DE4041281C2 - Therapeutische Mittel zur Bekämpfung von Viruserkrankungen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft therapeutische Mittel zur Bekämpfung von Viruserkrankungen, enthaltend eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel

Ferner betrifft die Erfindung ein derartiges therapeutisches Mittel, enthaltend eine Verbindung mit mindestens einem der folgenden Parameter gegebenenfalls neben einem üblichen Träger und/oder Verdünnungsmittel:

Nachweis der Verbindung durch analytische HPLC: Säule (⌀ · Länge) 4 · 250 mm, gepackt mit HD-Sil 18-5-100 (Fa. Kronwald), Detektion UV-Absorption bei 210-250 nm, Laufmittel Methanol/Wasser (80 : 20), Fluß 1,5 ml/min, t_R = 7,9 min. - Smp. 92-94°C. -

UV (Methanol): λ_max (ε/lg ε) = 204 (75420/4.877), 229 (53850/4.731), 244 (sh), 252 (sh), 262 (sh), 274 (sh). -

NMR-Spektroskopie:

¹H-NMR ([D₄]Methanol, 600,127 MHz): δ = 8,39 (s, 1H), 7,30 (m, 2H), 7,19 (m, 3H), 6,33 [s, 1H, (br.)], 4,10 (s, 3H), 3,15 (t, 1H, J = 7,4 Hz), 2,88 (q, 3H, J = 7,4 Hz), 2,72 [t, 1H, J = 7,4 Hz (br.)], 1,93 (d, 3H, J = 1,2 Hz), 1,88 (s, 3H), 1,11 (t, 3H, J = 7,4 Hz). -
¹³C-NMR ([D₄]Methanol, 75,5 MHz): δ = 182,65 s, 166,89 s, 164,46 s, 149,75 s, 140,70 d, 139,58 s, 137,80 s, 135,31 s, 130,00 d (2C), 129,22 d (2C), 127,84 d, 127,42 d, 126,37 s, 101,11 s, 56,85 q, 38,82 t, 27,85 t, 18,58 t, 17,76 q, 14,00 q, 7,30 q. -

Massenspektroskopie:

(+)FAB-MS (Xenon, Matrix Glycerol). m/z = 380 [M+H]⁺. -
EI-MS (70 eV, 160 C, m/z <90): m/z (%) = 379 (100), 365 (22), 364 (88), 336 (5), 323 (14), 308 (13), 234 (49), 207 (10), 194 (18), 192 (12), 171 (14), 156 (16), 143 (11), 131 (69), 129 (37), 128 (17), 116 (26), 115 (31), 91 (92). -
Hochauflösung: C₂₃H₂₅NO₄ Ber. 379,1783 Gef. 379,1781 (EI-MS)

Gemäß speziellen Ausführungsformen betrifft die Erfindung ein derartiges therapeutisches Mittel zur Bekämpfung von Erkrankungen durch Retroviren, beispielsweise zur Bekämpfung von HIV.

Verbindungen der vorstehend angeführten allgemeinen Formel lassen sich dadurch gewinnen, daß man Polyangium DSM 6270

• - in einem Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Mineralsalze enthaltenen Medium kultiviert,
• - die Zellmasse von der Kultur abtrennt und
• - mit Aceton extrahiert,
• - den Extrakt einengt,
• - in Essigsäureethylester/Wasser aufnimmt,
• - die Esterphase einengt,
• - das Konzentrat in Methanol/Heptan aufnimmt,
• - die methanolische Phase einengt und mit tert.-Butylmethylether versetzt,
• - die flüssige Phase gegebenenfalls über Kieselgel filtriert und
• - die Verbindung (antivirale Aktivität) in an sich bekannter Weise von der flüssigen Phase abtrennt und gewinnt.

Die genannten Verbindungen lassen sich aus tert.-Butylmethylether/Petrolether kristallisieren.

Eine Verbindung mit einem oder mehreren der vorstehend angegebenen Parameter läßt sich durch UV-Bestrahlung in sein Cis-Trans-Isomeres überführen.

Nachstehend wird die Erfindung mit experimentellen Daten näher erläutert.

A. Produktionsbedingungen

A.1. Produktionsstamm: Das Bakterium Polyangium spec., Stamm Pl VO 19 Familie Polyangiaceae, Unterordnung Sorangineae, Ordnung Myxobacterales.

A.2. Herkunft des Produktionsstamms: Isoliert im März 1988 an der GBF aus einer Erdprobe von Ephesos, Türkei.

