DE4017818C2

DE4017818C2 - Verfahren zur Überprüfung von Substanzen auf ihre Wirksamkeit als paf-Acether-Antagonisten

Info

Publication number: DE4017818C2
Application number: DE19904017818
Authority: DE
Inventors: Ruth-Maria Korth
Original assignee: KORTH RUTH MARIA
Current assignee: KORTH RUTH MARIA
Priority date: 1990-06-06
Filing date: 1990-06-06
Publication date: 2001-02-15
Anticipated expiration: 2010-06-07
Also published as: DE4017818A1

Description

Paf-Acether (platelet-activating-factor) ist seiner chemi schen Struktur nach 1-0-Alkyl-2-acetyl-sn-glyceryl-3-phos phorylcholin (Benveniste et al., 1979).

Das Endothel bildet eine zellige Auskleidung, die das Gewebe schützt. Beim Durchbrechen der Endothel-Zellenbarriere tritt eine Reihe von Erkrankungen auf. Auch führen Läsionen des En dothels zu einem gesteigerten Stoffeinstrom, der Reaktionen hervorruft, die zur Arteriosklerose führen können. Aus der EP 312 913 A2 ist ferner bekannt, daß Substanzen, die paf- Acether-Bindungsstellen an Zellen inhibieren (paf-Acether- Antagonisten) sich zur Behandlung von Erkrankungen eignen, die durch den Abbau der Endothelzellenbarriere hervorgerufen werden. So ist insbesondere eine Behandlung und Vorbeugung von Arteriosklerose mit paf-Acether-Antagonisten erfolgver sprechend.

Als paf-Acether-inhibierende Substanzen haben sich bisher ins besondere hydrophiles Triazolothieno-diazepin oder Analoge davon sowie Gingkolide oder synthetische Derivate derselben ebenso wie Analoge des paf-Acethers mit paf-antagonistischen Eigenschaften, wie das CV 3988, als geeignet erwiesen. Zu den hydrophilen Triazolothieno-diazepin-Verbindungen, die paf-Ace ther-Antagonisten bilden, gehört beispielsweise WEB 2086 mit der Formel 3-(4-(2-Chlorophenyl)-9-methyl-6H-thieno(3,2,-f) (1,2,4) triazolo-(4,3-a)- (1,4) diazepin-2yl)-1-(4-morpholinyl) -1-propanon.

Es ist bekannt, zur Bestimmung der Wirksamkeit von paf-Ace ther-Antagonisten Bindungsstudien an Zellen mit markiertem paf-Acether einmal in Gegenwart und zum anderen in Abwesen heit des betreffenden Antagonisten durchzuführen. Als Zellen werden bisher Thrombozyten, Leukozyten oder Endothel-Zellen eingesetzt. Thrombozyten müssen aus Versuchstieren oder vom Menschen frisch hergestellt werden, was mit einem relativ großen Aufwand verbunden ist. Endothel-Zellen, die nach EP 312 913 A2 eingesetzt werden, und bei denen entsprechend dem Oberbegriff des Anspruchs 1 vorgegangen wird, benötigen eine relativ lange Kultivierungszeit. Darüber hinaus müssen sie als adhärente Zellen vor dem Test voneinander gelöst werden.

Nach DE 37 35 525 C2 werden markierte Antagonisten und Antikörper verwendet, um die Wechselwirkung von Paf und einem Paf-Acether/Lipoprotein-Komplex mit humanen adhärenten Endothelzellen zu bestimmen. Die Wirkung von paf-Acether auf Paf Rezeptoren von adhärenten Monozyten oder Makrophagen und deren Beeinflussung durch BN 52021, Prostaglandine oder Lipoxygenasehemmer wird beschrieben in Pignol B. et al., Prostaglandins, 1987, Bd. 33, Nr. 6, S. 931-9 sowie Parnham M. J. et al., Agents and Actions Suppl., 1984, Bd. 14, S. 215-26. Die Bewegung von Neutrophilen durch eine Schicht von humanen Endothelzellen in Anwesenheit von paf-Acether wird mit Lipoxygenasehemmern vermindert (Hopkins N. K. et al. Biochim. Biophys. Acta, 1984, Bd. 805, Nr. 1, S. 30-36).

