Die vorliegende Erfindung basiert
auf der wissenschaftlichen Entdeckung von LA-Paf. LDL und LA-paf zeigen
andere Wirkungen als paf-Acether (Platelet-Activating-Factor-Acetyl-Ether)
und sind keine paf-Acether-ähnlichen
Substanzen. In einem erfinderischen Schritt werden Paf-Antagonisten
erstmals zur Hemmung von Bindungsstellen verwendet, die mit LDL
und LApaf aber nicht mit paf-Acether in Wechselwirkung treten, Die
Erfindung dient erstmals dem Schutz von Blutplättchen gegen Lipoproteine und
LA-paf.
Es wurde nun gefunden, daß die Blutplättchen-Aggregation
nicht nur durch paf-Acether induziert wird, sondern ebenfalls durch
Lipoproteine, insbesondere LDL (low density lipoproteins) und durch
Lipoprotein assoziierten paf-Acether (LA-paf).
Ferner wurde gefunden, daß die Blutplättchen-Aggregation,
die durch Lipoproteine und LA-paf hervorgerufen wird, durch paf-Acether-Antagonisten
gehemmt wird.
D, h., erfindungsgemäß sind paf-Acether-Antagonisten
zur Behandlung von Krankheiten einsehbar, die durch Lipoproteine
und LA-paf hervorgerufen werden.
Als Paf-Acether-Antagonisten sind
erfindungsgemäß ein hydrophiles
Triazolothieno-Diazepin, ein Ginkgolid oder ein synthetisches Ginkgolid-Derivat
verwendbar. Das hydrophile Triazolothieno-Diazepin ist dabei vorzugsweise
WEB 2086 und WEB 2098 und das Ginkgolid BN 52020, BN 52021 oder
BN 52022 sowie Gemische dieser Verbindungen.
CV 3988 hat die chemische Bezeichnung
rac-3-(N-n-octadecyl carbamoyl oxy)-2-methoxypropyl 2-thiazolioethyl
Phosphat, WEB 2086 die Bezeichnung 3-(4-(2-Chlorophenyl)-9-methyl-6H-thieno(3,2-f)
(1,2,4) triazolo-(4,3-a)-(1,4) diazepin-2yl)-1-(4-morpholinyl)-1-prapanon; WEB 2098
die Bezeichnung 3-(4-(2-Chloraphenyl)-9-cyclapropyl-6H-thieno
(3,2-f)-(1,2,4) triazolo-(4,3-a) (1,4) diazepin-2yl)-1-(4-marpholinyl)-1-propanon, BN 52020
die Bezeichnung 9H-1, 7a-(Epoxymethano)-1H, 6aH-cyclopenta[c]furo[2,3-b]furo[3',2': 3,4] cyclopenta
[1,2-d] furan-5,9,12
(4H)-trion, 3-tert-butylhexahydro-4, 7bdihydroxy-8-methyl, BN 52021
die Bezeichnung 9H-1, 7a (Epoxymethano)-1H, 6aH-cyclopenta[c]furo[2,3-b]furo-[3', 2': 3,4] cyclopenta[1,2-d]furan-5,9,1
2(4H)-trion, 3-tertbutylhexahydro-4, 7b-11-trihydroxy-8-methyl,
und BN 52022 die Bezeichnung 9H-1, 7a-(Epoxymethano)-1H, 6aHcyclopenta[c]furo
[2,3-b] furo[3',2': 3,4] cyclopenta
[1,2-d] furan-5,9,12 (4H)-trion, 3-tert-butylhexahydro-2,4,7b,11-tetrahydroxy-8-methyl,
Die Antagonisten sind (Blood & Vessels
1985; Eur. J. Pharmacol 123, 197-205, 1986; Eur. J. Pharmacol 152,
101-110, 19889 Br. J. Pharmacol. 98, 653-661, 1989).
Die Bestimmung der Wirksamkeit von
paf-Acether-Antagonisten erfolgte bisher durch kompetitive Bindungsstudien.
Tatsächlich
ist jedoch eine zuverlässige
Aussage über
die Wirksamkeit von paf-Acether-Antagonisten nur möglich, wenn
die Inkubation der Zellen und des markierten paf-Acethers mit und
ohne Antagonisten in Gegenwart von Lipoproteinen, und zwar speziell
von LDL, erfolgt.
