DE3878296T2

DE3878296T2 - Rekombinante menschliche glutathionperoxidase, verfahren zur herstellung des enzyms und dafuer kodierende dna.

Info

Publication number: DE3878296T2
Application number: DE19883878296
Authority: DE
Inventors: Koichi Ishida; Yoshikazu Sukenaga; Kenkichi Takagi; Teruyo Takeda
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1987-04-25
Filing date: 1988-04-21
Publication date: 1993-05-27
Anticipated expiration: 2008-04-22
Also published as: EP0288901A2; JPS63267273A; DE3878296D1; EP0288901B1; JPH0817699B2; EP0288901A3

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine DNA, die für die rekombinante Human-Glutathionperoidase codiert, ein Plasmid, enthaltend die genannte DNA und ein Verfahren zur Herstellung der genannten Peroxidase.
Kürzlich wurde vermutet, daß eine Erhöhung der Lipid- Peroxide der Grund für verschiedene Krankheiten ist, wie hepatitische Erkrankungen, Myocardinfarzierung, Entzündungen, Skabies, Strahlengefahr, Arteriosklerose, cerebrale Apoplexie, Diabetis oder Krebs. Die Anwendung von Glutathionperoxidase für medizinische Zwecke hat sich daher mehr und mehr ausgeweitet. Zum Beispiel wird dieses Polypeptid bei der Analyse von Lipid-Peroxiden oder bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten angewandt, hervorgerufen durch Peroxide wie Wasserstoffperoxid bei Lipid-Peroxiden, hervorgerufen durch aktiven Sauerstoff.
Glutathionperoxidase wurde von G. C. Mills zuerst in Rinder-Erythrocyten (J. Biol. Chem., 229, 189 (1957)) gefunden. Ein nachfolgender Bericht beschreibt, daß es in anderen Organen wie in der Leber (Arch. Biochem. Biophys., 86, 1 (1960)) gefunden wurde. Weiterhin wurde über eine Gesamt-Aminosäuresequenz dieses Polypeptids berichtet und eine DNA-Basensequenz, die für diese bei Mäusen codiert (The EMBO Journal, 5 (6), 1221 - 1227 (1986)); eine Gesamt-Aminosäuresequenz davon bei Rindern (Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem., 365, 195 - 212 (1984)); und eine Teil-Aminosäuresequenz davon bei Ratten (Biochem. Biophys. Acts, 709, 304 - 309 (1982)). Es ist bekannt, daß Glutathionperoxidase in fast allen menschlichen Organen auftritt, einschließlich der Niere, der Lunge, des Gehirns, des Herzens und der Hauptarterie. Es wurde weiterhin berichtet, daß dieses von einem Human-Erythrocyten genommene Polypeptid ein Tetrameres ist mit einem Molekulargewicht von 95000 (J. Biol. Chem., 250, 5144 (1975)). Allerdings ist weder die Aminosäuresequenz dieses Polypeptids noch die DNA-Basensequenz, die dafür codiert, bisher veröffentlicht worden.
Es ist daher erforderlich, ein Verfahren zur leichten Herstellung von vom Menschen herrührender Glutathionperoxidase in großem Maßstab vom Standpunkt von zum Beispiel der Antigenität zu entwickeln.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA mit der Basensequenz gemäß Fig. 1, die für die Aminosäuresequenz von rekombinanter Human-Glutathionperoxidase codiert, die nachfolgend abgekürzt wird mit rekombinanter hGSH.Px, ein diese DNA enthaltendes Plasmid und ein Verfahren zur Herstellung der rekombinanten hGSH.Px, das das Manifestieren der DNA in einem rekombinanten Wirt umfaßt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz der rekombinanten hGSH.Px und die Basensequenz einer dafür codierenden DNA.
Fig. 2 zeigt die gesamte Basensequenz der cDNA von hGSH.Px.
Fig. 3 ist eine Restriktionsmappe der pHGP 7.
Fig. 4 ist eine Restriktionsmappe von pSPHGP 7.
Fig. 5 zeigt ein Verfahren zur Herstellung von ptacHGP 7 und eine Restriktionsmappe davon.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Der Begriff "Human-Glutathionperoxidase", der mit hGSH.Px nachfolgend abgekürzt wird, bedeutet, so wie er hier verwendet wird, ein Protein, das im menschlichen Körper produziert wird und ein Peroxid zersetzt, wie Wasserstoffperoxid oder ein Lipid-Peroxid wenigstens in vivo nach beispielsweise der folgenden Reaktion:
