JP2539257B2 - Ｐａｆ―アセッサ―拮抗剤による疾患の治療 - Google Patents
Ｐａｆ―アセッサ―拮抗剤による疾患の治療Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、PAF−アセッサー（PAF−Acether）拮抗剤
による疾患の治療に関する。
による疾患の治療に関する。
その化学的構造によれば、PAF−アセッサー（血小板
活性化因子Platelet ａ ctivating factor）は、１
−０−アルキル−２−アセチル−sn−グリセリル−３−
燐酸コリンエステルである。（J.Exp.Med.,136:1356−1
377（1972）及びJ.Bicl.Chem.,254:9355−9358（1979）
参照）。PAF−アセッサーが強力な炎症性及び血圧下降
特性を有し、また冠状血管収縮及び皮膚の急激な水腫形
成を引き起こすことは知られている。血小板のPAF−ア
セッサー受容体、多形核好中球及びヒトの肺組織からの
膜製剤については報告されている。（J.Immunol.,129:
（1984）1637−1641、Thromb.Res.,41:（1986）699−70
6;Immunology48:141（1983）及びBiochem.Biophys.Res.
Commun.128:972（1985）参照）。
活性化因子Platelet ａ ctivating factor）は、１
−０−アルキル−２−アセチル−sn−グリセリル−３−
燐酸コリンエステルである。（J.Exp.Med.,136:1356−1
377（1972）及びJ.Bicl.Chem.,254:9355−9358（1979）
参照）。PAF−アセッサーが強力な炎症性及び血圧下降
特性を有し、また冠状血管収縮及び皮膚の急激な水腫形
成を引き起こすことは知られている。血小板のPAF−ア
セッサー受容体、多形核好中球及びヒトの肺組織からの
膜製剤については報告されている。（J.Immunol.,129:
（1984）1637−1641、Thromb.Res.,41:（1986）699−70
6;Immunology48:141（1983）及びBiochem.Biophys.Res.
Commun.128:972（1985）参照）。
〔発明が解決しようとする課題〕 脈管内皮は組織を保護する細胞内皮を形成する。脈管
内皮細胞の障壁（バリヤー）が破れると、各種の疾患が
生ずる。例えば、流体（分泌液）が組織から逃散するこ
とが可能であり、これにより水腫の形成が正起し得るこ
とになる。細菌性及び脳疾患、炎症及びアレルギーもま
た、脈管内皮細胞バリヤーが低くなることによって生じ
得る。もし、脈管内皮細胞バリヤーが低減すると、冠状
導管への罹患により痙攣性の冠状収縮をも生じ得る。脈
管内皮は罹患した組織部分の拡大に抗して保護するの
で、転移形成に抵抗する。脈管内皮の損傷も、同様に物
質の流入を増大するようになり、動脈硬化症につながり
得る反応を生ずる。
内皮細胞の障壁（バリヤー）が破れると、各種の疾患が
生ずる。例えば、流体（分泌液）が組織から逃散するこ
とが可能であり、これにより水腫の形成が正起し得るこ
とになる。細菌性及び脳疾患、炎症及びアレルギーもま
た、脈管内皮細胞バリヤーが低くなることによって生じ
得る。もし、脈管内皮細胞バリヤーが低減すると、冠状
導管への罹患により痙攣性の冠状収縮をも生じ得る。脈
管内皮は罹患した組織部分の拡大に抗して保護するの
で、転移形成に抵抗する。脈管内皮の損傷も、同様に物
質の流入を増大するようになり、動脈硬化症につながり
得る反応を生ずる。
極めて驚くべきことに、細胞のPAF−アセッサー結合
部位を抑制する物質（PAF−アセッサー拮抗剤）が、脈
管内皮細胞バリヤーの破損により生ずる疾患を治療する
のに適していることが見い出された。
部位を抑制する物質（PAF−アセッサー拮抗剤）が、脈
管内皮細胞バリヤーの破損により生ずる疾患を治療する
のに適していることが見い出された。
これらの物質は、痙攣性冠状収縮、動脈硬化症、動脈
及び静脈血栓症、及びアナフィラキシ−ショック及び内
毒素ショックなど、特に胃腸経路、脳及び心臓に関する
血管収縮、細菌性疾患、水腫、アレルギー（喘息を含
む）、炎症を治療及び予防するために特に適している。
これらは、さらに、転移の形成傾向を低減するのに適し
ている。さらに、食物成分は脈管内皮細胞のPAF−アセ
ッサー受容体に影響すると思われる。さらにまた、妊娠
初期において受精した卵子の卵着床を抑制（抗卵着床）
する物質は脈管内皮細胞のPAF−アセッサー受容体に効
果を有することができる。
及び静脈血栓症、及びアナフィラキシ−ショック及び内
毒素ショックなど、特に胃腸経路、脳及び心臓に関する
血管収縮、細菌性疾患、水腫、アレルギー（喘息を含
む）、炎症を治療及び予防するために特に適している。
これらは、さらに、転移の形成傾向を低減するのに適し
ている。さらに、食物成分は脈管内皮細胞のPAF−アセ
ッサー受容体に影響すると思われる。さらにまた、妊娠
初期において受精した卵子の卵着床を抑制（抗卵着床）
する物質は脈管内皮細胞のPAF−アセッサー受容体に効
果を有することができる。