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Screening-Verfahren bereit zustellen, mit dem Substanzen schnell und zuverlässig darauf getestet werden können, ob sie als paf-Acether-Antagonisten bzw. als Antagonisten gegen cholesterol- und LDL-bedingte atherogene Effekte wirksam und damit inbesondere zur Vorbeu gung und Behandlung von Arteriosklerose geeignet sind.

Dies wird erfindungsgemäß mit dem im Anspruch 1 gekennzeichne ten Verfahren erreicht. In den Unteransprüchen sind vorteil hafte Ausgestaltungen der Erfindung wiedergegeben. D. h., er findungsgemäß werden für die Bindungsstudien mit paf-Acether und den paf-Acether-Antagonisten monozyten- bzw. makrophagen ähnliche Zellen eingesetzt, die mit LDL (low density lipo proteins) bzw. Cholesterol stimuliert sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist schnell durchführbar. Die monozyten- bzw. makrophagenähnlichen Zellen sind im Handel oder über entsprechende Institute erhältlich und können problemlos kultiviert werden. Zum Test braucht von der Kul tur lediglich eine gewisse Menge Zellen entnommen und mit Cholesterol bzw. LDL stimuliert zu werden. Diese Vorgänge und die Bindungsstudie selbst können also mit Standard-Laborvor gängen, wie Pipettieren, durchgeführt werden, für die es be reits ausgereifte automatische Einrichtungen gibt. Das erfin dungsgemäße Verfahren ist daher problemlos automatisierbar, was für ein Screening-Verfahren von großer Bedeutung ist.

Zugleich stellt das erfindungsgemäße Verfahren ein zuverlässi ges Modell für einen Test dar, mit dem die Wirksamkeit einer Substanz im Hinblick auf ihre Aktivität als paf-Acether-Anta gonist bzw. zur Vorbeugung und Verhinderung der Arterioskle rose überprüft werden kann.

Bei der Pathogenese der Arteriosklerose kommt nämlich den mo nozyten- bzw. makrophagenähnlichen Zellen sowie LDL bzw. dem darin enthaltenen Cholesterol eine entscheidende Bedeutung zu. Durch monozyten- bzw. makrophagenähnliche Zellen zusammen mit LDL bzw. Cholesterol kommt es zu Läsionen des Endothels und ei nem gesteigerten Stoffeinstrom, wodurch metabolische und zel luläre Reaktionen der Gefäßwand ausgelöst werden. Dabei führt an die Rezeptoren von monozyten- bzw. makrophagenähnlichen Zellen gebundener paf-Acether zur Adhärenz dieser Zellen an den Endothelzellen, so daß die monozyten- bzw. makrophagen ähnlichen Zellen das Endothel durchwandern können und sich im Gewebe zu Makrophagen (Freßzellen) ausbilden, die in Schaum zellen übergehen, und zwar unter Anreicherung von Cholesterol mit folgender Endothelzellschädigung. Nach Untergang der Schaumzellen sammelt sich das kristalline Cholesterol im sub endothelialen Gewebe und schädigt wiederum das darüberliegen de Endothel. Die Schädigung des Endothels führt zur Anheftung von Blutzellen z. B. den Thrombozyten und somit zur Thrombus bildung.

D. h., bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden in vitro die gleichen bzw. ähnliche Zellen zusammen mit LDL bzw. Choleste rol eingesetzt, die in vivo zur Entstehung der Arteriosklerose führen.

Als monozyten- bzw. makrophagenähnliche Zellen haben sich ins besondere U937-Zellen als geeignet erwiesen.

Die Kultivierung der monozyten- bzw. makrophagenähnlichen Zellen erfolgt vorzugsweise in einem serumhaltigen, insbe sondere fötales Kalbsserum enthaltenden Kulturmedium.

Die monozyten- bzw. makrophagenähnlichen Zellen werden vor dem Test vorzugsweise in einem delipidiertes Serum, insbe sondere delipidiertes fötales Kalbsserum enthaltenden Medium einige Tage, vorzugsweise 24 h alleine und dann zusammen mit LDL bzw. Cholesterol im Vergleich mit den Trägern inkubiert, um sie zu stimulieren. Das Kulturmedium für die monozyten- bzw. makrophagenähnlichen Zellen kann dabei L-Glutamin ent halten. Die Kultivierung bzw. Inkubation erfolgt vorzugswei se bei erhöhter Temperatur, beispielsweise 37°C.

