DE3851002T2

DE3851002T2 - Lineare und zyklische Analoge von alpha-MSH-Fragmenten mit ausserordentlicher Wirkung.

Info

Publication number: DE3851002T2
Application number: DE3851002T
Authority: DE
Inventors: Fahad A. Tucson Arizona Al-Obeidi; Mac E. Tucson Arizona Hadley; Victor J. Tucson Arizona Hruby
Original assignee: University Patents Inc
Current assignee: Competitive Technologies Inc
Priority date: 1987-05-22
Filing date: 1988-05-19
Publication date: 1995-02-02
Anticipated expiration: 2008-05-20
Also published as: DE3851002D1; FI882380A0; PT87560A; CN1031242C; ATE109793T1; PH25819A; DK172760B1; DK277788A; JPH0826077B2; EP0292291B1; EP0292291A3; IE64903B1; JPS6470499A; CA1340107C; PT87560B; IE881537L; AU1650688A; AU618733B2; DK277788D0; FI882380A

Description

Aufgrund der teilweisen, in Form von Zuschüssen gewährten Unterstützung des Staatlichen Gesundheitsdienstes der Vereinigten Staaten und der Bundesstiftung zur Förderung der Wissenschaften für die Durchführung der vorliegenden Erfindung hat die Regierung der Vereinigten Staaten gemäß 35 USC 202 gewisse Rechte an dieser Technologie.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Klasse bisher unbekannter linearer und zyklischer Alpha-MSH-Fragmentanalogone, die Methode zur Stimulation von Melanozyten in Vertebraten durch transdermale Verabreichung dieser Analogone sowie diesbezüglich geeignete Strukturen.
Bei Vertebraten wird die Farbe der Haut, des Fells und der Federn durch die genetisch gesteuerte Anzahl und Verteilung bestimmter farbhaltiger Zellen, z. B. Melanozyten, bestimmt. Bei Säugetieren befinden sich Melanozyten in der Basalschicht der Epidermis, an dem dermal-epidermalen Berührungspunkt und in den Haarfollikeln. Die Synthese des Pigments (Melanins) innerhalb dieser Melanozyten wird durch die Aktivität eines Enzyms, Tyrosinase, gesteuert, das sich in einem intrazellularen Organel, dem Prämelanosom, befindet. Nach Aktivierung der Tyrosinase lagert sich entweder das Eumelanin- (braun-schwarz) oder das Phaeomelaninpigment (gelb-rot) in dem Organel ab; nach vollständiger Melanisierung ist das Prämelanosom als ein Melanosom und je nach Farbe insbesondere als ein Eumelanosom oder ein Phaeomelanosom bekannt [siehe Fitzpatrick, T. B., Y. Hori, K. Toda, M. Se&ijlig;i, Jap. J. Derm. 29 : 278(1969)]. Melanosome werden durch einen als Zytocrinsekretion bekannten Prozeß an umliegende Keratinozyten der Haut oder an Zellen im Schaft des wachsenden Haares abgegeben.
Obgleich Melaninsynthesen und Proben der Körperbedeckung von Säugetieren eindeutig genetisch sind, können Änderungen der follikularen Melanogenese und der Farbe der Körperbedeckung bei einigen Säugetieren hormonal durch Alpha-Melanotropin (auch als Alpha-Melanozyt stimulierendes Hormon, d. h. Alpha-MSH, bekannt), einem linearen Tridecapeptid mit der folgenden Formel, gesteuert werden:
Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH&sub2;.
Dieses Hormon stammt von dem Präkursorprotein, Pro-Opiomelanocortin, mit hohem Molekulargewicht ab, wird von dem Pars intermedia der Hypophyse abgesondert und stimuliert die Melanozyt-Adenylat-Zyklase-Aktivität, die Tyrosinase-Aktivität und die anschließende Melaninproduktion [siehe Hadley, M. E., C. B. Heward, V. J. Hruby, T. K. Sawyer und Y. C. S. Young, Pigment Cell 6 : 323 (1980)].
Bei dem Menschen wird Alpha-MSH anscheinend nur in der Hypophyse von Föten, nicht aber in der Hypophyse von Erwachsenen gefunden. Bei Erwachsenen ist die Melaninproduktion in einer bestimmten Menge genetisch festgelegt und im wesentlichen vorhanden. Eine variable Melaninsynthese über und unter diesem Basispegel hängt direkt von der UV-Stimulation, d. h. dem Sonnenlicht, ab; hohe Sonneneinstrahlung steigert die Melaninproduktion bei gleichzeitiger Dunklung der Haut. Diese Reaktion kann eine evolutionäre Anpassung sein, um eine Person vor dem Altern und den mutagenen Eigenschaften von UV zu schützen. Geringe Mengen UV-Strahlen führen zu einer geringeren integumentalen Melaninsynthese, zum Verblassen der Hautfarbe und zu einem verringerten Blockierungseffekt, der der Haut die Aufnahme größerer Strahlungsmengen ermöglicht. Obgleich Erwachsene in der Hypophyse kein Alpha-MSH synthetisieren, reagieren menschliche Melanozyten auf dieses Hormon (und ein razemisches Präparat desselben).
Die Hypopigmentation der menschlichen Haut entsteht durch lokale Defekte in der Melaninproduktion innerhalb der Melanozyten. Die Ursachen für viele dieser Hypopigmentationsstörungen sind jedoch noch unbekannt.
Es wird vermutet, daß ungefähr 1% der Weltbevölkerung an der einen oder anderen Hypopigmentationsstörung leidet. Obgleich bekannt ist, daß Alpha-MSH und bestimmte Alpha-MSH-Analogone bei subkutaner Verabreichung bei Amphibien eine Verdunklung hervorrufen können und daß Alpha-MSH bei intramuskulärer Verabreichung mit einer Hautverdunklung bei adrenalektomisierten Menschen in Verbindung gebracht wird [Lerner, A. B. und J. S. McGuire, N. E. J. Med. 270 : 539-546(1964)], sind diese Verabreichungsarten für wiederholte Anwendungen, die zur Erlangung und Beibehaltung der gewünschten Wirkung erforderlich sind, nicht geeignet. Vor dieser Erfindung waren keine Methoden zur Behandlung dieser Hypopigmentationsstörungen bekannt.
Es wurde nun herausgefunden, daß bestimmte Alpha-MSH-Analogone wirksam transkutan verabreicht werden können. Diese Bindungen erreichen die Melanozyten in aktiver Form zwecks Stimulierung der Melaninproduktion. Somit ist es gemäß der vorliegenden Erfindung nunmehr möglich, topische Zusammensetzungen aus Alpha-MSH-Analogonen zu verwenden, um eine Normalisierung der Hypopigmentationsstörungen, wie postentzündliche Hypopigmentation, einschließlich Pityriasis, Alba, Tinea-Versiocolor, Vitiligo, idiopathische, gesprenkelte Hypomelanosis und Nevus depigmentosus, zu erreichen. Weiterhin ist es jetzt möglich, das Dunkeln von altersbedingtem grauem Haar durch topische Verabreichung von Alpha-MSH-Analogonen zu erreichen. Es ist außerdem möglich, den Wert von für den Kommerz bestimmten Tierfellen durch Verdunkelung mittels topischer Verabreichung dieser Analogone zu steigern. Darüberhinaus ist es jetzt möglich, eine Bräunung der Haut ohne jegliche Sonnen- oder UV-Bestrahlung zu erreichen.