これに関してPAF−アセッサー結合部位を抑制する物
質は、親水性トリアゾロチェノ−ジアゼピン（triazolo
thieno−diazepine）もしくはその同族物質であり得
る。さらに、CV3988などのギングコリッド類（gingkoli
des）及びPAF−アセッサー同族体が適していると証明さ
れた。トリアゾロチェノ−ジアゼピン類は、Br.J.Pharm
ac.（1987）90:139−146頁に、ギングコリッド類は「血
液と導管（Blood and Vessel）」（1985）、No.16:55
8−572頁に記載されている。親水性トリアゾロチェノ−
ジアゼピン化合物のうち、WEB2086及び2098は特に適し
ている。ギングコリッド類のうち、BN52020、BN52021、
及びBN52020とBN52021とBN52022の混合物（以下、BN520
63という）ひ最良の結果を達成する。ギングコリッド類
の合成誘導体もまた使用できる。
質は、親水性トリアゾロチェノ−ジアゼピン（triazolo
thieno−diazepine）もしくはその同族物質であり得
る。さらに、CV3988などのギングコリッド類（gingkoli
des）及びPAF−アセッサー同族体が適していると証明さ
れた。トリアゾロチェノ−ジアゼピン類は、Br.J.Pharm
ac.（1987）90:139−146頁に、ギングコリッド類は「血
液と導管（Blood and Vessel）」（1985）、No.16:55
8−572頁に記載されている。親水性トリアゾロチェノ−
ジアゼピン化合物のうち、WEB2086及び2098は特に適し
ている。ギングコリッド類のうち、BN52020、BN52021、
及びBN52020とBN52021とBN52022の混合物（以下、BN520
63という）ひ最良の結果を達成する。ギングコリッド類
の合成誘導体もまた使用できる。
その大きな有効性（効果）とは別に、ギングコリッド
混合物BN52063は、ギングコリッド類の処理過程におい
て混合物として生じるので、個々の成分に分割する必要
がなく、比較的容易に製造できるので好ましい。
混合物BN52063は、ギングコリッド類の処理過程におい
て混合物として生じるので、個々の成分に分割する必要
がなく、比較的容易に製造できるので好ましい。
本発明によれば、PAF−アセッサーによる及びPAFアセ
ッサーにより刺激された細胞により脈管内皮細胞バリヤ
ーの侵入（穿孔）を防止するために、特にWEB2086及びW
EB2098、CV3988及びBN52020、BN52021及びBN52063が用
いられる。
ッサーにより刺激された細胞により脈管内皮細胞バリヤ
ーの侵入（穿孔）を防止するために、特にWEB2086及びW
EB2098、CV3988及びBN52020、BN52021及びBN52063が用
いられる。
CV3988の化学式はrac−３−（Ｎ−ｎ−オクタデシル
カルバモイル−オキシ）−２−メトキシプロピル２−チ
アゾリオエチルフォスフェートであり;WEB286の式は３
−（４−（２−クロロフェニル）−９−メチル−6H−チ
エノ（3,2,−ｆ）（1,2,4）トリアゾロ−（4,3−ａ）−
（1,4）ジアゼピン−２イル）−１−（４−モルホリニ
ル）−１−プロパノン;WEB2098については３−（４−
（２−クロロフェニル）−９−シクロプロピル−6H−チ
エノ（3,2−ｆ）−（1,2,4）トリアゾロ−（4,3,a）
（1,4）ジアゼピン−２イル−１−（４−モルホリニ
ル）−１−プロパノン;BN52020については9H−1,7a−
（エポキシメタノ）−1H、6aH−シクロペンタ［ｃ］フ
ロ［2,3−ｂ］フロ−［３′,2′:3,4］シクロペンタ
［1,2−ｄ］フラン−5,9,12−（4H）−トリオン３−ter
t−ブチルヘキサヒドロ−4,4b−11−トリヒドロキシ−
８−メチル;BN52021については9H−1,7a−（エポキシメ
タノ）−1H,6aH−シクロペンタ［ｃ］フロ［2,3−ｂ］
フロー［３′,2′:3,4］シクロペンタ［1,2−ｄ］フラ
ン−5,9,12−（4H）−トリオン３−tert−ブチルヘキサ
ヒドロ−4,7b−ジヒドロキシ−８−メチル；またBN5202
2についての式は9H−1,7a−（エポキシメタノ）−1H,6a
H−シロクペンタ［ｃ］フロ［３′,2′:3,4］シクロペ
ンタ［1,2−ｄ］フラン−5,9,12（4H）−トリオン３−t
ert−ブチル−ヘキサヒドロ−2,4,7b,11−テトラヒドロ
キシ−８−メチルで表わされる。
カルバモイル−オキシ）−２−メトキシプロピル２−チ
アゾリオエチルフォスフェートであり;WEB286の式は３
−（４−（２−クロロフェニル）−９−メチル−6H−チ
エノ（3,2,−ｆ）（1,2,4）トリアゾロ−（4,3−ａ）−
（1,4）ジアゼピン−２イル）−１−（４−モルホリニ
ル）−１−プロパノン;WEB2098については３−（４−
（２−クロロフェニル）−９−シクロプロピル−6H−チ
エノ（3,2−ｆ）−（1,2,4）トリアゾロ−（4,3,a）
（1,4）ジアゼピン−２イル−１−（４−モルホリニ
ル）−１−プロパノン;BN52020については9H−1,7a−