2GSH + ROOH > GSSG + ROH + H&sub2;O
Der Begriff "rekombinanter hGSH.Px", wie er hier verwendet wird, schließt nicht nur ein Polypeptid ein, das in einem mikrobiellen Inkubationssystem oder einem Zellinkubationssystem produziert wird und die Aminosäuresequenz von hGSH.Px aufweist, wie sie in Figur 1 gezeigt ist, sondern auch ein dasselbe umfassendes Polypeptid.
Ein Polypeptid mit der oben genannten Aminosäuresequenz von hGSH.Px ist eines, das ein anderes Polypeptid enthält, das an das N- oder C-Terminal des hGSH.Px Polypeptid gebunden ist und eine Aktivität zeigt, die vergleichbar ist mit der des hGSH.Px-Polypeptids.
Die vorliegende Erfindung schließt nicht nur die DNA von Figur 1 ein, die für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von hGSH.Px hat oder einen Vektor, worin die genannte DNA einbezogen ist, und einem Wirt, der mit dem genannten Vektor transformiert wird, sondern auch ein beliebiges Polypeptid, das hoch homolog mit dem hGSH.Px-Polypeptid von Figur 1 ist. Daher schließt die vorliegende Erfindung zum Beispiel ein hGSH.Px-DNA-Derivat von Figur 1 ein, erhalten durch partielle Modifikation des Gencodes sowie ein daraus erhaltenes Polypeptid. Der Begriff "hGSH.Px-DNA-Derivat erhalten durch partielle Modifikation" bedeutet ein Derivat, worin ein Teil der Basensequenz von hGSH.Px-DNA von Fig. 1 entfernt ist oder ein anderes DNA-Fragment an die hGSH.Px-DNA gebunden ist.
Es werden die folgenden Abkürzungen nachstehend verwendet:
DNA: Desoxyribonucleinsäure
A: Adenin
I: Inosin
T: Thymin
G: Guanin
C: Cytosin
RNA: Ribonucleinsäure
dATP: Desoxyadenosintriphosphat
dGTP: Desoxyguanosintriphosphat
dCTP: Desoxycytidintriphosphat
TTP: Thymidintriphosphat
ATP: Adenosintriphosphat
GTP: Guanosintriphosphat
CTP: Cytidintriphosphat
UTP: Uridintriphosphat
Gly: Glycin
Ala: Alanin
Vrl: Valin
Leu: Leucin
Ile: Isoleucin
Ser: Serin
Thr: Threonin
Cys: Cystein
Sec: Selenocystein
Glu: Glutaminsäure
Asp: Aspartinsäure
Lys: Lysin
Arg: Arginin
His: Histidin
Phe: Phenylalanin
Tip: Tryptophan
Pro: Prolin
Asn: Asparagin
Gln: Glutamin
Tris: Trishydrochlorid
Kbp: Kilobasenpaar
bp: Basenpaar
in vitro: außerhalb eines lebenden Organismus
in vivo: innerhalb eines lebenden Organismus
cDNA: komplementäre DNA
AmpR: Ampicillin-resistentes Gen
Amp: Ampicillin
GSH: reduziertes Glutathion
ROOH: Peroxid
GSSG: oxidiertes Glutathion
Tyr: Tyrosin
ROH: Hydroxid und
Met: Methionin
Figur 1 zeigt die Aminosäuresequenz der rekombinanten hGSH.Px der vorliegenden Erfindung und der Basensequenz einer DNA die für dieselbe codiert. Diese rekombinante hGSH.Px kann erhalten werden durch Manifestieren einer DNA, erhalten aus der menschlichen Leber-mRNA.
Auf der Basis des Auffindens der Aminosäuresequenz des hGSH.Px-Polypeptids und der DNA-Basensequenz, wie sie durch die vorliegende Erfindung klargestellt wurde, kann eine DNA, die für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von hGSH.Px codiert, wie in Figur 1 gezeigt, oder eine partiell modifizierte Variante von hGSH.Px erhalten werden durch konventionelle Gen-Rekombinationstechniken. Weiterhin kann eine rekombinante hGSH.Px-Aktivität leicht durch Verwendung derselben produziert werden. Es ist weiterhin möglich, eine Totalsynthese einer DNA durchzuführen, die die Basensequenz von Figur 1 hat die für die Aminosäuresequenz des hGSH.Px-Polypeptids codiert, das darauf basiert. Die vorliegende Erfindung bezieht alle diese oben beschriebenen Gegenstände ein.
Eine DNA mit der Basensequenz der vorliegenden Erfindung, die für die Aminosäuresequenz der rekombinanten hGSH.Px codiert, kann zum Beispiel durch das folgende Verfahren hergestellt werden.

