JPH0291020A

JPH0291020A - Ｐａｆ―アセッサー拮抗剤による疾患の治療

Info

Publication number: JPH0291020A
Application number: JP63262992A
Authority: JP
Inventors: Ruth Korth; ルース、コルス
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-10-20
Filing date: 1988-10-20
Publication date: 1990-03-30
Anticipated expiration: 2011-10-02
Also published as: AU613672B2; AU2394388A; JP2539257B2; DE3735525C2; GR3018869T3; ES2032922T3; GR3004464T3; DE3735525A1; EP0312913B2; EP0312913A2; EP0312913B1; EP0312913A3; ES2032922T5; ATE72113T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、ＰＡＦ−アセッサ−（ＰＡＦ−Ａｃｅｔｈｅ
ｒ）による疾患の治療及びそれらの有効性の決定方法に
関する。

〔従来の技術〕

その化学的構造によれば、ＰＡＦ−アセッサ−（血小板
活性化因子　ｐｌａｔ、ｅｌｅｔ　　ａｃｔ　１ｖａｔ
　ｉｎｇ　’ｆａｃｔｏｒ）は、１−〇−アルキルー２
−アセチルー５ｎ−グリセリル−３−燐酸コリンエステ
ルである（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１３６：１３５６−
１３７７（１９７２）及びＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２５４　：　９３５５−９３５８　（１９７９）参照）
ＰＡＦ−アセッサーが強力な炎症性及び血圧下降特性を
有し、また冠状血管収縮及び皮膚の急激な水腫形成を引
き起こすことは知られている。血小板のＰＡＦ−アセッ
サー受容体、多形核好中球及びヒトの肺組織からの膜製
剤については報告されている（Ｊ、１ｍｍｕｎｏ　ｌ。

１２９　：　　（１９８４）１６３７−１６４．１、Ｔ
ｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、、４１　：　　（１９８６）６９
９−７０６；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　　４Ｂ：１４１　
（１９８Ｂ）及びＢｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ
ｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１２８：９７２　（１９８５）参
照）。

〔発明が解決しようとする課題〕

脈管内皮は組織を保護する細胞外皮を形成する。脈管内
皮細胞の障壁（バリヤー）が破れると、各種の疾患が生
ずる。例えば、流体（分泌液）が組織から逃散すること
が可能であり、これにより水腫の形成が生起し得ること
になる。

細菌性及び脳疾患、炎症及びアレルギーもまた、脈管内
皮細胞バリヤーが低くなることによって生じ得る。もし
、脈管内皮細胞バリヤーが低減すると、冠状導管への罹
患により産学性の冠状収縮をも生じ得る。脈管内皮は罹
患した組織部分の拡大に抗して保護するので、転移形成
に抵抗する。脈管内皮の損傷も、同様に物質の流入を増
大するようになり、動脈硬化症につながり得る反応を生
ずる。

〔課題を解決するための手段及び作用・効果〕極メて驚
くべきことに、細胞のＰＡＦ−アセッサー結合部位を抑
制する物質（ＰＡＦ−アセッサー拮抗剤）が、脈管内皮
細胞バリヤーの破損により生ずる疾患を治療するのに適
していることが見、い出された。

これらの物質は、産学性冠状収縮、動脈硬化症、動脈及
び静脈血栓症、及びアナフィラキシ−ショック及び内毒
素ショックなど、特に胃腸経路、脳及び心臓に関する血
管収縮、細菌性疾患、水腫、アレルギー（喘息を含む）
、炎症を治療及び予防するために特に適している。これ
らは、さらに、転移の形成傾向を低減するのに適してい
る。さらに、食物成分は脈管内皮細胞のＰＡＦ−アセッ
サー受容体に影響すると思われる。さらにまた、妊娠初
期において受精した卵子の卵管床を抑制（抗卵着床）す
る物質は脈管内皮細胞のＰＡＦ−アセッサー受容体に効
果を有することができる。