（エポキシメタノ）−1H、6aH−シクロペンタ［ｃ］フ
ロ［2,3−ｂ］フロ−［３′,2′:3,4］シクロペンタ
［1,2−ｄ］フラン−5,9,12−（4H）−トリオン３−ter
t−ブチルヘキサヒドロ−4,4b−11−トリヒドロキシ−
８−メチル;BN52021については9H−1,7a−（エポキシメ
タノ）−1H,6aH−シクロペンタ［ｃ］フロ［2,3−ｂ］
フロー［３′,2′:3,4］シクロペンタ［1,2−ｄ］フラ
ン−5,9,12−（4H）−トリオン３−tert−ブチルヘキサ
ヒドロ−4,7b−ジヒドロキシ−８−メチル；またBN5202
2についての式は9H−1,7a−（エポキシメタノ）−1H,6a
H−シロクペンタ［ｃ］フロ［３′,2′:3,4］シクロペ
ンタ［1,2−ｄ］フラン−5,9,12（4H）−トリオン３−t
ert−ブチル−ヘキサヒドロ−2,4,7b,11−テトラヒドロ
キシ−８−メチルで表わされる。
今や見い出されたように、脈管内皮細胞はPAF−アセ
ッサーのための結合部位あるいは受容体を示す。これら
の受容体との相互作用により、脈管内皮細胞を攻撃しあ
るいは破壊するPAF−アセッサー自体を含むヒスタミ
ン、プロスタグランジン類などの媒介物が形成される。
ッサーのための結合部位あるいは受容体を示す。これら
の受容体との相互作用により、脈管内皮細胞を攻撃しあ
るいは破壊するPAF−アセッサー自体を含むヒスタミ
ン、プロスタグランジン類などの媒介物が形成される。
脈管内皮細胞の受容体と結合したPAF−アセッサー
が、媒介物を形成する好中球、好酸球などの細胞の粘着
を生じることもまた可能である。
が、媒介物を形成する好中球、好酸球などの細胞の粘着
を生じることもまた可能である。
それらの部分についての血小板、好中球及び好酸球
は、PAF−アセッサーのための受容体を有する。おそら
く、脈管内皮細胞バリヤーの侵入に導き得るさらにメカ
ニズムがあり、これは、これらの細胞の受容体へのPAF
−アセッサーの結合が脈管内皮細胞へのそれらの粘着あ
るいは既に述べたような媒介物の生成を生ずることがで
き、これが次いで脈管内皮細胞を攻撃するということか
ら成る。
は、PAF−アセッサーのための受容体を有する。おそら
く、脈管内皮細胞バリヤーの侵入に導き得るさらにメカ
ニズムがあり、これは、これらの細胞の受容体へのPAF
−アセッサーの結合が脈管内皮細胞へのそれらの粘着あ
るいは既に述べたような媒介物の生成を生ずることがで
き、これが次いで脈管内皮細胞を攻撃するということか
ら成る。
これを防ぐ（中和する）ために、本発明によれば、一
方では脈管内皮細胞へのPAF−アセッサーの結合を直接
抑制する物質及び他方では血小板、好中球及び好酸球な
どの他の細胞へのPAF−アセッサーの結合をブロックす
る物質が用いられ、これによりこれらの媒介物が脈管内
皮細胞を間接的に攻撃することを防止する。
方では脈管内皮細胞へのPAF−アセッサーの結合を直接
抑制する物質及び他方では血小板、好中球及び好酸球な
どの他の細胞へのPAF−アセッサーの結合をブロックす
る物質が用いられ、これによりこれらの媒介物が脈管内
皮細胞を間接的に攻撃することを防止する。
換言すれば、本発明によれば、PAF−アセッサーが他
の細胞へ結合した場合の媒介物の形成のために、また同
様にこれらの媒介物により脈管内皮細胞の毀損のため
に、脈管内皮細胞へのPAF−アセッサーの結合部位を抑
制する物質が用いられる。しかしながら、これらの細胞
へのPAF−アセッサーへの結合部位を抑制する化合物を
用いることもできる。
の細胞へ結合した場合の媒介物の形成のために、また同
様にこれらの媒介物により脈管内皮細胞の毀損のため
に、脈管内皮細胞へのPAF−アセッサーの結合部位を抑
制する物質が用いられる。しかしながら、これらの細胞
へのPAF−アセッサーへの結合部位を抑制する化合物を
用いることもできる。
PAF−アセッサーの結合部位を抑制する物質は、例え
ば注射により投与できるが、また経口的にも、経皮的に
も、また吸入によっても投与できる。
ば注射により投与できるが、また経口的にも、経皮的に
も、また吸入によっても投与できる。
PAF−アセッサー受容体に対するそれらの拮抗作用に
関する物質の効果を迅速かつ簡単に試験するために、す
なわち例えばスクリーニング方法を用いてPAF−アセッ
サー受容体への有効な拮抗剤を見い出す（これは次いで
前記疾患の処置について考慮される）ために、本発明に
よれば、最良の方法は以下のように進められる： ａ）脈管内皮細胞を培養し、 ｂ）脈管内皮細胞を洗滌し、 ｃ）所定量の脈管内皮細胞を、標識を付したPAF−アセ
ッサー及び測定されるべき拮抗剤の所定量と混合し、 ｄ）所定量の脈管内皮細胞を標識を付したPAF−アセッ
サーの所定量と混合し、 ｅ）脈管内皮細胞をｃ）及びｄ）の各場合の混合物から
分離し、 ｆ）それぞれの場合について、脈管内皮細胞に結合され
た標識付きPAF−アセッサーの量を測定し、 そして、 ｇ）同数の脈管内皮細胞について、拮抗剤の存在下に上
記ｃ）に従って脈管内皮細胞に結合された標識付きPAF
−アセッサーの量と、拮抗剤の不存在下に上記ｄ）に従
って脈管内皮細胞に結合された標識付きPAF−アセッサ