Ein wesentlicher Vorteil der monozyten- bzw. makrophagenähn lichen Zellen besteht neben ihrer einfachen Kultivierung dar in, daß sie als Suspension vorliegen, und damit mit herkömm lichen Geräten leicht entnommen und dosiert werden können.

Bevor die Zellen zu den Bindungsstudien eingesetzt werden, werden sie gewaschen, um paf-Acether abbauende Enzyme, wie Acetylhydrolase, zu entfernen. Als markierter paf-Acether wird bei den Bindungsstudien vorzugsweise radioaktiv markier ter paf-Acether, insbesondere Tritium-markierter paf-Acether verwendet. Auch eine Behandlung mit fluoreszierendem oder ge färbtem paf-Acether sowie markiertem Antagonisten oder Anti körpern wäre möglich.

Die Bindungsstudien werden vorzugsweise bei einer Temperatur von weniger als 20°C durchgeführt, vorzugsweise bei 2 bis 6°C, damit die in den monozyten- bzw. makrophagenähnlichen Zellen enthaltenen Enzyme, wie Phospholipasen oder Acetyl hydrolase, zu keinem Abbau des paf-Acethers führen. Eine In kubationszeit von einer Stunde oder weniger reicht im allge meinen für die Bindungsstudien aus.

Da paf-Acether als Phospholipid nicht in Wasser geht, werden die Bindungsstudien vorzugsweise in Gegenwart eines delipi dierten Serumalbumins, wie BSA, durchgeführt, wobei vorzugs weise Kalzium- und Magnesiumionen zugesetzt werden.

Das Serumalbumin hat dabei die Aufgabe, den an die monozyten- bzw. makrophagenähnlichen Zellen unspezifisch, also nicht an die Rezeptoren gebundenen paf-Acether und Antagonisten zu bin den, d. h. von den monozyten- bzw. makrophagenähnlichen Zellen zu entfernen. Das Abtrennen der monozyten- bzw. makrophagen ähnlichen Zellen nach der Inkubation mit paf-Acether bzw. paf-Acether-Antagonisten vom Oberstand bzw. der Flüssigkeit, erfolgt vorzugsweise durch Filtration, insbesondere Vakuum filtration. Diese Zellen sind nämlich nicht nur ausgezeich net filtrierbar, vielmehr stellt das Filtrieren zugleich ein relativ scharfes und damit sehr wirksames Verfahren zur Ab trennung des restlichen und spezifisch gebundenen markierten paf-Acethers von den monozyten- bzw. makrophagenähnlichen Zellen dar. Es wäre auch möglich, die Zellen durch Zentrifu gation vom Oberstand zu trennen.

Anschließend wird die Menge des an die monozyten- bzw. makro phagenähnlichen Zellen (spezifisch) gebundenen markierten paf-Acethers bestimmt, wobei bei Verwendung von radioaktiv markiertem paf-Acether lediglich die Radioaktivität der fil tergebundenen Zellen gemessen wird. Die filtergebundene Radio aktivität in Abwesenheit von diesen Zellen wird als Korrektur wert von diesen Werten abgezogen.

Duch Eichkurven, die mit unterschiedlichen Mengen der betref fenden Substanz erhalten werden, deren paf-Acether-Antagoni sten-Wirkung getestet werden soll, kann so die Wirksamkeit dieser Substanz bzw. des Antagonisten als 50%-iger Hemmwert erhalten werden, d. h. als die Menge, die bezogen auf eine vorgegebene Menge an monozyten- bzw. makrophagenähnlichen Zellen zu einer 50%-igen Hemmung der reversiblen Bindung von markiertem paf-Acether an den monozyten- bzw. makrophagenähn lichen Zellen führt. Das erfindungsgemäße Verfahren wurde mit Erfolg insbesondere mit dem hydrophilen Triazolothieno diazepin WEB 2086 getestet.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zugleich dazu, die Wirk samkeit der betreffenden Testsubstanz auf ihre Aktivität die Wirkung oder Bildung von Acetylhydrolase, also einem natür lichen Antagonisten des paf-Acethers, zu testen. LDL und Cholesterol stimulieren zudem die intrazelluläre Bildung der Acetylhydrolase und das erfindungsgemäße Verfahren kann somit zur Bildung der Acetylhydrolase und ihrer Antikörper genützt werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren könnte weiterhin die Pathogenität bzw. Atherogenität von LDL-Präparationen Kranker, vorzugsweise Hypercholesterolemiker in klinischen Untersuchungen genützt werden und auch die Wirkung anderer Steroide als Cholesterol, wie z. B. Corticosteroide oder Sexual hormone, im Screening-Verfahren getestet werden.

