JP3713581B2 - パフ拮抗剤及びその調製方法 - Google Patents
パフ拮抗剤及びその調製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3713581B2 JP3713581B2 JP15627291A JP15627291A JP3713581B2 JP 3713581 B2 JP3713581 B2 JP 3713581B2 JP 15627291 A JP15627291 A JP 15627291A JP 15627291 A JP15627291 A JP 15627291A JP 3713581 B2 JP3713581 B2 JP 3713581B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- paf
- cells
- puff
- antagonist
- ldl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/365—Lactones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Obesity (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、パフ−アセタ拮抗剤及びその調製方法に関する。なお、パフ−アセタは、ｐａｆ−ａｃｅｔｈｅｒと記され、ｐａｆは、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（血小板活性化要素）の略号であり、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，パリー，２８９号，１９７９年の１０３７〜１０４０頁に記載されている化学構造が１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−フォスフォコリンなる物質である。
【０００２】
【従来の技術】
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３６号，１９７２年，１３５６〜１３７７頁に記載されているようにパフ−アセタが血小板の凝集を誘引することは公知である。そこでパフ−アセタ媒介の血小板活性化による疾患を、天然のギンコリド類（ｇｉｎｇｏｌｉｄｅｓ）を用いて治療することがＦｕｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９８８年，１５２，１０１〜１１０頁で提案されている。
【０００３】
ギンコリド類とはパフ−アセタ拮抗剤であり、米国特許出願番号０７／２５９，６７４によると、パフ−アセタが血小板サイト（ｓｉｔｅｓ）に結合するのを抑制する化合物で、これによりこれらの細胞はパフ−アセタに攻撃されなくなる。
【０００４】
最近になって血小板活性化は，パフ−アセタだけでなくリポプロティン（通常のまたは修飾体）、特にＬＤＬ（ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，低密度リポプロティン）及びＬＡ−ｐａｆ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＰＡＦ−ａｃｅｔｈｅｒ，リポプロティン結合ｐａｆ−ａｃｅｔｈｅｒ）によっても引き起こされることが判明した。
【０００５】
更にリポプロティン（通常のまたは修飾体）及びＬＡ−ｐａｆにより誘引された血小板活性化は、パフ−アセタ拮抗剤により抑制されることも判明した。これは、リポプロティン（通常のまたは修飾体）やＬＡ−ｐａｆによる疾患の治療に、パフ−アセタ拮抗剤を使用し得ることを意味する。
【０００６】
【構成及び作用】
本発明によれば、パフ−アセタ（ｐａｆ−ａｃｅｔｈｅｒ）拮抗剤として親水性または非親水性トリアゾロチエノ−ジアゼピンまたはその類似体、ギンコリド、ギンコリドの混合物、または合成ギンコリド誘導体、あるいはＣＶ３９８８のようなパフ−アセタの類似体が使用可能である。上記トリアゾロチエノ−ジアゼピンとは好ましくはＷＥＢ２０８６，ＷＥＢ２０９８またはＢＮ５０７３９であり、またギンコリド類としてはＢＮ５２０２０，ＢＮ５２０２１，ＢＮ５２０２２またはこれら化合物の混合物が好ましい。
【０００７】
ＢＮ５０７３９の化学構造は、テトラヒドロ−４，７，８，１０メチル−（クロロ−２フェニル）６［ジメトキシ−３，４−フェニル）チオ］メチルチオカルボニル−９ピリド［４′，３′−４，５］チエノ［３，２−ｆ］トリアゾロ−１，２，４［４，３−ａ］ジアゼピン−１，４）である。
【０００８】
上述の化合物は、それぞれ下記の化学構造で示される。ＣＶ３９８８という化学用語は、りん酸塩ｒａｃ−３−（Ｎ−ｎ−オクタデシル−カルバモイロキシ）−２−メトキシプロピル ２−チアゾロイオエチルのことである。
【０００９】
ＷＥＢ２０８６という化学用語は、３−（４−（２−クロロフェニル）−９−メチル−６Ｈ−チエノ（３，２−ｆ）（１，２，４）トリアゾロ−（４，３−ａ）−（１，４）ジアゼピン−２イル）−１−（４−モルフォリニル）−１−プロパノンのことである。
【００１０】
ＷＥＢ２０９８という化学用語は、（３−（４−（２−クロロフェニル）−９−シクロプロピル−６Ｈ−チエノ）（３，２−ｆ）−（１，２，４）トリアゾロ−（４，３−ａ）（１，４）ジアゼピン−２イル）−１−（４−モルフォリニル）−１−プロパノンのことである。
【００１１】
ＢＮ５２０２０という化学用語は、９Ｈ−１、７ａ−（エポキシメタノ）−１Ｈ，６ａＨ−シクロペンタ［ｃ］フロ［２，３−ｂ）フロ−［３′，２′：３，４］シクロペンタ［１，２−ｄ］フラン−５，９，１２（４Ｈ）−トリオン，３−ｔｅｒｔ−ブチルヘキサヒドロ−４，７ｂ−ジヒドロキシ−８−メチルのことである。
【００１２】
ＢＮ５２０２１という化学用語は、９Ｈ−１，７ａ−（エポキシメタノ）−１Ｈ，６ａＨ−シクロ−ペンタ［ｃ］フロ［２，３−ｂ］フロ−［３′，２′：３，４］シクロペンタ［１，２−ｄ］フラン−５，９，１２（４Ｈ）−トリオン、３−ｔｅｒｔ−ブチルヘキサヒドロ−４，４ｂ−１１−トリヒドロキシ−８−メチルのことである。
【００１３】
ＢＮ５２０２２という化学用語は、９Ｈ−１、７ａ−（エポキシメタノ）−１Ｈ，６ａＨ−シクロペンタ［ｃ］フロ［３′，２′：３，４］シクロペンタ［１，２−ｄ］フラン−５，９，１２（４Ｈ）−トリオン，３−ｔｅｒｔ−ブチルヘキサヒドロ−２，４，７ｂ，１１−テトラヒドロキシ−８−メチルのことである。
【００１４】
パフ−アセタ拮抗剤の有効性測定に競合結合テスト（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｂｉｎｄｉｎｇ ｔｅｓｔ）を用いるのは既に知られている。しかしパフ−アセタ拮抗剤の有効性に関しては、リポプロティン（通常のまたは修飾体）、特にＬＤＬまたはＶＬＤＬ（ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，超低密度リポプロティン）の存在下あるいは不存在下で、細胞並びに標識パフ−アセタを恒温培養した時にのみ信頼すべき情報が得られる。
【００１５】
パフ−アセタ受容体に対する拮抗活性に関して各物質の効果を迅速かつ簡便にテストするには、例えばスクリーニング法によりパフ−アセタ受容体への有効な拮抗剤を見つけて、前記疾患の治療に適用できるようにするには、以下のステップからなる有効性測定方法を利用したパフ−アセタ拮抗剤の調製方法が良い。
【００１６】
パフ拮抗剤の調整方法であって、以下のステップ、
ａ）リポプロティン、ＬＡ−ｐａｆ及び／又はコレステロールの存在下で、清浄細胞と、放射性、着色化若しくは蛍光化標識パフ又は標識若しくは無標識パフ類縁物質及び測定すべき拮抗剤とを混合するステップ、
ｂ）リポプロティン、ＬＡ−ｐａｆ及び／又はコレステロールの存在下で、ステップａ）で用いたものと同じタイプの清浄細胞と、放射性、着色化若しくは蛍光化標識パフとを、測定すべき拮抗剤の不存在下で混合するステップ、
ｃ）上記の混合物ａ）とｂ）各々から細胞を分離するステップ、
ｄ）上記細胞に結合した放射性、着色化若しくは蛍光化標識パフの量を測定するステップ、及び
ｅ）拮抗剤の有効性を、上記ａ）での拮抗剤存在下で細胞に結合した標識パフ量と、上記ｂ）での拮抗剤不存在下で細胞に結合した標識パフ量との関係から判定するステップ、
を含んでなる有効パフ拮抗剤の調製方法。
【００１７】
本発明方法による有効性測定方法を利用したパフ−アセタ拮抗剤の調製方法に用いる細胞としては、血小板が好ましい。
【００１８】
細胞は例えば洗浄やゲル濾過により正常化処理をするのが望ましく、また好ましくはアスピリン（アセチルサリチル酸）を添加する。アスピリン添加により、本発明のパフ−アセタ拮抗剤の調製ステップに及ぼすプロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）の悪影響が取り除かれる。アスピリン添加とプロスタグランジン拮抗剤の添加効果も測定可能となる。
【００１９】
血小板を使用する際は、その後正常細胞を脱脂した血清ａｌｂｕｍｉｎを含有し、カルシウムイオンを全く含まない等張緩衝液中に分散させるのが好ましい。血小板は、請求項１記載の方法のステップａ）及びｂ）に使用する前に、カルシウム及びマグネシウムイオン存在下で数倍、例えば１０倍に濃縮する。
【００２０】
標識リガンド（ｌｉｇａｎｄ）としては、例えばトリチウム標識パフ−アセタまたは標識ＷＥＢ２０８６のような標識拮抗剤が使用できる。標識または未標識のパフ−類縁物質や着色化あるいは蛍光化標識化合物等も用いることができる。
【００２１】
請求項１記載のステップａ）及びｂ）による混合は２０℃の温度で行うのが好ましい。混合後は、細胞を１０分以上恒温培養するのが望ましく、その後本発明方法のステップｃ）により分離する。恒温培養期間は１０分以上が好ましい。ステップｃ）による細胞分離は、濾過または遠心分離によって行う。
【００２２】
血小板の他に、本発明では、単核マクロファージ様細胞を使用してパフ−アセタ拮抗剤を調製することもできる。この場合は、脱脂培養基中でリポプロティン（通常のまたは修飾体）及びコレステロールで刺激した単核マクロファージ様細胞を用いる。
【００２３】
単核マクロファージ様細胞を使用すると、本発明方法は、特に迅速で簡便なものになる。単核マクロファージ様細胞は、市販されており、培養に支障はない。コレステロールまたはＬＤＬやＶＬＤＬのようなリポプロティンで刺激した培養基からある量の細胞を、結合検査の前に採取するだけで良い。これらの操作や結合検査自体は、実験室での通常操作でできるので、市販の自動装置を使用することが可能である。従って、本発明方法を自動的に行うことができて、スクリーニング法では、非常に重要な意味を持つ。
【００２４】
単核マクロファージ様細胞を使用すると、動脈硬化症の予防と治療用のパフ−アセタ拮抗剤活性測定にも、本発明方法を用いることができる。動脈硬化症のみならず炎症性疾患やガンの病因においても単核マクロファージ様細胞及びＬＤＬのようなリポプロティン（通常のまたは修飾体）及びそこに含まれるコレステロールは、相当重要なものとなっている。
【００２５】
従って本発明方法では、生体内で動脈硬化症を引き起こすＬＤＬとコレステロールと共に、同様の細胞がガラス内で使用される。
【００２６】
単核マクロファージ様細胞としては、Ｕ９３７細胞が特に好ましい。単核マクロファージ様細胞は、血清特に子牛胎児血清を含有する培養基で培養される。テストの前に単核マクロファージ様細胞を脱脂血清、特に脱脂した子牛胎児血清を含有する培養基中で数時間培養するのが好ましい。培養開始から２４時間後に、ＬＤＬとコレステロールを添加して細胞を刺激するのが良い。単核マクロファージ様細胞の培養基は、Ｌ−グルタミンを含有しているのが望ましい。培養及び恒温培養は、それぞれ高温例えば３７℃で行われる。
【００２７】
更に、単核マクロファージ様細胞の単純培養は、それら細胞が懸濁液中にあるので、従来の市販装置で正確な量を調合できる本質的な利点がある。
【００２８】
細胞は結合検査に使用する前に、洗浄等の方法で清浄にして、アセチルヒドロラーゼ分解パフ−アセタのような酵素を取り除く。
【００２９】
単核マクロファージ様細胞を使用する場合は、フォスフォリパーゼやアセチルヒドロラーゼのような単核マクロファージ様細胞に含有される酵素によりパフ−アセタが分解されるのを防ぐために、結合検査は、２０℃未満、好ましくは２〜６℃の温度で行う。本発明の有効性測定方法を利用した調製方法のステップａ）及びｂ）による混合後、単核マクロファージ様細胞を使用した時は、１０分から１−４時間の恒温培養をするのが望ましい。
【００３０】
パフ−アセタは水に溶けにくいフォスフォリピドなので、結合検査は、牛の血清アルブミン等の血清アルブミンを脱脂したものの存在下で行うのが好ましく、この時カルシウム及びマグネシウムイオンを添加するとよい。
【００３１】
血清アルブミンは、パフ−アセタと特定単核マクロファージ様細胞と結合していない拮抗剤とを結合させる役割を果たし、これにより、パフ−アセタと拮抗剤のこの部分は、それぞれ単核マクロファージ様細胞から除かれる。
【００３２】
このように処理した単核マクロファージ様細胞を液状媒体から分離するには、濾過によることが良い。というのは濾過方式が大変簡単であるからである。同時に特定の結合をしていない残留標識パフ−アセタを細胞から分離するのに、濾過が、比較的に正確で、なおかつ非常に効果的な方法であるからである。
【００３３】
次に細胞に（特定）結合している標識パフ−アセタの量を測定する。放射能標識のパフ−アセタを使用したのであればフィルター中に残った細胞の放射能のみを測定する。測定数値から細胞のないフィルター中の放射能数値を差し引く。
【００３４】
上記ステップａ）に従い拮抗剤の量を変えてテストした結果を目盛りグラフに表わすと、５０％の抑制値で拮抗剤の有効性が得られた。即ちある量の細胞に対して、拮抗剤量は可逆性パフ−アセタ結合の５０％を抑制した。
【００３５】
単核マクロファージ様細胞を用いた本発明の効力測定方法では、親水性トリアゾロチエノ−ジアゼピンとしてＷＥＢ２０８６を使用してテストした時に特に優れた結果を示した。
【００３６】
更に、本発明方法は、パフ−アセタに対する天然の拮抗剤であるアセチルヒドロラーゼに対する特定の化合物であの活性有効性の測定にも使用できる。また、ＬＤＬとコレステロールは、アセチルヒドロラーゼの細胞内形成を刺激するので本発明方法をアセチルヒドロラーゼとその拮抗体の形成にも使用できる。
