JPH01157376A - 高等植物由来のプロトプラストの培養培地及びその培養法 - Google Patents
高等植物由来のプロトプラストの培養培地及びその培養法Info
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- JPH01157376A JPH01157376A JP62312097A JP31209787A JPH01157376A JP H01157376 A JPH01157376 A JP H01157376A JP 62312097 A JP62312097 A JP 62312097A JP 31209787 A JP31209787 A JP 31209787A JP H01157376 A JPH01157376 A JP H01157376A
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野］
本発明は、高等植物由来のプロトプラストの培養培地及
び該プロトプラストの培養法に関するもので、本発明は
プロトプラストから細胞、カルス及び植物体の再生等に
応用される。
び該プロトプラストの培養法に関するもので、本発明は
プロトプラストから細胞、カルス及び植物体の再生等に
応用される。
又、本発明はプロトプラスト系を用いた細胞融合もしく
は遺伝子組替え等のバイオテクノロジーを応用した新品
種の開発にも利用され得る。
は遺伝子組替え等のバイオテクノロジーを応用した新品
種の開発にも利用され得る。
高等植物由来のプロトプラストの培養培地としては、通
常植物の組織培養に使用される培地（加用、駒嶺編・植
物細胞組織培養、理工学社、１９７９年）に、浸透圧調
節剤として糖もしくは糖アルコール、又窒素源として無
機のアンモニウム塩、硝酸塩、その他アミノ酸を添加し
た培養培地が知られている。
常植物の組織培養に使用される培地（加用、駒嶺編・植
物細胞組織培養、理工学社、１９７９年）に、浸透圧調
節剤として糖もしくは糖アルコール、又窒素源として無
機のアンモニウム塩、硝酸塩、その他アミノ酸を添加し
た培養培地が知られている。
（発明が解決しようとする問題点〕
上記した培養培地で培養すると、プロトプラストは分裂
増殖してカルスとなり、一部の植物に於いては植物体が
再分化する。
増殖してカルスとなり、一部の植物に於いては植物体が
再分化する。
しかしながらプロトプラスト化されると、何れの植物に
於いても細胞のもつ生物活性は著しく減少する。
於いても細胞のもつ生物活性は著しく減少する。
プロトプラストが破壊もしくは死滅したり、又は細胞壁
の生合成能を消失したり、例え細胞壁を合成しても細胞
が分裂しない等の障害が起こる。
の生合成能を消失したり、例え細胞壁を合成しても細胞
が分裂しない等の障害が起こる。
ナス科等の最も生物活性の高い植物、例えばタバコ、ペ
チュニア等に於いても、単離されたプロトプラストの２
〜３割しか分裂増殖能を示さず、残りのほとんどの細胞
は、プロトプラスト化する過程で分裂能が消失する。他
の植物種に於いては障害を受けたプロトプラストが全く
分裂しないか、分裂す”る場合に於いても最適条件下で
数パーセント（２〜３％程度）しか分裂増殖能を示さな
い。
チュニア等に於いても、単離されたプロトプラストの２
〜３割しか分裂増殖能を示さず、残りのほとんどの細胞
は、プロトプラスト化する過程で分裂能が消失する。他
の植物種に於いては障害を受けたプロトプラストが全く
分裂しないか、分裂す”る場合に於いても最適条件下で
数パーセント（２〜３％程度）しか分裂増殖能を示さな
い。
そこでプロトプラスト系を高等植物のバイオテクノロジ
ーに利用するに当って゛は、°〜その基本技術としてプ
ロトプラスト障害要因の解明とその対策が当業界に於い
て強く望まれている。
ーに利用するに当って゛は、°〜その基本技術としてプ
ロトプラスト障害要因の解明とその対策が当業界に於い
て強く望まれている。
そこで本発明者等は、プロトプラストの培養培地に細胞
膜を修復する能力を存する酵素を添加した培地で培養す
れば、プロトプラストの生物活性を向上させることがで
きることを知り、この新知見に基すいて鋭意研究を重ね
た結果、本発明を完するに到った。
膜を修復する能力を存する酵素を添加した培地で培養す
れば、プロトプラストの生物活性を向上させることがで
きることを知り、この新知見に基すいて鋭意研究を重ね
た結果、本発明を完するに到った。
即ち本発明の第一番目の発明は、培地中に、還元型グル
タチオン及び／又はグルタチオンパーオキシダーゼを含
