DE3735524C2 - Verfahren zur Bestimmung des paf-Acether- oder Peak X-Gehaltes von Blut - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung des paf-Acether- oder Peak X-Gehaltes von Blut

Info

Publication number
DE3735524C2
DE3735524C2 DE3735524A DE3735524A DE3735524C2 DE 3735524 C2 DE3735524 C2 DE 3735524C2 DE 3735524 A DE3735524 A DE 3735524A DE 3735524 A DE3735524 A DE 3735524A DE 3735524 C2 DE3735524 C2 DE 3735524C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
platelets
fixed
paf
acether
aggregation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE3735524A
Other languages
English (en)
Other versions
DE3735524A1 (de
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korth Ruth-Maria Drmed 80639 Muenchen De
Original Assignee
Korth Ruth-Maria Drmed 80639 Muenchen De
KORTH RUTH MARIA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korth Ruth-Maria Drmed 80639 Muenchen De, KORTH RUTH MARIA filed Critical Korth Ruth-Maria Drmed 80639 Muenchen De
Priority to DE3735524A priority Critical patent/DE3735524C2/de
Publication of DE3735524A1 publication Critical patent/DE3735524A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3735524C2 publication Critical patent/DE3735524C2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/50—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving creatine phosphokinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung des paf-Acether- oder Peak-X-Gehaltes im Blut.
Paf-Acether ist ein biologisch aktives Phospholipid und hat folgende chemische Struktur: 1-O-Alkyl-2-acetyl-sn-glyce­ ryl-3-phosphocholin. Er besitzt als Mediator starke inflam­ matorische und hypotensive Eigenschaften und induziert unter anderem die koronare Vasokonstriktion sowie die akute Ödembildung der Haut.
Aus Chemical Abstracts, Vol. 82, 1975, S. 247, 151752r ist ein quantitatives Bestimmungsverfahren für den von Rinderplättchen abstammenden Aggregationsfaktor (PAF) und den Willebrand Faktor (vWF) mittels Aggregieren von fixierten Thrombozyten (FWP) bekannt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem ein erhöhter paf-Acether-Gehalt bzw. Peak X-Gehalt im Blut schnell und einfach festgestellt werden kann und zwar ohne vorherige Trennung der Lipide durch aufwendige Extraktionsverfahren und ohne Trennung der Phospholipide durch Hochdruck- oder Dünnschichtchromatogra­ phien.
Dies wird erfindungsgemäß durch das im Anspruch 1 gekenn­ zeichnete Verfahren erreicht.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird also das Blut des Patienten auf einen erhöhten Gehalt an paf-Acether oder Peak X getestet, wobei vorzugsweise folgendermaßen vorge­ gangen wird:
Es wird venöses Blut entnommen, welches zentrifugiert wird, um ein thrombozyten- oder plättchenreiches Plasma (PRP) zu erhalten, dem dann ein Antikoagulans, wie ACD, also eine Mischung aus dem Natriumsalz der Zitronensäure und Dextrose in wäßriger Lösung, zugesetzt wird.
Die Thrombozyten werden anschließend fixiert, und zwar vorzugsweise durch Zugabe von Paraformaldehyd. Die fixier­ ten Thrombozyten werden sodann vorzugsweise mit einer isotonischen Kochsalzlösung gewaschen, um überschüssiges Fixierungsmittel zu entfernen. Die Zellen können durch Zentrifugation oder Sedimentation vom Fixierungsmittel gereinigt werden. Danach schließt sich eine Inkubation mit Ovalalbumin an, um an die Thrombozyten gebundenes Fixie­ rungsmittel zu entfernen. Ovalalbumin besitzt nämlich die Eigenschaft, paf-Acether nicht zu binden.
Um die so fixierten Thrombozyten über einen längeren Zeitraum aufbewahren zu können, werden sie vorzugsweise mit Natriumazid oder einer anderen bioziden Substanz behandelt. Die biozide Substanz wird vorzugsweise vor dem Aggrega­ tionstest entfernt, was beispielsweise durch Waschen mit einer isotonischen Kochsalzlösung erfolgt.
Die fixierten Zellen oder ein Teil davon wird mit etwa dem dreifachen Volumen frisch gewonnener, lebender aspirinier­ ter Thrombozyten (vorzugsweise Kaninchenthrombozyten) ver­ setzt, und zwar vorzugsweise nicht mehr als eine Minute vor dem Aggregationstest.
In Anwesenheit von Aspirin und Kreatinphosphat/Kreatin­ phosphokinase (CP/CPK) wird alsdann festgestellt, ob eine Aggregation auftritt.
Eine Spontanaggregation der frischen Thrombozyten kann durch Zugabe von Rezeptorantagonisten gehemmt und mit Hilfe unterschiedlicher Antagonistenkonzentrationen somit quanti­ tativ bestimmt werden.
CP/CPK hemmt dabei ADP als aggregationswirksame Substanz, während Aspirin als Cyclooxykinase-Blocker einen störenden Einfluß von Prostaglandinen auf den Aggregationsvorgang verhindert.
Wenn die fixierten Thrombozyten einen entsprechend hohen Gehalt an paf-Acether oder Peak X aufweisen, lagern sich die lebenden, frischen Kaninchenthrombozyten mit ihren intakten paf-Acether-Rezeptoren an den an die fixierten Thromboyzten gebundenen paf-Acether an, wodurch es zu einer Spontanaggregation kommt, wenn ein hinreichend hoher paf-Acether- oder Peak X-Gehalt der fixierten Thrombozyten, d. h. in der zu bestimmenden Blutprobe vorliegt.