【００３７】
更に、本発明方法により、患者の、望ましくは高コレステロール血症患者に対する、ＬＤＬ製剤の病原性とアセロゲニティ（ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｔｙ）を個別に、臨床的にテストできるし、また、アポリポプロティン（ａ）またはアポリポプロティンＢ（１００）等の病原性リポプロティン中のＬＡ−ｐａｆ量と相関させることもできる。
【００３８】
更には、コレステロールのみならず、コルチコステロイドまたは性ホルモン等の他のステロイド類の効果も、本発明方法のスクリーニング手段によりテストできる。
【００３９】
受容体調節プロティンであるｐａｆやＬＡ−ｐａｆ用の結合位置及びｐａｆ拮抗剤例えばＷＥＢ２０８６用の結合位置は、ＬＤＬ及びコレステロール処理した単核マクロファージ様細胞のような分化細胞ラインを用いて形成することができる。このようなシステムにより各種疾患の治療や診断に使用し得るモノクロナル抗体を合成することができる。診断テスト用にＬＡ−ｐａｆ等の化合物のようなｐａｆにおけるプロティン部位に対抗するモノクロナル抗体も形成できる。ＬＡ−ｐａｆは、単核マクロファージ様細胞中（血小板及びリポプロティン中でも同様）に形成されるので、これらの細胞をＬＡ−ｐａｆまたは標識ＬＡ−ｐａｆの合成に使用することができる。
【００４０】
ドイツ特許公開公報ＤＥ ３７ ３５ ５２４Ａ１に提示されるように、血小板表面上のｐａｆまたはｐａｆ様化合物の結合増加がこれら化合物の簡易定量に用いることができる。細胞結合したｐａｆまたはＬＡ−ｐａｆ等のｐａｆ様化合物は、介在する細胞への付着性、血小板凝集、あるいは着色化または蛍光化の抗体への反応を含む種々の母材との反応等に関し、その潜在力を測定する。血小板等の血液細胞は、フォスフォリピド抽出と、濾過または遠心分離によるＨＰＬＣ分析をしなくても、容易に単離される。
【００４１】
濾過法では、自動装置付きの器具が市販されている。最後にｐａｆ受容体は、５日間は安定しており、市販の特殊テスト容器に採血して、ドイツ実用新案登録公告番号５７１６００４に示されるように、少量の血液量に修正後、中央研究施設で血液細胞の受容体状態を検査することができる。
【００４２】
ｐａｆまたは ＬＡ−ｐａｆ等のｐａｆ様化合物の特定結合は、細胞のカルシウム流と密接な相関関係にあるので、それらが細胞カルシウム流に及ぼす効果を、合成パフ−アセタの目盛りグラフと比較することで、本発明方法をパフ−アセタまたはｐａｆ様血液成分の測定に用いることができる。カルシウム測定を自動化するのに、市販の自動装置を用いても良い。
【実施例】
【００４３】
下記の実施例により本発明を詳細に説明する。
１．リポプロティンの単離
Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１９５５年，３４号，１３４５〜１３５３頁に記載されているように、超遠心分離と、０．１５モル ＮａＣｌ／１ミリモル ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５に対する透析によりＬＤＬが得られた。リポプロティン分留は、４℃で保存され、１週間以内に使用された。
【００４４】
２．洗浄血小板の用意と血小板凝集
Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ，１９８３年，５３号，５１３頁に従い、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９８８年，１５２号，１０１〜１１０頁により修正した方法で健康な男性有志から血小板を採取した。人血がＡＣＤ（Ａｃｉｄ Ｃｉｔｒａｔｅ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ，酸・クエン酸塩・ぶどう糖）７：１で前腕の静脈から採血され、遠心分離（１００×ｇ，１５分）して血小板富有の血漿を得た。
【００４５】
次に血小板は、ＡＣＤ９：１（ｐＨ６．４）タイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液中で３回遠心分離（９００×g, １０分）して洗浄され、最後の洗浄の前にリジン−アスピリン（１００μモル）と共に３０分間恒温培養された。血小板の最終濃縮は、クルター計数器を用いてｍｌ当たり血小板数１×１０８ に調整された。最終洗浄後ＡＣＤとＣａ２＋（血小板数ｍｌ当たり１０９ ）を含まない０．２５％ＢＳＡ（脂肪酸牛血清アルブミン）含有のｐＨ６．４のタイロード緩衝液中に懸濁し、結合実験の前に０．２５％ＢＳＡと１．３ミリモルＣａ２＋含有のｐＨ７．４のタイロード緩衝液で直接希釈した。Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ，１９８３年，５３号，５１３頁に記載されているように、３７℃で攪拌しながら異なる濃度のＷＥＢ２０８６を含有するまたは含有していない人のフィブリノーゲンの存在下で、合成ｐａｆ（５０ｎモル）、ＬＡ−ｐａｆまたはトロンピン（１Ｕ）を用いて血小板凝集を行った。
【００４６】
３．リポプロティン、血小板及び単核マクロファージ様Ｕ９３７細胞からのＬＡ−ｐａｆの単離
Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９５９年 ３７号 ９１１〜９１７頁に記載の方法で、Ｅｕｒ．ｊ．Ｐｈａｒｍａｃａｌ，１９８８年，１５２号 １０１〜１１０頁に従って修正したフォスフォリピド抽出をした。フォスフォリピドは、リポプロティンまたは超音波処理血小板、単核マクロファージ様Ｕ９３７細胞（ＲＰＭＩ培養基を含む標準１０％牛胎児血清（Ｆｃｓ）中で培養）から抽出した。ジクロメタン／メタノール（１／２，体積比）を４℃で一昼夜添加してから、２％の酢酸を含有するジクロメタン／水（１／１，体積比）を添加した。
【００４７】
有機相を採取し、水相は／体積部のジクロメタンで３回洗浄をした。サンプルを高圧液相クロマトグラフィー（ｈｐｌｃ）ミクロポラシルカラム（内径３．９ｍｍ×長３００ｍｍ）にかけ、次にＣ．Ｒ．Ａｃｒｄ．Ｓｃｉ．（パリ），１９７７年・２８９号，１０３７〜１０４０頁に記述されているように１ｍｌ／分の流速に希釈した。フォスフォコリン（ＰＣ），スフィンゴミエリン，合成ｐａｆ並びにリゾフォスファチジルコリンの放射性標準と対照してＬＡ−ｐａｆを特定した。
【００４８】
フォスフォリピドはジクロメタンを蒸発させてから４℃で保存し、１週間内にアスピリン化及びＣＰ，ＣＰＫ−（クレアチンフォスフェイト／クレアチンフォスフォキナーゼ）処理した兎血小板（ｍｌ当たり３×１０８ 血小板数）を用いて、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１９７２年，１３６号，１３５６〜１３７７頁の記載法を一部修正した方法で、即ち、上述した人の血小板の処理と同様に兎血小板も洗浄して、凝集による定量を行った。
【００４９】
血小板を最終洗浄する前にリジンアスピリン（１００μモル）を３０分間恒温培養した。ＣＰ（１ミリモル）とＣＰＫ（ｍｌ当たり１０Ｕ）を凝集測定前に直接添加した。ＬＡ−ｐａｆの凝集活性は、合成ｐａｆの標準と比較してｎｇ ｐａｆ同等活性として表わされ、合成ｐａｆの分子量を基にｎモルで算出される。ｐａｆ−介在血小板の凝集に及ぼすＷＥＢ２０８６の抑制効果は、ＬＡ−ｐａｆまたは合成ｐａｆの濃度を用いてテストした。この濃度は、ＷＥＢ２０８６が種々の濃度で３７℃１分の予備恒温培養後でも極大光透過率の８０％（ＥＣ８０）を媒介する。グラフからＩＣ５０値は、抑止制ＷＥＢ２０８６濃度の５０％と算出された。
【００５０】
４．洗浄人血小板に対する ３Ｈ−ｐａｆ結合検査
血小板への添加に先立ち、標識（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｕｃｋｓ Ｕ．Ｋ．による２６．１ｎＣｉを使用する０．０６５または０．６５ｎモル）を付けた又は未標識合成ｐａｆ（０．０１〜５０ｎモル）、またはＷＥＢ２０８６（１μモル）をＢＳＡ含有緩衝液（０．２５％，重量／体積）に添加して、ｐａｆ結合検査をした（Ｔｈｒｏｍｂｏｓ．Ｒｅｓ，１９８６年，４１号，６９９〜７０６頁参照のこと。）。また血小板添加の前にＬＤＬ（最終濃度、５０μｌ当たり２０μｇ）ＬＡ−ｐａｆ（１ｎモル）、未標識合成ｐａｆ（１ｎモル）、または賦形剤を細胞を含まない緩衝液に添加してもよい。次に５０μｌの標識ｐａｆを添加してから、４００μｌの緩衝液に５０μｌの血小板懸濁を添加して、結合実験を開始した。２０℃で３０分間の恒温培養の後、真空濾過法により上澄みから血小板を分離した。
【００５１】
除感検査用として、標識及び未標識合成ｐａｆの添加の前にＬＡ−ｐａｆ、合成ｐａｆ（１０ｎモル）またはＬＤＬ（５００μｌ当たり８５μｇ）を血小板と共に３分間恒温培養した。これらの実験では、最終洗浄の前に２０℃で４０分間、人のリポプロティンに対する拮抗体２．５ｍｇで、または人の血清アルブミンまたは賦形剤で血小板（ｍｌ当り１０９ ）を処理した。標識ｐａｆ結合は５×１０７ 血小板に結合したｆモルとして算出されるか、または未標識合成ｐａｆ（５０ｎモル）あるいはＷＥＢ２０８６（１μモル）で実証された ３Ｈ−ｐａｆ特定結合のパーセントで表わされる。数値は３種の異なる実験の±１ｓ．ｄ．の平均である。
【００５２】
図１は、人のリポプロティンにＬＡ−ｐａｆが存在することを示している。２人の健康な男性有志（●○）から得たＬＤＬからのＬＡ−ｐａｆは、ＨＰＬＣ−留分中に（１１〜１５分）機能的に不活性なフォスフォコリンと共に溶出した。この保持時間は合成ｐａｆ（２１〜２４分）のそれとは明らかに異なっている（図１）。
【００５３】
ＬＤＬ留分中のＬＡ−ｐａｆ活性を、血小板凝集を刺激するその能力からｐａｆ標準と比較して算出すると、リポプロティンｍｇ当り４．６±１．３ｎｇＬＡ−ｐａｆがｍｇ当りＶＬＤＬ３．４±０．６ｎｇに対して形成され、またｍｇ当りＨＤＬ２．５±１．３ｎｇに対するリポプロティンが測定され、３人の健康な男性有志（平均±ｓ．ｄ．）から採取したリポプロティン不足血清中でのプロティンｍｇ当り０．２±０．２ｎｇと比較された。
【００５４】
清浄な男性有志からの洗浄血小板を抽出すると１０９ 血小板は３．１±０．５ｎｇのＬＡ−ｐａｆを含有していた（データは示していない）。人の洗浄血小板を凝集している間に（ｎ＝３）、外因性ｐａｆ（５０ｎモル）またはトロンピン（１Ｕ）に応答して、その１部は放出された。洗浄血小板のＬＡ−ｐａｆ濃度は、１分の凝集後１０９ 血小板当り２．２±０．２及び２．１±０．１ｎｇに減少したが、これらは細胞起因のＬＡ−ｐａｆであることを示している。これら洗浄した人の血小板中にＬＤＬが存在していることは、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ ｐｅｓ，１９８０年，１９号，６９３〜７００頁に記載されているＳＤＳゲル電気泳動により本質的に証明された。凝集中血小板は無疵のままであった。なぜならＬＤＬ放出は全く検出されなかったからである（６．５±１．５％即ち±１．ｓ．ｄ．，ｎ＝３）。洗浄血小板と比較して、単核マクロファージ様Ｕ９３７細胞は１０９ 細胞当り１３３ｎｇを含有していた。
【００５５】
図２にＬＡ−ｐａｆに応答する兎の血小板凝集の投与応答曲線を示す。ＨＰＬＣを使用する前に分別した種々濃度のＬＡ−ｐａｆは（ａ：３２ｐＭ，ｂ：６８ｐＭ，ｃ：８３ｐＭ，ｄ：１０９ｐＭ，最終濃度）攪拌しながら血小板に添加し、合成ｐａｆの規定標準と比較した。各数値は３回の実験を示すものである。即ち、図２によると血小板凝集は、濃度と時間に応じて測定されるので、高光透過率（血小板凝集）の区域と再現可能な数値が得られる。図から明白なように、光透過率及び血小板凝集はＬＡ−ｐａｆ濃度と共に増加している。
【００５６】
図３はアスピリンとＣＰ／ＣＰＫ処理後、拮抗剤ＷＥＢ２０８６の濃度増加に応じたＬＡ−ｐａｆ（○）及び合成ｐａｆ（●）による兎血小板の凝集抑制を示す。数値は３回の実験の±／ｓ．ｄ．平均である。パフ−アセタ拮抗剤としてのＷＥＢ２０８６が、ＬＡ−ｐａｆ及びパフ−アセタに対して実質的な同一効果を示していることが分かる。即ち、ＷＥＢ２０８６は、ＬＡ−ｐａｆにより起こった血小板凝集をパフ−アセタが血小板凝集に対するのと同程度に抑制する。
【００５７】
図４は、洗浄した人の血小板に結合している ３Ｈ−ｐａｆに及ぼすＬＤＬとＬＡ−ｐａｆの効果を示している。ＬＤＬの有（■）、無（●）及び ３Ｈ−ｐａｆ（０．０６５ｎモル）とを用いた。血小板の同時恒温培養は、 ３Ｈ−ｐａｆの結合を促進した。ＬＤＬ（ｍｌ当り２０μｇ）は結合（ｐａｆ賦形剤で評価する、１００％）及び不特定結合（未標識ｐａｆ（５０ｎモル）で評価）で増加していた。図４の数値は特定ｐａｆ拮抗剤ＷＥＢ２０８６で得られた後記の表１の数値に対応している。
【００５８】
図５に洗浄した人の血小板への特定ｐａｆ結合の減感（ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）を示す。ＬＤＬとＬＡ−ｐａｆとが受容体への ３Ｈ−ｐａｆ結合を増加するように導いているのであれば、両物質を用いた血小板の予備恒温培養は、合成ｐａｆと比較して過剰未標識ｐａｆにより評価する、特定 ３Ｈ−ｐａｆ結合を減少させるはずである。実際にＬＡ−ｐａｆ（図５のｂ １−３ ）は、媒介物（図５のａ １−３ ）と比較して、ｐａｆの２回目の攻撃に対して血小板を減感させた。
【００５９】
ＬＡ−ｐａｆ（図５のｂ １−３ ）、合成ｐａｆ（図５のｃ）またはＬＤＬ（図５のｄ，５００μｌ当り８５μｇ）を用いた３分間の予備恒温培養後にも同様の効果が観測された。同様に、血小板を人のリポプロティン（図５のａ２ ，ｂ２ ，１０９ 血小板当り２．５ｍｇ，２０℃で４０分間）に対する拮抗体で前処理すると、非合成でｐａｆ（図５のａ２ ）のＬＡ−ｐａｆ（図５のｂ２ ）介在効果（ｅｆｆｅｃｔｓ）は、部分的に阻止された。
【００６０】