Alle früher durchgeführten Untersuchungen an von der Hypophyse isolierten Peptiden im Zusammenhang mit Alpha-MSH führten zu der Beibehaltung der Sequenz Met&sup4;-Glu&sup5;- His&sup6;-Phe&sup7;-Arg&sup8;-Trp&sup9;-Gly¹&sup0; (das heißt Methionin-Glutaminsäure-Histidin-Phenylalanin- Arginin-Tryptophan-Glycin) als gemeinsamen aktiven Kern. Diese Heptapeptidsequenz sollte die aktive Position der von Pro-Opiomelanocortin abstammenden Hormone sein.
Basierend auf der strukturellen Beziehung des Alpha-MSH (und seinen Analogonen und Fragmenten) zu seiner biologischen Wirksamkeit - unter Verwendung eines biologischen Prüfsystems an Froschhaut in vitro - scheint die aktive Position des Alpha-MSH die gemeinsame aktive Kernsequenz des angemessen modifizierten Ac-Met-Glu-His-Phe- Arg-Trp-Gly-Nh&sub2; zu sein. Dieses Fragment (Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;) wurde synthetisiert und hinsichtlich der stimulierenden Aktivität der Melanozyten in Froschhaut getestet. Beim Vergleich mit dem nativen Hormon zeigte es sich als schwacher Agonist. Die Aminosäuresubstitution an Position 5 (Glu) und 10 (Gly) wurde vor dieser Erfindung nicht untersucht. Frühere Forschungsarbeiten (siehe US Patente Nr. 4.457.864, 4.485.039, 4.866.038, 4.918.055 und 5.049.547) ergaben, daß die Substitution von Methionin durch Norleucin in dem aktiven linearen Kernheptapeptid ein wirksames Alpha-MSH-Analogon ergab. Weiterhin führte die Substitution von Phenylanin an Position 7 durch sein enantiomeres D-Phenylalanin zu einem biologisch wirksameren Analogon mit längerer Aktivität in den beiden anerkannten biologischen Prüfsystemen (Frosch- und Eidechsenhaut). In der folgenden Tabelle sind einige dieser Untersuchungen zusammengefaßt. Selektive Alpha-MSH-Fragmente und ihre biologischen Aktivitäten auf Froschhaut (Rana pipiens) und Eidechsenhaut (Anolis carolinensis) Peptid Relative Wirksamkeit Frosch Eidechse
Die Untersuchung dieser strukturellen Aktivitätsbeziehungen brachte zwei wichtige Faktoren zum Vorschein: (1) Die Substitution der Met-Aminosäure mit ihrer oxydierbaren Seitenkette durch die oxydativ stabile Aminosäure Nle, die ebenfalls ein Isoster für Met ist, ergab eine ungefähr 10-fache Steigerung der biologischen Aktivität des Peptidfragments; (2) Die Substitution von L-Phe an Position 7 durch D-Phe und Beihaltung von Lys an Position 11 steigerte die biologische Aktivität des Alpha-MSH noch weiter.
Zusätzlich zu den an linearen Alpha-MSH-Analogonen durchgeführten Untersuchungen wurde eine Anzahl konformationserzwungener Alpha-MSH-Bindungen synthetisiert und auf ihre biologische Wirksamkeit hin untersucht. Das erste untersuchte Analogon war Ac[Cys&sup4;,Cys¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub1;&submin;&sub1;&sub3;NH&sub2;, das die ungefähr 10- bis 20-fache Aktivität des nativen Alpha-MSH-Hormons in der Bioprüfung an Froschhaut und die ungefähr 2-fache Wirksamkeit des Alpha-MSH in der Bioprüfung an Eidechsenhaut aufwies. Die Struktur und die Synthese dieser zyklischen Alpha-MSH-Analogone basierten auf der Berücksichtigung der Beta-reversiblen Struktur in der Mitte des aktiven Kerns (His&sup6;-Phe&sup7;Arg&sup8; Trp&sup9;) von Alpha-MSH und der Bedeutung dieses Konformationsmusters für die biologische Aktivität.
Aus Strukturaktivitätsuntersuchungen dieser zyklischen Klasse von Alpha-MSH-Analogonen wurden mehrere Schlußfolgerungen gezogen: 1) Die Zyklisierung zwischen den Positionen 4 (Met) und 10 (Gly) mittels isosterischer Substitution durch Cystein- Aminosäure steigerte die Dispersionsaktivität der Melanozyten um nicht weniger als das 10-fache in der Bioprüfung an Froschhaut und um das 2-fache in der Bioprüfung an Eidechsenhaut. 2) Die Substitution von Phe&sup7; durch D-Phe&sup7; in diesen zyklischen Analogonen verdoppelte die Aktivität in der Bioprüfung an Froschhaut und steigerte sie um das 4-fache in der Bioprüfung an Eidechsenhaut. 3) Das Vorhandensein von Lys an Position 11 führte stets zu aktiveren Analogonen als ohne Lys. 4) Die Verkleinerung oder Vergrößerung der Ringgröße der Disulfid-Brücke von einem 23-gliederigen Ring verursachte eine erhebliche Abnahme der biologischen Wirksamkeit des entstehenden Analogons.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen mit zyklischen Alpha-MSH-Analogonen sind der nachstehenden Tabelle zu entnehmen: Relative in Vitro Wirksamkeit von zyklischen Alpha-MSH-Analogonen in Bioprüfungen an Frosch- und Eidechsenhaut Peptidanalogon Wirksamkeit* Frosch Eidechse Aminosäurensubstitutionseffekt Alpha-MSH
* Die biologische Wirksamkeit hinsichtlich des Alpha-MSH wird über dem linearen Abschnitt der Dosis-Reaktions-Kurve gemessen.
Maa = 2-Mercaptoessigsäure
Mpa = 3-Mercaptopropionsaure
Hcy = Homocystein
Zur weiteren Untersuchung der Strukturwirksamkeitsbeziehung von Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0; Fragmenten haben wir systematisch die strukturelle Anforderung an die melanotrope Aktivität einer Anzahl früher unbekannter linearer Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0; und Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub3; Analogone unter besonderer Berücksichtigung des Substitutionseffekts an den Positionen 5 und 10 untersucht.
Auf der Grundlage der mit linearen Alpha-MSH-Analogonen erzielten Ergebnisse untersuchten wir dann ein anderes, konformationsbeschränktes Alpha-MSH-Analogon. Wir konzentrierten uns auf die 4-10 Fragmente des Alpha-MSH mit der folgenden allgemeinen Struktur:
AC[Nle&sup4;, Xxx&sup5;, D-Phe&sup7;, Yyy¹&sup0;] alpha-MSH&sub4;-&sub1;&sub0;NH&sub2;
worin Xxx entweder Glutaminsäure (Glu) oder Asparaginsäure (Asp) (d. h. eine der Mono-Amino-Dicarboxylsäure) und Yyy Lysin, Ornithin, 2,4-Diamino-Buttersäure (Dab) oder 2,3-Diamino-Propionsäure (Dpr), d. h. eine zweibasische Aminosäure, ist. Die in der folgenden Tabelle aufgeführten linearen Alpha-MSH-Analogone wurden mittels Festphasen-Peptidsynthese unter Verwendung von p-Methylbenzhydrylaminharz als fester Träger synthetisiert und nach den Methoden gereinigt, die den früher für Alpha- Melanotropin und Analogone verwendeten Methoden entsprechen. Zum Zwecke des Vergleichs wird zuerst die Struktur des Alpha-MSH dargestellt.