ーの量との関係から、PAF−アセッサー拮抗剤の有効性
を決定する。
関する物質の効果を迅速かつ簡単に試験するために、す
なわち例えばスクリーニング方法を用いてPAF−アセッ
サー受容体への有効な拮抗剤を見い出す（これは次いで
前記疾患の処置について考慮される）ために、本発明に
よれば、最良の方法は以下のように進められる： ａ）脈管内皮細胞を培養し、 ｂ）脈管内皮細胞を洗滌し、 ｃ）所定量の脈管内皮細胞を、標識を付したPAF−アセ
ッサー及び測定されるべき拮抗剤の所定量と混合し、 ｄ）所定量の脈管内皮細胞を標識を付したPAF−アセッ
サーの所定量と混合し、 ｅ）脈管内皮細胞をｃ）及びｄ）の各場合の混合物から
分離し、 ｆ）それぞれの場合について、脈管内皮細胞に結合され
た標識付きPAF−アセッサーの量を測定し、 そして、 ｇ）同数の脈管内皮細胞について、拮抗剤の存在下に上
記ｃ）に従って脈管内皮細胞に結合された標識付きPAF
−アセッサーの量と、拮抗剤の不存在下に上記ｄ）に従
って脈管内皮細胞に結合された標識付きPAF−アセッサ
ーの量との関係から、PAF−アセッサー拮抗剤の有効性
を決定する。
本発明による上記工程ａ）における脈管内皮細胞の培
養は、好ましくは、血清特に子牛血清を含有する倍地で
行なわれる。しかしながら、血清を含有しない倍地を用
いることもできる。
養は、好ましくは、血清特に子牛血清を含有する倍地で
行なわれる。しかしながら、血清を含有しない倍地を用
いることもできる。
この関係において、好適な方法は、一般に培養器の床
で生長する倍地において合流（confluent）脈管内皮細
胞を培養することである。
で生長する倍地において合流（confluent）脈管内皮細
胞を培養することである。
血清を除去するために、またそれと共にアセチルヒド
ロラーゼなどPAF−アセッサーを破壊する酸素を除去す
るため、脈管内皮細胞は次いで本発明による方法の前記
工程ｂ）に従って洗滌される。この目的のために、緩衝
物質で処理された等張洗滌液が用いられ、これは内毒素
フリーの血清アルブミンを含む、ヒト血清アルブミン
（HSA）又はウシ血清アルブミン（BSA）などの脱脂血清
アルブミンを含有することが好ましい。
ロラーゼなどPAF−アセッサーを破壊する酸素を除去す
るため、脈管内皮細胞は次いで本発明による方法の前記
工程ｂ）に従って洗滌される。この目的のために、緩衝
物質で処理された等張洗滌液が用いられ、これは内毒素
フリーの血清アルブミンを含む、ヒト血清アルブミン
（HSA）又はウシ血清アルブミン（BSA）などの脱脂血清
アルブミンを含有することが好ましい。
次いで、本発明による前記工程ｃ）及びｄ）に従っ
て、一方の標識付きPAF−アセッサー及び測定されるべ
き拮抗剤を含む脈管内皮細胞と、他方の拮抗剤を含まな
い標識付きPAF−アセッサーについて結合検査を行なわ
れる。標識付きPAF−アセッサーとしての使用について
は、トリチウム標識付きPAF−アセッサーなどの放射性
標識のPAF−アセッサーを選択することが好ましい。
て、一方の標識付きPAF−アセッサー及び測定されるべ
き拮抗剤を含む脈管内皮細胞と、他方の拮抗剤を含まな
い標識付きPAF−アセッサーについて結合検査を行なわ
れる。標識付きPAF−アセッサーとしての使用について
は、トリチウム標識付きPAF−アセッサーなどの放射性
標識のPAF−アセッサーを選択することが好ましい。
上記結合検査は、ホスホリパーゼもしくはアセチルヒ
ドロラーゼなどの脈管内皮細胞に含まれる酵素によりPA
F−アセッサーの破壊が生じないように、20℃未満の室
温、好ましくは２〜６℃で行なうことが望ましい。好適
なインキュベーション期間は10〜30時間である。
ドロラーゼなどの脈管内皮細胞に含まれる酵素によりPA
F−アセッサーの破壊が生じないように、20℃未満の室
温、好ましくは２〜６℃で行なうことが望ましい。好適
なインキュベーション期間は10〜30時間である。
リン脂質としてPAF−アセッサーは水に溶解しないの
で、前記工程ｃ）及びｄ）による結合検査はエンドキシ
ンフリーの血清アルブミンを含むHSAやBSAなどの脱脂血
清アルブミンの存在下で行なうことがさらに好ましく、
またそのプロセスにおいて、好適な方法はカルシウム及
びマグネシウムイオンを加えることである。
で、前記工程ｃ）及びｄ）による結合検査はエンドキシ
ンフリーの血清アルブミンを含むHSAやBSAなどの脱脂血
清アルブミンの存在下で行なうことがさらに好ましく、
またそのプロセスにおいて、好適な方法はカルシウム及
びマグネシウムイオンを加えることである。
これに関する血清アルブミンの役割は、受容体にでは
なく脈管内皮細胞に非特異的に結合された拮抗剤とPAF
−アセッサーを結合すること、あるいは換言すればそれ
を脈管内皮細胞から除去することにある。
なく脈管内皮細胞に非特異的に結合された拮抗剤とPAF
−アセッサーを結合すること、あるいは換言すればそれ
を脈管内皮細胞から除去することにある。
前記工程ｅ）とｆ）との間に、合流脈管内皮細胞はそ
れらの基台（培養皿）から、またお互いから剥離（分
離）される。
れらの基台（培養皿）から、またお互いから剥離（分
離）される。