Als Zellen werden nach dem Verfahren
zur Wirksamkeitsbestimmung der paf-Acether-Antagonisten vorzugsweise
Blutplättchen
verwendet. Diese werden einer Vorbehandlung unterworfen, und zwar
werden die Blutplättchen
zunächst
gereinigt, beispielsweise durch Waschen oder Gelfiltration, sowie
ggfs. aspiriniert. Durch den Zusatz von Acetylsalicylsäure wird
die Wirkung von Prostaglandinen auf das Verfahren eliminiert. Die
gereinigten Blutplättchen
werden dann in einem serumalbuminhaltigen Puffer ohne Zusatz von
Calcium-Ionen gelöst
und anschließend
auf ein mehrfaches, beispielsweise das 10-fache, konzentriert.
Das nachstehende Beispiel dient der
weiteren Erläuterung
der Erfindung.
1. Lipoprotein-Isolierung
LDL wurde nach J. Clin. Invest.,
1955, Nr. 34, p. 1345-1353 erhalten, d.h. durch Ultrazentrifugation
und Dialyse gegen 0,15 mol/l NaCl/1 mmol/l EDTA, pH 7,5. Die Lipoprotein-Fraktion
wurde bei 4°C
gelagert und innerhalb von 1 Woche verwendet.
2. Herstellung
gewaschener menschlicher Blutplättchen
und Blutplättchen-Aggregation
Nach Br. J. Haematol., 1983, No.
53, S. 513 modifiziert nach Literaturstelle 12, Eur. J. Pharmacol, 1988,
Nr. 152, S. 101– 110,
wurden von gesunden männlichen
Probanden Blutplättchen
erhalten. Das menschliche Blut wurde dabei der Cubitalvene entnommen
und in ACD (Citratdextrose) 7:1 aufgenommen und zentrifugiert (100 × g, 15
min), um ein plättchenreiches
Plasma zu erhalten. Die Plättchen
wurden dann drei Mal durch Zentrifugieren (900 × g, 10 min) in Tyrode's Puffer, der ACD
9 1 (pH 6,4) enthielt, gewaschen und mit Lysin-Acetylsalicylsäure (100 μmol/l) 30 min vor dem letzten
Waschen inkubiert. Die endgültige
Plättchenkonzentration
wurde auf 1 × 108
Plättchen
pro Milliliter mit Hilfe eines "Coulter
Counter"-Zählgeräts eingestellt. Nach
dem letzten Waschen wurden die Plättchen in Tyrode's Puffer (pH 6,4),
der 0,25% BSA (fettsäurefreies Rinderserumalbumin)
ohne ACD und Ca2+ enthielt (109 Plättchen pro
Milliliter) suspendiert, um sie direkt vor dem Bindungsversuch mit
Tyrode's Puffer
(pH 7,4), der 0,25% BSA und 1,3 mmol/l Ca2+ enthielt,
zu verdünnen. Die
Plättchen-Aggregation
wurde wie in Br. J. Haematol., 1983, No. 53, S. 513, mit synthischem
paf (50 nmol/l) oder Thrombin (1 IE ) unter Rühren bei 37°C in Gegenwart von menschlichem
Fibrinogen vorgenommen.
3. Isolierung von LA-paf
von Lipoproteinen, Blutplättchen
und monozyten/makrophagenähnlichen
U 937 Zellen.
Es wurde eine Phospholipid-Extraktion
nach Can. J, Biochem. Physiol., 1959, Nr. 37, S. 91 1-917, modifiziert
nach Eur. J. Pharmacol. 1988, Nr. 1 52, S. 101-1 10 durchgeführt. Die
Phospholipide wurden aus Lipoproteinen oder schallbehandelten Blutplättchen sowie
monozyten/makrophagenähnlichen
U 937-Zellen, (die
in einem 10%-igen standardfoetalen Kalbsserum, das RPMI-Medium enthält, kultiviert
wurden), extrahiert. Dichlormethan/Methanol (1/2, V/V) wurde zugesetzt
und über
Nacht bei 4°C
stehen gelassen, bevor Dichlormethan/Wasser (1/1, V/V), das 2% Essigsäure enthielt,
zugesetzt wurde. Die organischen Phasen wurden gesammelt und die
Wasserphasen wurden drei Mal mit einem Volumen Dichlormethan gewaschen.