抗体賦形剤（図５のａ１ ，ｂ１ ）と比較して、人の血清アルブミン（図５のａ３ ，ｂ３ ）に対するポリクロナル拮抗体を用いた前処理は、合成ｐａｆによる２回目の攻撃に対抗してＬＡ−ｐａｆ介在の減感を修正しなかった。リポプロティンに対する拮抗体が、合成ｐａｆの２回目の攻撃に対抗して、ＬＡ−ｐａｆが誘引した減感または ３Ｈ−ｐａｆ結合を阻止したとの観察結果は、リポプロティンが原因として関係していることを示唆し、従ってＬＡ−ｐａｆ中のリポプロティン部位を示す。下記表１はＬＡ−ｐａｆ、ＬＤＬ、合成パフ−アセタ及び賦形剤の存在下で、無疵の洗浄人血小板への標識パフ−アセタの結合を示す。ＬＡ−ｐａｆ、合成ｐａｆ（１ｎモル）、ＬＤＬ（３０μｇ／ｍｌ）または賦形剤（０．２％エタノールを含有する水）は、ＢＳＡ緩衝液に添加した。 ３Ｈ−ｐａｆ（０．０６５ｎモル）の特定結合は、過剰ＷＥＢ２０８６（１μモル）の存在下または不存在下でそれぞれ確認された。数値は１０８ 血小板に結合したｆモルで表わされ、３回の異なる実験の平均±１ｓ．ｄ．である。
【００６１】
【００６２】
表１から未標識パフ−アセタが予想通り、賦形剤（１９１±１４ｆモル）と比較して標識 ３Ｈ−ｐａｆの血小板（１３７±１０ｆモル）への総結合を低下させたことがわかる。一方２６２±２３、２４７±２９ｆモルを使用するＬＡ−ｐａｆとＬＤＬとは、それぞれ血小板への ３Ｈ−ｐａｆの総結合を増加させた。不特定結合及び特定結合についても同じことが言える。
【００６３】
従って、ＬＡ−ｐａｆ用の血小板上の結合部位は少なくとも２つあり、１結合部位はリポプロティン（通常のまたは修飾体）とＬＡ−ｐａｆのみが接近可能であって、その部位には、どうしてもパフ−アセタは、近づけない。
【００６４】
下掲の表２は、リポプロティン存在下での ３Ｈ−ｐａｆの異化作用及びリポプロティンと血小板存在下での ３Ｈ−ＬＡ−ｐａｆへの、その代謝を示すものである。血小板は添加 ３Ｈ−ｐａｆを減成（ｄｅｇｒａｄｅ）しないが、ＬＤＬが存在すると ３Ｈ−ｐａｆの一部が ３Ｈ−リゾ−ｐａｆに減成された。同様の減成（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）は、ＶＬＤＬ存在下でも得られたが、ＨＤＬ存在下と比較すると、より高濃度（最終濃度０．０４％対０．１７％，重量／体積）で得られた。特定ｐａｆ受容体拮抗剤ＷＥＢ２０８６（４０ｎモル）は、リポプロティン存在下の ３Ｈ−ｐａｆ減成を妨害しなかった（表２参照）。
【００６５】
３Ｈ−ｐａｆは、ＷＥＢ２０８６（４０ｎモル）使用または不使用で、ＬＤ＋またはＶＬＤＬ（最終濃度、０．０４％，０．０３％または０．１７％体積／体積）を含有するＢＳＡ緩衝剤中の洗浄人血小板に添加された。前述したフォスフォリピド分析は、ＨＰＬＣを使用して行われた。各別のＨＰＬＣ停滞時間の放射能は、背景値（ボイド ボリウム；ｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅでない）を減殺してから総標識のパーセントとして算出した。数値は３人の健康な男性有志（平均±１ｓ．ｄ．）から採取したＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＨＤＬによって得た平均±１ｓ．ｄ．である。
【００６６】
【００６７】
標識ＬＡ−ｐａｆ（５．０±１．７％）の総量は、 ３Ｈ−ｐａｆが緩衝液を含んでいるＬＤＬ及びＢＳＡ中に血小板懸濁液を添加する時に、形成される（２０℃，３０分）。これは、またその細胞起因性（ｃｅｌｌｕｆａｒ ｏｒｉｇｉｎ）を指すものである。
【００６８】
アセチルヒドロラーゼ活性の特殊性は、ｐＨ８．０のＥＤＴＡ緩衝液にＬＤＬ（５００μｌ当たり２０μｇ）を添加して測定された。ＬＤＬの存在下では、賦形剤または変性ＬＤＬと比較して（１００℃，１０分）、５４％の ３Ｈ−アセテートが ３Ｈ−アセチル−ｐａｆから放出された（５μモル，３７℃，１０分）。
ＬＡ−ｐａｆの存在は、 ３Ｈ−アセチルｐａｆからの ３Ｈ−アセテートの形成には至らなかった。このことは、ＬＡ−ｐａｆ存在下での血小板への標識リゾｐａｆの不特定結合の可能性を排除するものである（データは示さず）。
【００６９】
５．単核マクロファージ様細胞の培養と刺激
５％ＣＯ２ と９５％空気の加湿雰囲気下３７℃で、１０％ＦＣＳと２ｍモルＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ １６４０培養基中の静止懸濁培養液中で、単核マクロファージ様Ｕ９３７が培養された。Ｕ９３７細胞は、１週間に２回希釈された（１／１０，体積／体積）。培養から３日後、Ｕ９３７細胞は、１０％の脱脂ＦＣＳ（ＣＰＲ１）と２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有する培養基中で、３種のＬＤＬ標本（１０μｇ／ｍｌ）、コレステロール（１０〜６０μｇ／ｍｌ）、ＬＤＬ−緩衝液またはエタノール（最終濃度、０．５％体積／体積）を用いて、２時間、４時間及び２４時間の恒温培養をされた。
【００７０】
６．単核マクロファージ様細胞によるｐａｆ結合検査
Ｕ９３７細胞は、遠心分離（１００ｇ×１０分）を用いた沈降の後２度洗浄された。細胞は、最後の洗浄後、０．２５％ＢＳＡ含有のＣａ２＋のないタイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液において懸濁された。すべての結合の分析が１．３ｍモルＣａ２＋，１．０ｍモル ＭｇＣｌ２ 及び０．２５％ＢＳＡ存在下のｐＨ７．４で行われた。種々濃度の（０．３５〜５．６ｎモル） ３Ｈ−ｐａｆ（５０μｌ）が過剰ＷＥＢ２０８６（１μｍ）の存在下と不存在下で４００μｌの緩衝液に添加された。懸濁液（最終濃度１．２５×１０６ ）中５０μｌの細胞を使用して反応が開始された。Ｕ９３７細胞が、４０℃、１時間の恒温培養後、真空濾過により上澄みから分離された。
【００７１】
図６は、ＬＤＬ添加後の ３Ｈ−ｐａｆ結合の投与応答曲線を示すものである。３回の洗浄前に、脱脂培養基３種類のＬＤ＋標本（１０μｇ／ｍｌ，２４時間）が添加された。Ｕ９３７細胞への ３Ｈ−ｐａｆ結合（１．２×１０６ 細胞当りｆモル）は、ＷＥＢ２０８６有（○）と無（●）（１μモル）で測定された。細胞は、４℃の１時間の恒温培養後、真空濾過で分離された。特定結合（■）は、総数間の差から算出され、また不特定結合が、ＷＥＢ２０８６（１μモル）の存在下で確認された。数値は、３回の異なる実験の平均±１ｓ．ｄ．である。
【００７２】
図７は、３回の洗浄前にＬＤＬ緩衝液を含む脱脂培養基中で、２４時間保持したＵ９３７細胞への ３Ｈ−ｐａｆ結合の投与応答曲線を示す。Ｕ９３７細胞への ３Ｈ−ｐａｆ結合（１．２５×１０６ 細胞当りｆモル）は、ＷＥＢ２０８６有（◆）と無（●）で測定された。細胞は、１時間の恒温培養後、真空濾過で分離された。特定結合（■）は、総数間の差から算出され、また不特定結合はＷＥＢ２０８６（１μモル）の存在下で確認された。数値は、３回の異なる実験の平均±１ｓ．ｄ．である。
【００７３】
図８は、コレステロール添加後の ３Ｈ−ｐａｆ結合の投与応答曲線を示す。コレステロール（６０μｇ／ｍｌ，２４時間）は、３回の洗浄前に脱脂細胞培養基中のＵ９３７細胞へ添加された。Ｕ９３７細胞への ３Ｈ−ｐａｆ（１．２５×１０６ 細胞当りｆモル）結合は、ＷＥＢ２０８６有（◆）と無（●）で行なわれた。細胞が４℃１時間の恒温培養後、真空濾過で分離された。特定結合（■）は、総数間の差から算出され、不特定結合は、ＷＥＢ２０８６（１μモル）の存在下で確認された。数値は、３回の異なる実験の平均±１ｓ．ｄ．である。
【００７４】
図９は、Ｕ９３７細胞数を増やしながら添加した ３Ｈ−アセチルｐａｆから放出された ３Ｈ−アセテートをパーセントで示したものである。Ｕ９３７細胞は、３種類のＬＤＬ標本（１０μｇ／ｍｌ，２４時間）の不存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）での脱脂培養基中で恒温培養された。３回洗浄してから、大量の無疵細胞が、ＷＥＢ２０８６（１μモル）有（▲）と無（●）で、３７℃、１５分間、 ３Ｈ−アセチルｐａｆ（５μモル）を用いて恒温培養され、氷浴中に入れて反応を終了した。プロティンは、過剰ＢＳＡで１０分間恒温培養後、ＴＣＡ（１４％、体積／体積）の添加により変性され、遠心分離された。放出 ３Ｈ−アセテートは、上澄み中で測定された。データは、 ３Ｈ−アセチルｐａｆ総添加量に対するパーセントで表され、３回の異なる実験の平均±１ｓ．ｄ．となっている。
【００７５】
ＬＤＬを用いた恒温培養後の ３Ｈ−パフ−アセタの特定結合について
単核マクロファージ様Ｕ９３７細胞（１．２５×１０６ ）は、４℃／１時間の恒温培養後、濃度依存の態様で ３Ｈ−パフ−アセタと結合したが、プラトー（ｐｌａｔｅａｕ）に達していない（図６と７）。３回の洗浄の前に、脱脂培養基中のＵ９３７細胞に３種類のＬＤＬ標本を添加すると（１０μｇ／ｍｌ，２４時間）、ＬＤＬ担体（図７）との不特定結合と比較して特定 ３Ｈ−ｐａｆ結合（図６）を示した。
【００７６】
３Ｈ−パフ−アセタの総結合は、ＬＤＬ処理Ｕ９３７細胞対コントロールＵ９３７細胞（１．２５×１０６ Ｕ９３７細胞当り ３３．３±５．７対３１．９±３．３ｆモル）で類似していた。ＷＥＢ２０８６（１μモル）の存在下で証明された不特定結合は、ＬＤＬ処理細胞の中では減少している。このようにして、ＬＤＬ処理細胞中に ３Ｈ−パフ−アセタの添加２．８ｎモルで、特定結合は１．８±０．８から４．６±２．１ｆモル（マン・ウイトニィ（Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ）テストでＰ＜０．０１，ｎ＝３）に重要な手段（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｍａｎｎｅｒ）で増加した。
【００７７】
（総結合）−（不特定結合）と定義した特定 ３Ｈ−パフ−アセタ結合は、 ３Ｈ−パフ−アセタを添加した１．４〜２．８ｎモルの間で、プラトー値に達した。
短期間の恒温培養（２時間、４時間）のＬＤＬ添加試料は、パフ−アセタ用特定結合部位を示さなかった。これはまたＷＥＢ２０８６を用いて証明された（下記表３を参照）。ＬＤＬ処理細胞とコントロール細胞のどちらも、添加 ３Ｈアセチルｐａｆ（５μモル，１時間）を４℃の結合条件下では異化（ｃａｔａｂｏｌｉｓｅ）しなかった（図示していない）。
【００７８】
コレステロールを用いた恒温培養後の特定 ３Ｈ−パフ−アセタ結合について脱脂培養基中のＵ９３７細胞にコレステロールを添加（６０μｇ／ｍｌ，２４時間）すると、ＬＤＬが示したのと同様に、特定 ３Ｈ−パフ−アセタ結合部位を示した（図８）。コントロール処理Ｕ９３７細胞への ３Ｈ−ｐａｆ（５．６ｎモル）の総結合は、ＬＤＬ処理細胞とコントロール細胞（３４．４±４．２ｆモル対３１．９±３．３及び３３．３±５．７ｆモル、Ｕ９３７細胞に結合）について得たのと同じような数値に達した。
【００７９】
ＷＥＢ２０８６（１μモル）で証明した不特定結合は、コレステロール処理細胞に比べてコントロール中では３４．４±４．２ｆモルから２５．２±５．０ｆモルに減少した。コントロール細胞への特定結合皆無と比較すると、 ３Ｈ−パフ−アセタ（５．６ｎモル）の特定結合は、ＬＤＬ処理のＵ９３７細胞（９．３±３．６ｆモル対１１．５±０．７ｆモル）へのそれと似ていた。 ３Ｈ−パフ−アセタ濃度が２．８ｎモル以上で、特定 ３Ｈ−パフ−アセタ結合は、コレステロール及びＬＤＬ処理細胞（６．２±２．９ｆモル対５．７±１．１ｆモル）と同様のプラトー値に達した。
【００８０】
コレステロールは、濃度依存態様（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ）で不特定結合を減らすことによって ３Ｈ−パフ−アセタ（０．７ｎモル）の特定結合を増やした（後記表４を参照）。コレステロールを脱脂培養基に２時間及び４時間添加した場合（表３）あるいは賦形剤添加後に脱脂培養基に添加した場合（表４）、やはり特定結合は全く検出されなかった。
【００８１】
無疵Ｕ９３７細胞のアセチルヒドロラーゼ活性について
無疵Ｕ９３７細胞は、変性プロティン存在下または細胞の不存在下で ３Ｈ−アセチルｐａｆ分解が皆無だったのと比較すると、２０℃で細胞数（図９中のＡ、Ｂ）に依存して添加 ３Ｈ−アセチルｐａｆ（５μモル）を分解した。脱脂培養基中（Ｂ：１０μｇ／ｍｌ，２４時間）のＵ９３７細胞への３種類のＬＤＬ標本の添加は、コントロール細胞（１２．０±１対１３．５±１％）と比べて、無疵Ｕ９３７細胞のパフ−アセタ分解を阻まなかった（図９中のＡ、Ｂ）。更にパフ−アセタ受容体拮抗剤ＷＥＢ２０８６は、無疵Ｕ９３７細胞の表面上での ３Ｈ−アセチル−ｐａｆ分解を抑制しなかった。
【００８２】
ＬＤＬ恒温培養後の細胞内アセチルヒドロラーゼ活性について
アセチルヒドロラーゼ活性もまた、ＬＤＬ処理後の洗浄Ｕ９３７細胞から得たリゼートで、コントロール細胞と比較して測定された。細胞リゼート（５μｌ）は、４４０μｌの等張性Ｈｅｐｅｓ／ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）が添加され、そして３７℃、５分間の予備恒温培養後 ３Ｈ−アセチル−ｐａｆを用いて反応が開始された。３７℃による１０分間の恒温培養後氷浴中で過剰ＢＳＡを用いて反応が止められてから、更に１０分間の恒温培養の後、ＴＣＡ（最終濃度 ９％、体積／体積、０℃）によりプロティンが変性させられた。遠心分離の後、上澄み中の放出 ３Ｈ−アセテートが測定された。データはプロティンｍｇ当りのｎモルで示された。
【００８３】
アセチルヒドロラーゼ活性は、最後の１０分間で、１１０μｇ／ｍｌ迄はプロティン濃度と一次関係にあった。賦形剤含有の脱脂培養基中で２４時間保持したコントロール細胞の酵素運動は、ＬＤＬ処理細胞とは異なっていた。
【００８４】
ラインウェーバ・ブルク・プロット（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂａｒｋ−Ｐｌｏｔｓ）から算出したＫｍとＶｍａｘ値は（後記の表５を参照）、脱脂培養基（１０μｇ／ｍｌ，２４時間）への３種類のＬＤＬ標本の添加後に増加した。細胞プロティンｍｇ当りのＶｍａｘの増加は、ＬＤＬ存在下の恒温培養中のＵ９３７細胞にアセチルヒドロラーゼが豊富になったことを意味する。ＬＤＬを用いた恒温培養後のＫｍ値は、血漿中であらわれたこれらのものに似ていた。
【００８５】
下記の表３は、３人の健康な男性有志から得たＬＤＬ標本（１０μｇ／ｍｌ）またはコレステロール（６０μｇ／ｍｌ）を脱脂培養基中のＵ９３７細胞に添加後２時間と４時間の、特定 ３Ｈ−パフ−アセタ結合の不足を賦形剤と比較して示すものである。細胞は３回洗浄され、ＷＥＢ２０８６（１μモル、１時間、４℃、０．２５％ＢＳＡ）の有、無で、 ３Ｈ−パフ−アセタ結合（１．６ｎモル）を形成させてから細胞が真空濾過で分離された。特定結合は（総結合）−（ＷＥＢ２０８６で証明した不特定結合）と定義する。数値は１．２５×１０６ Ｕ９３７細胞当りｆモルで表し、３種類の異なる実験の平均±１ｓ．ｄ．である。
【００８６】
【００８７】
下記の表４は、Ｕ９３７細胞（２４時間）への特定 ３Ｈ−パフ−アセタ結合のコレステロール投与依存度を示す。コレステロールは、賦形剤（０．５％エタノール、体積／体積）と比較して、脱脂培養基中のＵ９３７細胞に添加され、そして細胞は、２４時間恒温培養後に３回洗浄された。 ３Ｈ−パフ−アセタ結合（０．７ｎモル）は、ＷＥＢ２０８６（１μモル，１時間，４℃，０．２５％ＢＳＡ）有・無で形成させてから、細胞は、真空濾過で分離された。特定結合は、（総結合）−（ＷＥＢ２０８６で証明した不特定結合）と定義し、数値は、１．２５×１０６ Ｕ９３７細胞当りｆモルで表された。これらは、３回の異なる実験の平均±１ｓ．ｄ．である。
【００８８】
【００８９】
下記の表５は、３人の健康な男性有志（１０μｇ／ｍｌ）から得たＬＤＬ標本を脱脂培養基に添加後、２４時間溶解したＵ９３７細胞のアセチルヒドロラーゼ酵素運動を賦形剤と比べて示したものである。Ｕ９３７細胞は、３回洗浄後、超音波処理（３回、３０分間）により溶解され、３７℃、１０分間の恒温処理中に ３Ｈ−アセチルｐａｆからの放出 ３Ｈ−アセテートが確認された。反応は、過剰ＢＳＡとプロティン変性（ＴＣＡ，９％，体積／体積，０℃）により停止された。Ｋｍ及びＶｍａｘ値は、３種類の異なる実験で得たラインウェーバ・バーク・プロットから算出され、３種類の実験の平均±１ｓ．ｄ．で表されている。
【００９０】
【図面の簡単な説明】
【図１】人間のリポプロティンに、ＬＡーｐａｆが存在することを示すグラフである。
【図２】ＬＡーｐａｆに応答する兎の血小板凝集の投与応答曲線を示すグラフである。
【図３】ＬＡーｐａｆ及び合成ｐａｆによる兎の血小板の凝集抑制を示すグラフである。
【図４】洗浄した人間の血小板に結合している 3Ｈーｐａｆに及ぼすＬＤＬとＬＡーｐａｆの効果を示すグラフである。
【図５】洗浄した人間の血小板への、特定ｐａｆ結合の減感を示すグラフである。
【図６】ＬＤＬ添加後の 3Ｈーｐａｆ結合の投与応答曲線を示すグラフである。
【図７】Ｕ９３７細胞への 3Ｈーｐａｆ結合の投与応答曲線を示すグラフである。
【図８】コレステロール添加後の 3Ｈーｐａｆ結合の投与応答曲線を示すグラフである。
【図９】Ｕ９３７細胞数を増やしながら添加した 3Ｈーアセチルｐａｆから放出された 3Ｈーアセテートをパーセントで示したグラフである。
【産業上の利用分野】
本発明は、パフ−アセタ拮抗剤及びその調製方法に関する。なお、パフ−アセタは、ｐａｆ−ａｃｅｔｈｅｒと記され、ｐａｆは、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（血小板活性化要素）の略号であり、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，パリー，２８９号，１９７９年の１０３７〜１０４０頁に記載されている化学構造が１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−フォスフォコリンなる物質である。
【０００２】
【従来の技術】
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３６号，１９７２年，１３５６〜１３７７頁に記載されているようにパフ−アセタが血小板の凝集を誘引することは公知である。そこでパフ−アセタ媒介の血小板活性化による疾患を、天然のギンコリド類（ｇｉｎｇｏｌｉｄｅｓ）を用いて治療することがＦｕｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９８８年，１５２，１０１〜１１０頁で提案されている。
【０００３】
ギンコリド類とはパフ−アセタ拮抗剤であり、米国特許出願番号０７／２５９，６７４によると、パフ−アセタが血小板サイト（ｓｉｔｅｓ）に結合するのを抑制する化合物で、これによりこれらの細胞はパフ−アセタに攻撃されなくなる。
【０００４】
最近になって血小板活性化は，パフ−アセタだけでなくリポプロティン（通常のまたは修飾体）、特にＬＤＬ（ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，低密度リポプロティン）及びＬＡ−ｐａｆ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＰＡＦ−ａｃｅｔｈｅｒ，リポプロティン結合ｐａｆ−ａｃｅｔｈｅｒ）によっても引き起こされることが判明した。
【０００５】
更にリポプロティン（通常のまたは修飾体）及びＬＡ−ｐａｆにより誘引された血小板活性化は、パフ−アセタ拮抗剤により抑制されることも判明した。これは、リポプロティン（通常のまたは修飾体）やＬＡ−ｐａｆによる疾患の治療に、パフ−アセタ拮抗剤を使用し得ることを意味する。
【０００６】
【構成及び作用】
本発明によれば、パフ−アセタ（ｐａｆ−ａｃｅｔｈｅｒ）拮抗剤として親水性または非親水性トリアゾロチエノ−ジアゼピンまたはその類似体、ギンコリド、ギンコリドの混合物、または合成ギンコリド誘導体、あるいはＣＶ３９８８のようなパフ−アセタの類似体が使用可能である。上記トリアゾロチエノ−ジアゼピンとは好ましくはＷＥＢ２０８６，ＷＥＢ２０９８またはＢＮ５０７３９であり、またギンコリド類としてはＢＮ５２０２０，ＢＮ５２０２１，ＢＮ５２０２２またはこれら化合物の混合物が好ましい。
【０００７】
ＢＮ５０７３９の化学構造は、テトラヒドロ−４，７，８，１０メチル−（クロロ−２フェニル）６［ジメトキシ−３，４−フェニル）チオ］メチルチオカルボニル−９ピリド［４′，３′−４，５］チエノ［３，２−ｆ］トリアゾロ−１，２，４［４，３−ａ］ジアゼピン−１，４）である。
【０００８】
上述の化合物は、それぞれ下記の化学構造で示される。ＣＶ３９８８という化学用語は、りん酸塩ｒａｃ−３−（Ｎ−ｎ−オクタデシル−カルバモイロキシ）−２−メトキシプロピル ２−チアゾロイオエチルのことである。
【０００９】
ＷＥＢ２０８６という化学用語は、３−（４−（２−クロロフェニル）−９−メチル−６Ｈ−チエノ（３，２−ｆ）（１，２，４）トリアゾロ−（４，３−ａ）−（１，４）ジアゼピン−２イル）−１−（４−モルフォリニル）−１−プロパノンのことである。
【００１０】
ＷＥＢ２０９８という化学用語は、（３−（４−（２−クロロフェニル）−９−シクロプロピル−６Ｈ−チエノ）（３，２−ｆ）−（１，２，４）トリアゾロ−（４，３−ａ）（１，４）ジアゼピン−２イル）−１−（４−モルフォリニル）−１−プロパノンのことである。
【００１１】
ＢＮ５２０２０という化学用語は、９Ｈ−１、７ａ−（エポキシメタノ）−１Ｈ，６ａＨ−シクロペンタ［ｃ］フロ［２，３−ｂ）フロ−［３′，２′：３，４］シクロペンタ［１，２−ｄ］フラン−５，９，１２（４Ｈ）−トリオン，３−ｔｅｒｔ−ブチルヘキサヒドロ−４，７ｂ−ジヒドロキシ−８−メチルのことである。
【００１２】
ＢＮ５２０２１という化学用語は、９Ｈ−１，７ａ−（エポキシメタノ）−１Ｈ，６ａＨ−シクロ−ペンタ［ｃ］フロ［２，３−ｂ］フロ−［３′，２′：３，４］シクロペンタ［１，２−ｄ］フラン−５，９，１２（４Ｈ）−トリオン、３−ｔｅｒｔ−ブチルヘキサヒドロ−４，４ｂ−１１−トリヒドロキシ−８−メチルのことである。
【００１３】
ＢＮ５２０２２という化学用語は、９Ｈ−１、７ａ−（エポキシメタノ）−１Ｈ，６ａＨ−シクロペンタ［ｃ］フロ［３′，２′：３，４］シクロペンタ［１，２−ｄ］フラン−５，９，１２（４Ｈ）−トリオン，３−ｔｅｒｔ−ブチルヘキサヒドロ−２，４，７ｂ，１１−テトラヒドロキシ−８−メチルのことである。
【００１４】
パフ−アセタ拮抗剤の有効性測定に競合結合テスト（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｂｉｎｄｉｎｇ ｔｅｓｔ）を用いるのは既に知られている。しかしパフ−アセタ拮抗剤の有効性に関しては、リポプロティン（通常のまたは修飾体）、特にＬＤＬまたはＶＬＤＬ（ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，超低密度リポプロティン）の存在下あるいは不存在下で、細胞並びに標識パフ−アセタを恒温培養した時にのみ信頼すべき情報が得られる。
【００１５】
パフ−アセタ受容体に対する拮抗活性に関して各物質の効果を迅速かつ簡便にテストするには、例えばスクリーニング法によりパフ−アセタ受容体への有効な拮抗剤を見つけて、前記疾患の治療に適用できるようにするには、以下のステップからなる有効性測定方法を利用したパフ−アセタ拮抗剤の調製方法が良い。
【００１６】
パフ拮抗剤の調整方法であって、以下のステップ、
ａ）リポプロティン、ＬＡ−ｐａｆ及び／又はコレステロールの存在下で、清浄細胞と、放射性、着色化若しくは蛍光化標識パフ又は標識若しくは無標識パフ類縁物質及び測定すべき拮抗剤とを混合するステップ、
ｂ）リポプロティン、ＬＡ−ｐａｆ及び／又はコレステロールの存在下で、ステップａ）で用いたものと同じタイプの清浄細胞と、放射性、着色化若しくは蛍光化標識パフとを、測定すべき拮抗剤の不存在下で混合するステップ、
ｃ）上記の混合物ａ）とｂ）各々から細胞を分離するステップ、
ｄ）上記細胞に結合した放射性、着色化若しくは蛍光化標識パフの量を測定するステップ、及び
ｅ）拮抗剤の有効性を、上記ａ）での拮抗剤存在下で細胞に結合した標識パフ量と、上記ｂ）での拮抗剤不存在下で細胞に結合した標識パフ量との関係から判定するステップ、
を含んでなる有効パフ拮抗剤の調製方法。
【００１７】
本発明方法による有効性測定方法を利用したパフ−アセタ拮抗剤の調製方法に用いる細胞としては、血小板が好ましい。
【００１８】
細胞は例えば洗浄やゲル濾過により正常化処理をするのが望ましく、また好ましくはアスピリン（アセチルサリチル酸）を添加する。アスピリン添加により、本発明のパフ−アセタ拮抗剤の調製ステップに及ぼすプロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）の悪影響が取り除かれる。アスピリン添加とプロスタグランジン拮抗剤の添加効果も測定可能となる。
【００１９】
血小板を使用する際は、その後正常細胞を脱脂した血清ａｌｂｕｍｉｎを含有し、カルシウムイオンを全く含まない等張緩衝液中に分散させるのが好ましい。血小板は、請求項１記載の方法のステップａ）及びｂ）に使用する前に、カルシウム及びマグネシウムイオン存在下で数倍、例えば１０倍に濃縮する。
【００２０】
標識リガンド（ｌｉｇａｎｄ）としては、例えばトリチウム標識パフ−アセタまたは標識ＷＥＢ２０８６のような標識拮抗剤が使用できる。標識または未標識のパフ−類縁物質や着色化あるいは蛍光化標識化合物等も用いることができる。
【００２１】
請求項１記載のステップａ）及びｂ）による混合は２０℃の温度で行うのが好ましい。混合後は、細胞を１０分以上恒温培養するのが望ましく、その後本発明方法のステップｃ）により分離する。恒温培養期間は１０分以上が好ましい。ステップｃ）による細胞分離は、濾過または遠心分離によって行う。
【００２２】
血小板の他に、本発明では、単核マクロファージ様細胞を使用してパフ−アセタ拮抗剤を調製することもできる。この場合は、脱脂培養基中でリポプロティン（通常のまたは修飾体）及びコレステロールで刺激した単核マクロファージ様細胞を用いる。
【００２３】
単核マクロファージ様細胞を使用すると、本発明方法は、特に迅速で簡便なものになる。単核マクロファージ様細胞は、市販されており、培養に支障はない。コレステロールまたはＬＤＬやＶＬＤＬのようなリポプロティンで刺激した培養基からある量の細胞を、結合検査の前に採取するだけで良い。これらの操作や結合検査自体は、実験室での通常操作でできるので、市販の自動装置を使用することが可能である。従って、本発明方法を自動的に行うことができて、スクリーニング法では、非常に重要な意味を持つ。
【００２４】
単核マクロファージ様細胞を使用すると、動脈硬化症の予防と治療用のパフ−アセタ拮抗剤活性測定にも、本発明方法を用いることができる。動脈硬化症のみならず炎症性疾患やガンの病因においても単核マクロファージ様細胞及びＬＤＬのようなリポプロティン（通常のまたは修飾体）及びそこに含まれるコレステロールは、相当重要なものとなっている。
【００２５】
従って本発明方法では、生体内で動脈硬化症を引き起こすＬＤＬとコレステロールと共に、同様の細胞がガラス内で使用される。
【００２６】
単核マクロファージ様細胞としては、Ｕ９３７細胞が特に好ましい。単核マクロファージ様細胞は、血清特に子牛胎児血清を含有する培養基で培養される。テストの前に単核マクロファージ様細胞を脱脂血清、特に脱脂した子牛胎児血清を含有する培養基中で数時間培養するのが好ましい。培養開始から２４時間後に、ＬＤＬとコレステロールを添加して細胞を刺激するのが良い。単核マクロファージ様細胞の培養基は、Ｌ−グルタミンを含有しているのが望ましい。培養及び恒温培養は、それぞれ高温例えば３７℃で行われる。
【００２７】
更に、単核マクロファージ様細胞の単純培養は、それら細胞が懸濁液中にあるので、従来の市販装置で正確な量を調合できる本質的な利点がある。
【００２８】
細胞は結合検査に使用する前に、洗浄等の方法で清浄にして、アセチルヒドロラーゼ分解パフ−アセタのような酵素を取り除く。
【００２９】
単核マクロファージ様細胞を使用する場合は、フォスフォリパーゼやアセチルヒドロラーゼのような単核マクロファージ様細胞に含有される酵素によりパフ−アセタが分解されるのを防ぐために、結合検査は、２０℃未満、好ましくは２〜６℃の温度で行う。本発明の有効性測定方法を利用した調製方法のステップａ）及びｂ）による混合後、単核マクロファージ様細胞を使用した時は、１０分から１−４時間の恒温培養をするのが望ましい。
【００３０】
パフ−アセタは水に溶けにくいフォスフォリピドなので、結合検査は、牛の血清アルブミン等の血清アルブミンを脱脂したものの存在下で行うのが好ましく、この時カルシウム及びマグネシウムイオンを添加するとよい。
【００３１】
血清アルブミンは、パフ−アセタと特定単核マクロファージ様細胞と結合していない拮抗剤とを結合させる役割を果たし、これにより、パフ−アセタと拮抗剤のこの部分は、それぞれ単核マクロファージ様細胞から除かれる。
