DE4041687C1

DE4041687C1 -

Info

Publication number: DE4041687C1
Application number: DE19904041687
Authority: DE
Inventors: Gerhard Prof. Dr. Hunsmann; Elke Dr. 3400 Goettingen De Jurkiwicz; Hans Prof. Dr. Reichenbach; Edgar Dr. Forche; Klaus Dr. Gerth; Herbert Dr. Irschik; Brigitte Dr. Kunze; Florenz Dr. Sasse; Gerhard Prof. Dr. Hoefle; Norbert Dr. Bedorf; Rolf Dr. Jansen; Heinrich Steinmetz; Wolfram Dr. 3300 Braunschweig De Trowitzsch-Kienast
Original assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG DE; Deutsches Primatenzentrum GmbH
Current assignee: Deutsches Primatenzentrum GmbH
Priority date: 1990-12-24
Filing date: 1990-12-24
Publication date: 1992-08-13
Anticipated expiration: 2010-12-25
Also published as: WO1992011008A1

Description

Die Erfindung betrifft therapeutisches Mittel zur Bekämpfung von Viruserkrankungen, bestehend aus oder enthaltend Thiangazol der folgenden allgemeinen Formel (gegebenenfalls jeweils als therapeutisch verträgliches Säureadditionssalz) gegebenenfalls neben Trägern und/oder Verdünnungsmitteln:

Ferner betrifft die Erfindung ein derartiges Mittel mit einem Thiangazol (gegebenenfalls als therapeutisch verträgliches Säureadditionsalz), das durch einen oder mehrere Parameter gemäß Anspruch 2 gekennzeichnet ist.

Eine spezielle Ausführungsform betrifft ein derartiges therapeutisches Mittel zur Bekämpfung von Erkrankungen durch Retroviren, insbesondere zur Bekämpfung von HIV.

Insbesondere derartige Thiangazole sind dadurch erhältlich, daß man

- Polyangium DSM 6267 in einem Medium mit einem Gehalt an Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Mineralsalzen kultiviert,
- die geerntete Zellmasse mit Aceton extrahiert,
- den (vereinigten) Extrakt einengt,
- das Konzentrat mit Ether/Wasser aufnimmt,
- die wässerige Phase abtrennt und gegebenenfalls mit Ether extrahiert,
- die (vereinigte) Etherphase einengt,
- das Konzentrat mit Methanol/Heptan aufnimmt,
- die Methanolphase abtrennt und gegebenenfalls mit Heptan extrahiert,
- danach einengt und mit t-Butylmethylether/Benzin extrahiert,
- den Extrakt in t-Butylmethylether über Florisil filtriert,
- Thiangazol (bzw. antivirale Aktivität) aus dem Extrakt kristallisiert und
- gegebenenfalls in ein therapeutisch verträgliches Säureadditionssalz überführt.

Cis-trans-Isomere dieses Thiangazols, die unter die vorstehend angegebene allgemeine Formel fallen, sind dadurch erhältlich, daß man das nach dem angegebenen Verfahren erhältlich Thiangazol einer Behandlung mit UV-Licht unterwirft.

Alle erfindungsgemäßen Thiangazole lassen sich in an sich bekannter Weise in pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze überführen.

Nachstehend wird die Erfindung durch experimentelle Daten näher erläutert:

A. Produktionsbedingungen

A. 1. Produktionsstamm:
das Bakterium Polyangium spec. Stamm Pl 3007, Ordnung Myxobacterales, Unterordnung Soranginae, Familie Polyangiaceae.

A. 2. Herkunft des Produktionsstammes:
Isoliert an der GBF im Oktober 1986 aus Erde von den Gärten der Alhambra, Granada, Spanien.