Die Proben wurden auf eine Hochdruckflüssigkeitschromatographie(HPLC)-Säule mit
einem Innendurchmesser von 3,9 mm und einer Länge von 300 mm gegeben, worauf
mit einer Fließgeschwindigkeit
von 1 ml/min eluiert wurde, wie in C. R, Acad. Sci. (Paris), Nr.
289, 5. 1037-1040, 1979 beschrieben. LA-paf wurde durch Vergleich
mit radioaktiven Standards von Phosphocholin, Sphingomyelin, synthetischem
paf-Acether und Lysophosphatidylcholin identifiziert. Die Phospholipide
wurden nach dem Verdampfen des Dichloromethans bei 4°C aufbewahrt und
innerhalb einer Woche durch Aggregation von aspirinierten mit Kreatinphosphat/Kreatininphophatkinase-behandelten
Kaninchenblutplättchen
(3 × 108
Plättchen
pro Milliliter) quantitativ nach J. Exp. Med., 1972, Nr. 136, S.
1356-1377, bestimmt, und zwar mit einer leichten Abänderung,
da die Kaninchenblutplättchen
gewaschen wurden, wie es vorstehend für menschliche Blutplättchen beschrieben
ist. Lysin-Acetylsalicylsäure (100 μmol/l) wurde
zugesetzt und inkubiert, 30 min bevor die Blutplättchen zum letzten Mal gewaschen
wurden. Kreatinphosphat (1 mmol/l) und Kreatinphosphatkinase (10
IE pro Milliliter) wurden direkt vor den Aggregationsmessungen zugesetzt.
Die aggregatbildende Wirksamkeit von LA-paf wurde als ng-paf-Äquivalentwirksamkeit ausgedrückt, bezogen
auf Standards von synthetischem paf-Acether, und in nmol/l auf der
Basis des Molekulargewichts von synthetischem paf-Acether berechnet.
Der inhibierende Effekt von WEB 2086 auf die durch paf-Acether ausgelöste Plättchen-Aggregation
wurde bestimmt, indem die Konzentration von LA-paf oder synthetischem
paf-Acether angewendet wird, welche 80% (EC 80) der maximalen Lichtdurchlässigkeit nach
einer Vorinkubation von 1 min bei 37°C bei unterschiedlichen Konzentrationen
von WEB 2086 bewirkt. Der EC 80-Wert stellt also die Auslösekonzentration
des Agonisten paf bei 80% der Konzentration dar, die die maximale
Lichtdurchlässigkeit
bewirkt, also zu der maximalen Plättchen-Aggregation führt.
Die IC 50-Werte wurden dann mit den
entsprechenden Diagrammen als 50%-ige WEB 2086-Hemmkonzentrationen
errechnet.
4. 3H-paf-Bindungsstudien
an gewaschenen menschlichen Blutplättchen.
Bei den paf-Bindungsstudien wurde
markierter (0,065 oder 0,65 nmol/l) sowie unmarkierter paf-Acether
(0,01 bis 50 nmol/l) oder WEB 2086 (1 μmol/l) zu einem fettsäurefreiem
Rinderserumalbumin(BSA)-haltigen Puffer (0,25%, W/V) gegeben, und
zwar vor der Zugabe zu den Plättchen
(vgl. Thrombos. Res., 1986, Nr. 41, S. 699-706). LDL (20 μg in 500 μl, finale
Konzentration), LA-paf (1 nmol/l), unmarkierter synthetischer paf-Acether
(1 nmol/l) sowie Vehikel wurden ebenfalls zu dem zellfreien Puffer
vor der Zugabe zu den Plättchen
gegeben. Die Bindungsversuche wurden dann gestartet, indem 50 μl Plättchensuspension
zu 400 μl
Puffer nach Zugabe von 50 μl
markiertem paf-Acether gegeben wurden. Die Plättchen wurden von dem Überstand nach
30 min Inkubation bei 20°C
durch Vakuumfiltration abgetrennt.