これに関してＰＡＦ−アセッサー結合部位を抑制する物
質は、親水性トリアゾロチエノ−ジアゼピン（ｔｒｉａ
ｚｏｌｏｔｈｉｅｎｏ−ｄｉａｚｅｐｉｎｅ）もしくは
その同族物質であり得る。さらに、ＣＶ３９８８などの
ギンクコリッド類（ｇｉｎｇｋｏｌｉｄｅｓ）及びＰＡ
Ｆ−アセッサー同族体が適していると証明された。トリ
アゾロチエノ−ジアゼピン類は、Ｂｒ。

Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃ、（１９８７）９０：１３９−１４
６頁に、ギンクコリッド類は「血液と導管（Ｂｌｏｏｄ
　　ａｎｄ　　Ｖｅｓｓｅｌ）Ｊ（１９８５）　、Ｎｏ
、１６　：　５５８−５７２頁に記載されている。親水
性トリアゾロチエノ−ジアゼピン化合物のうち、ＷＥＢ
２０８６及び２０９８は特に適している。ギンクコリッ
ド類のうち、ＢＮ５２０２０、ＢＮ５２０２１、及びＢ
Ｎ５２０２０とＢＮ５２０２１とＢＮ５２０２２の混合
物（以下、ＢＮ５２０６３という）は最良の結果を達成
する。ギンクコリッド類の合成誘導体もまた使用できる
。

その大きな有効性（効果）とは別に、ギングコリッド混
合物ＢＮ５２０６３は、ギンクコリッド類の処理過程に
おいて混合物として生じるので、個々の成分に分割する
必要がなく、比較的容易に製造できるので好ましい。

本発明によれば、ＰＡＦ−アセッサーによる及びＰＡＦ
アセッサーにより刺激された細胞による脈管内皮細胞バ
リヤーの侵入（穿孔）を防止するために、特にＷＥ８２
０８６及びＷＥＢ２０９８、ＣＶ３９８８及びＢＮ５２
０２０、ＢＮ５２０２１及びＢＮ５２０６３が用いられ
る。

ＣＶ３９８８の化学式はｒａｃ−３−（Ｎｎ−オクタデ
シルカルバモイル−オキシ）−２−メトキシプロピル　
２−チアゾリオエチルフォスフェートであり、ＷＥ８２
０８６の式は３−　（４−（２−クロロフェニル）−９
−メチル−６Ｈ−チェノ（３，２，−ｆ）（１，２゜４
）トリアゾロ−（４，３−ａ）−（１，４）ジアゼピン
−２イル）−１−（４−モルホリニル）−１−プロパノ
ン、ＷＥ８２０９８については３−　（４−（２−クロ
ロフェニル）−９−シクロプロピル−６Ｈ−チェノ（３
，２−ｆ）（１，２，４）　　トリアゾロ−（４，３−
ａ）（１，４）ジアゼピン−２イル−１−（４−モルホ
リニル）−１−プロパノン、ＢＮ５２０２０については
９Ｈ−１，７ａ−（エポキシメタノ）＝ＩＨ，６ａＨ−
シクロペンタ［Ｃ］ｌフロ２．３−ｂ］ｌフロー３’　
、２’　　：　３，４］シクロペンタ［１，２−ｄ］　
フラン−５，９゜１２−　（４Ｈ）−トリオン３−ｔｅ
ｒｔ−ブチルヘキサヒドロ−４，４ｂ−１１−トリヒド
ロキシ−８−メチル、ＢＮ５２０２１については９Ｈ−
１，７ａ−（エポキシメタノ）−ＬＨ。

６ａＨ−シクロペンタ［Ｃ］　フロ［２，３−ｂｌフロ
ー［３’　、２’　　：　３．４］　シクロペンタ［１
，２−ｄ］フラン−５，９，１２（４Ｈ）−トリオン３
−ｔｅｒｔ−ブチルヘキサヒドロ−４，７ｂ−ジヒドロ
キシ−８−メチル；またＢＮ５２０２２についての式は
９Ｈ−１，７ａ（エポキシメタノ）−１Ｈ，６ａＨ−シ
クロペンタ［Ｃ］ｌフロ３’　、２’　　：　３，４］
　シクロペンタ［１，２−ｄ］フラン−５，９，１２（
４Ｈ）−トリオン３−ｔｅｒｔ−ブチル−へキサヒドロ
−２，４，７ｂ、１１−テトラヒドロキシ−８−メチル
で表わされる。

今や見い出されたように、脈管内皮細胞はＰＡＦ−アセ
ッサーのための結合部位あるいは受容体を抑制する。こ
れらの受容体との相互作用により、脈管内皮細胞を攻撃
しあるいは破壊するＰＡＦ−アセッサー自体を含むヒス
タミン、プロスタグランジン類などの媒介４ガが形成さ
れる。

脈管内皮細胞の受容体と結合したＰＡＦ−アセッサーが
、媒介物を形成する好中球、好酸球などの細胞の粘着を
生じることもまた可能である。

それらの部分についての血小板、好中球及び好酸球は、
ＰＡＦ−アセッサーのための受容体を有する。おそらく
、脈管内皮細胞バリヤーの侵入に導き得るさらにメカニ
ズムがあり、これは、これらの細胞の受容体へのＰＡＦ
−アセッサーの結合が脈管内皮細胞へのそれらの粘着あ
るいは既に述べたような媒介物の生成を生ずることがで
き、これが次いで脈管内皮細胞を攻撃するということか
ら成る。

これを防ぐ（中和する）ために、本発明によれば、一方
では脈管内皮細胞へのＰＡＦ−アセッサーの結合を直接
抑制する物質及び他方では血小板、好中球及び好酸球な
どの他の細胞へのＰＡＦ−アセッサーの結合をブロック
する物質が用いられ、これによりこれらの媒介物が脈管
内皮細胞を間接的に攻撃することを防止する。

換言すれば、本発明によれば、ＰＦＡ−アセッサーが他
の細胞へ結合した場合の媒介物の形成のために、また同
様にこれらの媒介物により脈管内皮細胞の毀損のために
、脈管内皮細胞へのＰＡＦ−アセッサーの結合部位を抑
制する物質が用いられる。しかしながら、これらの細胞
へのＰＡＦ−アセヅサーの結合部位を抑制する化合物を
用いることもできる。

ＰＡＦ−アセッサーの結合部位を抑制する物質は、例え
ば注射により投与できるが、また経口的にも、経皮的に
も、また吸入によっても投与できる。

ＰＡＦ−アセッサー受容体に対するそれらの拮抗作用、
に関する物質の効果を迅速かつ簡単に試験するために、
すなわち例えばスクリーニング方法を用いてＰＡＦ−ア
セツサー受容体への有効な拮抗剤を見い出す（これは次
いで前記疾患の処置について考慮される）ために、本発
明によれば、最良の方法は以下のよ５に進められる：ａ）脈管内皮細胞を培養し、ｂ）脈管内皮細胞を洗滌し、Ｃ）所定量の脈管内皮細胞を、標識を付したＰＡＦ−ア
セッサー及び測定されるべき拮抗剤の所定量と混合し、ｄ）所定量の脈管内皮細胞を標識を付したＰＡＦ−アセ
ッサーの所定量と混合し、ｅ）脈管内皮細胞をＣ）及びｄ）の各場合の混合物から
分離し、ｆ）それぞれの場合について、脈管内皮細胞に結合され
た標識付きＰＡＦ−アセッサーの量を？ＴＩＩＩ定し、そして、ｇ）同数の脈管内皮細胞について、拮抗剤の存在下に上
記Ｃ）に従って脈管内皮細胞に結合された標識付きＰＡ
Ｆ−アセッサーの量と、拮抗剤の不存在下に上記ｄ）に
従って脈管内皮細胞に結合された標識付きＰＡＦ−アセ
ツサーの量との関係から、ＰＡＦ−アセッサー拮抗剤の
有効性を決定する。