この目的のために、受容体に特異的に結合されたPAF
−アセッサー又は拮抗剤の最大限可能な量を本質的に抑
制する脈管内皮細胞を得るために、幾つかの付加的工程
を行なうことが好ましい。このため、脈管内皮細胞はま
ず、好ましくは、等張液すなわち特に生理食塩水と混合
され、それによって、そのプロセスにおいて、カルシウ
ム及びマグネシウムイオン、及び非特異的に結合された
PAF−アセッサーと拮抗剤が脈管内皮細胞から分離され
る。
−アセッサー又は拮抗剤の最大限可能な量を本質的に抑
制する脈管内皮細胞を得るために、幾つかの付加的工程
を行なうことが好ましい。このため、脈管内皮細胞はま
ず、好ましくは、等張液すなわち特に生理食塩水と混合
され、それによって、そのプロセスにおいて、カルシウ
ム及びマグネシウムイオン、及び非特異的に結合された
PAF−アセッサーと拮抗剤が脈管内皮細胞から分離され
る。
好適な方法では、次いで第２の洗滌工程が行なわれ、
この工程において５℃以下好ましくは約０℃に冷却され
た等張液が脈管内皮細胞に加えられる。この液体として
はEDTAを含有するものが好ましい。その低温と、カルシ
ウムイオンを脈管内皮に結合するEDTAのために、合流脈
管内皮細胞が収縮し、それによって、そのプロセスにお
いて、それらは培養器あるいは他の基台及び同様にお互
いから剥離され、すなわち脈管内皮細胞の合流層が破壊
される。同時に、洗滌液が低温であることにより、非特
異的に結合されたPAF−アセッサーと拮抗剤が脈管内皮
細胞からさらに容易に剥離されることになる。
この工程において５℃以下好ましくは約０℃に冷却され
た等張液が脈管内皮細胞に加えられる。この液体として
はEDTAを含有するものが好ましい。その低温と、カルシ
ウムイオンを脈管内皮に結合するEDTAのために、合流脈
管内皮細胞が収縮し、それによって、そのプロセスにお
いて、それらは培養器あるいは他の基台及び同様にお互
いから剥離され、すなわち脈管内皮細胞の合流層が破壊
される。同時に、洗滌液が低温であることにより、非特
異的に結合されたPAF−アセッサーと拮抗剤が脈管内皮
細胞からさらに容易に剥離されることになる。
このように処理された脈管内皮細胞を液体倍地から分
離するためには、それらを濾過することが好ましい。こ
れらは、上記剥離方法で脈管内皮細胞は損傷されないの
で、非常に容易に濾過され、単独で破壊されるようにな
る。同時に、濾過は、脈管内皮細胞から非特異的に結合
された残りの標識付きPAF−アセッサーを分離するため
の比較的正確で、従って非常に有効な方法となる。
離するためには、それらを濾過することが好ましい。こ
れらは、上記剥離方法で脈管内皮細胞は損傷されないの
で、非常に容易に濾過され、単独で破壊されるようにな
る。同時に、濾過は、脈管内皮細胞から非特異的に結合
された残りの標識付きPAF−アセッサーを分離するため
の比較的正確で、従って非常に有効な方法となる。
この後、脈管内皮細胞に（特異的に）結合された標識
付きPAF−アセッサーの量が決定される。放射能標識のP
AF−アセッサーが用いられている場合には、フィルター
に結合された脈管内皮細胞の放射能だけが測定される。
脈管内皮細胞がそこにないフィルターに結合された放射
能は、これらの値から差し引かれる。
付きPAF−アセッサーの量が決定される。放射能標識のP
AF−アセッサーが用いられている場合には、フィルター
に結合された脈管内皮細胞の放射能だけが測定される。
脈管内皮細胞がそこにないフィルターに結合された放射
能は、これらの値から差し引かれる。
前記工程（ｃ）に従って拮抗剤の量を種々変えること
により得られる検量図を描くことにより、拮抗剤の有効
性を50％抑制値として、すなわち所定量の脈管内皮細胞
に関して可逆PAF−アセッサー結合の50％抑制を達成す
る拮抗剤の量として得ることが可能である。
により得られる検量図を描くことにより、拮抗剤の有効
性を50％抑制値として、すなわち所定量の脈管内皮細胞
に関して可逆PAF−アセッサー結合の50％抑制を達成す
る拮抗剤の量として得ることが可能である。
本発明による方法は次のようなPAF−アセッサー受容
体拮抗剤、すなわち親水性トリアゾロチエノ−ジアゼピ
ン、WEB2086及び2098、ギングコリッド類BN52020、BN52
021及びBN52020とBN52021とBN52022との混合物を用い
て、またCV3988を用いて連続的に試験された。
体拮抗剤、すなわち親水性トリアゾロチエノ−ジアゼピ
ン、WEB2086及び2098、ギングコリッド類BN52020、BN52
021及びBN52020とBN52021とBN52022との混合物を用い
て、またCV3988を用いて連続的に試験された。
これらの受容体に抗して向けられるモノクローナル抗
体も本発明に係るPAF−アセッサー受容体拮抗剤として
考慮することができる。抗体もまた標識を付せられた形
態あるいは蛍光形態で用いることができる。この場合、
工程ｃ）およびｄ）による結合検査の前に、脈管内皮細
胞のプレーインキュベーションが過剰抗体を用いて行な
われる。工程ｃ）及びｄ）による結合検査は、同様に放
射能標識付き又は蛍光PAF−アセッサー拮抗剤もしくは
