DE3735524A1 - Verfahren zur bestimmung des paf-acether-gehaltes im blut - Google Patents

Verfahren zur bestimmung des paf-acether-gehaltes im blut

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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung des paf-Acether-Gehaltes im Blut.
Paf-Acether ist ein biologisch aktives Phospholipid und hat folgende chemische Struktur: 1-O-Alkyl-2-acetyl-sn-glyce­ ryl-3-phosphocholin. Er besitzt als Mediator starke inflam­ matorische und hypotensive Eigenschaften und induziert unter anderem die koronare Vasokonstriktion sowie die akute Ödembildung der Haut.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem ein erhöhter paf-Acether-Gehalt bzw. Peak X-Gehalt im Blut schnell und einfach festgestellt werden kann und zwar ohne vorherige Trennung der Lipide durch aufwendige Extraktionsverfahren und ohne Trennung der Phospholipide durch Hochdruck- oder Dünnschichtchromatogra­ phien.
Dies wird erfindungsgemäß durch das im Anspruch 1 gekenn­ zeichnete Verfahren erreicht.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird also das Blut des Patienten auf einen erhöhten Gehalt an paf-Acether oder Peak X getestet, wobei vorzugsweise folgendermaßen vorge­ gangen wird:
Es wird venöses Blut entnommen, welches zentrifugiert wird, um ein thrombozyten- oder plättchenreiches Plasma (PRP) zu erhalten, dem dann ein Antikoagulans, wie ACD, also eine Mischung aus dem Natriumsalz der Zitronensäure und Dextrose in wäßriger Lösung, zugesetzt wird.
Die Thrombozyten werden anschließend fixiert, und zwar vorzugsweise durch Zugabe von Paraformaldehyd. Die fixier­ ten Thrombozyten werden sodann vorzugsweise mit einer isotonischen Kochsalzlösung gewaschen, um überschüssiges Fixierungsmittel zu entfernen. Die Zellen können durch Zentrifugation oder Sedimentation vom Fixierungsmittel gereinigt werden. Danach schließt sich eine Inkubation mit Ovalalbumin an, um an die Thrombozyten gebundenes Fixie­ rungsmittel zu entfernen. Ovalalbumin besitzt nämlich die Eigenschaft, paf-Acether nicht zu binden.
Um die so fixierten Thombozyten über einen längeren Zeitraum aufbewahren zu können, werden sie vorzugsweise mit Natriumazid oder einer anderen bioziden Substanz behandelt. Die biozide Substanz wird vorzugsweise vor dem Aggrega­ tionstest entfernt, was beispielsweise durch Waschen mit einer isotonischen Kochsalzlösung erfolgt.
Die fixierten Zellen oder ein Teil davon wird mit etwa dem dreifachen Volumen frisch gewonnener, lebender aspirinier­ ter Thrombozyten (vorzugsweise Kaninchenthrombozyten) ver­ setzt, und zwar vorzugsweise nicht mehr als eine Minute vor dem Aggregationstest.
In Anwesenheit von Aspirin und Kreatinphosphat/Kreatin­ phosphokinase (CP/CPK) wird alsdann festgestellt, ob eine Aggregation auftritt.
Eine Spontanaggregation der frischen Thrombozyten kann durch Zugabe von Rezeptorantagonisten gehemmt und mit Hilfe unterschiedlicher Antagonistenkonzentrationen somit quanti­ tativ bestimmt werden.
CP/CPK hemmt dabei ADP als aggregationswirksame Substanz, während Aspirin als Cyclooxykinase-Blocker einen störenden Einfluß von Prostaglandinen auf den Aggregationsvorgang verhindert.
Wenn die fixierten Thrombozyten einen entsprechend hohen Gehalt an paf-Acether oder Peak X aufweisen, lagern sich die lebenden, frischen Kaninchenthrombozyten mit ihren intakten paf-Acether-Rezeptoren an den an die fixierten Thrombozyten gebundenen paf-Acether an, wodurch es zu einer Spontanaggregation kommt, wenn ein hinreichend hoher paf-Acether- oder Peak X-Gehalt der fixierten Thrombozyten, d. h. in der zu bestimmenden Blutprobe vorliegt.
Die Aggregation kann mit einem üblichen Laboraggregometer festgestellt werden. Es können die Aggregation frischer Thrombozyten mittels fixierter Thrombozyten aber noch durch weitere Verfahren bestimmt werden. Somit können die Spontanaggregate mikroskopisch gezählt werden (mit Hilfe gebräuchlicher Thrombozytenzählkammern). Weiterhin können Aggregate durch kleine Säulen abgefangen werden, was erlaubt, aus der Differenz der Zahl frischer Thrombozyten vor und nach Inkubation (unter Rühren) mit folgender Säulenpassage die Anzahl der Aggregate zu berechnen. Es ist ebenfalls möglich, die Säulen mit paf-Acether-Rezeptor­ haltigen Thrombozytenmembranen oder paf-Acether-Rezeptoran­ tagonisten (eventuell Passage auch mit frischen humanen unfixierten Thrombozyten im PRP) zu laden, um zu messen, ob und wieviel fixierte Thrombozyten durch die Säulenpassage verloren gehen. Dazu sollten entsprechende Einmalsäulen hergestellt werden, die als Schnelltest dienen können.
Die Spontanaggregation erfolgt also in Abwesenheit von Fibrinogen (keine Messung von Fibrinogen-Rezeptoren) und wird, wie festgestellt wurde, durch paf-Acether-Antagoni­ sten, wie dem hydrophilen Triazolothieno-diazepin WEB 2086 oder dem Ginkgolid BN 52021 Dosis abhängig gehemmt, d. h. es handelt sich in der Tat um eine Aggregation, die ausschließlich von paf-Acether oder Peak X induziert und von den fixierten Zellen ausgelöst wird, wobei die Mediatoren (paf-Acether und/oder Peak X) an paf-Acether-Re­ zeptoren der Thrombozyten gebunden und dort fixiert werden.
Die Aggregation frischer Thrombozyten mittels fixierter Thrombozyten und somit die Menge von paf-Acether oder Peak X kann dadurch quantitativ bestimmt werden, indem den frischen Thrombozyten vor Inkubation mit den fixierten Thrombozyten verschiedene Konzentrationen von paf-Acether- Rezeptorantagonisten zugesetzt werden (z. B. WEB 2086 oder BN 52021), um dann die Konzentrationen der Antagonisten zu vergleichen, die eine fünfzigprozentige Hemmung hervorru­ fen. Diese Spontanaggregation stellt daher ein einfaches Screening-Verfahren für die Bestimmung des paf-Acether- oder Peak X-Gehaltes im Blut dar. Die Zellen größerer klinischer Studien können in dieser Weise präpariert lange gelagert werden, um sie zu sammeln und mit Hilfe dieser einfachen erfindungsgemäßen Methode Risikogruppen zu iso­ lieren, die einen erhöhten Gehalt an paf-Acether oder Peak X auf ihren Zellen tragen, die dann mit paf-Acether-Anta­ gonisten behandelt werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dabei nicht nur zur Bestimmung des Gehaltes von paf-Acether als solchem geeignet, sondern auch für die Bestimmung von paf-Acether Komplexen, insbesondere dem paf-Acether-Lipoprotein-Kom­ plex, der als "Peak X" bezeichnet und in "Fed. Proc. 46 (3), 1987, S. 1468 (Abst)" näher beschrieben wird, da Peak X mit paf-Acether-Rezeptoren interagiert und somit mit ihnen fixiert werden kann.
Das nachstehende Beispiel dient der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Venöses Blut von Probanden wird der Kubitalvene in ACD (7 : 1) entnommen und zentrifugiert (100 × g; 15 Minuten), um ein thrombozytenreiches Plasma zu erhalten. Das ACD besteht dabei aus Zitronensäure (0,8%), Trinatriumcitrat (2,2%) und Glucose (2,45%).
Die Thrombozyten werden fixiert, indem sie in einem Plastikfläschchen mit 2%iger wäßriger Paraformaldehyd- Lösung versetzt werden. Das Fläschen wird etwa 24 Stunden bei 4°C oder Raumtemperatur stehengelassen.
Anschließend werden die Thrombozyten unter Zentrifugieren (3000 Umdrehungen/Minute; 10 Minuten) gewaschen, wobei der Inhalt jedes Zentrifugenglases mit 20 ml isotonischer Kochsalzlösung versetzt wird. Dieser Waschvorgang wird mehrmals durchgeführt. Der Rückstand wird dann in 15 ml isotonischer Kochsalzlösung aufgenommen und mit Natriumazid versetzt.
Vor dem Aggregationstest werden die fixierten Thrombozyten mehrmals mit isotonischer Kochsalzlösung gewaschen und mit 2% Ovalserumalbumin (OVA) inkubiert und erneut gewaschen. Unmittelbar vor dem Aggregationstest erfolgt nochmals eine Waschung der fixierten Thrombozyten mit isotonischer Kochsalzlösung.
Die Thrombozyten werden dann mit dem dreifachen Volumen an frischen, lebenden Kaninchen-Thrombozyten versetzt, es wird Aspegic (0,1 mM), d. h. Aspirin als Lysinsalz, sowie CP/CPK (0,7 mM/13,9 U/ml-1) zugesetzt und das Gemisch sofort in ein Laboraggregometer gegeben, um die Spontanaggregation zu messen. Dabei werden die Kaninchenthrombozyten wie beschrieben gewaschen und aggregiert (Benveniste et. al., 1972, J. Exp. Med. 136, 1356-1377).
Mit Hilfe der Thrombozytenfixierung können Bindungsstudien durchgeführt werden, um den Gehalt an freiem und nicht gebundenem paf-Acether zu messen oder den Status von paf-Acether-Rezeptoren von Thrombozyten Kranker (deren Thrombozyten fixiert gesammelt werden) im Rahmen klinischer Studien zu bestimmen.

Claims (11)

1. Verfahren zur Bestimmung des paf-Acether-Gehaltes im Blut, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
  • a) aus der zu bestimmenden Blutprobe wird ein thrombozyten­ reiches Plasma hergestellt,
  • b) die Thrombozyten werden fixiert,
  • c) die fixierten Thrombozyten werden mit frischen Thrombo­ zyten vermischt, und
  • d) in Gegenwart von Kreatinphosphat, Kreatinphosphokinase und Aspirin wird die Aggregation der so vermischten Thrombozyten überprüft.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasma zur Anreicherung der Thrombozyten gemäß a) zentrifugiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, daß die zu bestimmende Blutprobe mit einem Antikoagulans versetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Antikoagulanz ACD verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fixierung der Thrombozyten gemäß b) mit Formaldehyd durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Thrombozyten nach der Fixierung gemäß b) gewaschen werden, um Fixierungsmittel zu entfernen.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Entfernung von Fixierungsmittelresten die gewasche­ nen Thrombozyten mit Ovalalbumin inkubiert werden.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die fixierten Thrombozyten mit Natriumazid konserviert und vorzugsweise vor der Aggre­ gations-Prüfung gemäß d) gewaschen werden.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als frische Thrombozyten vorzugswei­ se Kaninchen-Thrombozyten verwendet werden.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis der fixierten Throm­ bozyten zu den frischen Thrombozyten höchstens 1 : 1, vorzugsweise etwa 1 : 3 (V/V) beim Schritt c) beträgt.
11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Vermischen der frischen und der fixierten Thrombozyten gemäß c) höchstens 3 Minuten, vorzugsweise höchstens 1 Minute vor der Aggregationsprüfung erfolgt.
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Chemical Abstracts, Vol. 82, 1975, 151752r *

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