Für
die Desensibilisierungsstudien wurden LA-paf, synthetisches paf
(10 nmol/l) oder LDL (85 μg
in 500 μl)
mit den Plättchen
3 min vor der Zugabe von markiertem und/oder unmarkiertem synthetischem
paf inkubiert. Bei diesen Versuchen wurden die Plättchen (109 pro Milliliter) mit 2,5 mg Antikörpern gegen
menschliche Lipoproteine oder menschliches Serumalbumin oder Vehikel
(40 min bei 20°C)
behandelt, bevor sie zum letzten Mal gewaschen wurden. Die Bindung
des markiertem paf wurde berechnet als fmol, gebunden an 5 × 107 Plättchen,
oder ausgedrückt
als Prozent der spezifischen 3Hpaf Bindung,
die mit unmarkiertem synthetischem paf (50 nmol/l oder WEB 2086
(1 μmol/l)
verifiziert wurde. Die Werte stellen ±/-1-Standardabweichungen
von drei Versuchen dar.
Die nachstehende 1 zeigt die HPLC-Elution von LA-paf,
verglichen mit synthetischem paf. Dabei wurden die Phospholipide
von zwei verschiedenen LDL-Fraktionen (o⦁), die durch Ultrazentrifugation
von gesunden männlichen
nüchternen
Probanden erhalten wurden, nach Eur. J. Pharmacol., 1988, Nr. 152,
S. 101-110, extrahiert und quantitativ nach der vorstehend beschriebenen
Blutplättchen-Aggregation
bestimmt. 1 zeigt also
die Existenz von LA-paf.
Die nachstehende 2 zeigt ein Diagramm der Kaninchenblutplättchen-Aggregation
in Abhängigkeit von
LApaf. Dabei wurden verschiedene Konzentrationen von LA-paf (A:
32 pmol/l, B: 68 pmol/l, C: 83 pmol/l, D: 109 pmol/l Endkonzentration),
die vor dem HPLC-Verfahren fraktioniert wurden, zu Blutplättchen unter
Rühren
gegeben, verglichen mit definierten Standards von synthetischem
paf. Die Ergebnisse sind representativ für drei identische Versuche.
Nach 2 wird also die
Plättchen-Aggregation
konzentrations- und zeitabhängig
gemessen, d. h. man bekommt Flächen
und damit reproduzierbare Werte der vermehrten Lichtdurchlässigkeit,
sprich Plättchen-Aggregation.
Es ist ersichtlich, daß die
Lichtdurchlässigkeit
und damit die Plättchen-Aggregation
mit der Konzentration an LA-paf zunimmt.
In der nachstehenden 3 ist die Aggregation von Kaninchenblutplättchen mit
LA-paf (⦁) und synthetischem paf (∎) nach Behandlung
mit Acetylsalicylsäure
und Kreatinphosphat/Kreatinphosphatkinase in Abhängigkeit von steigenden Konzentrationen
des Antagonisten WEB 2086 dargestellt. Die Ergebnisse sind Mittelwerte
mit einer +/-1-Standardabweichung
von drei Versuchen. Danach zeigt WEB 2086 als paf-Acether-Antagonist
gegenüber
LA-paf und paf-Acether praktisch die gleiche Wirkung. D. h., WEB
2086 hemmt die Plättchen-Aggregation
durch LA-paf im gleichen Ausmaß wie
die Plättchen-Aggregation
durch paf-Acether.
Die nachstehende 4 zeigt die erhöhte 3H-paf-Bindung
an gewaschenen menschlichen Blutplättchen in Gegenwart einer geringen
Menge LDL (20 μg
pro 500 μl)
(∎), verglichen mit Vehikel (⦁). Gewaschene menschliche
Blutplättchen
wurden in fettsäurefreiem
Rinderserumalbumin-Puffer (0,25%/G/V) zusammen mit 3H-paf
(0,065 nmol/l) 30 min bei 20°C
in Gegenwart steigender Konzentrationen von unmarkiertem paf-Acether (0,01 bis
50 nmol/l) inkubiert, bevor sie vom Überstand durch Vakuumfiltration
abgetrennt wurden. Die Werte stellen Mittelwerte mit einer +/-1-Standardabweichung
von drei Versuchen dar. Der Wert (⦁) bzw. (∎)
bei 50 nmol/l unmarkiertem paf-Acether stellt die unspezifische
Bindung an die Plättchen
irr Gegenwart von Vehikel (0,2%-ige alkoholische Lösung) bzw.
die unspezifische Bindung an die Plättchen in Gegenwart von LDL
dar. Die Werte der 4 stimmen
mit der nachstehenden Tabelle 1 überein.
Die nachstehende 5 zeigt die Desensibilisierung der spezifischen
paf-Bindung an gewaschene , menschliche Blutplättchen nach einer Vorinkubation
von 3 min bei 37°C
mit LA-paf (b1 bis 3: 10 nmol/l), synthetischem
paf (c: 1 nmol/l), LDL (d: 85 μg
pro 500 μl)
oder Vehikel (a1 bis 3). Die spezifisch
markierte paf-Bindung wurde mit einer 3H-paf-Bindung
(0,65 nmol/l) in Abwesenheit bzw. in Anwesenheit von unmarkiertem
paf (50 nmol/l) nach Vorinkubation mit dem Antikörper im Vehikel bestimmt. Die
Plättchen
wurden vor dem letzten Waschen entweder mit Antikörpern gegen
menschliche Lipoproteine (a2 und b2) oder menschliches Serumalbumin (a3 und b3) (2,5 mg
pro 109 Plättchen)
40 min bei 20°C
behandelt oder mit Vehikel (a1 und b1). Die Werte sind Mittelwerte mit einer
+/-1-Standardabweichung von drei Versuchen.
Während
nach 4 und Tabelle 1
alle Substanzen gleichzeitig auf die Plättchen einwirken, werden sie
nach 5 also nacheinander
den Plättchen
zugesetzt. Aus 5 geht
hervor, daß sowohl
LDL, LA-paf und paf-Acether mit den paf-Rezeptoren an den Plättchen in Wechselwirkung treten.
Die nachstehende Tabelle 1 zeigt
die Bindung von markiertem paf-Acether an intakte, gewaschene menschliche
Blutplättchen
in Gegenwart von LA-paf, LDL, synthetischem paf-Acether sowie Vehikel.
LA-paf, synthetisches paf (1 nmol/l), LDL (30 μg/ml) oder Vehikel (Wasser mit
0,2% Ethanol) wurden zu fettsäurefreiem Rinderserumalbumin-Puffer
gegeben. Die spezifische Bindung von 3H-paf
(0,65 nmol/l) wurde in Abwesenheit bzw. Gegenwart eines WEB 2086-Überschusses
(1 μmol/l)
bestimmt. Die Werte sind in Fentomol, gebunden an 108 Plättchen,
angegeben und stellen Mittelwerte mit einer +/-1-Standardabweichung
von drei verschiedenen Versuchen dar. Die nichtspezifische Bindung
wurde also mit einem Überschuß an WEB
2086 bestimmt. Die spezifische Bindung stellt die Differenz aus
der Gesamtbindung und der nichtspezifischen Bindung dar.
Aus dieser Tabelle geht hervor, daß paf-Acether
(137 ± 10
fmol) die Gesamtbindung des markierten 3H-paf
an Blutplättchen
gegenüber
Vehikel (191 ± 14
fmol) erwartungsgemäß erniedrigt,
LA-paf und LDL mit 262 ± 23
und 247 ± 29
fmol hingegen die Gesamtbindung von 3H-paf
an Blutplättchen
erhöhen.
Dies gilt gleichermaßen
für die
nichtspezifische Bindung und für
die spezifische Bindung.
Daraus ist zu schließen, daß wenigstens
zwei Bindungsstellen für
LA-paf an den Blutplättchen
existieren, wobei die eine Bindungsstelle nur LDL bzw. für LA-paf
zugänglich
ist, nicht hingegen für
paf-Acether.
In der nachstehenden Tabelle 2 ist
der Katabolismus von
3Hpaf durch Lipoproteine
zusammen mit Blutplättchen
dargestellt, verglichen mit einem fehlenden paf-Katabolismus durch
Blutplättchen
und/oder fettsäurefreiem
Rinderserumalbumin(BSA)-Puffer.
3H-paf wurde
mit und ohne WEB 2086 (40 nmol/l) zu BSA-Puffer, der LDL (0,04 %
V/V Endkonzentration) enthielt, gegeben, und es wurde eine Phospholipidanalyse
mit HPLC, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Die Werte stellen Prozentangaben
der Gesamtradioaktivität
nach der Substraktion der Hintergrundwerte dar. Die Werte stellen
Mittelwerte mit einer Plus/Minus-Standardabweichung von drei unterschiedlichen
Lipoproteinpräparationen
dar. Tabelle
2