Struktur von Alpha-Melanotropin-Analogonen

Nr. Primärsequenz
Alpha-MSH

Analogon

Alpha-MSH
Die linearen Analogone von Alpha-MSH Fragmenten wurden nach den folgenden Beispielen hergestellt.

BEISPIEL I

Ac-[Nle&sup4;, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;, Gly¹¹]-Alpha-MSH&sub1;&submin;&sub1;&sub3;NH&sub2;

Diese Verbindung wurde durch Kupplung von Nα-Boc-Cal (der Begriff "Boc" bedeutet t-Butyloxycarbonyl) mit p-Methylbenzhydrylaminharz (2,0 g pMBHA-Harz, 0,7 mmol NH&sub2;/g Harz) unter Verwendung eines 3-fachen Überschusses an Aminosäure und Vornahme der Festphasen-Peptidsynthese hergestellt. Nach 90 Minuten neutralisierte das mit Dichlormethan gewaschene Harz und die Aminogruppe acetylierte mit dem essigsauren Anhydrid-Pyridin-Gemisch. Reaktive Aminogruppen an dem Harz wurden durch den Ninhydrintest nach 30 Minuten nicht festgestellt. Ein Zyklus zur Kupplung eines jeden Aminosäurerückstands mit der wachsenden Peptidkette bestand aus dem Folgenden: 1) Waschen mit vier 30 mL-Portionen CH&sub2;Cl&sub2;, 2 Min./Wäsche; 2) Abspalten der Boc-Gruppe durch 30 ml 48% Trifluoressigsäure in 2% anisolhaltigem Dichlormethan, eine Behandlung von 5 Minuten, eine zweite Behandlung von 20 Minuten; 3) Waschen mit vier 30 mL-Portionen Dichlormethan, 2 Min./Wäsche; 4) Neutralisieren durch Hinzugabe von zwei 30 mL-Portionen 10% Diisopropylethylamin in Dichlormethan und jeweils 2-minütigem Schütteln; 5) Waschen mit vier 30 mL-Portionen Dichlormethan, 2 Min./Wäsche; 6) Hinzugabe des 3-fachen Boc-Amino-Derivats (in diesem Fall 2,1 mmol) zu 5 ml Dichlormethan, 2,4 ml N-hydroxybenzotriazol der 1 mmol/mL-Lösung HOBt in DMF (jedoch nicht bei N-Boc-NimTos His), (der Begriff "NimTos" bedeutet N-Imidazol-Tosyl), gefolgt von 2,4 ml DCC der 1 mmol/mlh-Lösung DCC in DMF. Das Gemisch wurde dann zwei bis drei Stunden lang geschüttelt (bei Trp, Arg und His wurde DMF als Kupplungssolvent benutzt); 7) Nach Kupplung (Ninhydrintest negativ) erfolgte das Waschen mit drei 30 mL-Portionen Dichlormethan, 2 Min./Wäsche; 8) Waschen mit einer 3 ml-Portion 100% Ethanol, 2 Min./Wäsche; 9) Waschen mit vier 30 mL-Portionen Dichlormethan, 1 Min./Wäsche. Das der Titelbindung entsprechende geschützte Peptidharz wurde nach der schrittweisen Kupplung der folgenden NαBoc-Aminosäuren (oder Derivate) erzeugt (in der Reihenfolge der Hinzugabe): Nα-Boc-Pro; Nα-Boc-Gly, Nα-Boc-Lys-(N&epsi;ClZ); Nα-Boc-Ni-For-Trp, Nα-Boc-Ng-Tos-Arg, Nα-Boc-D-Phe, Nα-Boc-Nim-Tos-His (der Begriff "Ng" bedeutet N-guanidino; "Ni" bedeutet N-indolyl und 2ClZ bedeutet 2-chlorobenzyloxycarbonyl). Das entstehende Boc-His(Nim-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys (N&epsi;ClZ)-Gly-Pro-Val-p-MBHA Harz wurde in vier Portionen geteilt. Ein Viertel (1,0 g 0,5 mmol) des geschützten Peptidharzes wurde nach Kupplung von NαBoc-γ-Bzl-Glu, Nα-Boc-Nle, Nα-Boc-Ser (0-Bzl), Nα-Boc-Tyr (0-2 BrZ), Nα-Boc-Ser(0-Bzl) (der Begriff "2BrZ" bedeutet 2-Brombenzyloxycarbonyl) in das geschützte Titelpeptidharz überführt. Nach Kupplung der letzten Aminosäure wurde die Nα-Boc Schutzgruppe entfernt, die Aminogruppe neutralisiert und das geschützte Peptid wurde mit 10-fachem Überschuß an N-acetylimidazol in 20 ml Dichlormethan N%acetyliert. Das erhaltene geschützte Peptidharz, Ac-Ser(0-Bzl)-Tyr(0-2-BrZ)- Ser(0-Bzl)-Nle-Glu(γ-Bzl)-His(Nim-Tos)-D- Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(N&epsi;-2-ClZ)-Gly-Pro-Val-p-MBHA Harz, wurde im Vakuum getrocknet. Das geschützte Peptidharz (1,0 g) wurde von dem Harz durch flüssiges HF abgespalten. Nach Verdunstung der flüchtigen Stoffe im Vakuum bei 0ºC wurde das getrocknete Produkt mit Ethylether (3 · 30 ml) gewaschen, mit 30% wasserhaltigem HOAc (3 · 30 ml) extrahiert und lyophilisiert. Das Peptidpulver (530 mg) wurde in zwei Portionen (à 260 mg) geteilt und eine Portion wurde in 1,5 ml Ammoniumacetat-Puffer (pH 4,5) aufgelöst, durch einen Patronenfilter in den oberen Teil einer CMC-Säule (2,0 · 30,0 cm) gefiltert und unter Verwendung von je 250 ml 0,01 M (pH 4,5), 0,1 M (pH 6,8) und 0,2 M (pH 6,8) NH&sub4;OAc eluiert. Die bei 280 nm festgestellte Hauptspitze wurde zwischen dem Ende von 0,1 und der ersten Hälfte der 0,2 M NH&sub4;OAc-Fraktion eluiert und lyophilisiert und ergab 142,3 mg weißes Pulver. 80,0 mg des Peptidpulvers wurden durch den Präparator HPLC gereinigt, die Hauptspitze wurde gesammelt und lyophilisiert und ergab 63 mg Titelpeptid.