Die Aggregation kann mit einem üblichen Laboraggregometer festgestellt werden. Es können die Aggregation frischer Thrombozyten mittels fixierter Thrombozyten aber noch durch weitere Verfahren bestimmt werden. Somit können die Spontanaggregate mikroskopisch gezählt werden (mit Hilfe gebräuchlicher Thrombozytenzählkammern). Weiterhin können Aggregate durch kleine Säulen abgefangen werden, was erlaubt, aus der Differenz der Zahl frischer Thrombozyten vor und nach Inkubation (unter Rühren) mit folgender Säulenpassage die Anzahl der Aggregate zu berechnen. Es ist ebenfalls möglich, die Säulen mit paf-Acether-Rezeptor­ haltigen Thrombozytenmembranen oder paf-Acether-Rezeptoran­ tagonisten (eventuell Passage auch mit frischen humanen unfixierten Thrombozyten im PRP) zu laden, um zu messen, ob und wieviel fixierte Thrombozyten durch die Säulenpassage verloren gehen. Dazu sollten entsprechende Einmalsäulen hergestellt werden, die als Schnelltest dienen können.
Die Spontanaggregation erfolgt also in Abwesenheit von Fibrinogen (keine Messung von Fibrinogen-Rezeptoren) und wird, wie festgestellt wurde, durch paf-Acether-Antagoni­ sten, wie dem hydrophilen Triazolothieno-diazepin WEB 2086 oder dem Ginkgolid BN 52021 Dosis abhängig gehemmt, d. h. es handelt sich in der Tat um eine Aggregation, die ausschließlich von paf-Acether oder Peak X induziert und von den fixierten Zellen ausgelöst wird, wobei die Mediatoren (paf-Acether und/oder Peak X) an paf-Acether-Re­ zeptoren der Thrombozyten gebunden und dort fixiert werden.
Die Aggregation frischer Thrombozyten mittels fixierter Thrombozyten und somit die Menge von paf-Acether oder Peak X kann dadurch quantitativ bestimmt werden, indem den frischen Thrombozyten vor Inkubation mit den fixierten Thrombozyten verschiedene Konzentrationen von paf-Acether- Rezeptorantagonisten zugesetzt werden (z. B. WEB 2086 oder BN 52021), um dann die Konzentrationen der Antagonisten zu vergleichen, die eine fünfzigprozentige Hemmung hervorru­ fen. Diese Spontanaggregation stellt daher ein einfaches Screening-Verfahren für die Bestimmung des paf-Acether- oder Peak X-Gehaltes im Blut dar. Die Zellen größerer klinischer Studien können in dieser Weise präpariert lange gelagert werden, um sie zu sammeln und mit Hilfe dieser einfachen erfindungsgemäßen Methode Risikogruppen zu iso­ lieren, die einen erhöhten Gehalt an paf-Acether oder Peak X auf ihren Zellen tragen, die dann mit paf-Acether-Anta­ gonisten behandelt werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dabei nicht nur zur Bestimmung des Gehaltes von paf-Acether als solchem geeignet, sondern auch für die Bestimmung von paf-Acether-Komplexen, insbesondere dem paf-Acether-Lipoprotein-Kom­ plex, der als "Peak X" bezeichnet und in "Fed. Proc. 46 (3), 1987, S.1468 (Abst)" näher beschrieben wird, da Peak X mit paf-Acether-Rezeptoren interagiert und somit mit ihnen fixiert werden kann.
Das nachstehende Beispiel dient der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Venöses Blut von Probanden wird der Kubitalvene in ACD (7:1) entnommen und zentrifugiert (100 × g; 15 Minuten), um ein thrombozytenreiches Plasma zu erhalten. Das ACD besteht dabei aus Zitronensäure (0,8%), Trinatriumcitrat (2,2%) und Glucose (2,45%).
Die Thrombozyten werden fixiert, indem sie in einem Plastikfläschchen mit 2%-iger wäßriger Paraformaldehyd-Lösung versetzt werden. Das Fläschchen wird etwa 24 Stunden bei 4°C oder Raumtemperatur stehengelassen.
Anschließend werden die Thrombozyten unter Zentrifugieren (3000 Umdrehungen/Minute; 10 Minuten) gewaschen, wobei der Inhalt jedes Zentrifugenglases mit 20 ml isotonischer Kochsalzlösung versetzt wird. Dieser Waschvorgang wird mehrmals durchgeführt. Der Rückstand wird dann in 15 ml isotonischer Kochsalzlösung aufgenommen und mit Natriumazid versetzt.
Vor dem Aggregationstest werden die fixierten Thrombozyten mehrmals mit isotonischer Kochsalzlösung gewaschen und mit 2% Ovalserumalbumin (OVA) inkubiert und erneut gewaschen. Unmittelbar vor dem Aggregationstest erfolgt nochmals eine Waschung der fixierten Thrombozyten mit isotonischer Kochsalzlösung.
Die Thrombozyten werden dann mit dem dreifachen Volumen an frischen, lebenden Kaninchen-Thrombozyten versetzt, es wird Aspegic (0,1 mM), d. h. Aspirin als Lysinsalz. sowie CP/CPK (0,7 mM / 13,9 U / ml-1) zugesetzt und das Gemisch sofort in ein Laboraggregometer gegeben, um die Spontanaggregation zu messen. Dabei werden die Kaninchentrombozyten wie beschrieben gewaschen und aggregiert (Benveniste et al., 1972, J. Exp.Med.136, 1356-1377).
Mit Hilfe der Thrombozytenfixierung können Bindungsstudien durchgeführt werden, um den Gehalt an freiem und nicht gebundenem paf-Acether zu messen oder den Status von paf-Acether-Rezeptoren von Thrombozyten Kranker (deren Thrombozyten fixiert gesammelt werden) im Rahmen klinischer Studien zu bestimmen.