(1) Herstellung einer Sonde für die Bestimmung der klonierten DNA, die für hGSH.Px codiert

Eine einzelsträngige DNA mit einer entsprechenden Länge, die mit der DNA-Sequenz einer entsprechenden Stelle der Maus-Glutathionperoxidase (Maus GSH.Px) korrespondiert, wie durch I. Chambers et al. (The EMBO Journal, 5 (6), 1221 - 1227 (1986)) berichtet, wurde chemisch synthetisiert, und das 5'-Terminal davon wurde mit ³²P markiert, wodurch sich eine Sonde zur Klonierung von hGSH.Px cDNA ergab, wie nachfolgend beschrieben.

(2) Herstellung einer Human-Leber mRNA

Die gesamten in dem menschlichen Lebergewebe enthaltenen RNAs wurden mittels eines üblichen Verfahrens wie der Guanidinthiocyanatmethode (Biochem., 18, 5294 - 5299 (1979)) extrahiert und in üblicher Weise behandelt unter Verwendung von beispeilsweise einer Oligo (dT)cellulose-Säule, um dadurch eine Poly(A) mRNA-Fraktion abzutrennen.

(3) Herstellung einer Human-Leber cDNA-Bibliothek

Unter Verwendung der mRNA, die in Stufe (2) erhalten wurde, als ein Templat, wurde ein Plasmid, worin cDNA eingeschlossen ist, nach beispielsweise dem Verfahren von Okayama-Berg (Mol. Cell. Biol. 2, 161 - 170 (1982)) hergestellt. Alternativ dazu kann die mRNA in eine einzelsträngige cDNA umgewandelt werden durch Einsatz der reversen Transkriptase in üblicher Weise. Anschließend kann die erhaltene einzelsträngige cDNA in eine doppelsträngige DNA umgewandelt werden, die dann in ein Plasmid einbezogen wird. Das auf diese Weise erhaltene rekombinante Plasmid wird anschließend in einen Wirt eingeschleust, wie dem Stamm E. coli X 1776, nach beispielsweise der Methode, wie sie durch Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harber Laboratory, 254 - 255 (1982)) berichtet wurde, um dadurch den Wirt zu transformieren. Durch Selektieren der Ampicillin-resistenten Stämme wurde eine cDNA-Bibliothek erhalten.

