JP5122292B2 - 哺乳動物の味覚細胞の培養方法 - Google Patents
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Description
本件は、2004年10月15日に提出し、その全体が本明細書に組み込まれる米国仮出願番号No. 60/636,377の利益を主張する。
本発明は、哺乳動物の味覚細胞の単離および長期間細胞培養のための方法に関する。哺乳動物の味覚細胞は、味覚刺激または味物質(tastants)に応答する哺乳動物の味覚受容体−発現細胞を含む。本発明の方法は、例えば、3ヵ月までまたはそれ以上のような延長された期間の味覚受容体細胞の研究を可能にする。さらに、本発明の方法は、既知の方法に比べて単離する必要のある味覚細胞の由来となる動物の数を低減する。本発明の方法によれば、味覚細胞がインビトロで増殖し、分化することができるので、増殖および分化、例えば、これらのプロセスに必要な栄養素の決定を含む味覚細胞プロセスのインビトロでの研究が可能になる。延長された期間の味覚細胞の培養が可能になったことによって、より長い時間枠を必要とする実験を可能にする。
味蕾は、神経特性および上皮特性の双方に存在する3つの形態型を含む、およそ50〜100個の味覚細胞からなる。免疫細胞化学の特徴づけに基づき、これらの味覚細胞は、タイプI(暗)、タイプII(明)およびタイプIII(中間)に分類される(Yee et al., J Comp Neurol. 2001 Nov 5;440(l):97- 108;Takeda et al, J Comp Neurol. 2004 Nov l;479(l):94-102)。
本発明は、一般的に、味覚受容体細胞を含む哺乳動物の味覚細胞の単離、培養および/またはアッセイの方法ならびに培養した哺乳動物の味覚細胞に関する。
ここで、味覚受容体細胞を含む味覚細胞の1、2または3ヵ月またはそれよりも長期間の培養に備えた単離方法および培養方法が提供される。本発明の方法は、生存している細胞の高いパーセンテージを、37℃の温度でさえも維持し、その結果、全ての細胞プロセスがゆっくりとなることがない。
− 単離の間、味覚細胞が酵素を含むおよび含まないの両方の単離溶液に暴露される時間を最小化する。例えば、好ましくは味覚細胞は単離溶液に、約30分以上暴露されず、好ましくは約20分以上暴露されず、そして最も好ましくは、約15分以上暴露されない。例えば、味覚細胞は、30分以下、好ましくは20分以下、および最も好ましくは15分以下で、次に記載のように用いるプロナーゼEを含有する単離溶液に好適に暴露される、
− 細胞培養容器は、適切なコーティングでコートされる。本発明の目的のために適切なコーティングは、細胞接着および増殖を行うコーティングである。コーティングは、好ましくはコラーゲンを含む。コーティングは、好ましくは、ポリ−D−リジン、CELL-TAK(登録商標)またはMATRIGEL(登録商標)を含まない、
− 適切な培養培地が用いられる。本発明の目的のために適切な培養培地は、細胞の生存率、増殖および分化をサポートする培養培地である。本発明の方法のために好ましい培養培地は、イスコーブ培地、MCDB153、FBS、インシュリンおよび抗生物質を含む。適切な培養培地の例は、15〜20%MCDB153、10%FBS、10ng/mlインシュリンおよび抗生物質を含有するイスコーブ培地である。培養培地は、好ましくは、単独もしくはウシ胎仔血清(FBS)および抗生物質補給剤を伴なう、DMEM、F12またはMCDB153から選択されない、
− 培地の最初の交換の後に(例えば、24〜48時間での培養培地の最初の交換の後に)、培地は、約5日よりも短い、好ましくは少なくとも約7日、そして最も好ましくは少なくとも約8日の間隔で交換されるべきではない、
の少なくとも1つを包含する。
本発明の方法は、好ましくは、これらのステップの2つまたは3つ以上を含み、より好ましくは、これらのステップの3つ以上を含み、最も好ましくは、ステップの4つ全てを含む。
i)細胞が、酵素を含むまたは含まない単離溶液に曝される時間が最小化されている舌上皮を単離すること、
ii)単離した舌上皮を適切なコーティングでコートした細胞培養容器にて適切な細胞培養培地でインキュベートすること、および、