Claims (11)

1. Verfahren zur Bestimmung des paf-Acether- oder Peak X-Gehaltes von Blut, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
  • a) aus der zu bestimmenden Blutprobe wird ein thrombozyten­ reiches Plasma hergestellt,
  • b) die Thrombozyten werden fixiert,
  • c) die fixierten Thrombozyten werden mit frischen Thrombo­ zyten vermischt, und
  • d) in Gegenwart von Kreatinphosphat, Kreatinphosphokinase und Aspirin wird die Aggregation der so vermischten Thrombozyten überprüft.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasma zur Anreicherung der Thrombozyten gemäß a) zentrifugiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Blutprobe mit einem Antikoagulans versetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Antikoagulanz ACD Verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fixierung der Thrombozyten gemäß b) mit Formaldehyd durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Thrombozyten nach der Fixierung gemäß b) gewaschen werden, um Fixierungsmittel zu entfernen.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Entfernung von Fixierungsmittelresten die gewasche­ nen Thrombozyten mit Ovalalbumin inkubiert werden.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die fixierten Thrombozyten mit Natriumazid konserviert und vorzugsweise vor der Aggregations-Prüfung gemäß d) gewaschen werden.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als frische Thrombozyten vorzugswei­ se Kaninchen-Thrombozyten verwendet werden.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis der fixierten Throm­ bozyten zu den frischen Thrombozyten höchstens 1 : 1, vorzugsweise etwa 1 : 3 (V/V) beim Schritt c) beträgt.
11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Vermischen der frischen und der fixierten Thrombozyten gemäß c) höchstens 3 Minuten, vorzugsweise höchstens 1 Minute vor der Aggregationsprüfung erfolgt.
DE3735524A 1986-10-21 1987-10-20 Verfahren zur Bestimmung des paf-Acether- oder Peak X-Gehaltes von Blut Expired - Fee Related DE3735524C2 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3735524A DE3735524C2 (de) 1986-10-21 1987-10-20 Verfahren zur Bestimmung des paf-Acether- oder Peak X-Gehaltes von Blut

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3635772 1986-10-21
DE3636307 1986-10-24
DE3735524A DE3735524C2 (de) 1986-10-21 1987-10-20 Verfahren zur Bestimmung des paf-Acether- oder Peak X-Gehaltes von Blut