BEISPIEL II

Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;, Gly¹¹]-Alpha-MSH&sub1;&submin;&sub1;&sub3;NH&sub2;

Diese Verbindung wurde aus 1,0 g ( 0,5 mmol) Nα-Boc-His (Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng- Tos)-(Trp-Ni-For)-Lys(N&epsi;ClZ)-Gly-Pro-Val-p-MBHA Harz durch schrittweise Kupplung von Nα-Boc-Asp(0-Bzl), Naα-Boc-Nle, Nα-Boc-Ser(0-BZl), Nα-Boc-Tyr(0-2-BrZ), Nα-Boc-Ser(0-Bzl) hergestellt. Jeder Kupplungsvorgang wurde wie oben beschrieben ausgeführt. Die Acetylierung der geschützten Tridecapapeptidharzes erfolgte durch 10-fachen Überschuß an N-acetylimidazol in Dichlormethan (5 h) nach Deprotektion und Neutralisation der N-terminalen Boc-Gruppe. Das Ac-Ser(0-Bzl)-Tyr(0-2-BrZ)-Ser (0-Bzl)-Nle-Asp(0-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp-(Ni-For)-L-ys(N&epsi;-2-ClZ)- Gly-Pro-Val-p-MBHA Harz wurde im Vakuum getrocknet und ergab 1,8 g geschütztes Peptidharz. 1,0 g des geschützten Peptidharzes wurde durch flüssiges HF abgespalten und nach Verdunstung der flüchtigen Stoffe mit Diethylether (3 · 30 ml) gewaschen. Das Peptid wurde mit 30% wasserhaltigem HOAc (3 · 30 ml) extrahiert und lyophilisiert. Eine Portion des rohen Tridecapeptids (200 mg) wurde in 1,5 ml NH&sub4;OAc-Puffer (pH 4,5) aufgelöst, durch einen Patronenfilter in den oberen Teil einer CMC-Säule (2,0 · 30,0 cm) gefiltert und mit der gleichen, in Beispiel 1 genannten Sequenz des diskontinuierlichen Gradienten von NH&sub4;OAc eluiert. Die Menge des abgespaltenen Peptids nach der Lyophilisation belief sich auf 152 mg. 100 mg dieses rohen Peptids wurden weiter durch HPLC gereinigt und ergaben 67 mg Titelpeptid.

BEISPIEL III

Ac-[Nle&sup4;, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;, Gly¹¹]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub3;NH&sub2;

Aus 1,0 g (0,5 mmol) Boc-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(N&epsi;ClZ)- Gly-Pro-Val-p-MBHA Harz wurde das Titelpeptid mittels Festphasen-Synthese nach schrittweiser Kupplung von Nα-Boc-Glu(γ-Bzl) und Nα-Boc-Nle synthetisiert. Jede Kupplungsreaktion wurde wie in den obigen Beispielen beschrieben erzielt, jedoch mit dem Unterschied, daß die Acetylierung des N-Terminus durch 2-fachen Überschuß an 1 : 1 essigsaurem Anhydrid-Pyridin in Dichlormethan (1 Std.) erreicht wurde. Das Peptid 4 wurde in gereinigter Form wie in Beispiel II beschrieben hergestellt und ergab ein weißes Pulver mit einer Ergiebigkeit von 22%.