有させてなる高等植物由来のプロトプラストの培養培地
であり、又本発明の第２番目の発明は高等植物由来のプ
ロトプラストを培養するに当り、還元型グルタチオン及
び／又はグルタチオンパーオキシダーゼを含有させた培
養培地で該プロトプラストを培養することを特徴とする
高等植物由来のプロトプラストの培養法である。
タチオン及び／又はグルタチオンパーオキシダーゼを含
有させてなる高等植物由来のプロトプラストの培養培地
であり、又本発明の第２番目の発明は高等植物由来のプ
ロトプラストを培養するに当り、還元型グルタチオン及
び／又はグルタチオンパーオキシダーゼを含有させた培
養培地で該プロトプラストを培養することを特徴とする
高等植物由来のプロトプラストの培養法である。
以下、本発明を詳述する。
先ず本発明の第１番目の発明は培地中に、還元型グルタ
チオン及び／又はグルタチオンパーオキシダーゼを含有
させてなる高等植物由来のプロトプラストの培養培地で
ある。
チオン及び／又はグルタチオンパーオキシダーゼを含有
させてなる高等植物由来のプロトプラストの培養培地で
ある。
本発明に使用される基本培地としては、通常のプロトプ
ラスト培養に用いられる培地ならば何れを用いても良く
、例えばムラシゲ・スクーグ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ
ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ
１５＋ ４７３＋１９６２） 、Ｂ５培地（Ｇａｍｂｏ
ｒｇ、 Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｏｊｉｍａ。
ラスト培養に用いられる培地ならば何れを用いても良く
、例えばムラシゲ・スクーグ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ
ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ
１５＋ ４７３＋１９６２） 、Ｂ５培地（Ｇａｍｂｏ
ｒｇ、 Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｏｊｉｍａ。
Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ Ｒｅｓ、 ５０．１５１．１９６８
）、ナガタ・タケベ培地（Ｎａｇａｔａ ａｎｄ Ｔａ
ｋｅｂｅ、 ＰＩａｎｔａ＋ ９９＋ １２＋ １９７
１）、エッチ・ニッチ培地（Ｎｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｎ
１ｔｓｃｈ、５ｃｉｅｎｃｅ監８５．１９６９）等が挙
げられる。
）、ナガタ・タケベ培地（Ｎａｇａｔａ ａｎｄ Ｔａ
ｋｅｂｅ、 ＰＩａｎｔａ＋ ９９＋ １２＋ １９７
１）、エッチ・ニッチ培地（Ｎｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｎ
１ｔｓｃｈ、５ｃｉｅｎｃｅ監８５．１９６９）等が挙
げられる。
上記培地に、還元型グルタチオン及び／又はグルタチオ
ンパーオキシダーゼを添加するが、先ず還元型グルタチ
オンとしては何れの起源のものでも、又市販品でも良く
、その培地の添加濃度は通常０．１〜１０ｍＭ程度が望
ましい。すなわち、０．１ｍＭ未満及び１０ｍＭを越え
ると分裂増殖能に及ぼす効果が不十分であり、いずれも
望ましくない。又、グルタチオンパーオキシダーゼとし
ては、何れの起源のものでも良く、例えばパン酵母由来
のもの、人間、半券血球、ホウレン草由来のもの等が挙
げられ、培地中に１〜１００単位程度添加するのが望ま
しい。すなわち１単位未満及び１００単位を越えると分
裂増殖能に及ぼす効果が不十分であり、いずれも望まし
くない。
ンパーオキシダーゼを添加するが、先ず還元型グルタチ
オンとしては何れの起源のものでも、又市販品でも良く
、その培地の添加濃度は通常０．１〜１０ｍＭ程度が望
ましい。すなわち、０．１ｍＭ未満及び１０ｍＭを越え
ると分裂増殖能に及ぼす効果が不十分であり、いずれも
望ましくない。又、グルタチオンパーオキシダーゼとし
ては、何れの起源のものでも良く、例えばパン酵母由来
のもの、人間、半券血球、ホウレン草由来のもの等が挙
げられ、培地中に１〜１００単位程度添加するのが望ま
しい。すなわち１単位未満及び１００単位を越えると分
裂増殖能に及ぼす効果が不十分であり、いずれも望まし
くない。
又、本発明に於いては、上記した培地にホスホリパーゼ