iii)例えば約24〜48時間で、培養培地の最初の交換に続いて、少なくとも約5日の間隔で培地を交換すること
を含む哺乳動物の味覚細胞を単離および培養する方法を含む。
いくつかの好ましい態様において、味覚細胞は味覚受容体細胞を含む。好ましい態様において、味覚細胞は味覚受容体細胞のみを含む。いくつかの態様において、味覚細胞を酵素を含むまたは含まない単離溶液に対して暴露する時間は、約30分以下、より好ましくは約20分以下、および最も好ましくは約15分以下である。いくつかの好ましい態様において、コーティングはコラーゲンである。いくつかの態様において、培養培地の交換の間隔は、少なくとも約7日であり、好ましくは少なくとも約8日である。
少なくとも約10日、約37℃以下の温度で、または少なくとも約20日、約18℃〜約37℃で、少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、さらにより好ましくは約95%の生存率が、本発明の方法にしたがって達成される。
i)コートした細胞培養容器にて適切な細胞培養培地で味覚細胞を培養すること、および
ii)例えば、約24〜48時間での培養培地の最初の交換に続いて、少なくとも約5日の間隔で培地を交換すること、
を含む哺乳動物の味覚細胞を培養する方法を提供する。
本発明の方法にしたがい培養された味覚細胞は、当該分野で知られた方法にしたがって単離され得る。好ましくは、味覚細胞は、本明細書で提供された方法にしたがって単離される。いくつかの好ましい態様において、味覚細胞は味覚受容体細胞を含む。いくつかの好ましい態様において、コーティングがコラーゲンである。いくつかの態様において、培養培地の交換の間隔は、少なくとも約7日であり、好ましくは少なくとも約8日である。
他の哺乳動物からの材料もまた本発明の方法にしたがって用い得るが、例に記載された単離された味覚乳頭はラットの舌に由来する。全ての哺乳動物は、味蕾およびその細胞および分子構成において味覚細胞の構成中、高い相同性を共有している。したがって、他の哺乳動物の味覚細胞はまた、同様の生存率を有したまま単離および/または長期培養され得る。例えば、用いられ得る一般的な研究動物は、例えば、ラット、マウス、ハムスターおよびモルモットを含むげっ歯動物である。用いられ得る他の哺乳動物には、例えば、ウシ亜科の動物、ブタ、イヌ、ネコおよび霊長動物(例えば、類人猿、サル、ヒト)が含まれる。
提供された酵素および単離溶液とのインキュベーション時間は短く、舌上皮組織および味蕾を単離する単離方法は、当該分野でよく知られているように行われ得る。オリジナルの方法は、Spielman et al. 1989, Brain Research 503: 326-29によって記載されている。この方法の種々の改変は既知であり、例えば、Kishi et al. 2001, Neuroscience 106(1): 217-25, Stone et al. 2002, Chem. Senses 27: 779-87, and Ruiz et al. 2001, Chem. Senses 26(7):861-73に記載されている。
本発明の方法に用いるべき適切な培養によって、味覚細胞の生存率、増殖および分化を支持する。本発明の方法のための培養培地は、好ましくは、イスコーブ培地、好ましくは、MCDB153培地、FBS、インシュリンおよび抗生物質の1つまたはそれ以上を添加している。細胞培養のための好ましい培地は、例えば、イスコーブ培地、好ましくは、15〜20%MCDB153培地、5〜20%FBS、10ng/mlインシュリンおよび抗生物質の1つまたはそれ以上を添加している。好適なFBS濃度は10%である。好適な抗生物質の組み合わせは、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンおよびファンギゾン(fungizone)である。好適な濃度は、100U/ml/100μg/ml、ペニシリン/ストレプトマイシン、2.5μg/mlゲンタマイシンおよび0.5μg/mlファンギゾンである
本発明の方法および味覚細胞は、味物質、味修飾剤(taste modifiers)(味を増強、抑制、刺激または阻害する、あるいは特定の味質に影響する刺激を含む)を含む味覚細胞での応答を誘発する候補刺激または化合物、および味覚細胞において特定の応答または効果を誘発するその他の候補刺激または化合物を同定するために、当該分野で知られたアッセイ方法において用いられ得る。例えば、これらのアッセイは、候補の味、味質、味の修飾効果、増殖促進効果、阻害効果または毒性効果を同定し、評価するのに用いられ得る。さらに、味覚欠損(taste loss)の処置のための候補、薬剤開発のための標的および健全な味覚細胞の維持に必要な栄養因子を同定するのに用いられ得る。一般的に、かかるアッセイは、興味ある候補または候補の混合物の、標準に対する、少なくとも1タイプの細胞内応答(例えば、カルシウム濃度に関連する蛍光シグナル)の比較を含む。
未知の味物質の候補に応答する味覚細胞は、既知の味物質のそれと比較され、細胞応答における差異または相同性を同定される。味覚細胞は、例8に記載するように、既知の味物質に対する応答によって、または当業者が知っている匹敵する細胞応答アッセイを用いることにより、同定される。候補に対する細胞応答はモニターされ、味物質に対する同一の細胞の細胞応答と比較される。
候補修飾剤(例えば、味修飾剤)の存在下および非存在下での既知の刺激(例えば、既知の味物質)に対する味覚細胞応答を比較した。細胞応答は、検出され比較された。比較によって、応答が増大、減少、遅延、延長または影響を受けなかったことが示され得る。刺激に対する細胞応答の規模の増大または刺激に応答する細胞の頻度の増大を引き起こす候補修飾剤は、候補修飾剤が、刺激(例えば、味物質)の強度を高めることに有用であり、与えられた刺激(例えば、味覚刺激/フレーバー)を高めるために、フード製品のようなある製品に添加するのに有用であろうことを示している。より短い待ち時間またはより長い応答期間を引き起こす刺激または化合物は、増大した強度または変化した質を示す。
種々のソース由来の味覚細胞の与えられた刺激(例えば、既知の味物質、既知の味物質および味修飾剤)に対する応答を比較する。これらのアッセイを用いることにより、刺激または味物質に対する細胞応答が、種々の培養、個体、種により選択された味覚細胞の種々のソース間で異なるか、または齢、遺伝的構成、代謝状態または栄養状態、疾患の状態、医薬用途および治療的処置における相違と関連して異なるのか決定することができる。
製品が意図する消費者グループの年齢に依存する消費者のための味質の改善する刺激濃度の必要な増大/低減が同定される。ある種において活性が既知である味修飾剤の有効性が、興味ある種における味覚刺激の有効性を同定するために、異なる種において同定される。
測定されたパラメーターは、先に詳述したような応答の差異、味覚刺激に対する応答の頻度、または、細胞の増殖速度を含む特定された細胞パラメーター、味に関連するタンパク質マーカーの発現、味覚細胞の再生(増殖、分化、生存)および例に記載のその他のものを含む。
本発明は、初めて、トランスフェクトされた培養味覚細胞を提供する。他の側面において、したがって、本発明は、例えば、プラスミドベクターによって、トランスフェクトされた培養された味覚細胞、好ましくは、本発明にしたがい培養された味覚細胞に関し、かかる細胞を、例えば、プラスミドベクターを用いることによるトランスフェクションなどによって、製造する方法に関する。
例1:
ラット味覚乳頭(有郭、葉状)から味覚受容体細胞を含む味覚細胞の単離および細胞培養
用いたラットは、1〜2月齢の成獣オスSprague-Dawleyラットである。ラットは、CO2吸入後の頸椎脱臼によって屠殺した。舌を有郭乳頭近傍で解剖し、直ちに冷やした単離溶液(26mM NaHCO3、2.5mM NaH2PO4、20mMグルコース、65mM NaCl、20mM KClおよび1mM EDTA)に氷上で5〜10分間置いた。
− 10%ウシ胎仔血清(BTI, MA, USA)、15〜20%MCDB153培地(Sigma, Saint Louis, MO, USA)、10ng/mlインシュリンおよび抗生物質(100U/ml/100μg/ml ペニシリン/ストレプトマイシン、2.5μg/mlゲンタマイシンおよび0.5μg/mlファンギゾン)を含むイスコーブ培地(CELLGRO(登録商標)の“Iscove's Modification of DMEM”、 Mediatech Inc, Herndon, VA, USA、製造番号10-016)
− 10%FBSを含むかまたは含まないダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Gibco BRL, NY, USA; Cellgro, USA)
− MCDB153(Sigma, Saint Louis, MO, USA)
− ラットテールタイプ1コラーゲンコートした(3.96mg/ml、水に1:4で希釈、BD Sciences, San Diego, CA)18mm丸ガラスカバースリップ(Fisher, USA);
− 無コーティングポリスチレン培養ディッシュ;
− 無コーティングガラスカバースリップ;
− マトリックスゲル(2ml/l、ATCC, USA)でコートしたガラスカバースリップ。
マトリックス溶液をEngelbreth-Holm-Swarm(EHS)マウス肉腫(ATCC, USA、製造番号CRL-2108)から調製した。マトリックスゲルは、次の3つの変形を用いた:細胞を、播種の前にマトリックスゲル内に埋め込み、穏やかにカバースリップに適用した;カバースリップはマトリックスゲルでコートし、細胞をポリマー化マトリックスゲルに播種した;細胞をマトリックスゲルに播種するとともに、ゲルをポリマー化した;
− ポリ−D−リジン(Sigma, Saint Louis, MO, USA、製造番号P-6407、終濃度は0.1mg/mlである)でコートしたガラスカバースリップ
細胞を全培養期間モニターし、本発明の単離手順、コラーゲンコートした培養表面およびイスコーブ培養培地を用い続けた場合、細胞は以下の特徴を示した:
BrdU標識によって示された味覚受容体細胞を含む味覚細胞の増殖
初期細胞培養が増殖性細胞を含むかを決定するために、5−ブロモ−2−デオキシウリジン(BrdU)の取り込みを培養11日目まで次に記載のとおり行った。
RT−PCRによる味覚細胞特異的マーカーの発現
逆転写ポリメラーゼ鎖反応(RT−PCR)分析は、例1に記載されたように、素早い単離手順で単離し、培養した味覚細胞において、例1に記載したように改変したイスコーブ培地で、コラーゲンコートした培養ディッシュで培養し、行った
各サンプルは、当該分野において知られているTRIZOL試薬(Invitrogen Corp, USA)によって、例えば、製造者の説明に従い、抽出される。代替的に、RNAは、Maniatis et al., 1982, “Molecular Cloning, A laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratoryに記載のように単離、逆転写および増幅されてもよい。
味覚受容体細胞特異的バイオマーカー、ガストデューシン、PLC−β2およびBrdUの免疫組織化学的局在
α−ガストデューシンおよびPLC−β2は、味覚刺激に応答する分化した味覚受容体細胞に対するバイオマーカーとして知られている。BrdUは細胞増殖に対する一般的なマーカーである。免疫組織化学は、例1に記載されたように、素早い単離手順で単離し、培養した味覚細胞において、例1に記載したように改変したイスコーブ培地で、コラーゲンコートした培養ディッシュで培養し、行った。分析した味覚細胞を、7〜10日間または2ヵ月培養し、以下のプロトコールに記載のとおり、α−ガストデューシン、PLC−β2およびBrdUに対する免疫活性を試験した。抗体特異性を、非特異的結合を検出するため、抗体特異的イムノグロブリンを用いて確認した。抗体特異的イムノグロブリンでの免疫染色は、非特異的免疫染色の非存在を示す。
コラーゲンコートしたカバースリップに播種した細胞を、0.1Mホスフェート緩衝液(pH、PB)中、4%のパラホルムアルデヒドを用いて、室温、10分間で固定した。リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で3回の洗浄ステップ(各10分間)の後、カバースリップを0.1M PBS中、0.3%Triton X−100、2%正常ヤギ血清および1%牛血清アルブミンで1時間ブロックし、その後さらにPBSで3回洗浄した。ブロッキング溶液に希釈した一次抗体をカバースリップに添加し、+4℃で一晩インキュベートした。用いた一次抗体は、ウサギ抗−ガストデューシンポリクローナル抗体(希釈1:500〜1:1000)およびウサギ抗−PLC−β2ポリクローナル抗体(希釈1:1000、Santa Cruz Biotechnology)であった。次いでカバースリップをPBSで洗浄し、暗下で、ブロッキング緩衝液で希釈したALEXA FLUOR 488抗マウス(1:500、Molecular Probes Inc.)またはALEXA FLUOR 633抗ウサギ(1:500、Molecular Probes Inc.)と、室温1時間反応させた。最後のPBSおよび水での洗浄後、カバースリップをVECTORSHIELDでマウントした。