Des weiteren können auch Bindungsstellen für paf-Acether-Anta gonisten, z. B. WEB 2086, durch LDL und Cholesterol ausgebildet werden und/oder ihr Postrezeptorengeschehen verändert werden. Da die spezifische Bindung von paf-Acether eng mit dem zellu lären Calciumfluß korreliert, könnte das erfindungsgemäße Ver fahren auch zum Messen von paf-Acether oder paf-Acether-ähnli chen Blutbestandteilen genützt werden, indem deren Wirkung auf den zellulären Calciumfluß mit einer Standardkurve von syn thetischem paf-Acether verglichen wird. Für eine Automatisie rung der Calciummessungen gäbe es ebenfalls ausgereifte au tomatische Einrichtungen.

Die nachstehenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Kultivierung und Stimulierung monozyten- bzw. makrophagenähn licher Zellen

Monozyten- bzw. makrophagenähnliche U937-Zellen wurden in ei ner stationären Suspensionskultur in RPMI 1640-Medium, das 10% fötales Kalbsserum und 2 mM L-Glutamin enthielt, bei 37°C unter einer feuchten Atmosphäre aus 5% CO₂ und 95% Luft vermehrt. Die Zellen wurden zweimal in der Woche auf das 10- fache (1/10 V/V) verdünnt. Drei Tage nach ihrer Kultivierung wurden die Zellen zunächst 24 Stunden in delipidiertem Me dium gehalten und dann entweder in einem Medium, das delipi diertes fötales Kalbsserum (CPSR 1) und 2 mM L-Glutamin ent hielt, entweder mit LDL-Präparationen, die von drei gesunden männlichen Probanden stammten und nach Standard-Verfahren ge wonnen wurden, in einer Menge von 10 µg/ml, mit Cholesterol (10-60 µg/ml), LDL-Träger oder Ethanol (0,5% Endkonzentration V/V) jeweils 2, 4 und 24 Stunden inkubiert.

Paf-Acether-Bindung an den monozyten- bzw. makrophagenähnli chen Zellen

Die U937-Zellen wurden mit 100 g zentrifugiert und nach dem Sedimentieren zweimal gewaschen. Die Zellen wurden gewaschen und nach dem letzten Waschgang in Tyrode's Puffer ohne Ca²⁺, der 0,25% delipidiertes Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, suspendiert. Alle Bindungsstudien wurden in Gegenwart von 1,3 mM Ca²⁺, 1,0 mM MgCl₂ und 0,25% BSA bei pH 7,4 durchge führt. Zu 400 µl Puffer wurden 50 µl ³H-paf-Acether in unter schiedlichen Konzentrationen (0,35 bis 5,6 nM) in Gegenwart von einem Oberschuß an WEB 2086 (1 µM) oder Träger gegeben. Die Reaktion wurde mit 50 µl der Zellsuspension (1,25 . 10⁶ Endkonzentration) in Gang gesetzt. Nach einer Inkubation von einer Stunde bei 4°C wurden die U937-Zellen von der Lösung durch Vakuumfiltration abgetrennt.