Ａ２を必要により添加しても良く、該ホスホリパーゼＡ
２としては何れの起源のものでも良く、例えばコブラ、
ハチ毒、ブタの膵臓由来のもの等が挙げられ、培地中の
添加濃度は、０．１〜１００単位程度添加するのが望ま
しい。すなわち１単位未満及び１００単位を越えると分
裂増殖能に及ぼす効果が不十分であっていずれも望まし
くない。
Ａ２を必要により添加しても良く、該ホスホリパーゼＡ
２としては何れの起源のものでも良く、例えばコブラ、
ハチ毒、ブタの膵臓由来のもの等が挙げられ、培地中の
添加濃度は、０．１〜１００単位程度添加するのが望ま
しい。すなわち１単位未満及び１００単位を越えると分
裂増殖能に及ぼす効果が不十分であっていずれも望まし
くない。
これらの酵素を培地に添加する場合には、無菌濾過した
酵素液として添加するのが望ましい。又、本発明の第２
番目の発明は高等植物由来のプロトプラストを培養する
に当り、還元型グルタチオン及び／又はグルタチオンパ
ーオキシダーゼを含有させた培養培地で該プロトプラス
トを培養することを特徴とする高等植物由来のプロトプ
ラストの培置注である。
酵素液として添加するのが望ましい。又、本発明の第２
番目の発明は高等植物由来のプロトプラストを培養する
に当り、還元型グルタチオン及び／又はグルタチオンパ
ーオキシダーゼを含有させた培養培地で該プロトプラス
トを培養することを特徴とする高等植物由来のプロトプ
ラストの培置注である。
本発明に使用される高等植物由来のプロトプラストとし
ては、例えばナス科、セリ科、アブラナ科及びマメ科な
どの双子葉植物及びイネ科、ユリ科などの単子葉植物の
いずれもが使用でき、これらの高等植物体の葉、茎、根
、花、子葉等の総ての組織、これらから誘導されたカル
ス又は液体培地で懸濁培養された高等植物由来の培養細
胞等、種々の材料より単離されたプロトプラストが用い
られる。
ては、例えばナス科、セリ科、アブラナ科及びマメ科な
どの双子葉植物及びイネ科、ユリ科などの単子葉植物の
いずれもが使用でき、これらの高等植物体の葉、茎、根
、花、子葉等の総ての組織、これらから誘導されたカル
ス又は液体培地で懸濁培養された高等植物由来の培養細
胞等、種々の材料より単離されたプロトプラストが用い
られる。
又、プロトプラスト化する際の酵素剤としては、マセレ
ーション酵素として、例えばペクトリアーゼＹ−２３（
盛進製薬株式会社製）、マセロチームＲ−１０（ヤクル
ト薬品工業株式会社製）等、細胞壁分解酵素としては例
えばセルラーゼＹＣ（盛進製薬株式会社製）、セルラー
ゼオノズカＲ４０（ヤクルト薬品工業株式会社製）、セ
ルラーゼＲ５（ヤクルト薬品工業株式会社製）、ドリセ
ラーゼ（協和醗酵工業株式会社製）等の市販品が挙げら
れ、これらを単独もしくは適宜組合わせて用いることが
でき、又純度の高い精製酵素標品（石井茂孝、組織培養
１１．１２５．１９８５）を用いて単離したプロトプラ
ストも使用することができる。
ーション酵素として、例えばペクトリアーゼＹ−２３（
盛進製薬株式会社製）、マセロチームＲ−１０（ヤクル
ト薬品工業株式会社製）等、細胞壁分解酵素としては例
えばセルラーゼＹＣ（盛進製薬株式会社製）、セルラー
ゼオノズカＲ４０（ヤクルト薬品工業株式会社製）、セ
ルラーゼＲ５（ヤクルト薬品工業株式会社製）、ドリセ
ラーゼ（協和醗酵工業株式会社製）等の市販品が挙げら
れ、これらを単独もしくは適宜組合わせて用いることが
でき、又純度の高い精製酵素標品（石井茂孝、組織培養
１１．１２５．１９８５）を用いて単離したプロトプラ
ストも使用することができる。
何れの酵素を使用しても、高等植物の細胞壁を分解する
過程で、活性酵素が発生し、これが細胞膜を酸化する。
過程で、活性酵素が発生し、これが細胞膜を酸化する。
細胞膜中の不飽和脂肪酸は、活性酵素で酸化されると過
酸化脂質を生ずるが、これがさらに別の不飽和脂肪酸を
酸化し、この反応が次々と進行していく、いわゆる連鎖
反応を起こして、膜脂質及びその機能を破壊する。
酸化脂質を生ずるが、これがさらに別の不飽和脂肪酸を
酸化し、この反応が次々と進行していく、いわゆる連鎖
反応を起こして、膜脂質及びその機能を破壊する。
そこで、単離されたプロトプラストの培養の培地中に還
元型グルタチオンとグルタチオンパーオキシダーゼをそ
れぞれ単独又は組合わせて添加したところ、生物活性が
向上し、分裂増殖するプロトプラストの増加が認められ
た。
元型グルタチオンとグルタチオンパーオキシダーゼをそ
れぞれ単独又は組合わせて添加したところ、生物活性が
向上し、分裂増殖するプロトプラストの増加が認められ
た。