BEISPIEL IV

Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;, Gly¹¹]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub3;NH&sub2;

Aus 1,0 g ( 0,5 mmol) Boc-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys (N&epsi;-2-ClZ)-Gly-Pro-Val-p-MBHA Harz, das wie in Beispiel I beschrieben zubereitet wurde, wurde das Titelpeptid durch schrittweise Kupplung von Nα-Boc-Asp(β-Bzl) und Nα-Boc-Nle hergestellt. Es wurde die gleiche, in Beispiel I beschriebene Technik für die weitere Verarbeitung des erhaltenen Schutzpeptidharzes angewandt. Das gewünschte Peptid ergab 53 mg rohes HPLC-Harz, das zuvor mittels in Beispiel I beschriebener CMC-Chromotographie gereinigt wurde.

BEISPIEL V

Ac-[Nle&sup4;, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;

2,7 g Harz von p-Methylbenzhydrylamin (0,7 mmol NH&sub2;/g Harz) wurde in Dichlormethan suspendiert und dreimal mit 30 ml Portionen Dichlormethan gewaschen. Das gewaschene Harz wurde dann 2 Stunden lang in Dichlormethan geschüttelt, bevor das Solvent ausgefiltert wurde. Das aufgequollene MBHA-Harz wurde neutralisiert und wie in Beispiel I beschrieben mit den Aminosäuren gekuppelt. Die folgenden Aminosäurederivate wurden (in der Reihenfolge ihrer Kupplung) in das Harz gekuppelt: Nα-Boc-Lys(N&epsi;-2-ClZ), Nα-Boc-Trp(Ni-For), Nα-Boc-Arg(Ng-Tos), Nα-Boc-D-Phe, Nα-Boc-His(Nim-Tos). Das erzeugte Boc-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos) Trp(Ni-For)-Lys(N&epsi;-2-ClZ)-p-MBHA Harz wurde in zwei Portionen geteilt. Ein Teil des Harzes wurde schrittweise gekuppelt: Nα-Boc-Glu(γ-Bzl) und Nα-Boc-Nle. Das fertige Peptidharz wurde debocyliert und der N-Terminus mit 2-fachem Überschuß an einem 1 : 1 Gemisch aus essigsaurem Anhydrid-Pyridin 1 Stunde lang in Dichlormethan acetyliert. Das fertige geschützte Peptidharz wurde mit Dichlormethan gewaschen im Vakuum getrocknet und ergab eine Menge von 2,1 g. 1,7 g des geschützten Peptidharzes wurden durch wasserfreies flüssiges HF-Anisol-Dithioethan (17 ml HF, 2 ml Anisol, 1 ml Dithioethan) abgespalten. Nach Verdunstung der flüchtigen Stoffe wurde das getrocknete, abgespaltene Peptid mit 3 · 30 ml wasserfreiem Diethylether gewaschen und mit 3 · 30 ml 30% wasserhaltigem HOAc extrahiert. Das wasserhaltige Extrakt des Peptids lyophilisierte und ergab 700 mg rohes Peptid. 300 mg des rohen Peptids wurden in 2 ml NH&sub4;OAc-Puffer (pH 4,5) aufgelöst und durch einen Patronenfilter in den oberen Teil einer CMC-Säule gefiltert. Die Hauptspitze wurde gesammelt und lyophilisiert und ergab 172 mg weißes pulveriges Peptid. 110 mg des rohen Peptids wurden mittels HPLC gereinigt und ergaben 50 mg reines Titelpeptid.

BEISPIEL VI

Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;

Das geschützte Peptidharz gemäß Titelbindung wurde aus 1,8 g Boc-His(Nim-Tos)-D- Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(N&epsi;-2-ClZ)-p-MBHA durch schrittweise Kupplung von Nα-Boc-Asp(γ-Bzl) und Nα-Boc-Nle hergestellt. Jede Kupplungsreaktion erfolgte mit einem 3-fachen Überschuß an Nα-Boc Aminosäure (oder einem Derivat), einem 2,4-fachen Überschuß an DCC und einem 2,4-fachen Überschuß an HOBt in Übereinstimmung mit der oben beschriebenen Vorgehensweise. Nach Kupplung der letzten Aminosäure wurde die Nα-Boc Schutzgruppe entfernt, die Aminogruppe neutralisiert und mit 2-fachem Überschuß an einem 1 : 1 Gemisch aus essigsaurem Anhydrid-Pyridin 1 Stunde lang in Dichlormethan acetyliert. Das Ac-Nle-Asp(γ-Bzl)- His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(N&epsi;-2-ClZ)-p-MBHA Harz wurde mit Dichlormethan gewaschen, im Vakuum getrocknet und ergab eine Menge von 2,1 g. 1,5 g des geschützten Peptidharzes wurden durch flüssiges HF abgespalten, wie in Beispiel beschrieben verarbeitet und ergab nach HPLC-Reinigung von 112 mg CMC-chromotographisch reinen Peptids 64 mg Titelpeptid.

BEISPIEL VII

Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;, Dab¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;

Das geschützte Peptidharz gemäß Titelbindung wurde wie in Beispiel V beschrieben synthetisiert, jedoch mit dem Unterschied, daß Nα-Boc-Dab(Nγ-Z) und Nα-Boc- Asp(β-Bzl) anstelle von Nα-Boc-Lys(N&epsi;-2-ClZ) und Nα-Boc-Glu(γ-Bzl) in der Kupplung verwendet wurden, um ein Ac-Nle-Asp(β-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)- Trp (Ni-For)-Dab(Nγ-Z)-p MBHA Harz zu ergeben. Nach erfolgter, wie in Beispiel V beschriebener Abspaltung und Verarbeitung des Peptidharzes wurde ein weißes, pulveriges Peptid mit einer Ergiebigkeit von 36% erhalten.