A.3. Beschreibung des Produktionsstamms: Die vegetativen Zellen sind zylindrisch mit breit abgerundeten Enden, 0,6-0,7 × 2-5 µm. Auf festen Nährböden wächst der Organismus gut auf Hefeagar, z. B. VY/2 Agar (Backhefe 0,5%, bezogen auf Frischgewicht; CaCL₂ · 2H₂O 0,1%, Cyanocobalamin 0,5 mg/l, Agar 1,5%; pH 7,2). Auf reinen Glucose-Mineralsalz-Medien ist kein Wachstum zu beobachten. Proteine werden rasch hydrolysiert, z. B. Casein oder Einzellerprotein. Chitin wird nicht angegriffen. Der Stamm wächst bevorzugt bei 30°C, im neutralen pH-Bereich und aerob. Auf geeigneten Nährboden breitet sich die Kolonie allmählich über die Kulturplatte aus und dringt dabei tief in den Agar ein. Auf der Oberfläche bilden sich kurze breite radiale Gräben. Sind Hefezellen im Nährboden vorhanden, werden sie weitgehend abgebaut. Nach einigen Tagen können Fruchtkörper entstehen: Diese bestehen aus kleinen graubraunen Sporangiolen, von etwa 15-30 µm Durchmesser, die in flachen Haufen dicht zusammengelagert sind. Im Innern findet man Myxosporen, die morphologisch den vegetativen Zellen sehr ähneln, physiologisch aber trocknungsresistente Ruhezellen darstellen. In Flüssigmedien wächst der Stamm in kleinen Zellklümpchen, sowohl in Schüttelkolben bei 160 rpm (100 ml Medium in 250 ml Erlenmeyerkolben bzw. 500 ml Medium in 1000 ml Erlenmeyerkolben), als auch in Bioreaktoren (getestet bis zum 60 l Maßstab). Als Kulturmedium ist z. B. Pol 1 - Medium geeignet: Probion PS (Einzellerprotein aus Methylomonas clarae; Hoechst, Frankfurt) 0,4%; Stärke 0,3%; MgSO₁ · 7 H₂O 0,1%: CaCl₂ · 2 H₂O 0,05%; 1 ml/l Standard-Spurenelementlösung (Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie 6. Auflage, S. 174, Thieme-Verlag, Stuttgart 1985) und 1 ml/l Standardvitaminlösung (Schlegel, loc. cit. Seite 174 pH 7,0. Die Kulturen werden bei 30°C über 3-4 Tage gehalten.
Pl VO 19 läßt sich konservieren: z. B. durch Einfrieren vegetativer Zellen von Agarplatten oder Flüssigkulturen in Peptonlösung bei -80° oder flüssigen Stickstoff.

A. 4. Leistungen des Produktionsstamms: In Zellextrakten, zum Teil auch in XAD-Eluaten (siehe unten) von Pl VO 19 ist anti-HIV Aktivität im Zelltest nachweisbar. In vitro läßt sich eine Hemmung der reversen Transcriptase sowohl in einem HIV-Lysat als auch in Isolaten aus M-MuLV Virus nachweisen.

A. 5. Zugänglichkeit des Stammes: Der Produktionsstamm Pl VO 19 ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig als Patentstamm unter der Nr. DSM 6270 hinterlegt.

A. 6. Nachweis der pyronhaltigen Substanz: Zum qualitativen Nachweis der Verbindung werden Zellmassen mit Aceton extrahiert. Alternativ können die Kulturen auch mit XAD 1180 (Fa. Röhm & Haas, Frankfurt) gerührt und das XAD nach Absieben mit Methanol und Aceton eluiert werden. Aliquote der konzentrierten Extrakte werden auf Hemmung der reversen Transcriptase aus dem Moloney Murine Leukemia (M-MuLV) getestet. Im dünnschichtchromatischen Test wird die pyronhaltige Substanz im Vergleich mit isolierter Reinsubstanz identifiziert. Die Aufarbeitung, Isolierung und Charakterisierung erfolgt gemäß Abschnitt B.

A. 7. Produktionsbedingungen der pyranhaltigen Substanz: In Schüttelkolben wird die Verbindung während des Wachstums gebildet und erreicht am Ende der logarithmischen bis frühen stationären Phase nach 3-4 Tagen die höchste Aktivität.

Fermentationsbeispiel im Bioreaktor

Bioreaktor (b50) mit 65 l Inhalt der Fa. Giavanola Freres, Monthey, Schweiz, mit Blattrührer. Medium: Probion PS (Einzellerprotein aus Methylomonas clarae; Hoechst, Frankfurt) 0,4%; MgSO₁ · 7 H₂O 0,1%; CaCl₁ · 2 H₂O 0,05%; Standard-Spurenelement- und Vitaminlösung je 1 ml/l (Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie); pH 7,2. 60 l Medium werden mit 5 l Kultur aus gut bewachsenen Schüttelkolben beimpft. Die Belüftungsrate wird auf 200 Nl/Stunde, die Drehzahl auf 200 UpM eingestellt. Der pO₂-Wert, der zu Beginn der Fermentation 90% Sättigung beträgt, sinkt bis zum Ende der Fermentation nach 100 Stunden kontinuierlich bis auf 50%. Der pH-Wert steigt im Verlauf der Fermentation von 7,0 auf 7,5 an.

In Zellextrakten, zum Teil auch in XAD-Eluaten (siehe unten) von Pl VO 19 ist ferner eine antibiotische Aktivität gegen einige Pilze (z. B. Botrytis cinerea) nachweisbar.

Aliquote der konzentrierten Extrakte werden ferner im Agardiffusionstest gegen Pilze getestet. Im dünnschichtchromatischen Test wird die Substanz im Vergleich mit isolierter Reinsubstanz identifiziert.

B. Gewinnung und Charakterisierung Isolierung einer Verbindung für erfindungsgemäßes Mittel

Aus einer 60-l-Fermentation des Stammes Pl vo19 werden 615 g feuchte Zellmasse gewonnen und viermal mit ca. 150 ml Aceton extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden i. Vak. eingeengt und zwischen Essigsäureethylester und Wasser verteilt. Bei schlechter Phasentrennung wird gesättigte NaCl-Lösung zugesetzt. Die organische Phase wird eingeengt (7,7 g) und zwischen Methanol und Heptan verteilt. 3,9 g Rohprodukt aus der Methanol-Phase werden in tert.-Butylmethylether aufgenommen und über 50 ml Kieselgel filtriert. Die mit tert.-Butylmethylether eluierten 3,2 g werden anschließend in Butylmethylether über 100 ml Florisil filtriert. Das verbindungshaltige Eluat wird in zwei Portionen mit 346 mg und 139 mg Gewicht vereinigt, die zur Kristallisation in tert.-Butylmethylether/Petrolether gelagert werden. Es werden 146 bzw. 39 mg der Verbindung kristallin abgetrennt. Weitere 68 mg ergeben sich bei der Kristallisation der vereinigten Mutterlaugen; Ausbeute 253 mg.

Daten der Verbindung

Nachweis der Verbindung durch analytische HPLC: Säule (⌀ · Länge) 4 · 250 mm, gepackt mit HD-Sil 18-5-100 (Fa. Kronwald), Detektion UV-Absorption bei 210-250 nm, Laufmittel Methanol/Wasser (80:20), Fluß 1,5 ml/min, t_R = 7,9 min.
Smp. 92-94°C.

UV (Methanol): λ_max (ε/lg ε) = 204 (75420/4.877), 229 (53850/4.731), 244 (sh), 252 (sh), 262 (sh), 274 (sh). -

NMR-Spektroskopie:

¹H-NMR ([D₄]Methanol, 600,127 MHz): δ = 8,39 (s, 1H), 7,30 (m, 2H), 7,19 (m, 3H), 6,33 [s, 1H, (br.)], 4,10 (s, 3H), 3,15 (t, 1H, J = 7,4 Hz), 2,88 (q, 3H, J = 7,4 Hz), 2,72 [t, 1H, J = 7,4 Hz (br.)], 1,93 (d, 3H, J = 1,2 Hz), 1,88 (s, 3H), 1,11 (t, 3H, J = 7,4 Hz). -
¹³C-NMR ([D₄]Methanol, 75,5 MHz): δ = 182,65 s, 166,89 s, 164,46 s, 149,75 s, 140,70 d, 139,58 s, 137,80 s, 135,31 s, 130,00 d (2C), 129,22 d (2C), 127,84 d, 127,42 d, 126,37 s, 101,11 s, 56,85 q, 38,82 t, 27,85 t, 18,58 t, 17,76 q, 14,00 q, 7,30 q. -

Massenspektroskopie:

(+)FAB-MS (Xenon, Matrix Glycerol). m/z = 380 [M+H]⁺. -
EI-MS (70 eV, 160 C, m/z <90): m/z (%) = 379 (100), 365 (22), 364 (88), 336 (5), 323 (14), 308 (13), 234 (49), 207 (10), 194 (18), 192 (12), 171 (14), 156 (16), 143 (11), 131 (69), 129 (37), 128 (17), 116 (26), 115 (31), 91 (92). -
Hochauflösung: C₂₃H₂₅NO₄ Ber. 379,1783 Gef. 379,1781 (EI-MS)

C. Biologische Charakterisierung einer Verbindung für erfindungsgemäßes Mittel

Die Verbindung zeigt eine hohe anti-HIV-Aktivität in der Zellkultur (ID₅₀ 0,0025 µg/ml), mit einem Konzentrationsabstand von Wirkung und Toxizität in der Größenordnung von 4 Zehnerpotenzen. Die Enzymaktivität der reversen Transkriptase aus einem HIV-Lysat wird bei Zugabe von ca. 8 µg/ml zu 50% gehemmt, die aus dem Moloney Murine Leukemia Virus (M-MuLV) bei Zugabe von 100 µg/ml bis zu 20%.

Anti-HIV-1-Aktivität und Zytotoxität im MT-4-Zelltest

Die genannte Verbindung wurde im MT-4-Zellsystem (Harada et al.; 1986) auf die Anti-HIV-1-Wirkung und Zelltoxizität untersucht. MT-4 ist eine humane T-Zellinie, die durch eine HIV-1-Infektion stark geschädigt wird und abstirbt.

In Abwandlung zu dem von Harada und Mitarbeiter beschriebenen MT-4-Zelltest (1986) wurden für den hier durchgeführten Zelltest Kulturüberstände aus der HIV-1 produzierenden Jurkat-Zellinie eingesetzt, die durch Infektion lymphozytärer Jurkat-Zellen (Wendler et al.; 1987) mit dem HIV-1-Typ HTLLV-IIIB aus H9-Zellen (Propovic et al.; 1984) entstanden ist.

Als Gewebekulturmedium wurde für Jurkat- und MT-4-Zellen sterilfiltriertes Medium RPMI 1640 (Gibco, Karlsruhe) unter Zusatz von 10% komplementinaktiviertem (30 Minuten, 56°C) fötalen Rinderserum (Seromed, Berlin) sowie Antibiotika verwendet. Während der Durchführung des MT-4-Zelltests wurde zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes dem Medium 25 mM HEPES (2-4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinylethansulfonsäure, Merck, Darmstadt) zugefügt. Die Zellkulturen wurden in einem Inkubator (Heraeus) bei 37°C mit einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre mit 6% CO₂ inkubiert.

Der MT-4-Zelltest wurde in Mikrotiterplatten durchgeführt. Pro Loch wurden 3 × 10⁴ MT-4-Zellen mit verschiedenen Substanzverdünnungen mit und ohne HIV-1 kultiviert. Die Verbindung wurde in einer Anfangskonzentration von 250 µg/ml gefolgt von 1 : 10er Verdünnungen austitriert. Für die Virusinfektion wurde eine zuvor austitrierte Virusdosis von 100 TCID₃₀ eingesetzt. Nach drei Tagen Kultivierung wurde frisches Medium RPMI 1640 zugegeben. Vier Tage nach Testansatz wurden 0,1 µci ³H-Thymidin pro Loch der Mikrotiterplatte zugegeben. Die Zellen wurden 20 Stunden später auf Glasfiberfiltern geerntet, mit Wasser gewaschen und der ³H-Thymidineinbau in der Zell-DNA nach Zugabe eines flüssigen Szintillators Toluol/POPOP (Roth, Karlsruhe) im β-Zähler (Packard, Frankfurt) gemessen. Niedrige Einbauraten weisen auf einen virusbedingten Zelltod bzw. die Toxizität der Substanz hin, hohe auf eine Hemmung der HIV-1-Infektion. Der ³H-Thymidineinbau wurde in Abhängigkeit der Substanzkonzentration graphisch dargestellt und die Toxizität sowie die maximale antivirale Wirksamkeit der Substanz ermittelt. Die Ergebnisse wurden mit denen des Nukleosidanalogen 3′-Azido-3′-deoxythymidin (AZT) verglichen.

In der Abb. 1 wurden die ³H-Thymidineinbauraten der mit HIV-1 und ohne Viruszugabe kultivierten MT-4-Zellen den Substanzverdünnungen gegenübergestellt. Dabei wurde der ³H-Thymidineinbau (cpm) in die Zell-DNA gegen die Substanzkonzentration (nM) von (A) der genannten Verbindung und (D) AZT aufgetragen. Die Zellen wurden mit Substanz in Anwesenheit (---) und in Abwesenheit von HIV-1 (- - -) kultiviert. Die für MT-4-Zellen maximale nicht toxische Substanzkonzentration, sowie die maximalen und therapeutischen Konzentrationen wurden aus den Graphiken ermittelt und in Tabelle 1 zusammengefaßt. Die Toxität der Verbindung lag außerhalb der Untersuchungskonzentrationen und somit oberhalb von 66 bzw. 46,5 µM.