【００３２】
このように処理した単核マクロファージ様細胞を液状媒体から分離するには、濾過によることが良い。というのは濾過方式が大変簡単であるからである。同時に特定の結合をしていない残留標識パフ−アセタを細胞から分離するのに、濾過が、比較的に正確で、なおかつ非常に効果的な方法であるからである。
【００３３】
次に細胞に（特定）結合している標識パフ−アセタの量を測定する。放射能標識のパフ−アセタを使用したのであればフィルター中に残った細胞の放射能のみを測定する。測定数値から細胞のないフィルター中の放射能数値を差し引く。
【００３４】
上記ステップａ）に従い拮抗剤の量を変えてテストした結果を目盛りグラフに表わすと、５０％の抑制値で拮抗剤の有効性が得られた。即ちある量の細胞に対して、拮抗剤量は可逆性パフ−アセタ結合の５０％を抑制した。
【００３５】
単核マクロファージ様細胞を用いた本発明の効力測定方法では、親水性トリアゾロチエノ−ジアゼピンとしてＷＥＢ２０８６を使用してテストした時に特に優れた結果を示した。
【００３６】
更に、本発明方法は、パフ−アセタに対する天然の拮抗剤であるアセチルヒドロラーゼに対する特定の化合物であの活性有効性の測定にも使用できる。また、ＬＤＬとコレステロールは、アセチルヒドロラーゼの細胞内形成を刺激するので本発明方法をアセチルヒドロラーゼとその拮抗体の形成にも使用できる。
【００３７】
更に、本発明方法により、患者の、望ましくは高コレステロール血症患者に対する、ＬＤＬ製剤の病原性とアセロゲニティ（ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｔｙ）を個別に、臨床的にテストできるし、また、アポリポプロティン（ａ）またはアポリポプロティンＢ（１００）等の病原性リポプロティン中のＬＡ−ｐａｆ量と相関させることもできる。
【００３８】
更には、コレステロールのみならず、コルチコステロイドまたは性ホルモン等の他のステロイド類の効果も、本発明方法のスクリーニング手段によりテストできる。
【００３９】
受容体調節プロティンであるｐａｆやＬＡ−ｐａｆ用の結合位置及びｐａｆ拮抗剤例えばＷＥＢ２０８６用の結合位置は、ＬＤＬ及びコレステロール処理した単核マクロファージ様細胞のような分化細胞ラインを用いて形成することができる。このようなシステムにより各種疾患の治療や診断に使用し得るモノクロナル抗体を合成することができる。診断テスト用にＬＡ−ｐａｆ等の化合物のようなｐａｆにおけるプロティン部位に対抗するモノクロナル抗体も形成できる。ＬＡ−ｐａｆは、単核マクロファージ様細胞中（血小板及びリポプロティン中でも同様）に形成されるので、これらの細胞をＬＡ−ｐａｆまたは標識ＬＡ−ｐａｆの合成に使用することができる。
【００４０】
ドイツ特許公開公報ＤＥ ３７ ３５ ５２４Ａ１に提示されるように、血小板表面上のｐａｆまたはｐａｆ様化合物の結合増加がこれら化合物の簡易定量に用いることができる。細胞結合したｐａｆまたはＬＡ−ｐａｆ等のｐａｆ様化合物は、介在する細胞への付着性、血小板凝集、あるいは着色化または蛍光化の抗体への反応を含む種々の母材との反応等に関し、その潜在力を測定する。血小板等の血液細胞は、フォスフォリピド抽出と、濾過または遠心分離によるＨＰＬＣ分析をしなくても、容易に単離される。
【００４１】
濾過法では、自動装置付きの器具が市販されている。最後にｐａｆ受容体は、５日間は安定しており、市販の特殊テスト容器に採血して、ドイツ実用新案登録公告番号５７１６００４に示されるように、少量の血液量に修正後、中央研究施設で血液細胞の受容体状態を検査することができる。
【００４２】
ｐａｆまたは ＬＡ−ｐａｆ等のｐａｆ様化合物の特定結合は、細胞のカルシウム流と密接な相関関係にあるので、それらが細胞カルシウム流に及ぼす効果を、合成パフ−アセタの目盛りグラフと比較することで、本発明方法をパフ−アセタまたはｐａｆ様血液成分の測定に用いることができる。カルシウム測定を自動化するのに、市販の自動装置を用いても良い。
【実施例】
【００４３】
下記の実施例により本発明を詳細に説明する。
１．リポプロティンの単離
Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１９５５年，３４号，１３４５〜１３５３頁に記載されているように、超遠心分離と、０．１５モル ＮａＣｌ／１ミリモル ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５に対する透析によりＬＤＬが得られた。リポプロティン分留は、４℃で保存され、１週間以内に使用された。
【００４４】
２．洗浄血小板の用意と血小板凝集
Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ，１９８３年，５３号，５１３頁に従い、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９８８年，１５２号，１０１〜１１０頁により修正した方法で健康な男性有志から血小板を採取した。人血がＡＣＤ（Ａｃｉｄ Ｃｉｔｒａｔｅ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ，酸・クエン酸塩・ぶどう糖）７：１で前腕の静脈から採血され、遠心分離（１００×ｇ，１５分）して血小板富有の血漿を得た。
【００４５】
次に血小板は、ＡＣＤ９：１（ｐＨ６．４）タイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液中で３回遠心分離（９００×g, １０分）して洗浄され、最後の洗浄の前にリジン−アスピリン（１００μモル）と共に３０分間恒温培養された。血小板の最終濃縮は、クルター計数器を用いてｍｌ当たり血小板数１×１０８ に調整された。最終洗浄後ＡＣＤとＣａ２＋（血小板数ｍｌ当たり１０９ ）を含まない０．２５％ＢＳＡ（脂肪酸牛血清アルブミン）含有のｐＨ６．４のタイロード緩衝液中に懸濁し、結合実験の前に０．２５％ＢＳＡと１．３ミリモルＣａ２＋含有のｐＨ７．４のタイロード緩衝液で直接希釈した。Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ，１９８３年，５３号，５１３頁に記載されているように、３７℃で攪拌しながら異なる濃度のＷＥＢ２０８６を含有するまたは含有していない人のフィブリノーゲンの存在下で、合成ｐａｆ（５０ｎモル）、ＬＡ−ｐａｆまたはトロンピン（１Ｕ）を用いて血小板凝集を行った。
【００４６】
３．リポプロティン、血小板及び単核マクロファージ様Ｕ９３７細胞からのＬＡ−ｐａｆの単離
Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９５９年 ３７号 ９１１〜９１７頁に記載の方法で、Ｅｕｒ．ｊ．Ｐｈａｒｍａｃａｌ，１９８８年，１５２号 １０１〜１１０頁に従って修正したフォスフォリピド抽出をした。フォスフォリピドは、リポプロティンまたは超音波処理血小板、単核マクロファージ様Ｕ９３７細胞（ＲＰＭＩ培養基を含む標準１０％牛胎児血清（Ｆｃｓ）中で培養）から抽出した。ジクロメタン／メタノール（１／２，体積比）を４℃で一昼夜添加してから、２％の酢酸を含有するジクロメタン／水（１／１，体積比）を添加した。
【００４７】
有機相を採取し、水相は／体積部のジクロメタンで３回洗浄をした。サンプルを高圧液相クロマトグラフィー（ｈｐｌｃ）ミクロポラシルカラム（内径３．９ｍｍ×長３００ｍｍ）にかけ、次にＣ．Ｒ．Ａｃｒｄ．Ｓｃｉ．（パリ），１９７７年・２８９号，１０３７〜１０４０頁に記述されているように１ｍｌ／分の流速に希釈した。フォスフォコリン（ＰＣ），スフィンゴミエリン，合成ｐａｆ並びにリゾフォスファチジルコリンの放射性標準と対照してＬＡ−ｐａｆを特定した。
【００４８】
フォスフォリピドはジクロメタンを蒸発させてから４℃で保存し、１週間内にアスピリン化及びＣＰ，ＣＰＫ−（クレアチンフォスフェイト／クレアチンフォスフォキナーゼ）処理した兎血小板（ｍｌ当たり３×１０８ 血小板数）を用いて、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１９７２年，１３６号，１３５６〜１３７７頁の記載法を一部修正した方法で、即ち、上述した人の血小板の処理と同様に兎血小板も洗浄して、凝集による定量を行った。
【００４９】
血小板を最終洗浄する前にリジンアスピリン（１００μモル）を３０分間恒温培養した。ＣＰ（１ミリモル）とＣＰＫ（ｍｌ当たり１０Ｕ）を凝集測定前に直接添加した。ＬＡ−ｐａｆの凝集活性は、合成ｐａｆの標準と比較してｎｇ ｐａｆ同等活性として表わされ、合成ｐａｆの分子量を基にｎモルで算出される。ｐａｆ−介在血小板の凝集に及ぼすＷＥＢ２０８６の抑制効果は、ＬＡ−ｐａｆまたは合成ｐａｆの濃度を用いてテストした。この濃度は、ＷＥＢ２０８６が種々の濃度で３７℃１分の予備恒温培養後でも極大光透過率の８０％（ＥＣ８０）を媒介する。グラフからＩＣ５０値は、抑止制ＷＥＢ２０８６濃度の５０％と算出された。
【００５０】
４．洗浄人血小板に対する ３Ｈ−ｐａｆ結合検査
血小板への添加に先立ち、標識（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｕｃｋｓ Ｕ．Ｋ．による２６．１ｎＣｉを使用する０．０６５または０．６５ｎモル）を付けた又は未標識合成ｐａｆ（０．０１〜５０ｎモル）、またはＷＥＢ２０８６（１μモル）をＢＳＡ含有緩衝液（０．２５％，重量／体積）に添加して、ｐａｆ結合検査をした（Ｔｈｒｏｍｂｏｓ．Ｒｅｓ，１９８６年，４１号，６９９〜７０６頁参照のこと。）。また血小板添加の前にＬＤＬ（最終濃度、５０μｌ当たり２０μｇ）ＬＡ−ｐａｆ（１ｎモル）、未標識合成ｐａｆ（１ｎモル）、または賦形剤を細胞を含まない緩衝液に添加してもよい。次に５０μｌの標識ｐａｆを添加してから、４００μｌの緩衝液に５０μｌの血小板懸濁を添加して、結合実験を開始した。２０℃で３０分間の恒温培養の後、真空濾過法により上澄みから血小板を分離した。
【００５１】
除感検査用として、標識及び未標識合成ｐａｆの添加の前にＬＡ−ｐａｆ、合成ｐａｆ（１０ｎモル）またはＬＤＬ（５００μｌ当たり８５μｇ）を血小板と共に３分間恒温培養した。これらの実験では、最終洗浄の前に２０℃で４０分間、人のリポプロティンに対する拮抗体２．５ｍｇで、または人の血清アルブミンまたは賦形剤で血小板（ｍｌ当り１０９ ）を処理した。標識ｐａｆ結合は５×１０７ 血小板に結合したｆモルとして算出されるか、または未標識合成ｐａｆ（５０ｎモル）あるいはＷＥＢ２０８６（１μモル）で実証された ３Ｈ−ｐａｆ特定結合のパーセントで表わされる。数値は３種の異なる実験の±１ｓ．ｄ．の平均である。
【００５２】
図１は、人のリポプロティンにＬＡ−ｐａｆが存在することを示している。２人の健康な男性有志（●○）から得たＬＤＬからのＬＡ−ｐａｆは、ＨＰＬＣ−留分中に（１１〜１５分）機能的に不活性なフォスフォコリンと共に溶出した。この保持時間は合成ｐａｆ（２１〜２４分）のそれとは明らかに異なっている（図１）。
【００５３】
ＬＤＬ留分中のＬＡ−ｐａｆ活性を、血小板凝集を刺激するその能力からｐａｆ標準と比較して算出すると、リポプロティンｍｇ当り４．６±１．３ｎｇＬＡ−ｐａｆがｍｇ当りＶＬＤＬ３．４±０．６ｎｇに対して形成され、またｍｇ当りＨＤＬ２．５±１．３ｎｇに対するリポプロティンが測定され、３人の健康な男性有志（平均±ｓ．ｄ．）から採取したリポプロティン不足血清中でのプロティンｍｇ当り０．２±０．２ｎｇと比較された。
【００５４】
清浄な男性有志からの洗浄血小板を抽出すると１０９ 血小板は３．１±０．５ｎｇのＬＡ−ｐａｆを含有していた（データは示していない）。人の洗浄血小板を凝集している間に（ｎ＝３）、外因性ｐａｆ（５０ｎモル）またはトロンピン（１Ｕ）に応答して、その１部は放出された。洗浄血小板のＬＡ−ｐａｆ濃度は、１分の凝集後１０９ 血小板当り２．２±０．２及び２．１±０．１ｎｇに減少したが、これらは細胞起因のＬＡ−ｐａｆであることを示している。これら洗浄した人の血小板中にＬＤＬが存在していることは、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ ｐｅｓ，１９８０年，１９号，６９３〜７００頁に記載されているＳＤＳゲル電気泳動により本質的に証明された。凝集中血小板は無疵のままであった。なぜならＬＤＬ放出は全く検出されなかったからである（６．５±１．５％即ち±１．ｓ．ｄ．，ｎ＝３）。洗浄血小板と比較して、単核マクロファージ様Ｕ９３７細胞は１０９ 細胞当り１３３ｎｇを含有していた。
【００５５】
図２にＬＡ−ｐａｆに応答する兎の血小板凝集の投与応答曲線を示す。ＨＰＬＣを使用する前に分別した種々濃度のＬＡ−ｐａｆは（ａ：３２ｐＭ，ｂ：６８ｐＭ，ｃ：８３ｐＭ，ｄ：１０９ｐＭ，最終濃度）攪拌しながら血小板に添加し、合成ｐａｆの規定標準と比較した。各数値は３回の実験を示すものである。即ち、図２によると血小板凝集は、濃度と時間に応じて測定されるので、高光透過率（血小板凝集）の区域と再現可能な数値が得られる。図から明白なように、光透過率及び血小板凝集はＬＡ−ｐａｆ濃度と共に増加している。
【００５６】
図３はアスピリンとＣＰ／ＣＰＫ処理後、拮抗剤ＷＥＢ２０８６の濃度増加に応じたＬＡ−ｐａｆ（○）及び合成ｐａｆ（●）による兎血小板の凝集抑制を示す。数値は３回の実験の±／ｓ．ｄ．平均である。パフ−アセタ拮抗剤としてのＷＥＢ２０８６が、ＬＡ−ｐａｆ及びパフ−アセタに対して実質的な同一効果を示していることが分かる。即ち、ＷＥＢ２０８６は、ＬＡ−ｐａｆにより起こった血小板凝集をパフ−アセタが血小板凝集に対するのと同程度に抑制する。
【００５７】
図４は、洗浄した人の血小板に結合している ３Ｈ−ｐａｆに及ぼすＬＤＬとＬＡ−ｐａｆの効果を示している。ＬＤＬの有（■）、無（●）及び ３Ｈ−ｐａｆ（０．０６５ｎモル）とを用いた。血小板の同時恒温培養は、 ３Ｈ−ｐａｆの結合を促進した。ＬＤＬ（ｍｌ当り２０μｇ）は結合（ｐａｆ賦形剤で評価する、１００％）及び不特定結合（未標識ｐａｆ（５０ｎモル）で評価）で増加していた。図４の数値は特定ｐａｆ拮抗剤ＷＥＢ２０８６で得られた後記の表１の数値に対応している。
【００５８】
図５に洗浄した人の血小板への特定ｐａｆ結合の減感（ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）を示す。ＬＤＬとＬＡ−ｐａｆとが受容体への ３Ｈ−ｐａｆ結合を増加するように導いているのであれば、両物質を用いた血小板の予備恒温培養は、合成ｐａｆと比較して過剰未標識ｐａｆにより評価する、特定 ３Ｈ−ｐａｆ結合を減少させるはずである。実際にＬＡ−ｐａｆ（図５のｂ １−３ ）は、媒介物（図５のａ １−３ ）と比較して、ｐａｆの２回目の攻撃に対して血小板を減感させた。
【００５９】
ＬＡ−ｐａｆ（図５のｂ １−３ ）、合成ｐａｆ（図５のｃ）またはＬＤＬ（図５のｄ，５００μｌ当り８５μｇ）を用いた３分間の予備恒温培養後にも同様の効果が観測された。同様に、血小板を人のリポプロティン（図５のａ２ ，ｂ２ ，１０９ 血小板当り２．５ｍｇ，２０℃で４０分間）に対する拮抗体で前処理すると、非合成でｐａｆ（図５のａ２ ）のＬＡ−ｐａｆ（図５のｂ２ ）介在効果（ｅｆｆｅｃｔｓ）は、部分的に阻止された。
【００６０】
抗体賦形剤（図５のａ１ ，ｂ１ ）と比較して、人の血清アルブミン（図５のａ３ ，ｂ３ ）に対するポリクロナル拮抗体を用いた前処理は、合成ｐａｆによる２回目の攻撃に対抗してＬＡ−ｐａｆ介在の減感を修正しなかった。リポプロティンに対する拮抗体が、合成ｐａｆの２回目の攻撃に対抗して、ＬＡ−ｐａｆが誘引した減感または ３Ｈ−ｐａｆ結合を阻止したとの観察結果は、リポプロティンが原因として関係していることを示唆し、従ってＬＡ−ｐａｆ中のリポプロティン部位を示す。下記表１はＬＡ−ｐａｆ、ＬＤＬ、合成パフ−アセタ及び賦形剤の存在下で、無疵の洗浄人血小板への標識パフ−アセタの結合を示す。ＬＡ−ｐａｆ、合成ｐａｆ（１ｎモル）、ＬＤＬ（３０μｇ／ｍｌ）または賦形剤（０．２％エタノールを含有する水）は、ＢＳＡ緩衝液に添加した。 ３Ｈ−ｐａｆ（０．０６５ｎモル）の特定結合は、過剰ＷＥＢ２０８６（１μモル）の存在下または不存在下でそれぞれ確認された。数値は１０８ 血小板に結合したｆモルで表わされ、３回の異なる実験の平均±１ｓ．ｄ．である。
【００６１】
表１から未標識パフ−アセタが予想通り、賦形剤（１９１±１４ｆモル）と比較して標識 ３Ｈ−ｐａｆの血小板（１３７±１０ｆモル）への総結合を低下させたことがわかる。一方２６２±２３、２４７±２９ｆモルを使用するＬＡ−ｐａｆとＬＤＬとは、それぞれ血小板への ３Ｈ−ｐａｆの総結合を増加させた。不特定結合及び特定結合についても同じことが言える。
【００６３】
従って、ＬＡ−ｐａｆ用の血小板上の結合部位は少なくとも２つあり、１結合部位はリポプロティン（通常のまたは修飾体）とＬＡ−ｐａｆのみが接近可能であって、その部位には、どうしてもパフ−アセタは、近づけない。
【００６４】
下掲の表２は、リポプロティン存在下での ３Ｈ−ｐａｆの異化作用及びリポプロティンと血小板存在下での ３Ｈ−ＬＡ−ｐａｆへの、その代謝を示すものである。血小板は添加 ３Ｈ−ｐａｆを減成（ｄｅｇｒａｄｅ）しないが、ＬＤＬが存在すると ３Ｈ−ｐａｆの一部が ３Ｈ−リゾ−ｐａｆに減成された。同様の減成（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）は、ＶＬＤＬ存在下でも得られたが、ＨＤＬ存在下と比較すると、より高濃度（最終濃度０．０４％対０．１７％，重量／体積）で得られた。特定ｐａｆ受容体拮抗剤ＷＥＢ２０８６（４０ｎモル）は、リポプロティン存在下の ３Ｈ−ｐａｆ減成を妨害しなかった（表２参照）。
【００６５】
３Ｈ−ｐａｆは、ＷＥＢ２０８６（４０ｎモル）使用または不使用で、ＬＤ＋またはＶＬＤＬ（最終濃度、０．０４％，０．０３％または０．１７％体積／体積）を含有するＢＳＡ緩衝剤中の洗浄人血小板に添加された。前述したフォスフォリピド分析は、ＨＰＬＣを使用して行われた。各別のＨＰＬＣ停滞時間の放射能は、背景値（ボイド ボリウム；ｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅでない）を減殺してから総標識のパーセントとして算出した。数値は３人の健康な男性有志（平均±１ｓ．ｄ．）から採取したＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＨＤＬによって得た平均±１ｓ．ｄ．である。
【００６６】
標識ＬＡ−ｐａｆ（５．０±１．７％）の総量は、 ３Ｈ−ｐａｆが緩衝液を含んでいるＬＤＬ及びＢＳＡ中に血小板懸濁液を添加する時に、形成される（２０℃，３０分）。これは、またその細胞起因性（ｃｅｌｌｕｆａｒ ｏｒｉｇｉｎ）を指すものである。
【００６８】
アセチルヒドロラーゼ活性の特殊性は、ｐＨ８．０のＥＤＴＡ緩衝液にＬＤＬ（５００μｌ当たり２０μｇ）を添加して測定された。ＬＤＬの存在下では、賦形剤または変性ＬＤＬと比較して（１００℃，１０分）、５４％の ３Ｈ−アセテートが ３Ｈ−アセチル−ｐａｆから放出された（５μモル，３７℃，１０分）。
ＬＡ−ｐａｆの存在は、 ３Ｈ−アセチルｐａｆからの ３Ｈ−アセテートの形成には至らなかった。このことは、ＬＡ−ｐａｆ存在下での血小板への標識リゾｐａｆの不特定結合の可能性を排除するものである（データは示さず）。
【００６９】
５．単核マクロファージ様細胞の培養と刺激
５％ＣＯ２ と９５％空気の加湿雰囲気下３７℃で、１０％ＦＣＳと２ｍモルＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ １６４０培養基中の静止懸濁培養液中で、単核マクロファージ様Ｕ９３７が培養された。Ｕ９３７細胞は、１週間に２回希釈された（１／１０，体積／体積）。培養から３日後、Ｕ９３７細胞は、１０％の脱脂ＦＣＳ（ＣＰＲ１）と２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有する培養基中で、３種のＬＤＬ標本（１０μｇ／ｍｌ）、コレステロール（１０〜６０μｇ／ｍｌ）、ＬＤＬ−緩衝液またはエタノール（最終濃度、０．５％体積／体積）を用いて、２時間、４時間及び２４時間の恒温培養をされた。
【００７０】
６．単核マクロファージ様細胞によるｐａｆ結合検査
Ｕ９３７細胞は、遠心分離（１００ｇ×１０分）を用いた沈降の後２度洗浄された。細胞は、最後の洗浄後、０．２５％ＢＳＡ含有のＣａ２＋のないタイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液において懸濁された。すべての結合の分析が１．３ｍモルＣａ２＋，１．０ｍモル ＭｇＣｌ２ 及び０．２５％ＢＳＡ存在下のｐＨ７．４で行われた。種々濃度の（０．３５〜５．６ｎモル） ３Ｈ−ｐａｆ（５０μｌ）が過剰ＷＥＢ２０８６（１μｍ）の存在下と不存在下で４００μｌの緩衝液に添加された。懸濁液（最終濃度１．２５×１０６ ）中５０μｌの細胞を使用して反応が開始された。Ｕ９３７細胞が、４０℃、１時間の恒温培養後、真空濾過により上澄みから分離された。
【００７１】
図６は、ＬＤＬ添加後の ３Ｈ−ｐａｆ結合の投与応答曲線を示すものである。３回の洗浄前に、脱脂培養基３種類のＬＤ＋標本（１０μｇ／ｍｌ，２４時間）が添加された。Ｕ９３７細胞への ３Ｈ−ｐａｆ結合（１．２×１０６ 細胞当りｆモル）は、ＷＥＢ２０８６有（○）と無（●）（１μモル）で測定された。細胞は、４℃の１時間の恒温培養後、真空濾過で分離された。特定結合（■）は、総数間の差から算出され、また不特定結合が、ＷＥＢ２０８６（１μモル）の存在下で確認された。数値は、３回の異なる実験の平均±１ｓ．ｄ．である。
【００７２】
図７は、３回の洗浄前にＬＤＬ緩衝液を含む脱脂培養基中で、２４時間保持したＵ９３７細胞への ３Ｈ−ｐａｆ結合の投与応答曲線を示す。Ｕ９３７細胞への ３Ｈ−ｐａｆ結合（１．２５×１０６ 細胞当りｆモル）は、ＷＥＢ２０８６有（◆）と無（●）で測定された。細胞は、１時間の恒温培養後、真空濾過で分離された。特定結合（■）は、総数間の差から算出され、また不特定結合はＷＥＢ２０８６（１μモル）の存在下で確認された。数値は、３回の異なる実験の平均±１ｓ．ｄ．である。
【００７３】
図８は、コレステロール添加後の ３Ｈ−ｐａｆ結合の投与応答曲線を示す。コレステロール（６０μｇ／ｍｌ，２４時間）は、３回の洗浄前に脱脂細胞培養基中のＵ９３７細胞へ添加された。Ｕ９３７細胞への ３Ｈ−ｐａｆ（１．２５×１０６ 細胞当りｆモル）結合は、ＷＥＢ２０８６有（◆）と無（●）で行なわれた。細胞が４℃１時間の恒温培養後、真空濾過で分離された。特定結合（■）は、総数間の差から算出され、不特定結合は、ＷＥＢ２０８６（１μモル）の存在下で確認された。数値は、３回の異なる実験の平均±１ｓ．ｄ．である。
【００７４】
図９は、Ｕ９３７細胞数を増やしながら添加した ３Ｈ−アセチルｐａｆから放出された ３Ｈ−アセテートをパーセントで示したものである。Ｕ９３７細胞は、３種類のＬＤＬ標本（１０μｇ／ｍｌ，２４時間）の不存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）での脱脂培養基中で恒温培養された。３回洗浄してから、大量の無疵細胞が、ＷＥＢ２０８６（１μモル）有（▲）と無（●）で、３７℃、１５分間、 ３Ｈ−アセチルｐａｆ（５μモル）を用いて恒温培養され、氷浴中に入れて反応を終了した。プロティンは、過剰ＢＳＡで１０分間恒温培養後、ＴＣＡ（１４％、体積／体積）の添加により変性され、遠心分離された。放出 ３Ｈ−アセテートは、上澄み中で測定された。データは、 ３Ｈ−アセチルｐａｆ総添加量に対するパーセントで表され、３回の異なる実験の平均±１ｓ．ｄ．となっている。
【００７５】
ＬＤＬを用いた恒温培養後の ３Ｈ−パフ−アセタの特定結合について
単核マクロファージ様Ｕ９３７細胞（１．２５×１０６ ）は、４℃／１時間の恒温培養後、濃度依存の態様で ３Ｈ−パフ−アセタと結合したが、プラトー（ｐｌａｔｅａｕ）に達していない（図６と７）。３回の洗浄の前に、脱脂培養基中のＵ９３７細胞に３種類のＬＤＬ標本を添加すると（１０μｇ／ｍｌ，２４時間）、ＬＤＬ担体（図７）との不特定結合と比較して特定 ３Ｈ−ｐａｆ結合（図６）を示した。
【００７６】
３Ｈ−パフ−アセタの総結合は、ＬＤＬ処理Ｕ９３７細胞対コントロールＵ９３７細胞（１．２５×１０６ Ｕ９３７細胞当り ３３．３±５．７対３１．９±３．３ｆモル）で類似していた。ＷＥＢ２０８６（１μモル）の存在下で証明された不特定結合は、ＬＤＬ処理細胞の中では減少している。このようにして、ＬＤＬ処理細胞中に ３Ｈ−パフ−アセタの添加２．８ｎモルで、特定結合は１．８±０．８から４．６±２．１ｆモル（マン・ウイトニィ（Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ）テストでＰ＜０．０１，ｎ＝３）に重要な手段（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｍａｎｎｅｒ）で増加した。
【００７７】
（総結合）−（不特定結合）と定義した特定 ３Ｈ−パフ−アセタ結合は、 ３Ｈ−パフ−アセタを添加した１．４〜２．８ｎモルの間で、プラトー値に達した。
短期間の恒温培養（２時間、４時間）のＬＤＬ添加試料は、パフ−アセタ用特定結合部位を示さなかった。これはまたＷＥＢ２０８６を用いて証明された（下記表３を参照）。ＬＤＬ処理細胞とコントロール細胞のどちらも、添加 ３Ｈアセチルｐａｆ（５μモル，１時間）を４℃の結合条件下では異化（ｃａｔａｂｏｌｉｓｅ）しなかった（図示していない）。
【００７８】
コレステロールを用いた恒温培養後の特定 ３Ｈ−パフ−アセタ結合について脱脂培養基中のＵ９３７細胞にコレステロールを添加（６０μｇ／ｍｌ，２４時間）すると、ＬＤＬが示したのと同様に、特定 ３Ｈ−パフ−アセタ結合部位を示した（図８）。コントロール処理Ｕ９３７細胞への ３Ｈ−ｐａｆ（５．６ｎモル）の総結合は、ＬＤＬ処理細胞とコントロール細胞（３４．４±４．２ｆモル対３１．９±３．３及び３３．３±５．７ｆモル、Ｕ９３７細胞に結合）について得たのと同じような数値に達した。
【００７９】
ＷＥＢ２０８６（１μモル）で証明した不特定結合は、コレステロール処理細胞に比べてコントロール中では３４．４±４．２ｆモルから２５．２±５．０ｆモルに減少した。コントロール細胞への特定結合皆無と比較すると、 ３Ｈ−パフ−アセタ（５．６ｎモル）の特定結合は、ＬＤＬ処理のＵ９３７細胞（９．３±３．６ｆモル対１１．５±０．７ｆモル）へのそれと似ていた。 ３Ｈ−パフ−アセタ濃度が２．８ｎモル以上で、特定 ３Ｈ−パフ−アセタ結合は、コレステロール及びＬＤＬ処理細胞（６．２±２．９ｆモル対５．７±１．１ｆモル）と同様のプラトー値に達した。
【００８０】
コレステロールは、濃度依存態様（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ）で不特定結合を減らすことによって ３Ｈ−パフ−アセタ（０．７ｎモル）の特定結合を増やした（後記表４を参照）。コレステロールを脱脂培養基に２時間及び４時間添加した場合（表３）あるいは賦形剤添加後に脱脂培養基に添加した場合（表４）、やはり特定結合は全く検出されなかった。
【００８１】
無疵Ｕ９３７細胞のアセチルヒドロラーゼ活性について
無疵Ｕ９３７細胞は、変性プロティン存在下または細胞の不存在下で ３Ｈ−アセチルｐａｆ分解が皆無だったのと比較すると、２０℃で細胞数（図９中のＡ、Ｂ）に依存して添加 ３Ｈ−アセチルｐａｆ（５μモル）を分解した。脱脂培養基中（Ｂ：１０μｇ／ｍｌ，２４時間）のＵ９３７細胞への３種類のＬＤＬ標本の添加は、コントロール細胞（１２．０±１対１３．５±１％）と比べて、無疵Ｕ９３７細胞のパフ−アセタ分解を阻まなかった（図９中のＡ、Ｂ）。更にパフ−アセタ受容体拮抗剤ＷＥＢ２０８６は、無疵Ｕ９３７細胞の表面上での ３Ｈ−アセチル−ｐａｆ分解を抑制しなかった。
【００８２】
ＬＤＬ恒温培養後の細胞内アセチルヒドロラーゼ活性について
アセチルヒドロラーゼ活性もまた、ＬＤＬ処理後の洗浄Ｕ９３７細胞から得たリゼートで、コントロール細胞と比較して測定された。細胞リゼート（５μｌ）は、４４０μｌの等張性Ｈｅｐｅｓ／ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）が添加され、そして３７℃、５分間の予備恒温培養後 ３Ｈ−アセチル−ｐａｆを用いて反応が開始された。３７℃による１０分間の恒温培養後氷浴中で過剰ＢＳＡを用いて反応が止められてから、更に１０分間の恒温培養の後、ＴＣＡ（最終濃度 ９％、体積／体積、０℃）によりプロティンが変性させられた。遠心分離の後、上澄み中の放出 ３Ｈ−アセテートが測定された。データはプロティンｍｇ当りのｎモルで示された。
【００８３】
アセチルヒドロラーゼ活性は、最後の１０分間で、１１０μｇ／ｍｌ迄はプロティン濃度と一次関係にあった。賦形剤含有の脱脂培養基中で２４時間保持したコントロール細胞の酵素運動は、ＬＤＬ処理細胞とは異なっていた。
【００８４】
ラインウェーバ・ブルク・プロット（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂａｒｋ−Ｐｌｏｔｓ）から算出したＫｍとＶｍａｘ値は（後記の表５を参照）、脱脂培養基（１０μｇ／ｍｌ，２４時間）への３種類のＬＤＬ標本の添加後に増加した。細胞プロティンｍｇ当りのＶｍａｘの増加は、ＬＤＬ存在下の恒温培養中のＵ９３７細胞にアセチルヒドロラーゼが豊富になったことを意味する。ＬＤＬを用いた恒温培養後のＫｍ値は、血漿中であらわれたこれらのものに似ていた。
【００８５】
下記の表３は、３人の健康な男性有志から得たＬＤＬ標本（１０μｇ／ｍｌ）またはコレステロール（６０μｇ／ｍｌ）を脱脂培養基中のＵ９３７細胞に添加後２時間と４時間の、特定 ３Ｈ−パフ−アセタ結合の不足を賦形剤と比較して示すものである。細胞は３回洗浄され、ＷＥＢ２０８６（１μモル、１時間、４℃、０．２５％ＢＳＡ）の有、無で、 ３Ｈ−パフ−アセタ結合（１．６ｎモル）を形成させてから細胞が真空濾過で分離された。特定結合は（総結合）−（ＷＥＢ２０８６で証明した不特定結合）と定義する。数値は１．２５×１０６ Ｕ９３７細胞当りｆモルで表し、３種類の異なる実験の平均±１ｓ．ｄ．である。
【００８６】
下記の表４は、Ｕ９３７細胞（２４時間）への特定 ３Ｈ−パフ−アセタ結合のコレステロール投与依存度を示す。コレステロールは、賦形剤（０．５％エタノール、体積／体積）と比較して、脱脂培養基中のＵ９３７細胞に添加され、そして細胞は、２４時間恒温培養後に３回洗浄された。 ３Ｈ−パフ−アセタ結合（０．７ｎモル）は、ＷＥＢ２０８６（１μモル，１時間，４℃，０．２５％ＢＳＡ）有・無で形成させてから、細胞は、真空濾過で分離された。特定結合は、（総結合）−（ＷＥＢ２０８６で証明した不特定結合）と定義し、数値は、１．２５×１０６ Ｕ９３７細胞当りｆモルで表された。これらは、３回の異なる実験の平均±１ｓ．ｄ．である。
【００８８】
下記の表５は、３人の健康な男性有志（１０μｇ／ｍｌ）から得たＬＤＬ標本を脱脂培養基に添加後、２４時間溶解したＵ９３７細胞のアセチルヒドロラーゼ酵素運動を賦形剤と比べて示したものである。Ｕ９３７細胞は、３回洗浄後、超音波処理（３回、３０分間）により溶解され、３７℃、１０分間の恒温処理中に ３Ｈ−アセチルｐａｆからの放出 ３Ｈ−アセテートが確認された。反応は、過剰ＢＳＡとプロティン変性（ＴＣＡ，９％，体積／体積，０℃）により停止された。Ｋｍ及びＶｍａｘ値は、３種類の異なる実験で得たラインウェーバ・バーク・プロットから算出され、３種類の実験の平均±１ｓ．ｄ．で表されている。
【００９０】
【図面の簡単な説明】
【図１】人間のリポプロティンに、ＬＡーｐａｆが存在することを示すグラフである。
【図２】ＬＡーｐａｆに応答する兎の血小板凝集の投与応答曲線を示すグラフである。
【図３】ＬＡーｐａｆ及び合成ｐａｆによる兎の血小板の凝集抑制を示すグラフである。
【図４】洗浄した人間の血小板に結合している 3Ｈーｐａｆに及ぼすＬＤＬとＬＡーｐａｆの効果を示すグラフである。
【図５】洗浄した人間の血小板への、特定ｐａｆ結合の減感を示すグラフである。
【図６】ＬＤＬ添加後の 3Ｈーｐａｆ結合の投与応答曲線を示すグラフである。
【図７】Ｕ９３７細胞への 3Ｈーｐａｆ結合の投与応答曲線を示すグラフである。
【図８】コレステロール添加後の 3Ｈーｐａｆ結合の投与応答曲線を示すグラフである。
【図９】Ｕ９３７細胞数を増やしながら添加した 3Ｈーアセチルｐａｆから放出された 3Ｈーアセテートをパーセントで示したグラフである。
Claims (16)
- パフ拮抗剤の調整方法であって、以下のステップ、
ａ）リポプロティン、ＬＡ−ｐａｆ及び／又はコレステロールの存在下で、清浄細胞と、放射性、着色化若しくは蛍光化標識パフ又は標識若しくは無標識パフ類似体及び測定すべき拮抗剤とを混合するステップ、
ｂ）リポプロティン、ＬＡ−ｐａｆ及び／又はコレステロールの存在下で、ステップａ）で用いたものと同じタイプの清浄細胞と、放射性、着色化若しくは蛍光化標識パフとを、測定すべき拮抗剤の不存在下で混合するステップ、
ｃ）上記の混合物ａ）とｂ）各々から細胞を分離するステップ、
ｄ）上記細胞に結合した放射性、着色化若しくは蛍光化標識パフの量を測定するステップ、及び
ｅ）拮抗剤の有効性を、上記ａ）での拮抗剤存在下で細胞に結合した標識パフ量と、上記ｂ）での拮抗剤不存在下で細胞に結合した標識パフ量との関係から判定するステップ、
を含んでなる有効パフ拮抗剤の調製方法。 - 上記清浄細胞がアセチルサリチル酸の存在下で洗浄又はゲルろ過されることにより得られることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 上記清浄細胞が、脱脂した血清アルブミンを含有しカルシウムイオンを全く含まない等張緩衝液中に分散された血小板であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 上記清浄細胞が、上記ａ）及びｂ）のステップで使用される前に、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンの存在下で数回濃縮された血小板であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 上記清浄細胞が、上記ａ）及びｂ）のステップにおいて２０℃の温度で混合され、その後該細胞がｃ）のステップで分離される前に１０分以上恒温培養されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 上記清浄細胞が、血清含有培養基中で培養された単核マクロファージ様細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 上記培養基が子牛胎児血清を含有することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
- 上記培養基がＬ−グルタミンを含有することを特徴とする、請求項６又は７のいずれか１項に記載の方法。
- 上記単核マクロファージ様細胞が、培養後脱脂した血清又は脱脂した子牛胎児血清を含有する培養基中で数時間恒温培養され、該細胞が恒温培養開始の２４時間後にＬＤＬ又はコレステロールの添加によって刺激されることを特徴とする、請求項６から８のいずれか１項に記載の方法。
- 培養及び恒温培養が２０℃の温度で行われることを特徴とする、請求項６から９のいずれか１項に記載の方法。
- 上記単核マクロファージ様細胞が、Ｕ９３７細胞であることを特徴とする、請求項６から１０のいずれか１項に記載の方法。
- 上記のＬＡ−ｐａｆがインビトロで、リポプロティンとともに細胞を恒温培養し、ＬＡ−ｐａｆを分離し、ＬＡ−ｐａｆを精製することを含む方法によって調製されることを特徴とする、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
- 上記の調製されたＬＡ−ｐａｆが、標識ＬＡ−ｐａｆであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
- 請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法によって得られるパフ拮抗剤であって、ＷＥＢ ２０８６又はＷＥＢ ２０９８であり、リポプロテイン及びＬＡ−ｐａｆがサイトに結合するのを抑制する、ＬＡ−ｐａｆ及びリポプロテインに起因する高コレステロール血症又はＬＤＬ介在性血小板活性化の治療及び予防用パフ拮抗剤。
- 請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法によって得られるパフ拮抗剤であって、ＷＥＢ ２０８６又はＷＥＢ ２０９８であり、ＢＮ５２０２０、Ｂ Ｎ５２０２１、ＢＮ５２０２２からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物又はこれら化合物の混合物とともに、ＬＤＬ介在性血小板活性化の治療及び予防用物質の調製に用いられるパフ拮抗剤。
- ＷＥＢ ２０８６の化学構造が、３−（４−（２−クロロフェニル）−９−メチル−６Ｈ−チエノ（３，２−ｆ）（１，２，４）トリアゾロ−（４，３−ａ）−（１，４）ジアゼピン−２イル）−１−（４−モルフォリニル）−１−プロパノンであり；ＷＥＢ ２０９８の化学構造が、３−（４−（２−クロロフェニル）−９−シクロプロピル−６Ｈ−チエノ（３，２−ｆ）−（１，２，４）トリアゾロ−（４，３−ａ）−（１，４）ジアゼピン−２イル）−１−（４−モルフォリニル）−１−プロパノンであり；ＢＮ５２０２０の化学構造が、９Ｈ−１，７ａ−（エポキシメタノ）−１Ｈ，６ａＨ−シクロペンタ［ｃ］フロ［２，３−ｂ］フロ−［３’，２’：３，４］シクロペンタ［１，２−ｄ］フラン−５，９，１２（４Ｈ）−トリオン，３−ｔｅｒｔ−ブチルヘキサヒドロ−４，７ｂ−ジヒドロキシ−８−メチルであり；ＢＮ５２０２１の化学構造が、９Ｈ−１，７ａ−（エポキシメタノ）−１Ｈ，６ａＨ−シクロペンタ［ｃ］フロ［２，３−ｂ］フロ−［３’，２’：３，４］シクロペンタ［１，２−ｄ］フラン−５，９，１２（４Ｈ）−トリオン，３−ｔｅｒｔ−ブチルヘキサヒドロ−４，４ｂ−１１−トリヒドロキシ−８−メチルであり；ＢＮ５２０２２の化学構造が９Ｈ−１，７ａ−（エポキシメタノ）−１Ｈ，６ａＨ−シクロペンタ［ｃ］フロ［３’，２’：３，４］シクロペンタ［１，２−ｄ］フラン−５，９，１２（４Ｈ）−トリオン，３−ｔｅｒｔ−ブチルヘキサヒドロ−２，４，７ｂ，１１−テトラヒドロキシ−８−メチルであることを特徴とする、請求項１４又は１５に記載のパフ拮抗剤。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19904017818 DE4017818C2 (de) | 1990-06-06 | 1990-06-06 | Verfahren zur Überprüfung von Substanzen auf ihre Wirksamkeit als paf-Acether-Antagonisten |
| DE4034090A DE4034090B4 (de) | 1990-10-20 | 1990-10-20 | Verwendung von Ginkgoliden und Triazolothienodiazepinen zur Behandlung der Blutplättchenaggregation in Gegenwart von LDL und LA-paf |
| DE4034090.2 | 1990-10-26 | ||
| DE4017818.8 | 1990-10-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06227984A JPH06227984A (ja) | 1994-08-16 |
| JP3713581B2 true JP3713581B2 (ja) | 2005-11-09 |
Family
ID=25893790
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15627291A Expired - Lifetime JP3713581B2 (ja) | 1990-06-06 | 1991-05-31 | パフ拮抗剤及びその調製方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5356791A (ja) |
| EP (1) | EP0459432B1 (ja) |
| JP (1) | JP3713581B2 (ja) |
| AT (1) | ATE195653T1 (ja) |
| DE (1) | DE69132379T2 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5530023A (en) * | 1987-10-20 | 1996-06-25 | Korth; Ruth | Production of binding sites for PAF, PAF analogues and PAF antagonists in endothelial cells |
| US5895785A (en) * | 1987-10-20 | 1999-04-20 | Ruth Korth | Treatment and prevention of disorders mediated by LA-paf or endothelial cells |
| DE540767T1 (de) * | 1991-11-04 | 2001-10-25 | Korth Ruth Maria | Behandlung und Vorbeugung von von erhöhten Lyso-PAF-Spiegel mediierten mentalen Erkrankungen mit PAF-Antagonisten |
| DE540766T1 (de) | 1991-11-04 | 2002-11-28 | Ruth-Maria Korth | Behandlung von Eosinophil-mediierten Erkrankungen mit PAF-Antagonisten, und Verfahren zur Bestimmung deren Effektivität. |
| DE4208868A1 (de) * | 1992-03-04 | 1993-09-09 | Michaelis Peter Dr Med | Verwendung eines arzneimittels zur behandlung von metastatischen krebserkrankungen |
| EP0638648A3 (en) * | 1993-08-09 | 1996-05-08 | Sumitomo Electric Industries | Monoclonal antibodies reactive specifically with the PAF receptor, process for their preparation and hybridomas producing said antibodies. |
| CN1144482A (zh) * | 1994-03-24 | 1997-03-05 | 默里尔药物公司 | 降低胆固醇、抗动脉粥样硬化和降低甘油三酯的巯基乙酰胺二硫化物衍生物 |
| EP0875247B1 (en) * | 1997-04-18 | 2003-05-28 | Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno | Method for controlling the plasma level of lipoproteins |
| US6444664B1 (en) | 1997-04-18 | 2002-09-03 | Nederlandse Organisatie Voor Toegepast - Natuurweten Schappelijk Onderzoek (Tno) | Method for controlling the plasma level of lipoproteins to treat alzheimeris disease |
| US11039997B2 (en) | 2005-12-27 | 2021-06-22 | Ruth-Maria Korth | Cosmetic, dermatic, protective compositions comprising phospholipids, lecithins with peptides and at least one acetylating compound |
| DE102005062417A1 (de) | 2005-12-27 | 2007-08-23 | Korth, Ruth-Maria, Dr.med. | Kompositionen mit spezifischen und unspezifischen Lipidantagonisten |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8418424D0 (en) * | 1984-07-19 | 1984-08-22 | Scras | Inhibition of platelets aggregation |
| US4761404A (en) * | 1985-07-01 | 1988-08-02 | Merck & Co., Inc. | Phospholipid analogs useful as PAF synthesis inhibitors |
| DE3710921C2 (de) * | 1986-10-21 | 1996-09-26 | Korth Ruth | Verwendung der Gingkolide BN 52020, BN 52021 und BN 52063 zur Behandlung von Arteriosklerose |
| DE3735524C2 (de) * | 1986-10-21 | 1996-07-11 | Korth Ruth Maria | Verfahren zur Bestimmung des paf-Acether- oder Peak X-Gehaltes von Blut |
| DE3735525C2 (de) * | 1987-10-20 | 1997-02-20 | Korth Ruth Maria | Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit von paf-Acether-Rezeptor-Antagonisten |
| GB8725871D0 (en) * | 1987-11-04 | 1987-12-09 | Scras | Ginkgolide derivatives |
| US4914096A (en) * | 1988-04-21 | 1990-04-03 | Sandoz Pharmaceuticals Corp. | 6-aryl-substituted-4H-thieno(2,3-e)(1,2,4)triazolo(3,4-c)(1,4)diazepines |
-
1991
- 1991-05-29 EP EP91108763A patent/EP0459432B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-29 AT AT91108763T patent/ATE195653T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-05-29 DE DE69132379T patent/DE69132379T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-05-31 JP JP15627291A patent/JP3713581B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-03-03 US US07/845,088 patent/US5356791A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0459432B1 (en) | 2000-08-23 |
| US5356791A (en) | 1994-10-18 |
| JPH06227984A (ja) | 1994-08-16 |
| ATE195653T1 (de) | 2000-09-15 |
| DE69132379D1 (de) | 2000-09-28 |
| DE69132379T2 (de) | 2001-03-01 |
| EP0459432A1 (en) | 1991-12-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Espinola et al. | Hydroxychloroquine reverses platelet activation induced by human IgG antiphospholipid antibodies | |
| Griveau et al. | Superoxide anion production by human spermatozoa as a part of the ionophore‐induced acrosome reaction process | |
| Takuwa et al. | Endothelin-1 activates phospholipase C and mobilizes Ca2+ from extra-and intracellular pools in osteoblastic cells | |
| Graber et al. | Evidence that changes in platelet cyclic AMP levels regulate the fibrinogen receptor on human platelets. | |
| Sogos et al. | Acetylcholine‐induced production of platelet‐activating factor by human fetal brain cells in culture | |
| JP3713581B2 (ja) | パフ拮抗剤及びその調製方法 | |
| Ansfield et al. | Identification of the immunosuppressive components of canine pulmonary surface active material. | |
| Lin et al. | The protective effect of hesperetin in osteoarthritis: an in vitro and in vivo study | |
| Kong et al. | Melatonin induces Akt phosphorylation through melatonin receptor-and PI3K-dependent pathways in primary astrocytes | |
| JPH11507356A (ja) | 経口薬理化合物の生物有用性を高めるためのエッセンシャルオイルの利用 | |
| US5605927A (en) | Treatment of skin diseases using ginkgolide PAF antagonists | |
| Dellas et al. | Leptin signalling and leptin-mediated activation of human platelets: importance of JAK2 and the phospholipases Cγ2 and A2 | |
| Lajeunesse et al. | Parathyroid hormone and hydrochlorothiazide increase calcium transport by the luminal membrane of rabbit distal nephron segments through different pathways | |
| JP2539257B2 (ja) | Ｐａｆ―アセッサ―拮抗剤による疾患の治療 | |
| Bailey et al. | Anti-inflammatory drugs in experimental atherosclerosis: Part 4. Inhibition of atherosclerosis in vivo and thromboxane synthesis and platelet aggregation in vitro | |
| Ranganathan et al. | Effect of calcium-channel-blocking drugs on lysosomal function in human skin fibroblasts | |
| Joshi et al. | High concentrations of tricyclic antidepressants increase intracellular Ca 2+ in cultured neural cells | |
| Benhamou et al. | Decrease in IgE Fc receptor expression on mouse bone marrow-derived mast cells and inhibition of paf-acether formation and of beta-hexosaminidase release by dexamethasone. | |
| Holl et al. | Cytosolic free calcium in normal somatotropes: effects of forskolin and phorbol ester | |
| Moraczewski et al. | Distribution and rate of metabolism of phosphorus compounds in Trypanosoma equiperdum | |
| US5696114A (en) | Treatment and prevention of odema | |
| Orekhov et al. | “Regression” of atherosclerosis in cell culture: effects of stable prostacyclin analogues | |
| US5480881A (en) | Treatment of disease with paf-acether antagonists and procedure determining their efficacy | |
| FUTAMURA | Effect of amiodarone on cytokine release and on enzyme activities of mouse alveolar macrophages, bone marrow macrophages, and blood monocytes | |
| US20020127287A1 (en) | Treatment of lyso paf-mediated disorders with lyso paf or paf antagonists and procedure for determining their efficacy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040205 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040604 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20040908 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050712 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050809 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090902 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090902 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100902 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100902 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110902 Year of fee payment: 6 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110902 Year of fee payment: 6 |