その同族体を用いて行なうことができ、これらは次いで
標識の付されていないPAF−アセッサーによる結合から
置換される。同様にして、本発明による方法において
は、PAF−アセッサーをPAF−アセッサー同族体により置
か換えることも、またPAF−アセッサー拮抗剤をこのよ
うな拮抗剤の同族体により置き換えることも可能であ
り、換言すれば、請求項４に記載の方法の工程ｃ）、
ｄ）、ｆ）及びｇ）において、標識付き又は未標識のPA
F−アセッサー同族体、PAF−アセッサー拮抗剤又はこれ
らの拮抗剤の同族体により置き換えることができる。
体も本発明に係るPAF−アセッサー受容体拮抗剤として
考慮することができる。抗体もまた標識を付せられた形
態あるいは蛍光形態で用いることができる。この場合、
工程ｃ）およびｄ）による結合検査の前に、脈管内皮細
胞のプレーインキュベーションが過剰抗体を用いて行な
われる。工程ｃ）及びｄ）による結合検査は、同様に放
射能標識付き又は蛍光PAF−アセッサー拮抗剤もしくは
その同族体を用いて行なうことができ、これらは次いで
標識の付されていないPAF−アセッサーによる結合から
置換される。同様にして、本発明による方法において
は、PAF−アセッサーをPAF−アセッサー同族体により置
か換えることも、またPAF−アセッサー拮抗剤をこのよ
うな拮抗剤の同族体により置き換えることも可能であ
り、換言すれば、請求項４に記載の方法の工程ｃ）、
ｄ）、ｆ）及びｇ）において、標識付き又は未標識のPA
F−アセッサー同族体、PAF−アセッサー拮抗剤又はこれ
らの拮抗剤の同族体により置き換えることができる。
本発明による方法は、このようなPAF−アセッサー用
受容体の拮抗剤を決定するためだけでなく、PAF−アセ
ッサー複合体、特にFed.Proc.46,1987（３）第1468頁に
記載されており、“PEAK X"と称されているPAF−アセ
ッサーリポタンパク質複合体を決定するためにも適して
いる。
受容体の拮抗剤を決定するためだけでなく、PAF−アセ
ッサー複合体、特にFed.Proc.46,1987（３）第1468頁に
記載されており、“PEAK X"と称されているPAF−アセ
ッサーリポタンパク質複合体を決定するためにも適して
いる。
以下、実施例を示して本発明についてさらに詳細に説
明する。
明する。
１）脈管内皮細胞の産生 ヒト脈管内皮細胞が臍静脈から単離された（J.Clin.I
nvest.,1973,52:2745−2756）。詳しくは、カニューレ
が臍に挿入され、0.1％コラゲナーゼ溶液（米国.MO.セ
ントルイス．シグマ社（sigma）製タイプＩ）で満たさ
れた。37℃で10分のインキュベーション期間後、剥離し
た細胞が洗い出され、遠心分離により集めめられた。細
胞は、10％の熱不活性化胎児ウシ血清（米国、ユタ州、
ローガン、ハイクロン社（Hyclone）製FCS）、１％のウ
ルトロサーエスエフ（ultroer SF）（フランス国、ヴ
ィレニューヴ・ラ・ガレヌ、アイ・ビイ・エフ社（IB
F））及びヘパリン90μg/mlを含有し、ペニシリン50ユ
ニット/ml及びストレプトマイシン（Science1983,222:6
23−625）50μg/mlが付加されたハムス−Ｆ−12（Hams
−Ｆ−12）培地に再懸濁された。細胞は、25cm2培養フ
ラスコ（米国、カルフォルニア、ラブウェアー、オック
スナード、プライマリア、ファルコン社（Primaria、Fa
lcon））中で１時間インキュベートされた。未付着細胞
は次いで入念に洗い出され、そして付着している細胞は
新しい培地でさらに培養され、培地は２日毎に換えられ
た。培養物が合流に達したとき（３〜５日）、細胞はト
リプシンEDTA（スコットランド、ペイスリー、ギイブコ
社（Gibco））に手短かに曝すことにより採取され、1:3
乃至1:5の分割関係で35mm培養皿（プライマリア、ファ
ルコン社）中に置かれた。
nvest.,1973,52:2745−2756）。詳しくは、カニューレ
が臍に挿入され、0.1％コラゲナーゼ溶液（米国.MO.セ
ントルイス．シグマ社（sigma）製タイプＩ）で満たさ
れた。37℃で10分のインキュベーション期間後、剥離し
た細胞が洗い出され、遠心分離により集めめられた。細
胞は、10％の熱不活性化胎児ウシ血清（米国、ユタ州、
ローガン、ハイクロン社（Hyclone）製FCS）、１％のウ
ルトロサーエスエフ（ultroer SF）（フランス国、ヴ
ィレニューヴ・ラ・ガレヌ、アイ・ビイ・エフ社（IB
F））及びヘパリン90μg/mlを含有し、ペニシリン50ユ
ニット/ml及びストレプトマイシン（Science1983,222:6
23−625）50μg/mlが付加されたハムス−Ｆ−12（Hams
−Ｆ−12）培地に再懸濁された。細胞は、25cm2培養フ
ラスコ（米国、カルフォルニア、ラブウェアー、オック
スナード、プライマリア、ファルコン社（Primaria、Fa
lcon））中で１時間インキュベートされた。未付着細胞
は次いで入念に洗い出され、そして付着している細胞は
新しい培地でさらに培養され、培地は２日毎に換えられ
た。培養物が合流に達したとき（３〜５日）、細胞はト
リプシンEDTA（スコットランド、ペイスリー、ギイブコ