二次抗体、抗ガストデューシンまたは抗PLC−β2を導入することを除いて、同様の方法で行った。免疫蛍光顕微鏡のためのコントロールは、一次抗体を省略したことからなり、この条件下では免疫活性は見られない。
並行したガストデューシン、PLC−β2およびBrdUの免疫組織化学の局在
インビトロで増殖した細胞と味覚細胞特異的バイオマーカーの発現との間の関係は、並行してガストデューシン、PLC−β2およびBrdUで二重標識で分析した。実験は、例4に記載のとおり、並行して3つのバイオマーカーの各2つを用いて行った。
共焦点イメージング
蛍光イメージは、UV、アルゴンおよびHeNeレーザーを用いてLeica TCS SP2 スペクトル共焦点顕微鏡 (LEICA Microsystems Inc., Mannheim, Germany)で捕捉した。カバースリップは、HC PL APO CS 20.0×(0.070 NA)対物で見た。用いた励起波長は、適切な波長で検出された発光を有する、DAPIに対し405nm、ALEXA FLUOR 488に対し488nm、ALEXA FLUOR 633に対し633nmである。ピンホールの直径は、蛍光焦点面に対するZ軸の許容し得る解像度を与え、用いられる対象物用のエアリーディスク(Airy disc)の最初の最小の直径でセットされる。レーザービームのためのパワーおよび光電子倍増管の増幅率は、シグナル/ノイズ比を最適化するように調整した。各波長の連続する捕捉は、いくつかの二重標識実験に用い、同時のスキャンを比較した場合、波長または相違に亘って流れ出る。LEICA Scanwareのソフトウェアを、平均して2ラインプラス3フレームで1024×1024ピクセルフォーマットで一方向にスキャニングする共焦点イメージを得るために用いた。デジタルズームを制御するコンピュータは、20×対物で最大2.5×の拡大をするために用いた。デジタルイメージは、LCSソフトウェア(LEICA Microsystems Inc.)を用いて、コントラストおよび明るさを整え、調整される。
ウェスタンブロットにより分析した味覚受容体細胞特異的マーカーの発現
培養した味覚細胞のガストデューシンおよびPLC−β2の発現に対し、以下に記載するプロトコールにしたがい、ウェスタンブロットを用いた。
Caイメージングによる種々の味覚刺激に対する味覚細胞の応答の決定
用いた味覚細胞は、例1に記載のように単離し、ラットテールコラーゲンタイプ1でコートしたカバースリップで1週間または2ヵ月間培養した。
アッセイのための改善された緩衝液における味覚細胞の維持
用いた培養味覚細胞は、例8に記載のとおりである。カバースリップの培養した味覚細胞を室温(22〜25℃)、インキュベーターの外で、改善したアッセイ緩衝液にて一晩インキュベートした。改善したアッセイ緩衝液は、5M NaClで300〜310に調整したオスモル濃度を有する改変したMHNKリンガー溶液(80mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、1mMピルビン酸Na、20mM Hepes−Na、pH7.2)である。
培養味覚細胞のトランスフェクション
コラーゲンコートしたカバースリップで培養された例1に記載のように単離された味覚細胞を、5〜8μgのpGFP2-MCS-Rluc(h)発現ベクター(BioSignal Packard, Montreal, Canada, 製造番号6310051)で、およびRoche Diagnostics “FuGene 6 Transfection Reagent” Instruction Manual, Version 5, September 2000にしたがって、FuGene(登録商標)6 Transfection Reagent(Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)で、単離後5〜7日でトランスフェクトした。15〜24マイクロリットルのFugene 6(登録商標)Transfection Reagentを、50マイクロリットルの無血清培地に添加した。用いた培地は、無血清であること以外、例1に記載のイスコーブ培地を補った。混合物を穏やかに手で混ぜた。5〜8マイクログラムのDNA(pGFP2-MCS-Rluc(h)発現ベクター)を加え、混合物を穏やかに手で混ぜた。混合物を室温で15〜30分間インキュベートし、次いで細胞に滴下して加えた。プレートを穏やかに旋回し、2日間、37℃で細胞培養インキュベーターでインキュベートした。
mT2R5およびhT2R16を用いた培養味覚細胞のトランスフェクションおよびカルシウムイメージング
例11のトランスフェクションは、以下の改変に従い、例10に記載されているように行った:
― 用いたカバースリップはラットテールコラーゲン1コートカバースリップである;
― 単離後、3〜7日後にトランスフェクションを行った;および
― トランスフェクトされるDNAは、GFPを有する例10の発現ベクターまたは、マウスT2R5DNA(sst:mT2R5:HSV/pcDNA3.1-zeo, 6053 bp)またはヒトT2R16DNAをインサートとして(両方のケースで、構築物は、Bufe et al. Nat Genet. 2002 Nov;32(3):397-401によるヒトTAS2R遺伝子のクローニングについて記載されたように形成され得る)、DNAインサートを運ぶ発現ベクターである。
Claims (10)
- 哺乳動物の味覚細胞の培養方法であって、
a.味覚受容体細胞を含む哺乳動物の味覚細胞を、15〜20%MCDB153培地、5〜20%FBS、10ng/mlインシュリンおよび抗生物質を添加したイスコーブ培地を含む適切な細胞培養培地中、コラーゲンでコートされた細胞培養容器にて培養すること、および
b.培地の最初の交換から、少なくとも5日の間隔で培地を交換すること、
を含み、ここで、前記味覚受容体細胞は、少なくとも1つの味覚刺激に対する反応性を維持している、前記方法。 - 哺乳動物の味覚受容体細胞の培養物を得る方法であって、
a.哺乳動物の単離した舌上皮組織をタンパク質分解酵素と接触させること、
b.哺乳動物の単離した舌上皮組織を、15〜20%MCDB153培地、5〜20%FBS、10ng/mlインシュリンおよび抗生物質を添加したイスコーブ培地を含む細胞培養培地中、コラーゲンでコートされた細胞培養容器にて培養すること、および
c.24〜48時間後に培地を交換し、次いで5〜10日毎に交換すること、
を含む、前記方法。 - 哺乳動物の培養味覚受容体細胞をトランスフェクトする方法であって:
哺乳動物の単離した舌上皮組織をタンパク質分解酵素と接触させること;
哺乳動物の単離した舌上皮組織を、15〜20%MCDB153培地、5〜20%FBS、10ng/mlインシュリンおよび抗生物質を添加したイスコーブ培地を含む細胞培養培地中、コラーゲンでコートされた表面にて培養すること;
24〜48時間後に培地を交換し、次いで5〜10日毎に交換すること;および
培養した哺乳動物の味覚受容体細胞を核酸と接触させること、
を含む、前記方法。 - 核酸が、ベクターDNAを含む、請求項3に記載の方法。
- タンパク質分解酵素が、プロナーゼEおよびエラスターゼである、請求項2に記載の方法。
- 接触の長さが、30分またはそれ以下である、請求項2に記載の方法。
- タンパク質分解酵素が、単離溶液に添加される、請求項2に記載の方法。
- 単離溶液が、NaHCO3、NaH2PO4、NaCl、KClおよびEDTAを含む、請求項7に記載の方法。
- 単離した舌上皮組織が、有郭乳頭および葉状乳頭の領域から単離されたものである、請求項2に記載の方法。
- 15〜20%MCDB153培地、5〜20%FBS、10ng/mlインシュリンおよび抗生物質を添加したイスコーブ培地、およびコラーゲンでコートされた細胞培養容器を含む、哺乳動物の味覚細胞を培養するためのキット。
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