A. 3. Beschreibung des Produktionsstammes:
Die vegetativen Zellen sind zylindrisch mit breit abgerundeten Enden (Polyangium-Typ), meist um 0,6-0,8×4-6 µm. Bei Nährstoffmangel, z. B. bei Kultur auf einem Ausstrich von lebenden Escherichia-coli-Bakterien auf Wasseragar, bildet der Organismus Fruchtkörper. Dabei handelt es sich um plattenförmige Haufen von kleinen bis mittelgroßen, kugeligen oder ovoiden, gold- bis rotbraunen Sporangiolen, deren Durchmesser meist um 30-80 µm liegt. Die Sporangiolenhaufen können recht groß werden, schwanken aber stark in ihrer Ausdehnung, meist zwischen 100 und 600 µm Pl 3007 wächst gut auf lebenden Escherichia col-Bakterien auf Wasseragar, wobei die Futter-Bakterien abgebaut werden. Die Kolonie breitet sich, bedingt durch die gleitende Bewegung der Bakterienzellen, als Schwarm allmählich über die Kulturplatte aus. Außerdem wächst der Organismus auch gut auf Hefe-Agar (VY/2-Agar: 0,5% Bäckerhefe; 0,1% CaCl₂ · 2H₂O; 0,5 mg/l Cyanocobalamin; pH 7,2). Dabei dringt er auch tief in das Kultursubstrat ein und baut die Hefezellen weitgehend ab. Katalase und Oxidase sind positiv. In Flüssigmedien wächst der Stamm in kleinen Zellklümpchen, sowohl in Schüttelkolben bei 160 rpm (100 ml Medium in 250 ml Erlenmeyerkolben bzw. 500 ml Medium in 1000 ml Erlenmeyerkolben), als auch in Bioreaktoren (getestet bis zum 300 l Maßstab). Als Kulturmedium ist z. B. Poll-Medium geeignet: Probion PS (Einzellerprotein aus Methylomonas clarae; Hoechst Frankfurt) 0,4%; Stärke 0,3%; MgSO₄ · 7 H₂O 0,1%; CaCl₂ · 2 H₂O 0,05%; 1 ml/l Standard-Spurenelementlösung und 1 ml/l Standard-Vitaminlösung (Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie, 6. Auflage, Seite 174, Thieme-Verlag, Stuttgart 1985); pH 7,0. Die Kulturen werden bei 30°C über 3-4 Tage gehalten. Pl 3007 läßt sich konservieren: z. B. durch Einfrieren vegetativer Zellen von Agarplatten oder Flüssigkulturen in Peptonlösung bei -80°C oder in flüssigem Stickstoff.

A. 4. Leistungen des Produktionsstamms:
In Zellextrakten, oder zum Teil auch in XAD-Eluaten von Pl 3007 ist eine Aktivität nachweisbar, die im Agardiffusionstest das Wachstum gewisser Pilze hemmt (vgl. unten). Die Substanz besteht chemisch unter anderem aus 3 Thiazollinkernen und einem Oxazolkern und wurde Thiangazol genannt.

A. 5. Zugänglichkeit des Stammes:
Der Produktionsstamm ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Braunschweig als Patentstamm unter der Nr. DSM 6267 hinterlegt.

A. 6. Nachweis von Thiangazol:
Zum qualitativen Nachweis von Thiangazol werden Zellmassen mit Aceton extrahiert oder die Kulturen mit dem Adsorberharz XAD 1180 (Fa. Röhm und Haas) gerührt und das XAD nach Absieben mit Methanol und Aceton eluiert. Aliquote der konzentrierten Extrakte werden auf Hemmung z. B. des Pilzes Mucor hiemalis getestet und im dünnschichtchromatischen Test wird Thiangazol im Vergleich mit der Reinsubstanz identifiziert. Die Aufarbeitung, Isolierung und chemische Charakterisierung erfolgt gemäß Abschnitt B.

A. 7. Produktionsbedingungen von Thiangazol:
In Schüttelkolben wird Thiangazol während des Wachstums gebildet und erreicht am Ende der logarithmischen bis frühen stationären Phase die höchste Aktivität.

Fermentationsbeispiel im Bioreaktor

Bioreaktor (b50) mit 65 l Inhalt der Fa. Giovanola Frres, Monthey, Schweiz, mit 2 Scheibenrührern. Medium: Probion PS/Einzellerprotein aus Methylomonas clarae; Hoechst, Frankfurt) 0,4%; Stärke 0,3%; MgSO₄ · 7 H₂O 0,1%, CaCl₂ · 2H₂O 0,05%; Standard-Spurenelementlösung 1 ml/l (siehe oben) und Cyanocobalamin 0,5 mg/l; pH 7,2. 60 l Medium werden mit 5 l Kultur aus gut bewachsenen Schüttelkolben beimpft. Die Belüftungsrate wird auf 200 Nl/Stunde, die Drehzahl auf 200 UpM eingestellt, der pO₂, der zu Beginn der Fermentation 100% Sättigung beträgt, sinkt bis zum Ende der Fermentation nach 95 Stunden kontinuierlich auf 85%. Der pH-Wert steigt im Verlauf der Fermentation von 7,0 auf 7,2 an.

Isolierung von Thiangazol

309 g feuchte Zellmasse Polyangium Pl 3007 werden mit 500 ml Aceton gerührt. Der feste Rückstand wird abzentrifugiert und viermal jeweils mit ca. 150 ml Aceton 30 min extrahiert und abzentrifugiert. Die vereinigten Acetonüberstände werden i. Vak. eingeengt. Der Eindampfrückstand (6,7 g) wird in Ether/Wasser gelöst. Die Wasserphase wird dreimal mit Ether extrahiert und verworfen. Die vereinigten Etherphasen werden i. Vak. eingeengt (3,45 g) und im Methanol/Heptan gelöst. Nach Abtrennung der Heptanphase wird die Methanolphase dreimal mit Heptan extrahiert und i. Vak. eingeengt (1,93 g). Die Heptanphasen werden verworfen. Das Rohprodukt aus der Methanolphase wird mit 500 ml t-Butylmethylether über 50 ml Florisil filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum eineengt und mit Benzin versetzt. 82 mg des Produktes werden kristallin abgetrennt. Die Mutterlauge wird durch Mitteldruckchromatographie gereinigt (Säule (⌀ · Länge) 37 · 420 mm, Kieselgel 15 µ, 60 Å (HD-SIL-15-60, Fa. Kronwald), Laufmittel Benzin/tert.-Butylmethylether/Methanol 50/49/1, 28 ml/min, Detektion UV-Absorption bei 278 mm). Der Hauptpeak (t_R ≈ 45 min) wird vereinigt und in tert.-Butylmethylether/Benzin kristallisiert (35 mg). Ausbeute 117 mg.