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3735524A1 DE3735524A1 (de) 1988-04-28
DE3735524C2 true DE3735524C2 (de) 1996-07-11

Family

ID=25848646

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3735524A Expired - Fee Related DE3735524C2 (de) 1986-10-21 1987-10-20 Verfahren zur Bestimmung des paf-Acether- oder Peak X-Gehaltes von Blut

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE3735524C2 (de)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5895785A (en) * 1987-10-20 1999-04-20 Ruth Korth Treatment and prevention of disorders mediated by LA-paf or endothelial cells
EP0540767B9 (de) * 1991-11-04 2004-12-22 Korth, Ruth-Maria, Dr. med Behandlung und Vorbeugung von erhöhten Lyso-PAF-Spiegel mediierten mentalen Erkrankungen mit PAF-Antagonisten
EP0459432B1 (de) * 1990-06-01 2000-08-23 Korth, Ruth, Dr. med. Behandlung von Erkrankungen mit Paf-Antagonisten und Verfahren zur Bestimmung deren Wirksamkeit

Also Published As

Publication number Publication date
DE3735524A1 (de) 1988-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2936307C2 (de)
DE3445010A1 (de) Kontroll- bzw. eichserum fuer die lipid-diagnostik
EP1850135B1 (de) Verfahren zur Bestimmung der Thrombozytenfunktion und der Flussbedingungen
DE2705897A1 (de) Mehrkomponenten-reagens zur bestimmung von cyclischem adenosin-3',5'- monophosphat und/oder cyclischem guanosin- 3',5'-monophosphat und seine verwendung
EP0826966B1 (de) Methode zur Stabilisierung von Plättchen
DE1189763B (de) Reagens zur Kontrolle der Gerinnungsfaehigkeit des Blutes waehrend einer Antikoagulantien-Therapie und Verfahren zur Herstellung des Reagens
EP0021152A1 (de) Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Basalmembranmaterial, hierfür geeignete Basalmembranfragmente und Verfahren zu deren Herstellung, bzw. Gewinnung
DE2602997C2 (de) Lyophilisierte Kollagenzubereitung und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE2944792A1 (de) Mucopolysaccharidfraktion, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel
DE60201525T2 (de) Verfahren zur herstellung eines an wirkstoffen hochangereicherten extraktes der blätter von ginkgo biloba
DD284087A5 (de) Verfahren zur bestimmung der ionenstaerke oder des spezifischen gewichts von waessrigen fluessigkeiten
CH635199A5 (de) Verfahren zum nachweis und zur bestimmung des lipoproteins lp-x im serum.
DE3735524C2 (de) Verfahren zur Bestimmung des paf-Acether- oder Peak X-Gehaltes von Blut
DE2536713A1 (de) Verfahren zur bestimmung von vitamin-b-12 mit radioisotopen
EP0185335B1 (de) Verfahren zum Nachweis des Vorliegens einer Allergie und zum spezifischen Nachweis des für die Allergie verantwortlichen Allergens
EP1134584A1 (de) Induzierte Aggregation und Agglutination von Plättchen
EP0433927A2 (de) Mittel zur Verbesserung der Wiederfindung von Annexinen
DE3424640A1 (de) Verfahren zur gewinnung und/oder bestimmung von humanspezifischem interferon im blut
Linder et al. Random distribution of exogenous lithium in nasal secretion and its application in substance determination
DE19963420A1 (de) Gewinnung von biologischen Komponenten aus Körperflüssigkeiten
EP0005243A2 (de) Kontrollplasma, dessen Herstellung, dessen Verwendung zur Ueberwachung der oralen Antikoagulantientherapie sowie Reagenziengarnitur enthaltend dieses Kontrollplasma
EP0826965A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Faktor V-Mangelplasma und ein so erhaltenes Mangelplasma
DE3014076A1 (de) Neue heparin-fraktionen mit erhoehter antikoagulans-wirkung
Reimers et al. Blutgerinnung, insbesondere Thrombocytenumsatz, bei Hyperlipoproteinämien
DE2539219A1 (de) Radioimmunologisches untersuchungsverfahren zur in-vitro-bestimmung der renin-aktivitaet und besteck zur durchfuehrung dieses verfahrens

Legal Events

Date Code Title Description
8110 Request for examination paragraph 44
8128 New person/name/address of the agent

Representative=s name: VOSSIUS & PARTNER, 81675 MUENCHEN

8127 New person/name/address of the applicant

Owner name: KORTH, RUTH-MARIA, DR.MED., 80639 MUENCHEN, DE

D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee