DE4041463A1 - 5-cyanmethylen-10-(piperazin-1-yl)-dibenzo(a,d)cycloheptene zur bekaempfung der migraene - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Verwendung von 5-Cyan­ methylen-10-(piperazin-1-yl)-dibenzo[a,d]cycloheptenen.

5-Cyanmethylen-10-(piperazin-1-yl)-dibenzo[a,d]cycloheptene sind bereits aus der EP-PS 35 711 bekannt. Für diese Verbindungen sind neuroleptische, sedative, hypnotische und tranquilisierende Wirkungen beschrieben worden.

Es wurde nun gefunden, daß 5-Cyanmethylen-10-(piperazin-1-yl)-dibenzo­ [a,d]cycloheptene der Formel I

in der

R¹ ein Wasserstoffatom oder ein C_1-3-Alkylrest ist und
R² und R³ Wasserstoffatome sind oder einer der Reste R² und R³ auch ein Fluor- oder Chloratom darstellen kann,

sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren auch eine gute Wirkung gegen Migräne besitzen.

Besonders ausgeprägt ist die neue Wirkung beim (E), (Z) -5-Cyanmethylen-2- chlor-10-(4-methylpiperazin-1-yl)-dibenzo[a,d]cyclohepten und insbesondere beim (Z)-Isomeren (A).

Die Herstellung der Verbindungen I ist in der EP-PS 35 711 beschrieben. Dasselbe gilt für die Trennung der Verbindungen I in die cis- und trans- Isomeren sowie für die Herstellung von galenischen Applikationsformen mit den Verbindungen I.

Die Wirkung der Verbindungen I gegen Migräne ergibt sich aus ihrer hohen Affinität zu 5-Hydroxytryptamin (5-HT_1D)-Rezeptoren, die wesentlich stärker ist als die des Sumatriptans (Merck-Index, 11. Auflage 1989: Nr. 8979).

Die Wirkung wurde durch folgende Versuche gezeigt:

• 1) 5-HT_1D-Rezeptortest mit Großhirnrinde vom Rind
  Rinderhirn wurde sofort nach Entnahme in 0,32 M Sucroselösung (4°C) gelegt und in Eis transportiert. Die frontale Hirnrinde wurde mit ca. 5 Volumen Sucroselösung bei 0°C im Potter-Elvehjem-Homogenisator homogenisiert. Das Homogenat wurde 15 min bei 3000 xg zentrifugiert, der Überstand gesammelt und bei 40 000 xg zentrifugiert (10 min, 4⁰C). Das Pellet wurde durch Resuspension und Rezentrifugation 2mal mit Puffer (50 mM Tris-HCl, PH 7,4) gewaschen und kurz homogenisiert. Das Homogenat wurde portioniert und in flüssigem Stickstoff aufgenommen. Die Proteinbestimmung erfolgte mit dem BCA-Protein-Assay (Pierce, Rockford, Illinois, USA).
  Das Homogenat wurde mit Inkubationspuffer (50 mM Tris-HCl, 10 µM Pargylin, 4 mM CaCl₂; 0,1% Ascorbinsäure, pH 7,7) verdünnt.
  Die Testansätze (1 ml) setzten sich zusammen aus: 600 µg Homogenat, 53 nM ³H-Serotonin (NEN, Dreeich; spezifische Radioaktivität 23,2 Ci/mmol). Zur Belegung der 5-HT_1A- und 5-HT_1C-Rezeptoren wurde den Ansätzen 100 nM 8-Hydroxydipropylaminotetralin und 10 nM Mianserin zugegeben. Die Bestimmung der unspezifischen Bindung erfolgte mit 1 µM Serotonin; sie betrug 65% der totalen Bindung.
• 2) Vektorkonstruktion für die transiente Expression des 5HT_1D-ähnlichen Rezeptors
  Die für den 5HT_1D-ähnlichen Rezeptor kodierende cDNA wurde mit Hilfe der Restriktionsenzyme HindIII und EcoRI aus dem Vektor mp18 isoliert und mit den kommerziell von der Firma Luvitrogen erhältlichen BstXI Linkern mit der Sequenz versehen. Danach wurde die so modifizierte DNA-Sequenz des SHT_1D-ähn­ lichen Rezeptors in den ebenfalls von der Firma Luvitrogen kommerziell erhältlichen Klonierungsvektor pCDM8 integriert. Dazu wurde der Vektor mit dem Enzym BstXI restringiert und das sogenannte Stuffer-Fragment gelelektrophoretisch von dem Vektor abgetrennt. Nach Gelelution des um das Stuffer-Fragment verkürzten pCDM8-Vektors wurde die mit BstXI-Linkern versehene für den 5HT_1D-ähnlichen Rezeptor kodierende DNA in den wie oben beschrieben vorbehandelten pCDM8 ligiert. Die Ligation fand bei 12°C statt und dauerte 14 h. Die verwendeten Metho­ den sind in "Current Protocols in Molecular Biology" Band I und II, veröffentlicht von Greene Publishing Associates and Wiley Interscience ISBN 0-471-50 338-x, beschrieben.
• 3) Transiente Expression des klonierten 5HT_1D-ähnlichen Rezeptors in 293 Zellen
  Wenn nicht besonders beschrieben sind die Methoden zur Zellkultur in "Zell- und Gewebekultur" von Lindl und Bauer (Gustav Fischer Verlag) nachzulesen.
  293 Zellen wurden unter Standard-Bedingungen in einer 10-cm-Zell­ kulturschale bis zu einer Zellzahl von 7 bis 8×106 Zellen kulti­ viert. Nach Trypsinierung wurden die Zellen 1 : 3 in MEM Medium (Gibco 041 bis 1090 M), das 2,2 g/l NaHCO₃ enthielt, verdünnt und erneut in 10 cm Petrischalen ausgesät. Danach wurden die Zellen für 40 bis 48 h bei 37°C kultiviert.
  Die zu transfizierende DNA wurde wie folgt vorbereitet: 20 µg der DNA- Lösung (1 mg/ml), gereinigt über CsCl-Grandient, wurden mit 437 µl H₂O versetzt, danach wurden 62,5 µl 2 M CaCl₂ zugesetzt und schließlich 500 µl BBS. Diese Reihenfolge ist streng zu beachten. Innerhalb von 10 min bildeten sich bei Raumtemperatur Ca⁺⁺-Präzipitate.
  Die Lösung wurde auf eine 10-cm-Zellkulturschale mit den nach obiger Vorschrift kultivierten 293 Zellen gegeben. Nach vorsichtiger Durch­ mischung wurden die Zellen 15 bis 20 h in einem 3% CO₂-Inkubator bei 37°C kultiviert. Danach wurden vorsichtig 5 ml serumfreies Medium zugesetzt. Nach Entfernung des gesamten Mediums und Wiederholung des Waschvorgangs mit 5 ml serumfreiem Medium wurden den Zellen 10 ml Vollmedium zugesetzt. Nach 48 h Inkubation in einem 5% CO₂-Inkubator konnten die Zellen für pharmakologische und elektrophysiologische Untersuchungen verwendet werden.
  Den transfizierten und kultivierten Zellen wurden 2,5 ml kaltes PBS zugesetzt. Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden weitere 5 ml PBS zugegeben und die Zellen vorsichtig von der Oberfläche der Kulturschale heruntergewaschen. Die Zellsuspension wurde in ein Zentrifugenröhrchen überführt und bei ca. 1200 g 10 min lang zentri­ fugiert. Nach sorgfältiger Entfernung des Überstandes wurden die Zellen für Rezeptortests verwendet.
• 4) Rezeptortest mit einem Ratten 5-HT_1D-ähnlichen transient exprimierten Rezeptorklon
  Humane embryonale Nierenzellen aus Beispiel 3 wurden in 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 aufgenommen und mit Ultraschall (Sinifer 20 sec, 90% bei output 3, 0°C) homogenisiert. Das Homogenat wurde mit Inkubations­ puffer (50 µM Tris-HCl, 10 µM Pargylin, 4 µM CaCl₂, 0,1% Ascorbin- Säure, pH 7,7) verdünnt.
  Nach beendeter Inkubation des Homogenats (30 min bei 25°C) wurden die Ansätze über Glasfaserfilter (Whatman GF/F) filtriert und mit eis­ kaltem Puffer (50 µM Tris-HCl, pH 7,4) gewaschen. Die auf den Filtern Zurückgehaltene Radioaktivität wurde mittels Flüssigkeitsszintilla­ tionsmessung bestimmt.
  Der Testansatz von 1 ml setzte sich zusammen aus 35 Hg des erhaltenen Homogenats, 3 nM ³H-Serotonin (NEN, Dreeich; spezifische Radioaktivi­ tät 23,2 Ci/ mmol). Die unspezifische Bindung erfolgte mit Serotonin und betrug 15% der totalen Bindung.
  Die Auswertung der Kompetitionskurven erfolgte über iterative nicht­ lineare Regressionsanalyse in Anlehnung an das Programm LIGAND (Munson and Rodbard: Anal. Biochem. 107, 220, (1980).

Ergebnisse

Die benutzten Methoden sind beschrieben in C. Waeber et al.: 5-HT_1D receptors in guinea-pig and pigeon brain radioligand binding and biochemical studies, Naunyn-Schmiedeberg′s Arch. Pharmacol. 340: 479-485 1989).

Für die neue Indikation sollen die Verbindungen I in einer Dosierung von 10-200 mg pro Patient und Tag bei oraler Gabe bzw. 1-100 mg pro Patient und Tag bei parenteraler (intravenös, intramuskulär) Gabe eingesetzt werden.

Claims (3)

1. Verwendung von 5-Cyanmethylen-10-(piperazin-1-yl)-dibenzo[a,d]cyclo­ heptenen der Formel I in der
R¹ ein Wasserstoffatom oder ein C_1-3-Alkylrest ist und
R² und R³ Wasserstoffatome sind oder einer der Reste R² und R³ auch ein Fluor- oder Chloratom darstellen kann,
sowie deren Salzen mit physiologisch verträglichen Säuren zur Bekämpfung von Migräne.

2. Verwendung von (E), (Z)-5-Cyanmethylen-2-chlor-10-(4-methylpiperazin­ 1-yl)-dibenzo[a,d]cyclohepten sowie dessen Salzen mit physiologisch verträglichen Säuren zur Bekämpfung von Migräne.

3. Verwendung von (Z)-5-Cyanmethylen-2-chlor-10-(4-methylpiperazin­ 1-yl)-dibenzo[a,d]cyclohepten sowie dessen Salzen mit physiologisch verträglichen Säuren zur Bekämpfung von Migräne.