Daten von Thiangazol

Nachweis von Thiangazol durch analytische HPLC: Säule (⌀ · Länge) 4 · 250 mm, gepackt mit HD-SIL 18-5-100 (Fa. Kronwald), Detektion UV-Absorption bei 290 mm, Laufmittel Methanol/Wasser (80 : 20), Fluß 1,5 ml/min, t_R = 5,8 min; mit Methanol/Wasser (75/25) t_R = 10,5 min.
Smp. 140°C.
UV (Methanol): λ_max (ε/lg ε) = 211 (sh), 218 (sh), 223 (37884/4.578), 228 (sh), 288 (36384/4/4.561), 300 (sh), (sh = Schulter).
IR (CHCl₃): 3432 (m), 1664 (s), 1633 (s), 1577 (m), 1567 (m) 1536 (m), 1465 (w), 1449 (w), 1413 (w), 1370 (w), 1168 (m), 1102 (m), 1015 (m), 963 (m) cm^-1
(s = stark, m = mittelstark, w = wenig intensiv).
¹H-NMR (CDCl₃), 300,133 MHz): δ = 7,48 (m, 2H), 7,35 (m, 3H), 7,13 (d, 1H, J=16,2 Hz), 7,04 (d, 1H, J=16,2 Hz), 6,91 (m, 1H), 3,85 (d, 1H, J=11,2 Hz), 3,81 (d, 1H, J=10,6 Hz), 3,74 (d, 1H, J=11,4 Hz), 3,37 (d, 1H, J=11,2 Hz), 3,27 (d, 1H, J=11,4 Hz), 3,20 (d, 1H, J=11,3 Hz), 2,93 (d, 3H, J=5,1 Hz), 2,63 (s, 3H), 1,68 (s, 3H), 1,66 (s, 3H), 1,59 (s, 3H).
¹³C-NMR (CDCl₃, 75.473 MHz): δ = 179,22 s, 178,07 s, 167,90 s, 162,50 s, 162,36 s, 153,39 s, 141,99 d, 135,12 s, 129,73 d, 129,18 s, 128,92 d(2C), 127,62 d(2C), 122,48 d, 83,69 s, 83,53 s, 79,45 s, 43,22 t, 42,50 t, 41,99 t, 26,15 q, 25,70 q, 25,53 q, 24,38 q, 11,75 q. (s, d, t und q bezeichnen die Signalmultiplizitäten, die ein SFORD ¹³C-NMR- Spektrum ergeben würde. 2C bedeutet doppelte Signalintensität).
(+)FAB-MS (Xenon, Matrix 3-Nitrobenzylalkohol): m/z = 540 = (M+H)⁺.
Hochauflösung
[C₂₆H₂₉N₅O₂S₃+H] Ber. 540.1562, Gef. 540.1688 (FAB-MS)
EI-MS (210°C, 70 eV): m/z (%) = 541 (2,1), 540 (5,1), 539 (14) [M⁺], 524 (12), 493 (16), 379 (4,5), 337 (20), 301 (50), 280 (21), 260 (44), 213 (23), 202 (74), 182 (18), 172 (31), 150 (14), 140 (19), 130 (22), 115 (21), 103 (10), 85 (22), 73 (100).
Hochauflösungen
C₂₆H₂₉N₅O₂S₃ Ber. 539.1483, Gef. 539.1488 (EI-MS)
C₂₅H₂₇N₅O₂S₂ Ber. 493.1606, Gef. 493.1604 (EI-MS)
C₁₄H₁₇N₄O₂S₂ Ber. 337.0793, Gef. 337.0793 (EI-MS)
C₁₆H₁₇N₂S₂ Ber. 301.0833, Gef. 301.0833 (EI-MS)
C₁₃H₁₂N₂S₂ Ber. 260.0442, Gef. 260.0444 (EI-MS)
C₁₂H₁₂N₁S₁ Ber. 202.0690, Gef. 202.0691 (EI-MS)
Handelsbezeichnungen
HD-SIL-15-60 und HD-SIL-18-5-100 (Kronwald; vgl. Anlage) Florisil (Floridin Corp.; Magnesiumsilicatgel)

Anti-HIV-1-Aktivität und Zytotoxität im MT-4-Zelltest

Thiangazol wurde im MT-4-Zellsystem (Harada et al.; 1986) auf die Anti-HIV-1-Wirkung und Zelltoxizität untersucht. MT-4 ist eine humane T-Zellinie, die durch eine HIV-1-Infektion stark geschädigt wird und abstirbt.

In Abwandlung zu dem von Harada und Mitarbeiter beschriebenen MT-4-Zelltest (1986) wurden für den hier durchgeführten Zelltest Kulturüberstände aus der HIV-1 produzierenden Jurkat-Zellinie eingesetzt, die durch Infektion lymphozytärer Jurkat-Zellen (Wendler et al.; 1987) mit dem HIV-1-Typ HTLLV-IIIB aus H9-Zellen (Popovic et al.; 1984) entstanden ist.

Als Gewebekulturmedium wurde für Jurkat- und MT-4-Zellen sterilfiltriertes Medium RPMI 1640 (Gibco, Karlsruhe) unter Zusatz von 10% komplementinaktiviertem (30 Minuten, 56°C) fötalen Rinderserum (Seromed. Berlin) sowie Antibiotika verwendet. Während der Durchführung des MT-4-Zelltests wurde zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes dem Medium 25 mM HEPES (2-4(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinylethansulfonsäure, Merck, Darmstadt) zugefügt. Die Zellkulturen wurden in einem Inkubator (Heraeus) bei 37°C mit einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre mit 6% CO₂ inkubiert.