(4) Klonieren von hGSH.Px cDNA

Mit einem Maus GSH.Px DNA-Fragment zu hybridisierende Klone wurden gescreent, indem die in Stufe (3) erhaltene cDNA-Bibliothek einem Koloniehybridisierungstest unterworfen wurde durch Verwendung des einzelsträngigen DNA-Fragmentes, das die Maus GSH.Px codiert, erhalten in Stufe (1) als Sonde.
Die Basissequenz der auf diese Weise erhaltenen klonierten DNAs wurde nach beispielsweise der M13 Didesoxy-Methode (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 - 5467 (1977)) analysiert. Diese Basensequenzen, die homolog mit der von Maus GSH.Px sind, die bereits aufgeklärt worden sind, wurden bestimmt, und eine cDNA mit einer Basensequenz, die mit der gesamten Translationsregion korrespondiert, wurde schließlich ausgewählt, wodurch sich eine klonierte DNA ergab mit einer Basensequenz, die für das hGSH.Px Polypeptid codiert.
Das hGSH.Px Polypeptid kann erhalten werden durch Ausschneiden der Region, die für hGSH.Px der klonierten DNA der vorliegenden Erfindung codiert, Einbringen der geschnittenen Region in einen Gen-Expressionsvektor mit einem entsprechenden Promoter, Einbringen des genannten Vektors in einen Wirt wie E. coli C 600 und Reinigen des angestrebten Proteins mit Hilfe der hGSH.Px-Aktivität.
Zu Beispielen für den genannten Promoter gehören der lac Promoter, der trp Promoter, der tac Promoter, der PL Promoter und der SV 40 Primärpromoter. Als Vektor kann ein beliebiger eingesetzt werden, der in der Lage ist in einem zu transformierenden Wirt, zu wachsen. Zum Beispiel sind ein Plasmid wie pBR322, ein Phage wie der λ-Phage oder ein Virus wie SV40 verwendbar. Einer dieser Vektoren kann auch allein angewandt werden. Alternativ dazu kann eine Kombination davon, zum Beispiel das pBR322-SV 40-Hybridplasmid verwendet werden. Der Vektor, worin die klonierte DNA eingebracht wird, wird in einen Wirt eingeschleust, um dadurch denselben zu transformieren. Somit kann ein Gen-Expressionswirt erhalten werden. Als zu transformierender Wirt kann ein Mikroorganismus wie E. coli, Bacillus subtilis, eine Hefe oder eine tierische oder pflanzliche Kulturzelle wie die cos-Zelle verwendet werden.
Der Gen-Expressionswirt kann in der für den Wirt üblichen Weise inkubiert werden. Da hGSH.Px Cystein enthält, das eine Selen enthaltende Aminosäure ist von einer der konstitutionellen Aminosäuren, ist es vorzuziehen, eine Selenquelle wie Selenige Säure dem Medium in einem Verhältnis von annähernd 10 uM bis 2 mM hinzuzugeben, vorzugsweise etwa 20 uM bis 1 mM. Nach Beendigung der Inkubation werden die Zellen gesammelt und gemahlen. Die angestrebte hGSH.Px kann aus dem Überstehenden der gemahlenen Zellen erhalten werden.
hGSH.Px kann aus dem Überstehenden mit einer hohen Reinheit zum Beispiel mittels des folgenden Verfahrens erhalten werden. Das Überstehende wird zum Beispiel über eine DEAE- Celluloseaustauschsäule behandelt, um dadurch die stark sauren Komponenten zu entfernen, einschließlich der Nucleinsäure durch Absorption. Das auf diese Weise erhaltene Eluat wird gegen einen von üblichem Salz freien Phosphatpuffer dialysiert, adsorbiert durch beispielsweise eine DEAE-Celluloseaustauschsäule und anschließend einer Gradient-Eluierung mit üblichem Salz unterworfen. Die hGSH.Px Fraktion wird durch Ultrafiltration aufkonzentriert und anschließend durch beispielsweise eine Gelfiltrationssäule wie Sephadex G100 gegeben. Die erhaltene hGSH.Px Fraktion wird weiter aufkonzentriert und im Anschluß daran durch beispielsweise ein präparatives SDS-Acrylamidgel gegeben. Somit kann hGSH.Px mit hoher Reinheit erhalten werden.

Beispiel

(1) Herstellung der Sonde für die Bestimmung der klonierten DNA, die für hGSH.Px codiert

Eine einzelsträngige Inosin (I) enthaltende DNA, teilweise durch die folgende Formel repräsentiert, die mit einem Teil der Basensequenz einer DNA komplementär war, die für Maus GSH.Px codiert, wie von I. Cambers et al. berichtet, wurde chemisch synthetisiert:
Diese einzelsträngige DNA mit 56 Basen wurde mit ³²P markiert und als Sonde für die Klonierung von hGSH.Px cDNA in den folgenden Stufen (6) und (7) eingesetzt.

(2) Isolierung der mRNA aus menschlicher Leber

2 g eines frischen menschlichen Lebergewebes wurde mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) gewaschen, und alle im Cytoplasma enthaltenen RNAs wurden daraus mittels der Guanidinthiocyanat-Methode (Biochem., 18, 5294 - 5299 (1979)) extrahiert.
Die gesamten auf diese Weise extrahierten RNAs wurden in einem Puffer mit einer hohen Salzkonzentration (Tris enthaltend 0,5 M NaCl, pH 7,4) gelöst und die erhaltene Lösung wurde durch eine Oligo(dT)Cellulosesäule geführt. Die dadurch adsorbierte Poly A RNA (mRNA) wurde mit einem Puffer einer niederen Salzkonzentration eluiert (Tris frei von NaCl, pH 7,4) und anschließend aus Ethanol gefällt. Somit wurden 30 ug der mRNA aus 3 mg der gesamten RNAs erhalten.

(3) Ringschluß der mRNA und Synthese der cDNA

Die in Stufe (2) erhaltene Fraktion wurde nach der Methode von Okayama-Berg ('83 Mol. Cell Biol., 3, 280 (1983)) in folgender Weise behandelt. Es wurden hergestellt 20 ul einer Lösung, enthaltend 50 mM Tris (pH 8,3), 30 mM KCl, 0,3 mM Dithiothreitol (DTT), 8 mM MgCl&sub2;, 40 ug/ml Actinomycin D, 2 mM Portionen von dATP, dCTP, dGTP und TTP, 30 uCi[a-³²P] dCTP (600 Ci/mMol), 280 Einheiten Ribonuclease-Inhibitor und 3,8 mg Plasmidprimer, der ein Primer eines T-Schwanzstückes war, umfassend etwa 60 Basen und synthetisiert durch Verwendung von E. coli Plasmid pcDV1 (ein Produkt von Pharmacia)-DNA für den Okayama-Berg-Primer nach der Methode von Okayama-Berg, wurde hergestellt und bei 37 ºC gehalten. Anschließend wurden 20 ul einer Lösung hergestellt, enthaltend 10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM ETDA und 3 ug der mRNA und bei 65 ºC für fünf Minuten gehalten. Anschließend wurde sie unmittelbar auf 37 ºC abgekühlt und mit 20 ul der oben genannten Lösung vermischt. Das erhaltene Gemisch wurde bei dieser Temperatur für weitere fünf Minuten gehalten. Anschließend wurden 20 Einheiten reverse Transkriptase dazu gegeben und das Gemisch auf 37 ºC für 20 Minuten erhitzt. Im Anschluß daran wurde die Reaktion durch Zugabe von 4 ul 250 mM EDTA und 2 ul einer 10 % SDS-Lösung dazu unterbrochen. Das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert (1:1) und zweimal aus Ethanol gefällt.

(4) Herstellung des rekombinanten Plasmids

Der in Stufe (3) erhaltene Niederschlag wurde in einer Lösung gelöst, enthaltend 140 mM Natriumcacodylat, 30 mM Tris (pH 6,8), 1 mM CoCl&sub2;, 0,1 mM DDT, 1 mM dCTP und 50 uCi[α-³²P] dCTP, und die erhaltene Lösung wurde auf 37 ºC für zwei bis drei minuten erhitzt. Anschließend wurden 54 Einheiten Terminal-Desoxynucleotidyltransferase hinzugegeben, wodurch sich ein Gesamtvolumen von 50 ul ergab. Das erhaltene Gemisch wurde auf 37 ºC für drei Minuten erhitzt und in gleicher Weise behandelt wie bei der obigen reversen Transkription angewandt, um dadurch einen Niederschlag aus Ethanol zu erhalten.
Dieser Neiderschlag wurde in einer Lösung gelöst, enthaltend 50 mM MaCl, mM Tris (pH 8,0), 10 mM MgCl&sub2;, 100 g/ml Rinderserumalbumin (BSA) und 12 Einheiten Hind III, und die erhaltene Lösung wurde auf 37 ºC für zwei bis vier Stunden erhitzt.
Anschließend wurde sie mit Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert und aus Ethanol gefällt. Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wurde in 20 ul einer Lösung gelöst, die 10 mM Tris (pH 7,3) und 1 mM EDTA enthielt, und es wurden 6 ul Ethanol weiterhin hinzugegeben, um dadurch ein Gesamtvolumen von 26 ul zu erhalten.
Zu 1 ul dieser Lösung wurden zugegeben 1 ul eines zehnfachen Konzentrates einer Lösung, enthaltend 0,04 pmol des Oligo (dG) Linkers, der ein Linker mit dG-Schwanz war, enthaltend etwa 12 basen und synthetisiert unter Verwendung des E. coli- Plamids pL1 (ein Produkt von Pharmacia)-DNA für den Okayama- Berg-Linker nach dem Verfahren von Okayama-Berg, 10 mM Tris (pH 7,5), 0,1 M NaCl und 1 mM EDTA und 8 ul destilliertes Wasser, um dadurch zu einem Gesamtvolumen von 10 ul zu gelangen. Die erhaltene Lösung wurde auf 65 ºC für fünf Minuten erhitzt und anschließend auf 42 ºC für 30 Minuten. Nachfolgend wurde sie bei 0 ºC gehalten. Dann wurde eine konzentrierte Lösung dazu gegeben, enthaltend 20 mM Tris (pH 7,5), 4 mM MgCl&sub2;, 10 mM Ammoniumsulfat, 0,1 M KCl, 50 ug/ml BSA, 0,1 mM β-Nicotinamid-adenindinucleotid (β-NAD) und 0,6 ug E. coli-DNA-Ligase, um zu einem Endvolumen von 150 ul zu gelangen. Die erhaltene Lösung wurde bei 12 ºC über Nacht gehalten. Dann wurden 0,4 ul einer Lösung hinzugegeben, enthaltend 20 mM Portionen von dATP, dGTP, dCTP und TTP, 1 ul 1,5 mM β-NAD, 0,4 ug E. coli DNA-Ligase, 0,3 ug E. coli DNA-Polymerase und 1 Einheit E. coli Ribunuclease H, um zu einem Gesamtvolumen von 104 ul zu gelangen. Das erhaltene Gemisch wurde auf 12 ºC für eine Stunde erwärmt und auf 25 ºC für eine weitere Stunde.
Die restliche Lösung (25 ul) wurde ebenso in gleicher Weise behandelt.

(5) Transformation von E. coli

Leistungsfähige Zellen wurden hergestellt durch Verwendung von E. coli Stamm X1776 nach dem von Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harber Laboratory, 254 - 255 (1982)) berichteten Verfahren. 0,2 ml Portionen davon wurden pipettiert. 135 Anteile (jeweils 20 ul) der in Stufe (2) erhaltenen DNA-Lösung wurden transformiert. Jede auf diese Weise erhaltene Transformante wurde in einem flüssigen Medium (Amp L-Medium), enthaltend 10 g/l Bactotrypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Natriumchlorid, 50 ug/l Ampicillin (Amp), 0,1 g/l Diaminopimelinsäure und 0,04 g/l Thymidin, suspendiert und darin bei 37 ºC für 20 Stunden unter Schütteln inkubiert. Anschließend wurde diese in Form einer 15 % Lösung in Glycerol bei -80 ºC gelagert. Getrennt davon wurde die Transformante in ein Medium (Amp L-Agarmedium), hergestellt durch Zugabe von 1,5 % gereinigtem Agar zu dem oben genannten Amp L-Medium, transplan-tiert. Somit wurden Kolonien mit einer entsprechenden Effektivität von 1,3 x 10&sup6; gebildet.

(6) Koloniehybridisierung (primär)

Die in Stufe (5) erhaltene Zellsuspension wurde in das gleiche L-Agarmedium geimpft wie das in Stufe (5) erhaltene in 24 Petrischalen (14 x 10 cm) bei einem Verhältnis von etwa 15000 Kolonien pro Schale, und sie wurden solange inkubiert, bis der Durchmesser einer jeden Kolonie etwa 1 mm erreichte. Eine Nylonmembran (Hybond-N, Produkt von Amersham Co., Ltd.) wurde langsam in einer solchen Weise darauf plaziert, daß die gesamten Kolonien auf die Membran wanderten. Anschließend wurde die genannte Membran eng mit der Oberfläche eines L- Agarmediums, enthaltend 250 ug/ml Chloramphenicol, in Kontakt gebracht und für zwei Tage und Nächte inkubiert. Die DNAs wurden auf der Membran in folgender Weise fixiert.
Nach vollständiger Inkubierung wurde die Membran mit einer Denaturierungslösung (1,5 M NaCl und 0,5 M NaOH) für sieben Minuten behandelt und anschließend durch zweimalige Behandlung mit einer Lösung (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris (pH 7,2) und 0,01 M EDTA) zwei Mal. Dann wurde sie mit 6 x SSC gewaschen ( 1 x SSC: 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat), an der Luft getrocknet und mit UV-Licht bestrahlt, um dadurch die DNAs auf der Membrane zu fixieren.

(a) Vorhybridisierung

Die obige Membran wurde auf 65 ºC in einer Vorhybridisierungslösung erhitzt, enthaltend 6 x SSC, 0,1 % BSA, 0,1 % Ficoll, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon, 0,5 % SDS und 20 ug/ml denaturiertes Heringssperma für drei Stunden.

(b) Hybridisierung

Anschließend wurde die Membran auf 50 ºC in einer Hybridisierungslösung erhitzt, enthaltend 175 uCi/ug DNA der Vorhybridisierungslösung der Sonde, wie in Stufe (1) hergestellt, und 10&sup7; cpm/ml der Vorhybridisierungslösung für 16 Stunden.

(c) Isolierung des Plasmids mit der Basensequenz, codierend für hGSH.Px Polypeptid

Die Membran wurde mit 6 x SSC-Lösung dreimal gewaschen, d. h. bei 57 ºC für 30, 20 und 15 Minuten. Nach dem Lufttrocknen wurde die Membran einer Autoradiografie unterworfen unter Verwendung eines Röntgenfilms (Kodax XAR5). Dadurch wurden 52 positive Koloniegruppen selektiert.

(7) Koloniehybridisierung (sekundär)

Die über die Stufe (6) erhaltenen Koloniegruppen wurden in einem Amp L-Agarmedium monokloniert, und das Verfahren der Stufe (6) wurde wiederholt. Somit wurden vier Plasmide, codierend für das hGSH.Px Polypeptid selektiert, und das längste von ihnen wurde pHGP 7 genannt.

(8) Restriktionsmappe von cDNA, codierend für hGSH.Px und Bestimmung der Basensequenz davon

Eine DNA, codierend für hGSH.Px wurde erhalten durch Abbau der pHGP 7 Plasmid-DNA mit BamHI und anschließendem partiellen Abbau derselben mit PstI. Es wurde eine Restriktionsmappe hergestellt durch wietere Verwendung von XhoI, EcoRI und PstI. Somit wurde gesichert, daß die pHGP 7 eine Struktur wie in Fig.3 hatte. Es wurde gesichert, daß die in dieses Plasmid insertierte 1134 bp DNA für hGSH.Px codierte durch Bestimmung der Gesamtbasensequenz der insertierten DNA mit Hilfe M13 Didesoxy-Methode.
Fig. 2 zeigt die Gesamtbasensequenz, worin die 319. bis 321. Basensequenz ATG ein Initiatorcodon ist; die 322. bis 921. ist eine Translationsregion; und die 922. bis 924. TAG ist ein Terminatorcodon.

(9) Bestimmung der Aktivität von Glutathionperoxidase

Die Aktivität von GSH.Px wurde bestimmt durch Zugabe einer entsprechenden Menge einer GSH.Px Lösung zu 3,0 ml einer Reaktionslösung, enthaltend 3 uMol Cumenhydroperoxid, 3 uMol Glutathion (reduzierter Typ), 150 uMol eines Phosphatpuffers (pH 7), 3 uMol EDTA, 3 mMol Natriumazid, 0,64 uMol NADPH und 3 Einheiten Glutathionreduktase, Erhitzen des erhaltenen Gemisches auf 25 ºC und Messen des Abfalls der Absorption derselben bei 340 nm.
Die Menge des Enzyms, das zur Oxidation von 1 umol des Glutathions innerhalb einer Minute in der Lage ist, wird als eine Einheit der GSH.Px Aktivität definiert.

(10) Genexpression in der COS-Zelle

Die in Stufe (7) erhaltene pHGP 7-DNA wurde in eine COS 7-Zelle mittels der Calciumphosphatmethode (DNA-Klonierung, Bd. II, IRL Press, 152 - 153 (1985)) eingeführt, und die Rekombinante hGSH.Px Aktivität in der Zelle wurde nach der in Stufe (9) beschriebenen Methode bestimmt. Somit wurde die Aktivität davon bei 1 Einheit/ml des Inkubationsmediums gefunden.

(11) Genexpression im Xenopus laevis Oocyten

Eine DNA, codierend für das hGSH.Px Polypeptid wurde ausgeschnitten durch Abbau der pHGP 7 Plasmid-DNA mit BamHI und XhoI und anschließend in die Sal, BamHI-Stelle des Plasmids pSP64 (ein Produkt von Amersham) insertiert. Das auf diese Weise gebildete Plasmidt wurd mit pSPHGP 7 bezeichnet. Fig. 7 zeigt dessen Struktur.
Dieses pSPHGP 7 Plasmid wurde mit BamHI abgebaut, wobei sich eine geradkettige doppelsträngige DNA ergab, die anschließend an eine RNA transskibiert wurde in Gegenwart von SP6 RNA-Polymerase (ein Produkt von BRL), ATP, GTP, CTP, UTP und m&sup7;G(5')p.p.p.(5')G, um dadurch eine mRNA zu synthetisieren.
Eine Spurenmenge (40 - 50 pg/Oocyt) der auf diese Weise erhaltenen mRNA wurde in Xenopus laevis Oocyten injiziert, und diese Oocyten wurden bei 20 ºC für zwei Tage gehalten. Dann wurden die Oocyten aufgebrochen und die GSH.Px Aktivität des Überstehenden nach dem in Stufe (9) beschriebenen Verfahren bestimmt. Die auf diese Weise bestimmte Aktivität betrug 0,5 Einheiten/Oocyt.

(12) Struktur des in der E. coli-Zelle manifestierten Vektors

Das Plasmid pHGP 7, enthaltend hGSH.Px, wie in Stufe (7) erhalten, wurde mit BamHI und NheI geschnitten, wodurch sich ein DNA-Fragment von etwa 1 kbp ergab. Die folgenden beiden einzelsträngigen DNA wurden zu dem oben erhaltenen DNA-Fragment phosphoryliert und anschließend durch Ringschluß zusammengefügt:
einzelsträngige DNA Nr. 1:
(5')-GATCCATGTGTGCTGCTCGG-(3'); und
einzelsträngige DNA Nr. 2:
(5')-CTAGCCGAGCAGCACACATG-(3').
Das Produkt wurde mit BamHI geschnitten und in die BamHI- Stelle der pBR322 tac Plasmid-DNA eingesetzt, die durch Insertieren eines Fragmentes von 121 bp, enthaltend den Tac-Promoter von pDR540 (ein Produkt von Pharmacia), zwischen die Eco-RI- und BamHI-Stellen von pBR322. Das auf diese Weise erhaltene Produkt wurde als ptacHGP 7 beziechnet. Fig. 5 zeigt ein Verfahren zur Herstellung desselben und dessen Struktur.

(13) Genexpression von hGSH.Px in E. coli

Das ptacHGP , hergestellt in Stufe (12), wurde in E. coli JM105, tragend lac Iq (ein Produkt der Takara Shuzo Co. Ltd.), transformiert. Die auf diese Weise erhaltenen Kolonien wurden in einem Medium bei 37 ºC inkubiert, bestehend aus 50 mM Amp, 10 g/l Bactotrypton, 5 g/l Hefeextrakt und 5 g/l Natriumchlorid, bis die Absorption des Inkubationsmediums bei 600 nm 0,1 bis 0,3 erreichte. Danach wurde Isopropyl-β-thiogalactosid hinzugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erreichen, und die Inkubation wurde bei 37 ºC für mehrere zusätzliche Stunden durchgeführt. Anschließend wurde das Inkubationsmedium zentrifuggiert, um dadurch die Zellen zu sammeln. Die Zellen wurden durch Ultraschall aufgebrochen und die hGSH.Px Aktivität des Überstehenden nach dem Verfahren bestimmt, das in Stufe (9) beschrieben worden ist. Die auf diese Weise bestimmte Aktivität betrug 5,5 Einheiten/ml des Mediums. Dieses Überstehende wurde lyophilisiert, um dadurch zu einem Pulver der rekombinanten hGSH.Px zu gelangen.
Alternativ dazu kann die angestrebte hGSH.Px hergestellt werden unter Einsatz eines lac Iq-freien E. coli Stammes, wie C600 oder N99cI&spplus;. Zum Beispiel produziert N99cI&spplus; die hGSH.Px mit einer Ausbeute von 1 mg/l oder darüber in Gegenwart von Seleniger Säure.

Claims

1. DNA, codierend für die Aminosäuresequenz von rekombinanter Human-Glutathionperoxidase, die die Basensequenz gemäß Fig. 1 aufweist.

2. Plasmid mit einer DNA, codierend für die Aminosäuresequenz von rekombinanter Human-Glutathionperoxidase, worin die Basensequenz der DNA eine solche ist, wie sie in Fig. 1 aufgeführt ist.

3. Plasmid nach Anspruch 2, das eine DNA hat, die für die Aminosäuresequenz der rekombinanter Human-Glutathionperoxidase codiert an der Stromabwärts-Seite eines Promoters, worin die Basensequenz der DNA eine ist, wie sie in Fig. 1 aufgeführt ist.

4. Verfahren zur Herstellung von rekombinanter Human- Glutathionperoxidase in einem Rekombinationswirt, welches umfaßt die Verwendung einer DNA mit der Basensequenz von Anspruch 1.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die DNA ein Plasmid ist gemäß einem der Ansprüche 2 und 3.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, worin der Rekombinationswirt E. coli ist.