In der Zeichnung zeigen:

Fig. 1 die Dosis-Ansprech- oder Reaktionskurve für die ³H-paf-Acether-Bindung nach Zugabe von LDL. Die LDL- Präparation von drei gesunden männlichen Probanden (10 µg/ml, 24 Stunden) wurden zu U937-Zellen in de lipidiertem Medium vor drei Waschgängen gegeben. Die ³H-paf-Acether-Bindung an die U937-Zellen (fmol pro 1,25 . 10⁶ Zellen) wurden mit (0) und ohne (⚫) WEB 2086 (1 µM) gemessen. Die Zellen wurden durch Vakuum filtration nach einstündiger Inkubation bei 4°C abge trennt. Die spezifische Bindung (∎) wurde aufgrund der Differenz zwischen der Gesamtbindung und der nicht spezifischen Bindung in Gegenwart von WEB 2086 (1 µM) berechnet. Die Werte stellen Mittelwerte mit einer +/-1-Standard-Abweichung von drei verschiedenen Versu chen dar.

Fig. 2 die Dosis-Ansprechkurve der ³H-paf-Acether-Bindung an U937-Zellen, die 24 Stunden in einem delipidierten Me dium mit LDL-Träger aufbewahrt wurden. Die ³H-paf-Ace ther-Bindung an gewaschenen U937-Zellen (fMol pro 1,25 . 10⁶ Zellen) wurde mit (⬩) und ohne (⚫) WEB 2086 gemessen. Die Zellen wurden durch Vakuumfiltration nach einstündiger Inkubation bei 4°C abgetrennt. Die spezifische Bindung (∎) wurde aus der Differenz zwi schen Gesamtbindung und nichtspezifischer Bindung in Gegenwart von WEB 2086 (1 µM) berechnet. Die Werte stellen Mittelwerte mit einer +/-1-Standard-Abweichung von drei verschiedenen Versuchen dar.

Fig. 3 die Dosis-Ansprechkurve der ³H-paf-Acether-Bindung nach Zugabe von Cholesterol. Cholesterol (60 µg/ml, 24 Stun den) wurde zu U937-Zellen gegeben. Die ³H-paf-Acether- Bindung an gewaschenen U937-Zellen (fMol pro 1,25 . 10⁶ Zellen) wurde mit (⬩) und ohne (⚫) WEB 2086 durchge führt. Die Zellen wurden durch Vakuumfiltration nach einstündiger Inkubation bei 4°C abgetrennt. Die spezi fische Bindung (∎) wurde aus der Differenz zwischen der Gesamtbindung und nichtspezifischer Bindung in Ge genwart von WEB 2086 (1 µM) berechnet. Die Werte stel len Mittelwerte mit einer +/-1-Standard-Abweichung von drei verschiedenen Versuchen dar.

Fig. 4 die prozentuale ³H-Acetat-Freisetzung von ³H-Ace tyl-paf, das einer zunehmenden Zahl von U937-Zellen zugesetzt wurde. U937-Zellen wurden in einem delipi dierten Medium in Abwesenheit (A) oder Anwesenheit (B) von LDL-Präparationen von drei gesunden männlichen Pro banden (10 µg/ml, 24 Stunden) inkubiert. Eine zunehmen de Anzahl von intakten gewaschenen Zellen wurde mit ³H-Acetyl-paf (5 µM) mit (▲) und ohne (⚫) WEB 2086 (1 µM, 15 Minuten bei 37°C inkubiert, bevor die Reak tion durch Stellen in ein Eisbad gestoppt wurde. Die Proteine wurden durch Zusatz von TCA (14% V/V) nach einer Inkubation von 10 Minuten mit überschüssigem BSA denaturiert und zentrifugiert. Das freigesetzte ³H-Acetat wurde in dem überstand nach einem Standard- Verfahren gemessen. Die Daten sind in Prozent des ge samten zugesetzten ³H-Acetyl-paf angegeben und stellen Mittelwerte mit einer +/-1-Standard-Abweichung von drei verschiedenen Versuchen dar.

Spezifische ³H-paf-Acether-Bindung nach Inkubation mit LDL:

Die monozyten- bzw. makrophagenähnlichen U937-Zellen (1,25 . 10⁶) binden ³H-paf-Acether in einer konzentrationsabhängi gen Weise nach einer Stunde Inkubation bei 4°C, ohne daß ein Endwert erreicht wird (Fit. 1 und 2). Der Zusatz der LDL-Prä parationen (10 µg/ml, 24 Stunden) zu U937-Zellen in delipi diertem Medium stellte nach drei Waschgängen die spezifische ³H-paf-Acether-Bindung (Fig. 1), verglichen mit der unspezi fischen Bindung mit LDL-Träger (0,5% V/V) (Fig. 2), dar.