Der MT-4-Zelltest wurde in Mikrotiterplatten durchgeführt. Pro Loch wurden 3×10⁴ MT-4-Zellen mit verschiedenen Substanzverdünnungen mit und ohne HIV-1 kultiviert. Thiangazol wurde in einer Anfangskonzentration von 250 µg/ml gefolgt von 1 : 10er Verdünnungen austitriert. Für die Virusinfektion wurde eine zuvor austitrierte Virusdosis von 100 TCID₃₀ eingesetzt. Nach drei Tagen Kultivierung wurde frisches Medium RPMI 1640 zugegeben. Vier Tage nach Testansatz wurden 0,1 µci ³H-Thymidin pro Loch der Mikrotiterplatte zugegeben. Die Zellen wurden 20 Stunden später auf Glasfiberfilter geerntet, mit Wasser gewaschen und der ³H- Thymidineinbau in der Zell-DNA nach Zugabe eines flüssigen Szintillators Toluol/POPOP (Roth, Karlsruhe) im β-Zähler (Packard, Frankfurt) gemessen. Niedrige Einbauraten weisen auf einen virusbedingten Zelltod bzw. die Toxizität der Substanz hin, hohe auf eine Hemmung der HIV-1-Infektion. Der ³H-Thymidineinbau wurde in Abhängigkeit der Substanzkonzentration graphisch dargestellt und die Toxizität sowie die maximale antivirale Wirksamkeit der Substanz ermittelt. Die Ergebnisse wurden mit denen des Nukleosidanalogen 3′-Azido-3′-deoxythymidin (AZT) verglichen.

In der Abb. 1 wurden die ³H-.Thymidineinbauraten der mit HIV-1 und ohne Viruszugabe kultivierten MT-4-Zellen den Substanzverdünnungen gegenübergestellt. Dabei wurde der ³H-Thymidineinbau (cpm) in die Zell-DNA gegen die Substanzkonzentration (nM) von (B) Thiangazol und (D) AZT aufgetragen. Die Zellen wurden mit Substanz in Anwesenheit (- - -) und in Abwesenheit von HIV-1 (- - -) kultiviert. Die für MT-4-Zellen maximale nicht toxische Substanzkonzentration, sowie die maximalen und therapeutischen Konzentrationen wurden aus den Graphiken ermittelt und in Tabelle 1 zusammengefaßt. Die Toxität des Thiangazols lag außerhalb der Untersuchungskonzentrationen und somit oberhalb von 46,5 µM.

Thiangazol wurde bisher noch nicht stark genug ausgedünnt, so daß die minimale therapeutische Substanzkonzentration noch nicht bestimmt werden konnte. Thiangazol zeigte noch in der Konzentration von 0,047 nM Anti-HIV-Wirksamkeit. In Tabelle 1 wird der Selektivitätsindex (SI) der untersuchten Substanz aufgeführt. Er beschreibt das Verhältnis der auf die MT-4-Zellen toxisch wirkenden Substanzkonzentration zu der Substanzkonzentration, bei der eine HIV-1-Infektion zu 100% verhindert wird. Thiangazol ist in seiner Fähigkeit, eine HIV-1-Infektion zu verhindern, mit der hohen Wirksamkeit von AZT mit einem SI von 10⁴ zu vergleichen.

Tabelle 1

Vergleich der Toxizität und anti-HIV-1-Wirksamkeit der Reinsubstanz mit AZT.

Literatur:
Harada, S., Purtilo, D. T., Koyanagi, Y., Sonnabend, J., Yamamoto, N. (1986), Sensitiva assay for neutralizating antibodies against AIDS-related viruses (HTLV-III/LAV). J. Immunol. Meth. 92, 177-181.
Popovic, M., Sarngadharan, M. G., Read, E., Gallo, R. C. (1984). Detection, isolation and production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS. Science 224, 497- 500.
Wendler, I., Jentsch, K. D., Schneider, J., Hunsmann, G. (1987). Efficient replication of HTLV-III and STLV-IIImac in human Jurkat cells. Med. Microbiol. Immunol. 176, 273-280.

Claims

1. Therapeutisches Mittel zur Bekämpfung von Viruserkrankungen, enthaltend Thiangazol der folgenden allgemeinen Formel oder ein therapeutisch verträgliches Säureadditionssalz davon:

2. Therapeutisches Mittel nach Anspruch 1 zur Bekämpfung von Erkrankungen durch Retroviren.

3. Therapeutisches Mittel nach Anspruch 2 zur Bekämpfung von HIV.