 소태아혈청이 포함된 mSOF 배지 하에서 GSH의 처리에 의해 체내 발달한 배반포기배와 유사한 세포수의 배반포기배로 발달함을 보여 주었다. 본 실시예에서는 이들 배반포기배를 대리모의 자궁에 이식하였을 때, 정상적인 산자로 태어날 수 있는가를 조사함으로써 체외발달한 배반포기배의 발생능력을 최종 평가하였다.

1. 대리모의 준비와 수정란 이식

대리모는 정관수술을 실시한 수컷 산양을 이용하여 자연발정이 관찰된 암컷 산양을 선별하여 이용하였다. 체외에서 배반포 단계까지 배양한 후 정상적인수정란을 선별하여 외과적 이식 방법으로 자궁에 이식하였다.

2. 체외배반포기배의 임신과 분만

GSH의 처리 하에서 체외 발달한 배반포기배 12개를 6마리의 대리모 자궁에 마리당 2개씩 이식한 후 45일째에 초음파 임신 진단을 하였을 때, 이들 중 4마리에서 임신을 확인하였으며, 이들이 모두 정상적인 6마리의 산자를 생산하였다.

실시예 5: GSH의 처리시기별 산양 초기수정란의 체외발달

산양 초기 수정란의 체외 배발생을 유도한 GSH의 작용이 배발생과정 중의 어느 시기에 직접적인 작용을 하였는지를 확인하기 위하여 초기 수정란을 소태아혈청이 든 mSOF 기본배지에서 배양하면서 GSH의 처리시기를 하루 간격으로 달리하면서 단 하루만 처리하였다. 다음 표 6에서 보는 바와 같이, GSH를 체외배양 3일째에 처리하였을 때에는 단 하루 처리했음에도 불구하고 다른 처리구에 비해 현저히 높은 비율(77%)의 수정란이 배반포기배로 발달하였다. 배양 3일째의 수정란은 대개 8 ∼ 16세포기에 해당하는 시기로서, 체외배발생정지현상이 나타나는 시기에해당한다. 그리고 배양 1, 2일째 혹은 4, 5일째 처리하였을 때는 배반포기배로의 발달 성적이 배양 3일째에 처리한 성적에 비해 현저히 낮은 것으로 보아, 결국 GSH가 산양 수정란의 체외배발생을 가능하게 한 것은 수정란의 체외배양 시 나타나는 체외배발생정지현상을 극복하게 해 주기 때문인 것으로 확인할 수 있었다.

상기 설명한 바와 같이, 본 발명은 산양의 초기 수정란을 체외에서 배양할 때 GSH를 처리함으로써 이식가능한 배반포기배로 발달시킬 수 있는 간편한 배양방법이다. 또한, 본 발명은 지금까지 주로 이용하고 있는 체세포와의 공동 배양법보다도 뛰어난 결과를 보여 주며, 체내에서 발달한 배반포기배와 비교해도 질적인 차이를 전혀 보이지 않는다.

따라서, 본 발명은 수정란의 체외배양과정을 필수적으로 요구하는 형질전환동물 및 복제동물의 생산효율을 극대화시킬 수 있다.

Claims

수정란 체외배양법에 있어서, 기본배지(mSOF)에 글루타티온(GSH)을 첨가하여 체외에서 초기 수정란을 배반포기배로 배양하는 것을 특징으로 하는 수정란 체외배양법.
제 1 항에 있어서, 상기 수정란은 체외배발생정지현상을 보이는 포유동물의 수정란인 것을 특징으로 하는 수정란 체외배양법.
제 2 항에 있어서, 상기 포유동물의 수정란은 산양의 수정란인 것을 특징으로 하는 수정란 체외배양법.
제 1 항에 있어서, 상기 기본배지(mSOF)에는 소태아혈청 및 혈청알부민 중에서 선택된 단백질 성분이 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 수정란 체외배양법.