BEISPIEL VIII

Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;, Dpr¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;

Das geschützte Peptidharz gemäß Titelbindung wurde wie in Beispiel V beschrieben synthetisiert, jedoch mit dem Unterschied, daß Nα-Boc-Dpr(Nβ-Z) anstelle von Nα-Boc- Lys(N&epsi;-2-ClZ) und Nα-Boc-Asp(β-Bzl) für Nα-Boc-Glu(γ-Bzl) in der Kupplung verwendet wurden, um ein Ac-Nle-Asp(β-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)- Dpr-(Nβ-Z)-p-MBHA Harz zu ergeben. Das Peptid wurde wie in Beispiel V beschrieben abgespalten und verarbeitet um das gewünschte Peptid in Form eines weißen Pulvers mit einer Ergiebigkeit von 36% zu erhalten.

BEISPIEL IX

Ac-[Nle&sup4;, Lys¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub6;NH&sub2;

Das geschützte Peptidharz gemäß Titelbindung wurde wie in Beispiel V beschrieben synthetisiert, jedoch mit dem Unterschied, daß Nα-Boc-Phe anstelle von Nα-Boc-D-Phe in der Kupplung verwendet wurde, um ein Ac-Nle-Glu(γ-Bzl)-His(Nim-Tos)-Phe- Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys-(N&epsi;-2-ClZ)-p-MBHA Harz zu ergeben. Das Peptid wurde abgespalten und verarbeitet, um die Titelbindung mit einer Ergiebigkeit von 40% zu erhalten.

BEISPIEL X

Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5;, Lys¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;

Das geschützte Peptidharz gemäß Titelbindung wurde wie in Beispiel V beschrieben synthetisiert, jedoch mit dem Unterschied, daß Nα-Boc-Phe anstelle von N-Boc-D-Phe verwendet wurde und Nα-Boc-Asp(β-Bzl) durch Nα-Boc-Glu (γ-Bzl) in der Kupplung substituiert wurde, um ein Ac-Nle-Asp(β-Bzl)-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys-(N&epsi;-2- ClZ)-p-MBHA Harz zu ergeben. Das Peptid wurde von dem Harz abgespalten, die Schutzgruppen wurden entfernt und die Titelbindung wurde wie oben beschrieben gereinigt, um das Produkt in Form eines weißen Pulvers mit einer Ergiebigkeit von 37% zu erhalten.
Die biologische Wirksamkeit der linearen Analogone, die gemäß den o.a. Beispielen hergestellt wurden, ist der nachstehenden Tabelle zu entnehmen, in der "P" die verlängerte Aktion ("+" = ja, "-" = nein) bedeutet und "ND" angibt, daß die Probe in diesem spezifischen Test nicht erfolgte. Analogon Biologische Wirksamkeit Frosch Eidechse Restaktivität Frosch Eidechse Alpha-MSH
Die mit den linearen konformationsbeschränkten Alpha-MSH-Analogonen erzielten Ergebnisse führten zu Untersuchungen unter Verwendung einer anderen Art beschränkter Analogone, den konformationsbeschränkten zyklischen Alpha-MSH-Analogonen.
Die Festphasen-Peptidsynthese zyklischer Melanotropin-Peptidanalogone erfolgte mittels herkömmlicher Festphasen-Synthesetechniken. Die Nα-tert-butyloxylcarbonyl (Boc) geschützten Aminosäuren und ihre Derivate wurden an ein p-methylbenzhydrylaminharz mit einem 3-fachem Überschuß an Boc-geschütztem Aminosäurederivat, einem 2,4-fachen Überschuß an N-hydroxybenzotriazol (HOBt) aus 1 mmol/ml Lösung in DMF (außer bei His) und einem 2,4-fachen Überschuß an 1 mmol/ml Lösung aus Dicyciohexylcarbodiimid (DCC) in DMF gekuppelt. Die Kupplungsreaktion erfolgte 1 bis 3 Stunden lang in Dichlormethan und wurde mittels Ninhydrin- und/oder Chloraniltests überwacht und gegebenenfalls wiederholt. Reaktive Seitenketten von Aminosäuren wurden wie folgt geschützt: Lys durch 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl; Orn, Dab und Dpr durch Benzyloxycarbonyl; Trp durch Formyl; Arg durch Tosyl; His durch Tosyl; Glu und Asp durch Benzylester. Die Abspaltung der Nα-Boc Schutzgruppe erfolgte durch Behandlung mit 48% Trifluoressigsäure mit einem Gehalt von 2% Anisol in Dichlormethan während je 5 und 20 Minuten.
Ein Zyklus für das Einfügen eines jeden Aminosäurerückstands in die wachsende Peptidkette besteht aus dem Folgenden: 1) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2; (4 · 30 ml, 1 Min./Wäsche); 2) Entfernen des Boc-Schutzes bei jedem Schritt durch zwei Behandlungen mit 48% TFA in CH&sub2;Cl&sub2; mit einem Gehalt von 2% Anisol, während je 5 und 20 Minuten; 3) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2; (2 · 30 ml); 4) Neutralisieren mit 10% Diisopropylethylamin in CH&sub2;Cl&sub2; (2 · 30 ml, 3 Min./Wäsche); 5) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2; (3 x 30 ml, 2 Min./Wäsche); 6) Hinzugabe des Boc-geschützten Aminosäurederivats in 20 ml CH&sub2;Cl&sub2; (außer bei Trp, Arg und His, wenn DMF wegen des Löslichkeitsproblems durch CH&sub2;Cl&sub2; substituiert wurde), danach HOBT, danach DCC und schließlich 1- bis 3-stündiges Schütteln; 7) Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2; (3 · 30 ml, 2 Min./Wäsche); 8) Waschen mit 100% EtOH (3 · 30 ml, 2 Min./Wäsche). Der vollständige Kupplungsvorgang wurde überwacht und nach Kupplung der letzten Aminosäure wurde die Nα-Boc Schutzgruppe entfernt, die Aminogruppe neutralisiert und mit einem 10-fachen Überschuß an N-acetylimidazol in CH&sub2;Cl&sub2; oder unter Verwendung eines 1 : 1 Gemischs aus Essigsäureanhydrid : Pyridin in CH&sub2;Cl&sub2; (2-facher Überschuß, 1 Stunde lang) acetylisiert.
Der Schutz der Peptide wurde aufgehoben und aus dem Harz mit wasserfreiem flüssigem HF (10 ml/l g Harz) mit einem Gehalt von 10% Anisol und 8% 1,2-Dithioethan bei 0ºC 45 Minuten lang entfernt. Nach Verdunstung der flüchtigen Stoffe im Vakuum wurden die freien Peptide mit Diethylether oder Ethyl-Acetat (3 · 30 ml) gewaschen und dann mit 30% wasserhaltiger Lösung aus Essigsäure (3 · 30 ml) und destilliertem Wasser (3 · 30 ml) extrahiert. Das gebundene wasserhaltige Extrakt wurde lyophilisiert und ergab das rohe Peptid in Form ein weißen Pulvers. Jedes Peptid wurde mittels Säulenchromatographie auf Kationenaustausch-Carboxymethyl-Zelluloseharz (CMC) unter Verwendung eines diskontinuierlichen Gradienten des Ammoniumacetat-Puffers wie folgt gereinigt: 250 ml 0,01M NH&sub4;OAc (pH 4,5), 250 ml 0,01 M NH&sub4;OAc (pH 6,8), 250 ml 0,1 M NH&sub4;OAc (pH 6,8) und 250 ml 0,2 M NH&sub4;OAc (pH 6,8). Die Hauptspitze (Nachweis: 280 nm) eluierte während des letzten Teils von 0,01 M NH&sub4;OAc (pH 6,8), die erste Hälfte des Puffers von 0, 1 M NH&sub4;OAc (pH 6,8) wurde lyophilisiert und ergab ein gereinigtes Peptid in Form eines weißen Pulvers.
Die Struktur der zyklischen Alpha-Melanotropin-Analogone, die einen Teil der vorliegenden Erfindung enthält, ist der folgenden Tabelle zu entnehmen.