プロトプラストの培養培地に還元型グルタチオン、グル
タチオンパーオキシダーゼと共にホスホリパーゼＡ２を
添加して培養したところさらに大なる効果が認められた
。
タチオンパーオキシダーゼと共にホスホリパーゼＡ２を
添加して培養したところさらに大なる効果が認められた
。
本発明の培養培地で培養すれば、プロトプラストの生物
活性が上昇することにより、これを利用する細胞融合も
しくは遺伝子組替え等のバイオテクノロジーを応用した
新品種の作出が効率化される。
活性が上昇することにより、これを利用する細胞融合も
しくは遺伝子組替え等のバイオテクノロジーを応用した
新品種の作出が効率化される。
以下、実施例により本発明の効果を具体的に示す。
実施例１
イネの根由来のカルスを１ｍｇ／Ｉ！、の２，４−Ｄと
３％シュークロースを含む液体培地で懸濁培養している
イネ培養細胞を１％セルラーゼＲ３（盛進製薬社製）と
０．１％ペクトリアーゼＹ−２３（盛進製薬社製）を含
む０．５Ｍマンニトール溶液中で１時間酵素処理を行な
いプロトプラストを得た。反応物をミラクロスで濾過し
、濾液中のプロトプラストを０゜５門マンニトールによ
る遠心法で洗浄した。
３％シュークロースを含む液体培地で懸濁培養している
イネ培養細胞を１％セルラーゼＲ３（盛進製薬社製）と
０．１％ペクトリアーゼＹ−２３（盛進製薬社製）を含
む０．５Ｍマンニトール溶液中で１時間酵素処理を行な
いプロトプラストを得た。反応物をミラクロスで濾過し
、濾液中のプロトプラストを０゜５門マンニトールによ
る遠心法で洗浄した。
このようにして得られたプロトプラストを３×１０５ケ
／ｒｎ！の密度で、０．５ｍｇ／ ｌ ２．４−Ｄ、
０．３ｍｇ／ ｌカイネチン、１％シュークロース、
０．５Ｍマンニトールを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅ ＆
Ｓｋｏｏｇ培地で培養したが、この培地中に種々の濃度
の還元型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ社製）とグルタチオ
ンパーオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加して培養
して培養１ケ月後のカルス数を測定した。
／ｒｎ！の密度で、０．５ｍｇ／ ｌ ２．４−Ｄ、
０．３ｍｇ／ ｌカイネチン、１％シュークロース、
０．５Ｍマンニトールを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅ ＆
Ｓｋｏｏｇ培地で培養したが、この培地中に種々の濃度
の還元型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ社製）とグルタチオ
ンパーオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加して培養
して培養１ケ月後のカルス数を測定した。
（本頁以下余白）
実施例２
実施例１と同様のイネ培養細胞を精製したセルラーゼＣ
Ｉ、キシラナーゼ及びペクチンリアーゼで、４時間処理
しプロトプラストを得た。実施例１と同様の方法で培養
し、培地に還元型グルタチオンとグルタチオンパーオキ
シダーゼ（Ｓｉｇｍａ製）及びこれにさらにホスホリパ
ーゼＡ２ （Ｓｉｇｍａ社製）を添加して１ケ月後のカ
ルス数を測定した。
Ｉ、キシラナーゼ及びペクチンリアーゼで、４時間処理
しプロトプラストを得た。実施例１と同様の方法で培養
し、培地に還元型グルタチオンとグルタチオンパーオキ
シダーゼ（Ｓｉｇｍａ製）及びこれにさらにホスホリパ
ーゼＡ２ （Ｓｉｇｍａ社製）を添加して１ケ月後のカ
ルス数を測定した。
（本頁以下余白）
実施例３
十分に展開したペチュニアの葉を殺菌後切断し、０．２
％セルラーゼＹＣ（盛進製薬社製）と０．０２％ペクト
リアーゼＹ−２３（盛進製薬社製）を含む０．５５Ｍマ
ンニトール、 １０ｍＭ ＭＢＳ緩衝液中で２時間半酵
素分解し、プロトプラストを得た。
％セルラーゼＹＣ（盛進製薬社製）と０．０２％ペクト
リアーゼＹ−２３（盛進製薬社製）を含む０．５５Ｍマ
ンニトール、 １０ｍＭ ＭＢＳ緩衝液中で２時間半酵
素分解し、プロトプラストを得た。
０６５Ｍマンニトールによる遠心法によって洗浄された
プロトプラストを、密度を５Ｘ１０’ケ／ｍｆで、１
ｍｇ／ １．の２，４−Ｄ、 ０．５ｍｇ／ｆベンジル
アデニン。
プロトプラストを、密度を５Ｘ１０’ケ／ｍｆで、１
ｍｇ／ １．の２，４−Ｄ、 ０．５ｍｇ／ｆベンジル
アデニン。
１．０％シュークロース、０．０２５％ＮＺアミン及び
０．４Ｍマンニトールを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅ ＆
Ｓｋｏｏｇ培地で培養したが、これに１ｍＭ還元型グル
タチオン、２０単位グルタチオンパーツキシダーゼ（Ｓ
ｉｇｍａ社製）及び２５単位ホスホリパーゼＡｚ （Ｓ
ｉｇｍａ社製）を添加すると、無添加のものに比べ、細
胞壁の再生が早く、第１回の分裂に要する時間が短縮さ
れ、かつ下記のような効果が認められた。
０．４Ｍマンニトールを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅ ＆
Ｓｋｏｏｇ培地で培養したが、これに１ｍＭ還元型グル
タチオン、２０単位グルタチオンパーツキシダーゼ（Ｓ
ｉｇｍａ社製）及び２５単位ホスホリパーゼＡｚ （Ｓ
ｉｇｍａ社製）を添加すると、無添加のものに比べ、細
胞壁の再生が早く、第１回の分裂に要する時間が短縮さ
れ、かつ下記のような効果が認められた。
出願人 社団法人 農林水産技術情報協会代理人 弁理
士 平 木 祐 輔
士 平 木 祐 輔
Claims (4)
- （１）培地中に還元型グルタチオン及び／又はグルタチ
オンパーオキシダーゼを含有させてなる高等植物由来の
プロトプラストの培養培地。 - （２）ホスホリパーゼＡ＿２を含有させてなる特許請求
の範囲第（１）項記載の高等植物由来のプロトプラスト
の培養培地。 - （３）高等植物由来のプロトプラストを培養するに当り
、還元型グルタチオン及び／又はグルタチオンパーオキ
シダーゼを含有させた培養培地で該プロトプラストを培
養することを特徴とする高等植物由来のプロトプラスト
の培養法。 - （４）還元型グルタチオン及び／又はグルタチオンパー
オキシダーゼ、及びホスホリパーゼＡ＿２を含有させた
培養培地で高等植物由来のプロトプラストを培養するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第（３）項記載の高等植
物由来のプロトプラストの培養法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62312097A JPH01157376A (ja) | 1987-12-11 | 1987-12-11 | 高等植物由来のプロトプラストの培養培地及びその培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62312097A JPH01157376A (ja) | 1987-12-11 | 1987-12-11 | 高等植物由来のプロトプラストの培養培地及びその培養法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01157376A true JPH01157376A (ja) | 1989-06-20 |
Family
ID=18025202
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62312097A Pending JPH01157376A (ja) | 1987-12-11 | 1987-12-11 | 高等植物由来のプロトプラストの培養培地及びその培養法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01157376A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020022458A (ko) * | 2000-09-20 | 2002-03-27 | 복성해 | 수정란의 체외배양법 |
| JP2009163265A (ja) * | 2001-12-12 | 2009-07-23 | Gnb Co Ltd | 思考単位と連結質問を用いる言語教育方法 |
-
1987
- 1987-12-11 JP JP62312097A patent/JPH01157376A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020022458A (ko) * | 2000-09-20 | 2002-03-27 | 복성해 | 수정란의 체외배양법 |
| JP2009163265A (ja) * | 2001-12-12 | 2009-07-23 | Gnb Co Ltd | 思考単位と連結質問を用いる言語教育方法 |
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