Die Gesamtbindung des ³H-paf-Acethers (5,6 nM) war ähnlich bei LDL-behandelten U937-Zellen gegenüber U937-Kontrollzel len (33,3 +/- 5,7 gegenüber 31,9 +/- 3,3 fmol pro 1,25 . 10⁶ U937-Zellen). Die nichtspezifische Bindung, die in Gegenwart von WEB 2086 (1 µM) gemessen wurde, nahm von 28,0 +/- 1,1 fMol auf 21,8 +/- 6,3 fMol bei der Kontrolle gegenüber LDL- behandelten Zellen ab.

Die spezifische ³H-paf-Acether-Bindung, definiert als Gesamt bindung minus nichtspezifischer Bindung, erreichte Endwerte zwischen 1,4 und 2,8 nM zugegebenem ³H-paf-Acether und nahm mit 5,6 nM zugesetztem ³H-paf-Acether auf 11,5 +/- 0,7 fMol zu.

LDL, das in kürzeren Inkubationsperioden (2 Stunden, 4 Stun den) zugesetzt wurde, führte zu keiner Exprimierung spezifi scher Bindungsstellen für paf-Acether, gemessen mit WEB 2086 (sh. nachstehende Tabelle 1). Weder LDL-behandelte Zellen, noch Kontrollzellen katabolisierten zugesetztes ³H-Acetat (5 µM, eine Stunde) unter Bindungsbedingungen bei 4°C.

Spezifische ³H-paf-Acether-Bindung nach Inkubation mit Cho lesterol

Der Zusatz von Cholesterol zu U937-Zellen führte zur Aus bildung spezifischer ³H-paf-Acether-Bindungsstellen in ähn licher Weise wie LDL (60 µg/ml in delipidiertem Medium wäh rend 24 Stunden) (Fig. 3). Die Gesamtbindung von ³H-paf-Ace ther (5,6 nM) an cholesterolbehandelten U937-Zellen erreich te ähnliche Werte wie jene, die mit LDL-behandelten sowie Kontrollzellen erhalten wurden (34,4 +/- 4,2 fMol gegenüber 31,9 +/- 3,3 und 33,3 +/- 5,7 fMol gebunden an 1,25 . 10⁶ U937-Zellen). Die nichtspezifische Bindung, gemessen mit WEB 2086 (1 µM) nahm von 34,4 +/- 4,2 fMol auf 25,2 +/- 5,0 fMol bei Kontrollzellen gegenüber cholesterolbehandelten Zellen ab. Die spezifische Bindung von ³H-paf-Acether (5,6 nM) war derjenigen von LDL-behandelten U937-Zellen ähnlich (9,3 +/- 0,8 gegenüber 11,5 +/- 0,7 fMol), verglichen mit der ge ringen spezifischen Bindung an Kontrollzellen (3,9 +/- 3,6 fMol). Die spezifische ³H-paf-Acether-Bindung erreichte ähn liche Endwerte bei cholesterol- und LDL-behandelten Zellen (6,2 +/- 2,9 gegenüber 5,7 +/- 1,1 fMol) bei Konzentrationen über 2,8 nM. Cholesterol erhöhte die spezifische Bindung von ³H-paf-Acether (0,7 nM) in einer konzentrationsabhängigen Weise unter Herabsetzung der nichtspezifischen Bindung (vgl. nachstehende Tabelle 2). Es wurde wiederum keine spezifische Bindung festgestellt, wenn Cholesterol 2 bis 4 Stunden zu dem delipidierten Medium (vgl. nachstehende Tabelle 1) oder nach Zusatz des Trägers oder Vehikels zu dem delipidierten Medium (vgl. nachstehende Tabelle 2) zugesetzt wurde.