本発明による上記工程ａ）における脈管内皮細胞の培養
は、好ましくは、血清特に子牛血清を含有する培地で行
なわれる。しかしながら、血清を含有しない培地を用い
ることもできる。

この関係において、好適な方法は、一般に培養器の床で
生長する培地において合流（ｃａｎｆｌｕｅｎｔ）脈管
内皮細胞を培養することである。

血清を除去するために、またそれと共にアセチルヒドロ
ラーゼなどＰＡＦ−アセッサーを破壊する酵素を除去す
るため、脈管内皮細胞は次いで本発明による方法の前記
工程ｂ）に従って洗滌される。この目的のために、緩衝
物質で処理された等張洗滌液が用いられ、これは内毒素
フリーの血清アルブミンを含む、ヒト血清アルブミン（
ＩＳＡ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの脱脂
血清アルブミンを含有することが好ましい。

次いで、本発明による前記工程Ｃ）及びｄ）に従って、
一方の標識付きＰＡＦ−アセッサー及び測定されるべき
拮抗剤を含む脈管内皮細胞と、他方の拮抗剤を含まない
標識付きＰＡＦ−アセッサーについて結合検査が行なわ
れる。標識付きＰＡＦ−アセッサーとしての使用につい
ては、トリチウム標識付きＰＡＦ−アセッサーなどの放
射性標識のＰＡＦ−アセッサーを選択することが好まし
い。

上記結合検査は、ホスホリパーゼもしくはアセチルヒド
ロラーゼなどの脈管内皮細胞に含まれる酵素によりＰＡ
Ｆ−アセッサーの破壊が生じないように、２０℃未満の
室温、好ましくは２〜６℃で行なうことが望ましい。好
適なインキュベーション期間は１０〜３０時間である。

リン脂質としてＰＡＦ−アセッサーは水に溶解しないの
で、前記工程Ｃ）及びｄ）による結合検査はエンドキシ
ンフリーの血清アルブミンを含むＨＳＡやＢＳＡなどの
脱脂血清アルブミンの存在下で行なうことがさらに好ま
しく、またそのプロセスにおいて、好適な方法はカルシ
ウム及びマグネシウムイオンを加えることである。

これに関する血清アルブミンの役割は、受容体にではな
く脈管内皮細胞に非特異的に結合された拮抗剤とＰＡＦ
−アセッサーを結合すること、あるいは換言すればそれ
を脈管内皮細胞から除去することにある。

前記工程ｅ）とｆ）との間に、合流脈管内皮細胞はそれ
らの基台（培養皿）から、またお互いから剥ｔ！ｉ（分
離）される。

この目的のために、受容体に特異的に結合されたＰＡＦ
−アセッサー又は拮抗剤の最大限可能な量を本質的に抑
制する脈管内皮細胞を得るために、幾つかの付加的工程
を行なうことが好ましい。このため、脈管内皮細胞はま
ず、好ましくは、等張液すなわち特に生理食塩水と混合
され、それによって、そのプロセスにおいて、カルシウ
ム及びマグネシウムイオン、及び非特異的に結合された
ＰＡＦ−アセッサーと拮抗剤が脈管内皮細胞から分離さ
れる。

好適な方法では、次いで第２の洗滌工程が行なわれ、こ
の工程において５℃以下好ましくは約０℃に冷却された
等張液が脈管内皮細胞に加えられる。この液体としては
ＥＤＴＡを含有するものが好ましい。その低温と、カル
シウムイオンを脈管内皮に結合するＥＤＴＡのために、
合流脈管内皮細胞が収縮し、それによって、そのプロセ
スにおいて、それらは培養器あるいは他の基台及び同様
にお互いから剥離され、すなわち脈管内皮細胞の合流層
が破壊される。同時に、洗滌液が低温であることにより
、非特異的に結合されたＰＡＦ−アセッサーと拮抗剤が
脈管内皮細胞からさらに容易に剥離されることになる。