Struktur von zyklischen Alpha-Melanotropin-Analogonen

Nr. Primärsequenz
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Alpha-MSH Ac-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH&sub2;
15 Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH&sub2;
16 Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH&sub2;
17 Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH&sub2;
18 Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Orn-NH&sub2;
19 Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dab-NH&sub2;
20 Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dpr-NH&sub2;
Nr. Analogon
Alpha-MSH
15 Ac-[Nle&sup4; Glu&sup5; D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;, Gly¹¹]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub3;NH&sub2;
16 Ac-[Nle&sup4; Glu&sup5; D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;
17 Ac-[Nle&sup4; Asp&sup5; D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;
18 Ac-[Nle&sup4; Asp&sup5; D-Phe&sup7;, Orn¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;
19 Ac-[Nle&sup4; Asp&sup5; D-Phe&sup7;, Dab¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;
20 Ac-[Nle&sup4; Asp&sup5; D-Phe&sup7;, Dpr¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;
Die Peptidanalogone der vorliegenden Erfindung wurden wie in den folgenden Beispielen beschrieben hergestellt:

BEISPIEL XI

Ac-[Nle&sup4;, Glu&sup5;, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;, Gly¹¹]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub3;NH&sub2; Aus 1,0 g Nα-Boc-Val-p-MBHA Harz (0,7 mmol Naα-Boc-Val) wurde das geschützte Peptidharz der Titelbindung nach schrittweiser Kupplung der nachstehend genannten Nα-Boc geschützten Aminosäuren (in der Reihenfolge der Hinzugabe) hergestellt: Naα-Boc-Pro; Nα-Boc-Gly; Nα-Boc-Lys(N&epsi;-2,4-ClZ); Nα-Boc-Trp(Ni-For); Nα-Boc- Arg(Ng-Tos); Nα-Boc-D-Phe Nα-Boc-His(Nim-Tos); Nα-Boc-Glu(γ-Bzl); Nα-Boc-Nle. Nach Kupplung der letzten Aminosäure wurde die Nα-Boc Schutzgruppe entfernt, die Aminogruppe neutralisiert und mit entweder 10-fachem Überschuß an N-acetylimidazol in Dichlormethan (6 bis 8 Stunden) oder mit 2-fachem Überschuß eines 1 : 1 Gemischs aus Essigsäureanhydrid: Pyridin in Dichlormethan (1 bis 2 Stunden) und dem erhaltenen geschützten Peptidharz Ac-Nle-Glu(γ-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp (Ni-For)-Lys(N&epsi;-2,4-ClZ)-Gly-Pro-Val-p-MBHA acetylisiert. Eine Portion von 1,0 g (0,6 mmol) des geschützten Peptidharzes wurde 45 Minuten lang bei 0ºC mit 10 ml wasserfreiem HF bei Vorhandensein von 1 ml Anisol und 0,8 ml 1,2-Dithioethan behandelt. Nach HF verdunsteten Anisol und 1,2-Dithioethan im Vakuum, das getrocknete Produktgemisch wurde mit drei 30 ml Portionen Diethylether gewaschen und das Peptid wurde mit drei 30 ml Portionen 30% Essigsäure extrahiert. Nach der Lyophilisation des wasserhaltigen Extrakts des Peptids wurden 325 mg des rohen Peptids Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH&sub2; in Form eines weißen Pulvers erhalten. 150 mg des rohen Ac-[Nle&sup4; D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;, Gly¹¹]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub3;NH&sub2; wurden einer Reinigung unterzogen, die das Auflösen des rohen Peptids in 2-4 ml 0,01 M NH&sub4;OAc, pH 4,5 beinhaltete, und in einer Carboxymethylzellulose-Säule (2,0 · 25,0 cm) mit einem diskontinuierlichen Gradienten (je 250 ml) von 0,01 (pH 4,5), 0,01 und 0,2 M NH&sub4;OAc (pH 6,8) chromatographiert. Die bei 280 nm nachgewiesene Hauptspitze wurde während der ersten Hälfte des Puffers aus 0,1 M NH&sub4;OAc (pH 6,8) eluiert und lyophilisiert und ergab 104 mg eines weißen Pulvers. Das CMC reine Ac-[Nle&sup4;, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;, Gly¹¹]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub3;NH&sub2; wurde mittels HPLC unter Verwendung eines 0,1% Trifluoracticsäure-Puffers und Acetonitril als organischer Modifizierer in einer Vydac 218TP15-16 C&sub1;&sub8;RP (25 cm · 25 cm) halbpräparativen Säule weiter gereinigt. 100 mg des Peptids wurden HPLC-gereinigt und ergaben 74 mg reines Ac-[Nle&sup4;, D-Phe&sup7; Lys¹&sup0;, Gly¹¹]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub3;NH&sub2; Peptid. 40 mg des reinen Ac-[Nle&sup4; D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;, Gly¹¹]- Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub3;NH&sub2; wurden in 1 ml 5% HCl wasserhaltiger Lösung aufgelöst und in einer Diethylaminoethylzellulose-Säule (aus Chlorwasserstoffsäure) (1,0 · 15,0 cm) mit 100 ml der 5% HCl wasserhaltigen Lösung chromatographiert und die eluierte Spitze wurde bei 280 nm überwacht. Die Lyophilisation der gesammelten Peptidspitze ergab 35 mg Ac-[Nle, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;, Gly¹¹]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub3;NH&sub2; · HCl Salz. Das Peptidsalz wurde in 3 ml trockenem DMF und sekundäraminfreiem DMF aufgelöst (unter verringertem Druck aus Ninhydrin destilliert). Zu der Peptidlösung in DMF wurde wasserfreies K&sub2;HPO&sub4; hinzugegeben, das Reaktionsgemisch wurde in einem Eissalzbad auf 0ºC abgekühlt und 17 ul Diphenylphosphorylazid wurden hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0ºC gerührt, danach wurde das ganze Reaktionsgefäß in den Kaltraum mit 12ºC transferiert. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 12ºC gerührt. Die vollständige Durchführung der Reaktion wurde mittels HPLC (Vydac-Säule, 25,0 cm · 4,6 mm mit 0,1% Trifluoressigsäure/CH&sub3;CN) überwacht. Auch der Ninhydrin-Test wurde zur Feststellung der vollständigen Durchführung der Zyklisierung verwendet. Das Ac-[Nle&sup4;, Glu&sup5;, D-Phe&sup7; Lys¹&sup0;, Gly¹¹]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub3;NH&sub2; wurde nach dem Löschen der Reaktion mit 10% wasserhaltiger HOAc-Lösung durch Entsalzen in einer P&sub4; Polyacrylamidsäule (80,0 cm · 1,0 cm) unter Verwendung von 30% HOAc und halbpräparativem HPLC gereinigt und ergab 16 mg des zyklischen Peptids Ac-[Nle&sup4;, Glu&sup5; D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;, Gly¹¹-]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub3;NH&sub2;.