Acetylhydrolase-Aktivität an der Oberfläche intakter U937- Zellen

Intakte U937-Zellen katabolisierten zugesetztes ³H-Acetyl-paf (5 µM) in Abhängigkeit von der Anzahl der Zellen bei 37°C (Fig. 4A, B), verglichen mit dem nichterfolgten Abbau von ³H-Acetyl-paf in Gegenwart von denaturierten Zellproteinen oder in Abwesenheit von Zellen. Der Zusatz von drei verschie denen LDL-Präparationen zu U937-Zellen in delipidiertem Medium (B: 10 µg/ml, 24 Stunden) griff nicht in den paf-Acether-Kata bolismus an der Oberfläche der gewaschenen intakten U937-Zel len ein, verglichen mit den Kontrollzellen (12,0 +/- 1 gegen über 13,5 +/- 1%) (Fig. 4A, B). Der paf-Acether-Rezeptor- Antagonist WEB 2086 inhibierte nicht den Katabolismus von ³H-Acetyl-paf, der an der Oberfläche intakter U937-Zellen festgestellt wurde.

Intrazelluläre Acetylhydrolase-Aktivität nach LDL-Inkubation

Die Acetylhydrolase-Aktivität wurde gleichfalls in Lysaten ge waschener U937-Zellen nach LDL-Behandlung gemessen, verglichen mit Kontrollzellen. Dazu wurden die Zell-Lysate (50 µl) zu 440 µl isotonem Hepes/EDTA Puffer (pH 8,0) gegeben und die Reaktion nach fünfminütiger Vorinkubation bei 37°C mit ³H-Acetyl-paf gestartet. Nach zehnminütiger Inkubation bei 37°C wurde diese durch Stellen in ein Eisbad gestoppt, und die Proteine durch TCA (14%) nach weiterer zehnminütiger Inkubation mit überschüssigem BSA denaturiert. Das freige setzte ³H-Acetat wurde wiederum im überstand nach Zentri fugation bestimmt. Die Daten sind in nMol pro mg Protein ange geben. Die Acetylhydrolase-Aktivität war linear mit der Pro teinkonzentration bis zu 110 µg/ml bis wenigstens 10 Minuten. Die Enzymkinetik von Kontrollzellen, die 24 Stunden mit Trä ger oder Vehikel in delipidiertem Medium aufbewahrt wurden, unterschied sich von der LDL-behandelter Zellen. Der K_m- und v_max-Wert, berechnet aufgrund der Lineweaver-Burk-Diagramme (vgl. nachstehende Tabelle 3) nahm nach Zugabe von drei ver schiedenen LDL-Präparationen zu dem delipidierten Medium (10 µg/ml, 24 Stunden) zu. Die Zunahme von v_max weist auf eine Anreicherung der Acetylhydrolase in U937-Zellen während der Inkubation in Gegenwart von LDL hin. Der K_m-Wert gleicht nach Inkubation mit LDL dem im Plasma K_m gemessenen.

Aus der nachstehenden Tabelle 1 geht hervor, daß 2 und 4 Stun den nach Zusatz von LDL-Präparationen von drei verschiedenen gesunden männlichen Probanden (10 µm/ml) oder Cholesterol (60 µm/ml) zu delipidiertem Medium, verglichen mit dem Träger oder Vehikel, keine spezifische ³H-paf-Acether-Bindung vorlag. Die Zellen wurden dreimal gewaschen und die ³H-paf-Acether-Bindung (1,6 nM) wurde mit und ohne WEB 2086 (1 µM, 1 Stunde, 4°C, 0,25% BSA) durchgeführt, bevor die Zellen durch Vakuum filtration abgetrennt wurden. Die spezifische Bindung ist als Gesamtbindung minus nichtspezifischer Bindung, gemessen mit WEB 2086, angegeben. Die Angaben sind in fMol pro 1,25 . 10⁶ U937-Zellen dargestellt und sind Mittelwerte mit einer +/-1- Standard-Abweichung von drei verschiedenen Versuchen.

Tabelle 1

In der nachstehenden Tabelle 2 ist die Cholesterol-Konzentra tion in Abhängigkeit von der spezifischen ³H-paf-Acether-Bin dung an U937-Zellen dargestellt. Cholesterol wurde delipidier tem Medium, verglichen mit Träger (0,5% Ethanol V/V) zuge setzt, und U937-Zellen wurden dreimal nach 24-stündiger In kubationszeit gewaschen. Die ³H-paf-Acether-Bindung (0,7 nM) wurde mit und ohne WEB 2086 (1 µM, 1 Stunde, 4°C, 0,25% BSA) durchgeführt, bevor die Zellen durch Vakuumfiltration abge trennt wurden. Die spezifische Bindung ist als Gesamtbindung minus nichtspezifischer Bindung, gemessen mit WEB 2086, ange geben, und die Werte sind in fMol pro 1,25 . 10⁶ U937-Zellen ausgedrückt. Sie sind Mittelwerte mit einer +/-1-Standard-Ab weichung von drei verschiedenen Versuchen.