このように処理された脈管内皮細胞を液体培地から分離
するためには、それらを濾過することが好ましい。これ
らは、上記剥離方法で脈管内皮細胞は損傷されないので
、非常に容易に濾過され、単独で破壊されるようにする
。同時に、濾過は、脈管内皮細胞から非特異的に結合さ
れた残りの標識付きＰＡＦ−アセッサーを分離するため
の比較的正確で、従って非常に有効な方法となる。

この後、脈管内皮細胞に（特異的に）結合された標識付
きＰＡＦ−アセッサーの量が決定される。放射能標識の
ＰＡＦ−アセッサーが用いられている場合には、フィル
ターに結合された脈管内皮細胞の放射能だけが？＃１定
される。脈管内皮細胞がそこにないフィルターに結合さ
れた放射能は、これらの値から差し引かれる。

前記工程（ｃ）に従って拮抗剤の量を種々変えることに
より得られる検量図を描くことにより、拮抗剤の有効性
を５０％抑制値として、すなわち所定量の脈管内皮細胞
に関して可逆ＰＡＦ−アセッサー結合の５０％抑制を達
成する拮抗剤の量として得ることが可能である。

本発明による方法は次のようなＰＡＦ−アセッサー受容
体拮抗剤、すなわち親水性トリアゾロチエノ−ジアゼピ
ン、ＷＥＢ２０８６及び２０９８、ギングコリッド類Ｂ
Ｎ５ゴ０２０、ＢＮ５２０２１及びＢＮ５２０２０とＢ
Ｎ５２０２１とＢＮ５２０２２との混合物を用いて、ま
たＣＶ３９８８を用いて連続的に試験された。

これらの受容体に抗して向けられるモノクローナル抗体
も本発明に係るＰＡＦ−アセツサー受容体拮抗剤として
考慮することができる。抗体もまた標識を付せられた形
態あるいは螢光形態で用いることができる。この場合、
工程Ｃ）およびｄ）による結合検査の前に、脈管内皮細
胞のプレーインキュベーションが過剰抗体を用いて行な
われる。工程Ｃ）及びｄ）による結合検査は、同様に放
射能標識付き又は螢光ＰＡＦ−アセッサー拮抗剤もしく
はその同族体を用いて行なうことができ、これらは次い
で標識の付されていないＰＡＦ−アセツサーによる結合
から置換される。同様にして、本発明による方法におい
ては、ＰＡＦ−アセツサーをＰＡＦ−アセッサー同族体
により置き換えることも、またＰＡＦ−アセッサー拮抗
剤をこのような拮抗剤の同族体により置き換えることも
可能であり、換言すれば、請求項４に記載の方法の工程
Ｃ）、ｄ）、ｆ）及びｇ）において、標識付き又は未標
識のＰＦＡ−アセツサー同族体、ＰＡＦ−アセッサー拮
抗剤又はこれらの拮抗剤の同族体により置き換えること
ができる。

本発明による方法は、このようなＰＡＦ−アセッサー用
受容体の拮抗剤を決定するためだけでなく、ＰＡＦ−ア
セッサー複合体、特にＦｅｄ、Ｐｒｏｃ、４６．１９８
７　（３）第１４６８頁に記載されており、”ＰＥＡＫ
　　Ｘ”と称されているＰＡＦ−アセッサーリボタンパ
ク質複合体を決定するためにも適している。

〔実　施　例〕

以下、実施例を示して本発明についてさらに詳細に説明
する。

■）脈管内皮細胞の産生ヒト脈管内皮細胞が請静脈から単離された（Ｊ、Ｃｌ１
ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、１９７３゜５２二２７４５−２７
５６）。詳しくは、カニユーレが屑に挿入され、０．１
％コラゲナーゼ溶液（米国、ＭＯ，セントルイス、シグ
マ社（ｓ　ｉ　ｇｍａ）製タイプＩ）で満たされた。３
７℃で１０分のインキュベーション期間後、剥離した細
胞が洗い出され、遠心分離により集めめられた。細胞は
、１０％の熱不活性化胎児ウシ血清（米国、ユタ州、ロ
ーガン、ハイクロン社（Ｈｙｃｌｏｎｅ）製ＦＣＳ）、
１％のウルトロサーエスエフ（ｕｌｔｒｏｓｅｒ　　５
Ｆ）（フランス国、ヴイレニューヴ・う・ガレヌ、アイ
・ビイ・エフ社（ＩＢＦ））及びヘパリン９０μｇ　／
　ｍｌを含有し、ペニシリン５０ユニツト／ｍｌ及びス
トレプトマイシン（Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８３．２２２：
６２３−６２５）５０μｇ　／　ｍｌが付加されたハム
ス−Ｆ　　１２（Ｈａｍｓ−Ｆ−１２）培地に再懸濁さ
れた。細胞は、２５ｃｄ培養フラスコ（米国、カリフォ
ルニア、ラブウェアー、オックスナード、プライマリア
、ファルコン社（Ｐｒｉｍａｒｉａ、Ｆａｌｃ。

ｎ））中で１時間インキュベートされた。未付着細胞は
次いで入念に洗い出され、そして付着している細胞は新
しい培地でさらに培養され、培地は２日毎に換えられた
。培養物が合流に達したとき（３〜５日）、細胞はトリ
プシンＥＤＴＡ（スコツトランド、ペイスリー、ギイブ
コ社（Ｇｉｂｃｏ））に手短かに曝すことにより採取さ
れ、に３乃至１：５の分割関係で３５闘培養皿（プライ
マリア、ファルコン社）中に置かれた。

次いで、細胞は、１５％ＦＣ３，１％ｕｌｔｒｏｓｅｒ
　　ＳＦ及びヘパリン９０　ｕ　ｇ　／　ｍｌを含有す
るＨａｍｓ−Ｆ−１２培地中で、培地を２日乃至３日毎
に変えながらさらに生長を続けさせられた。細胞は４〜
６日後に合流に達し、皿当り細胞数は５．２±０．１５
Ｘ１０’に達した。上記第一プロセスからの細胞は全調
査にわたって用いられた。培養物は、形態基準に基づき
、内皮細胞用の標準標識化物質であるヒト因子■抗原用
の特異抗血清（オランダ国、ティルブルク、ノルデイッ
ク・イミュノル社（Ｎ。

ｒｄｉｃ　　１ｍｍｕｎｏ＋、））を用いて間接螢光抗
体法によって脈管内皮細胞であることが決定された。内
皮細胞培養物は、形態基準に基づき、α２−マクログロ
ブリン用のモノクローナル抗体を用いて間接螢光抗体法
によりいかなる単球／マクロファージ含有細胞も含有し
ていなかった。

２）内皮細胞へのＰＡＦ−アセッサーの結合合流ヒト内
皮細胞、すなわち−緒に生長したものの、培地を０．２
５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有のタイロード緩
衝液（Ｔｙｒ。

ｄｅ’　　ｓ　　ｂｕｆｆｅｒ）で洗滌した。合流内皮
細胞に種々の時間間隔（３，５，１５，３０分）で次の
ものを加えた：タイロード緩衝液（ｐＨ７，４）９００
μ、１７ＳＢＳＡ　（シグマ社）０．２５％、１．３ｍ
Ｍ　　Ｃａ”　　５００μＭの未標識（標識の付けられ
ていない）ＰＡＦ−アセッサ−（１−０−オクタデシル
−２−アセチル−５ｎ−グリセリル−１−燐酸コリンエ
ステル）（スイス国、ブーデンドルフ、バラヘム社（Ｂ
ａｃｈｅｍ））を含有し及び含有しない１００μｇの３
Ｈ−Ｐ　Ａ　Ｆ−アセッサー（０゜０６５μＭ）（１−
０−３Ｈ−オクタデシル−２−アセチル−５ｎ−グリセ
リル−３−燐酸コリンエステル８０Ｃｉ／ｍＭ、英国、
パックス（Ｂｕｃｋｓ、）アマージャム社（ＡｍｅｒＳ
ｈａ　　ｍ））。

第２の試験においては、種々の濃度の３Ｈ−ＰＡＦ−ア
セッサ−（０，０３２５〜０．６５ｎＭ）が、前記した
未標識のＰＡＦ−アセッサー又はその鏡像異性体（３−
０−ヘキサデシル−２−アセチル−グリセリル−１−燐
酸コリンエステル）（５００μＭ）の存在下又は不存在
下に３０分間インキュベートされた。

さらにその後の試験においては、ＰＡＦ−アセッサー拮
抗剤ＢＮ５２０２１　（６０，１０゜６μＭ）（フラン
ス国し・プレセスロビンソン、ＩＨＢ−イブセン（ＩＨ
Ｂ−ＩＰＳＥＮ））、ＣＶ３９８８　（３０，１０，３
μＭ）（日本、大阪、武田薬品工業（株）製）又は媒体
（ジメチルスルホキシド又は等張ＮａＣ，７７溶液）が
、０．６５ｎＭの３Ｈ−Ｐ　Ａ　Ｆ−アセッサーと共に
合流脈管内皮細胞に加えられた。

３０分後、自由活性はＢＳＡ含有タイロード緩衝液（ｐ
Ｈ６，４）で２回、次いで冷等張Ｎａｃ１１溶液で１回
、合流脈管内皮細胞を洗滌することにより洗い流された
。細胞は冷等張ＥＤＴＡ　　Ｎａｃｆｌ溶液（５ｍ　Ｍ
　）を加えることにより分離され、その後、０〜４℃で
３０〜６０分間インキュベートされた。分離された細胞
はミリポア真空システム（ドイツ連邦共和国、モルシャ
イム社（Ｍｏｌｓｈｅｉｍ））での真空濾過により培地
から分離された。

インキューベーション緩衝液は、結合処理後の洗滌プロ
セスの間に細胞が損失するのを防ぐために、同様に濾過
された。フィルターは１０ｍ１の冷タイロード緩衝液で
２回洗滌され、そしてフィルターに結合した放射能がＰ
Ｃ３（アマージャム社）中で標準状態下で決定された。

脈管内皮細胞の不存在下にフィルターに結合した放射能
は、脈管的細胞の存在下での放射能から差し引かれた。

結合した放射能は５．２０±０゜１５Ｘ１０’脈管内皮
細胞に結合した１モル３Ｈ−ＰＡＦ−アセッサーで計算
された。ＰＡＦ−アセッサー拮抗剤の漸増する濃度で３
０分間のインキュベート後、細胞は冷ＥＤＴＡ　　Ｎａ
ＣΩ溶液によって遊離され、次いで真空濾過によって分
離された。’Ｈ−Ｐ　Ａ　Ｆ−アセッサー結合は５．２
±０．１５Ｘ１０’脈管内皮細胞に結合されたｆモルで
計算された。

次表に５．−２±０．１５Ｘ１０’合流脈管内皮細胞へ
の特異的３Ｈ−Ｐ　Ａ　Ｆ−アセッサー結合（ｆモル）
の結果を示す。

第１表ｆモルｆモル３μＭ　　　２．２８±１．４　６μＭ　　１．６　±
１．４ＩＯμＭ２．７０±１．９１０μＭ４．８　±３．５ると、５．２Ｘ１０５脈管内皮細胞へのＰＡＦ−アセッ
サー結合は２．２６±１．４ｆモルだけ衰え、また６μ
ＭのＢＮ５２０２１が加えられると１，６±１，４ｆモ
ルだけ衰える、などということがわかる。換言すれば、
Ｃｖ３９８８はＢＮ５２０２１よりもより効果的な拮抗
剤を構成する。

２０℃での３０分のインキュベーション期間に代えて、
４℃で２０時間インキュベートすることも可能である。

しかしながら、この場合には、拮抗剤にとって１５分間
予備インキュベートすることが好ましい。他のことの中
でも、これはリガンドの代謝を防止する。

３）ＢＮ５２０２１又はＣＶ３９８８に代えて、親水性
トリアゾロジェノ−ジアゼピンＷＥ８２０８６（１，１
０，１００，１０１０００ｎを用いた以外は、前記試験
２）に従って脈管内皮細胞へのＰＡＦ−アセッサー結合
が繰り返された。

結果を下記表−２に示す。

表−２すなわち、１ｎＭのＷＥ８２０８６が加えられると、５
．２Ｘ１０’脈管内皮細胞へのＰＡＦ−アセッサー結合
は、０．６６±０．２ｆモルだけ衰え、１１０００ｎが
加えられると３±０．７ｆモルだけ衰える。

出願人　ル　−　ス　　コ　ル　ス代理人　弁理士　米　原　正　章

Claims

【特許請求の範囲】

（１）脈管内皮細胞バリヤーの低下により生ずる疾患を
治療するためのＰＡＦ−アセッサー拮抗剤の用途。
（２）ＰＡＦ−アセッサー拮抗剤が親水性トリアゾロチ
エノ−ジアゼピンもしくはそれらの同族体、ギングコリ
ッドもしくは合成ギングコリッド誘導体、又はＣＶ３９
８８などのＰＡＦ−アセッサーの同族体であることを特
徴とする請求項１記載の用途。
（３）親水性トリアゾロチエノ−ジアゼピンがＷＥＢ２
０８６及びＷＥＢ２０９８であり、またギングコリッド
がＢＮ５２０２０、ＢＮ５２０２１又はＢＮ５２０２０
とＢＮ５２０２１とＢＮ５２０２２との混合物であるこ
とを特徴とする請求項２記載の用途。
（４）下記工程ａ）脈管内皮細胞を培養し、ｂ）脈管内皮細胞を洗滌し、ｃ）所定量の脈管内皮細胞を、標識を付したＰＡＦ−ア
セッサー及び測定されるべき拮抗剤の所定量と混合し、ｄ）所定量の脈管内皮細胞を標識を付したＰＡＦ−アセ
ッサーの所定量と混合し、ｅ）脈管内皮細胞をｃ）及びｄ）の各場合の混合物から
分離し、ｆ）それぞれの場合について、脈管内皮細胞に結合され
た標識付きＰＡＦ−アセッサーの量を測定し、そしてｇ）同数の脈管内皮細胞について、拮抗剤の存在下に上
記ｃ）に従って脈管内皮細胞に結合された標識付きＰＡ
Ｆ−アセッサーの量と、拮抗剤の不存在下に上記ｄ）に
従って脈管内皮細胞に結合された標識付きＰＡＦ−アセ
ッサーの量との関係から、ＰＡＦ−アセッサー拮抗剤の
有効性を決定する各工程からなることを特徴とするＰＡＦ−アセッサー拮
抗剤の有効性を決定する方法。
（５）前記工程ａ）において、工程ｅ）による脈管内皮
細胞の分離後に剥離される合流脈管内皮細胞が培養され
ることを特徴とする請求項４記載の方法。
（６）脈管内皮細胞が５℃以下に冷却された等張液に剥
離されることを特徴とする請求項５記載の方法。
（７）等張液がＥＤＴＡを含有することを特徴とする請
求項６記載の方法。
（８）血清アルブミンが、各場合について、工程ｃ）に
従って脈管内皮細胞、標識付きＰＡＦ−アセッサー及び
拮抗剤を含有する培地へ、及び工程ｄ）に従って脈管内
皮細胞及び標識付きＰＡＦ−アセッサーを含有する培地
へ加えられることを特徴とする請求項４乃至７のいずれ
かに記載の方法。
（９）脈管内皮細胞が工程ｂ）に従って洗滌されるとき
、これが血清アルブミンを含有する等張液で行なわれる
ことを特徴とする請求項４乃至８のいずれかに記載の方
法。
（１０）工程ｅ）に従っての分離が濾過によって行なわ
れることを特徴とする請求項４乃至９のいずれかに記載
の方法。