社（Gibco））に手短かに曝すことにより採取され、1:3
乃至1:5の分割関係で35mm培養皿（プライマリア、ファ
ルコン社）中に置かれた。
次いで、細胞は、15％FCS、１％ultroser SF及びヘ
パリン90μg/mlを含有するHams−Ｆ−12培地中で、培地
を２日乃至３日毎に変えながらさらに生長を続けさせら
れた。細胞は４〜６日後に合流に達し、皿当り細胞数は
5.2±0.15×105に達した。上記第一プロセスからの細胞
は全調査にわたって用いられた。培養物は、形態基準に
基づき、内皮細胞用の標準標識化物質であるヒト因子VI
II抗原用の特異抗血清（オランダ国、ティルブルク、ノ
ルディック・イミユノル社（Nordic lmmunol.））を用
いて間接蛍光抗体法によって脈管内皮細胞であることが
決定された。内皮細胞培養物は、形態基準に基づき、α
２−マクログロブリン用のモノクローナル抗体を用いて
間接蛍光抗体法によりいかなる単球／マクロファージ含
有細胞も含有していなかった。
パリン90μg/mlを含有するHams−Ｆ−12培地中で、培地
を２日乃至３日毎に変えながらさらに生長を続けさせら
れた。細胞は４〜６日後に合流に達し、皿当り細胞数は
5.2±0.15×105に達した。上記第一プロセスからの細胞
は全調査にわたって用いられた。培養物は、形態基準に
基づき、内皮細胞用の標準標識化物質であるヒト因子VI
II抗原用の特異抗血清（オランダ国、ティルブルク、ノ
ルディック・イミユノル社（Nordic lmmunol.））を用
いて間接蛍光抗体法によって脈管内皮細胞であることが
決定された。内皮細胞培養物は、形態基準に基づき、α
２−マクログロブリン用のモノクローナル抗体を用いて
間接蛍光抗体法によりいかなる単球／マクロファージ含
有細胞も含有していなかった。
２）内皮細胞へのPAF−アセッサーの結合合流ヒト内皮
細胞、すなわち一緒に生長したものの、培地を0.25％ウ
シ血清アルブミン（BSA）含有のタイロード緩衝液（Tyr
ode′ｓ blffer）で洗滌した。合流内皮細胞に種々の
時間間隔（3,5,15,30分）で次のものを加えた：タイロ
ード緩衝液（pH7.4）900μ、BSA（シグマ社）0.25
％、1.3mM Ca2+、500nMの未標識（標識の付けられてい
ない）PAF−アセッサー（１−０−オクタデシル−２−
アセチル−sn−グリセリル−１−燐酸コリンエステル）
（スイス国、ブーデンドルフ、バッヘム社（Bachem））
を含有し及び含有しない100μの3H−PAF−アセッサー
（0.65nM）（１−０−3H−オクタデシル−２−アセチル
−sn−グリセリル−３−燐酸コリンエステル80Ci/mmo
l、英国バックス（Bucks.）アマーシャム社（Amersha
ｍ））。
細胞、すなわち一緒に生長したものの、培地を0.25％ウ
シ血清アルブミン（BSA）含有のタイロード緩衝液（Tyr
ode′ｓ blffer）で洗滌した。合流内皮細胞に種々の
時間間隔（3,5,15,30分）で次のものを加えた：タイロ
ード緩衝液（pH7.4）900μ、BSA（シグマ社）0.25
％、1.3mM Ca2+、500nMの未標識（標識の付けられてい
ない）PAF−アセッサー（１−０−オクタデシル−２−
アセチル−sn−グリセリル−１−燐酸コリンエステル）
（スイス国、ブーデンドルフ、バッヘム社（Bachem））
を含有し及び含有しない100μの3H−PAF−アセッサー
（0.65nM）（１−０−3H−オクタデシル−２−アセチル
−sn−グリセリル−３−燐酸コリンエステル80Ci/mmo
l、英国バックス（Bucks.）アマーシャム社（Amersha
ｍ））。
第２の試験においては、種々の濃度の3H−PAF−アセ
ッサー（0.0325〜0.65nM）が、前記した未標識のPAF−
アセッサー又はその鏡像異性体（３−０−ヘキサデシル
−２−アセチル−グリセリル−１−燐酸コリンエステ
ル）（500nM）の存在下又は不存在下に30分間インキュ
ベートされた。
ッサー（0.0325〜0.65nM）が、前記した未標識のPAF−
アセッサー又はその鏡像異性体（３−０−ヘキサデシル
−２−アセチル−グリセリル−１−燐酸コリンエステ
ル）（500nM）の存在下又は不存在下に30分間インキュ
ベートされた。
さらにその後の試験においては、PAF−アセッサー拮
抗剤BN52021（60,10,6μＭ）（フランス国レ・プレセス
ロビンソン、IHB−イプセン（IHB−IPSEN））、CV3988
（30,10,3μＭ）（日本、大阪、武田薬品工業（株）
製）又は媒体（ジメチルスルホキシド又は等張NaCl溶
液）が、0.65nMの3H−PAF−アセッサーと共に合流脈管
内皮細胞に加えられた。
抗剤BN52021（60,10,6μＭ）（フランス国レ・プレセス
ロビンソン、IHB−イプセン（IHB−IPSEN））、CV3988
（30,10,3μＭ）（日本、大阪、武田薬品工業（株）
製）又は媒体（ジメチルスルホキシド又は等張NaCl溶
液）が、0.65nMの3H−PAF−アセッサーと共に合流脈管
内皮細胞に加えられた。
30分後、自由活性はBSA含有タイロード緩衝液（pH6.