Die genannte Verbindung unterdrückte den HIV-1-bedingten Zelltod bei einer Konzentration oberhalb von 0,66 nM. Bei der Konzentration von 6,6 µM konnte die genannte Verbindung eine 100prozentige Inhibition der HIV-1-Infektion in den MT-4-Zellen bewirken. In Tabelle 1 wird der Selektivitätsindex (SI) der untersuchten Substanz aufgeführt. Er beschreibt das Verhältnis der auf die MT-4-Zellen toxisch wirkenden Substanzkonzentration zu der Substanzkonzentration, bei der eine HIV-1-Infektion zu 100% verhindert wird. Die genannte Verbindung ist in ihrer Fähigkeit, eine HIV-1-Infektion zu verhindern, mit der hohen Wirksamkeit von AZT mit einem SI von 10⁴ zu vergleichen.

Tabelle 1

Vergleich der Toxizität und anti-HIV-1-Wirksamkeit der Reinsubstanz mit AZT.

Literatur

Harada, S., Purtilo, D. T., Koyanagi, Y., Sonnabend, J., Yamamoto, N. (1986), Sensitive assay for neutralizating antibodies against AIDS-ralated viruses (HTLV-III/LAV), J. Immunol. Meth. 92, 177-181.
Popovic, M., Sarngadharan, M. G., Read, E., Gallo, R. C. (1984). Detection, isolation and production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS, Science 224, 497-500.
Wendler, I., Jentsch, K. D., Schneider, J., Hunsmann, G. (1987). Efficient replication of HTLV-III and STLV-IIImac in human Jurkat cells. Med. Microbiol. Immunol. 176, 273-280.

Verwendete Handelsbezeichnungen:
HD-Sil 18-5-100 (Kronwald)
XAD 1180 (Rohm & Haas)

Claims (4)

1. Therapeutische Mittel zur Bekämpfung von Viruserkrankungen, enthaltend eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel:

2. Therapeutisches Mittel nach Anspruch 1, enthaltend eine Verbindung mit mindestens einem der folgenden Parameter: Analytische HPLC: Säule (⌀ · Länge) 4 · 250 mm, gepackt mit HD-Sil 18-5-100 (Fa. Kronwald), Detektion UV-Absorption bei 210-250 nm, Laufmittel Methanol/Wasser (80 : 20), Fluß 1,5 ml/min, t_R = 7,9 min.UV (Methanol): λ_max (ε/lg ε) = 204 (75420/4.877), 229 (53850/4.731), 244 (sh), 252 (sh), 262 (sh), 274 (sh).NMR-Spektroskopie:¹H-NMR ([D₄]Methanol, 600,127 MHz): δ = 8,39 (s, 1H), 7,30 (m, 2H), 7,19 (m, 3H), 6,33 [s, 1H, (br.)], 4,10 (s, 3H), 3,15 (t, 1H, J = 7,4 Hz), 2,88 (q, 3H, J = 7,4 Hz), 2,72 [t, 1H, J = 7,4 Hz (br.)], 1,93 (d, 3H, J = 1,2 Hz), 1,88 (s, 3H), 1,11 (t, 3H, J = 7,4 Hz). -
¹³C-NMR ([D₄]Methanol, 75,5 MHz): δ = 182,65 s, 166,89 s, 164,46 s, 149,75 s, 140,70 d, 139,58 s, 137,80 s, 135,31 s, 130,00 d (2C), 129,22 d (2C), 127,84 d, 127,42 d, 126,37 s, 101,11 s, 56,85 q, 38,82 t, 27,85 t, 18,58 t, 17,76 q, 14,00 q, 7,30 q.Massenspektroskopie:(+)FAB-MS (Xenon, Matrix Glycerol). m/z = 380 [M+H]⁺. -
EI-MS (70 eV, 160 C, m/z <90): m/z (%) = 379 (100), 365 (22), 364 (88), 336 (5), 323 (14), 308 (13), 234 (49), 207 (10), 194 (18), 192 (12), 171 (14), 156 (16), 143 (11), 131 (69), 129 (37), 128 (17), 116 (26), 115 (31), 91 (92). -
Hochauflösung: C₂₃H₂₅NO₄ Ber. 379,1783 Gef. 379,1781 (EI-MS)
wobei die Verbindung einen Schmelzpunkt von 92-94°C aufweist.

3. Therapeutisches Mittel nach Anspruch 1 oder 2 zur Bekämpfung von Erkrankungen durch Retroviren.

4. Therapeutisches Mittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Bekämpfung von HIV.