Tabelle 2

In der nachstehenden Tabelle 3 ist die Acetylhydrolase-Enzym kinetik von lysierten U937-Zellen 24 Stunden nach Zugabe von LDL-Präparationen von drei gesunden männlichen Probanden (10 µg/ml) zu delipidiertem Medium wiedergegeben, verglichen mit dem Träger. U937-Zellen wurden lysiert (dreimal während 30 Sekunden), nach drei Waschgängen, und die Freisetzung von ³H-Acetat während einer Inkubation von 10 Minuten bei 37°C wurde nach Proteindenaturierung gemessen. Die K_m- und v_max-Werte basieren auf einem Lineweaver-Burk-Diagramm von drei verschiedenen Versuchen und stellen Mittelwerte mit einer +/-1-Standard-Abweichung von drei verschiedenen Versu chen dar.

Tabelle 3

Aus der Tabelle 3 geht hervor, daß LDL sowohl die aktive Kom ponente (paf-Acether-Bindung) wie die intrazelluläre Acetyl hydrolase stimuliert, welche als Antagonist zu paf-Acether wirkt.

Die vorstehend wiedergegebenen Versuchsergebnisse zeigen eine Expression von spezifischen paf-Acether-Bindungsstellen an monozyten- bzw. makrophagenähnlichen U937-Zellen mit den wichtigsten arterogenetischen Faktoren Cholesterol und LDL, zusammen mit einer LDL-bedingten Anreicherung von intrazellu lärer Acetylhydrolase. Daraus ist auf die Rolle von paf-Ace ther am Anfang der arteriosklerotischen Erkrankung zu schlies sen. Aus dem inhibierenden Effekt des paf-Rezeptor-Antagoni sten WEB 2086 ergibt sich im übrigen, daß dieser als Arznei mittelwirkstoff arteriosklerotische Läsionen bei Hyperchole sterolämie verhindert.

Claims

1. Verfahren zur Überprüfung von Substanzen auf ihre Wirksamkeit als paf-Acether-Antagonisten, bei dem

a) eine vorgegebene Menge von Zellen, die einer Zell-Kultur entnommen und gewaschen werden, mit einer vorgegebenen Menge von markiertem paf-Acether und einer vorgegebenen Menge der zu überprüfenden Substanz versetzt wird;
b) eine weitere vorgegebene Menge von Zellen, die von der Zell- Kultur entnommen und gewaschen werden, mit einer vorgegebenen Menge markiertem paf-Acether versetzt wird;
c) die Zellen von dem Gemisch a) und b) jeweils abgetrennt werden;
d) die Menge des an die Zellen gebundenen markierten paf- Acethers gemessen wird; und
e) aus dem Verhältnis der Menge des markierten paf-Acethers, der gemäß a) in Gegenwart der Substanz an die Zellen gebunden ist, zu der Menge des markierten paf-Acethers, der gemäß b) ohne die Substanz an die Zellen gebunden wird, bezogen auf die gleiche Menge Zellen und zugegebenem markierten paf- Acether, die Wirksamkeit der Substanz als paf-Acether- Antagonist bestimmt wird,

dadurch gekennzeichnet, dass als Zellen monozyten- und/oder makrophagenähnliche Zellen verwendet werden, die mit Cholesterol und/oder LDL stimuliert sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als monozyten- und/oder makrophagenähnliche Zellen U937-Zellen verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die monozyten- und/oder makrophagenähnlichen Zellen in einem delipidierten Medium mit Cholesterol und/oder LDL stimuliert werden.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die monozyten- und/oder makrophagenähnlichen Zellen als Suspension mit der zu überprüfenden Substanz versetzt werden.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirksamkeit der zu überprüfenden Substanz auf die Wirkung der Bildung von Acetylhydrolase getestet wird.