4）で２回、次いで冷等張NaCl溶液で１回、合流脈管内
皮細胞を洗滌することにより洗い流された。細胞は冷等
張EDTA Nacl溶液（5mM）を加えることにより分離さ
れ、その後、０〜４℃で30〜60分間インキュベートされ
た。分離された細胞はミリポア真空システム（ドイツ連
邦共和国、モルシャイム社（Molsheim））での真空濾過
により培地から分離された。
4）で２回、次いで冷等張NaCl溶液で１回、合流脈管内
皮細胞を洗滌することにより洗い流された。細胞は冷等
張EDTA Nacl溶液（5mM）を加えることにより分離さ
れ、その後、０〜４℃で30〜60分間インキュベートされ
た。分離された細胞はミリポア真空システム（ドイツ連
邦共和国、モルシャイム社（Molsheim））での真空濾過
により培地から分離された。
インキューベーション緩衝液は、結合処理後の洗滌プ
ロセスの間に細胞が損失するのを防ぐために、同様に濾
過された。フィルターは10mlの冷タイロード緩衝液で２
回洗滌され、そしてフィルターに結合した放射能がPCS
（アマーシャム社）中で標準状態下で決定された。脈管
内皮細胞の不存在下にフィルターに結合した放射能は、
脈管内細胞の存在下での放射能から差し引かれた。結合
した放射能は5.20±0.15×105脈管内皮細胞に結合した
ｆモル3H−PAF−アセッサーで計算された。PAF−アセッ
サー拮抗剤の漸増する濃度で30分間のインキュベート
後、細胞は冷EDTA Nacl溶液によって遊離され、次いで
真空濾過によって分離された。3H−PAF−アセッサー結
合は5.2±0.15×105脈管内皮細胞に結合されたｆモルで
計算された。
ロセスの間に細胞が損失するのを防ぐために、同様に濾
過された。フィルターは10mlの冷タイロード緩衝液で２
回洗滌され、そしてフィルターに結合した放射能がPCS
（アマーシャム社）中で標準状態下で決定された。脈管
内皮細胞の不存在下にフィルターに結合した放射能は、
脈管内細胞の存在下での放射能から差し引かれた。結合
した放射能は5.20±0.15×105脈管内皮細胞に結合した
ｆモル3H−PAF−アセッサーで計算された。PAF−アセッ
サー拮抗剤の漸増する濃度で30分間のインキュベート
後、細胞は冷EDTA Nacl溶液によって遊離され、次いで
真空濾過によって分離された。3H−PAF−アセッサー結
合は5.2±0.15×105脈管内皮細胞に結合されたｆモルで
計算された。
次表に5.2±0.15×105合流脈管内皮細胞への特異的3H
−PAF−アセッサー結合（ｆモル）の結果を示す。
−PAF−アセッサー結合（ｆモル）の結果を示す。
すなわち、３μＭのCV3988が加えられると、5.2×105
脈管内皮細胞へのPAF−アセッサー結合は2.26±1.4fモ
ルだけ衰え、また６μＭのBN5021が加えられると1.6±
1.4fモルだけ衰える、などということがわかる。換言す
れば、CV3988はBN52021よりもより効果的の拮抗剤を構
成する。
脈管内皮細胞へのPAF−アセッサー結合は2.26±1.4fモ
ルだけ衰え、また６μＭのBN5021が加えられると1.6±
1.4fモルだけ衰える、などということがわかる。換言す
れば、CV3988はBN52021よりもより効果的の拮抗剤を構
成する。
20℃での30分のインキュベーション期間に代えて、４
℃で20時間インキュベートすることも可能である。しか
しながら、この場合には、拮抗剤にとって15分間予備イ
ンキュベートすることが好ましい。他のことの中でも、
これはリガンドの代謝を防止する。
℃で20時間インキュベートすることも可能である。しか
しながら、この場合には、拮抗剤にとって15分間予備イ
ンキュベートすることが好ましい。他のことの中でも、
これはリガンドの代謝を防止する。
３）BN52021又はCV3988に代えて、親水性トリアゾロジ
エノ−ジアゼピンWEB2086（1,10,100,1000nM）を用いた
以外は、前記試験２）に従って脈管内皮細胞へのPAF−
アセッサー結合が繰り返された。
エノ−ジアゼピンWEB2086（1,10,100,1000nM）を用いた
以外は、前記試験２）に従って脈管内皮細胞へのPAF−
アセッサー結合が繰り返された。
結果を下記表−２に示す。
すなわち、1nMのWEB2086が加えられると、5.2×105脈
管内皮細胞へのPAF−アセッサー結合は、0.66±0.2fモ
ルだけ衰え、1000nMが加えられると３±0.7fモルだけ衰
える。
管内皮細胞へのPAF−アセッサー結合は、0.66±0.2fモ
ルだけ衰え、1000nMが加えられると３±0.7fモルだけ衰
える。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｄ 493/22 Ｃ０７Ｄ 493/22 495/04 １０５ 495/04 １０５Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｌ 33/58 33/58 Ｚ
Claims (3)
- 【請求項１】脈管内皮細胞バリヤーの低下による疾患の
予防又は治療のため、脈管内皮細胞のPAF−アセッサー
受容体に対抗させるための、親水性トリアゾロチエノ−
ジアゼピン、BN52020とBN52021とBN52022の混合物、又
はモノクローナル抗体、の少なくとも１つを含む医薬組
成物の用途。 - 【請求項２】親水性トリアゾロチエノ−ジアゼピンはWE
B2086及びWEB2098である請求項１記載の用途。 - 【請求項３】脈管内皮細胞バリヤーの低下によって生ず
る疾患は動脈硬化症である請求項１記載の用途。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3735525.2 | 1987-10-20 | ||
| DE3735525A DE3735525C2 (de) | 1987-10-20 | 1987-10-20 | Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit von paf-Acether-Rezeptor-Antagonisten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0291020A JPH0291020A (ja) | 1990-03-30 |
| JP2539257B2 true JP2539257B2 (ja) | 1996-10-02 |
Family
ID=6338731
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63262992A Expired - Fee Related JP2539257B2 (ja) | 1987-10-20 | 1988-10-20 | Ｐａｆ―アセッサ―拮抗剤による疾患の治療 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0312913B2 (ja) |
| JP (1) | JP2539257B2 (ja) |
| AT (1) | ATE72113T1 (ja) |
| AU (1) | AU613672B2 (ja) |
| DE (1) | DE3735525C2 (ja) |
| ES (1) | ES2032922T5 (ja) |
| GR (2) | GR3004464T3 (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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