BEISPIEL XII

Ac-[Nle&sup4;, Glu&sup5;, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;

Die Titelbindung wurde aus 2,0 g Nα-Boc-Lys(Nα-2,4-ClZ)-p-MBHA Harz (1,0 mmol/g Nα-Boc-Lys(Nα-2,4-ClZ) hergestellt, das geschützte Peptidharz der Titelbindung wurde nach schrittweiser Kupplung der nachstehend genannten Nα-Boc geschützten Aminosäuren (in der Reihenfolge der Hinzugabe) hergestellt: Nα-Boc-Trp(Ni-For); Nα-Boc-Arg-(Ng-Tos); Nα-Boc-D-Phe Nα-Boc-His(Nim-Tos). Das entstehende geschützte Peptidharz, Nα-Boc-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)- Lys(N&epsi;-2,4-Cl&sub2;Z)-p-MBHA Harz, wurde in zwei Hälften geteilt. Eine Portion von 1,4 g (0,5 mmol) des geschützten Pentapeptidharzes wurde nach Kupplung von Nα-Boc- Glu(γ-Bzl) und Nα-Boc-Nle in das geschützte Titelpeptidharz überführt. Nach Kupplung der letzten Aminosäure wurde die Nα-Boc Schutzgruppe entfernt, die Aminogruppe neutralisiert, wie in Beispiel XI beschrieben acetylisiert und ergab das geschützte Peptidharz Ac-Nle-Glu-(γ-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys (N&epsi;-2,4-Cl&sub2;Z)-p-MBHA. 1,0 g des geschützten Peptidharzes wurde der Abspaltung mittels flüssigem HF unterzogen. Das Peptid wurde wie in Beispiel XI beschrieben verarbeitet und ergab 356 mg rohes Ac-[Nle&sup4; D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2; Peptid in Form eines weißen Pulvers. 100,0 mg des rohen Peptids wurden der in Beispiel XI beschriebenen Reinigung unterzogen und ergaben 65 mg HPLC reines Ac-[Nle&sup4; D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2; Peptid. 40 mg dieses reinen Peptids wurden wie in Beispiel XI beschrieben zyklisiert und ergaben 13 mg HPLC reines Ac-[Nle&sup4;, Glu&sup5; D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;.

BEISPIEL XIII

Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5; D-Phe Lys¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub4;

Aus 1,4 g (0,5 mmol) Boc-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(N-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(N&epsi;-2,4- Cl&sub2;Z)-p-MBHA Harz wurde das geschützte Peptidharz der Titelbindung durch schrittweise Kupplung von Nα-Boc-Asp(β-Bzl) und Nα-Boc-Nle hergestellt. Jede Kupplungsreaktion wurde unter Einhaltung des Kupplungsvorgangs gemäß der allgemeinen Festphasenpeptid-Methodologie erreicht. Nach Kupplung der letzten Aminosäure wurde die Nα-Boc Schutzgruppe entfernt, die Aminogruppe neutralisiert und wie in Beispiel XI beschrieben acetylisiert, um das geschützte Peptidharz Ac-Nle-Asp(β-Bzl)-His(Nim-Tos)- D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Lys(N&epsi;-2,4-Cl&sub2;Z)-p-MBHA zu ergeben. 1,0 g des im Vakuum getrockneten Peptidharzes wurde abgespalten, wie in Beispiel XI beschrieben verarbeitet und ergab 370 mg rohes Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7; Lys¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;. Eine Portion des rohen Heptapeptids (110 mg) wurde wie in Beispiel XI beschrieben gereinigt und ergab 82 mg linearen Titelpeptid-Präkursor in Form eines weißen Pulvers. 40,0 mg des reinen Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;, Lys¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2; wurden einer Zyklisierung unterzogen und ergaben nach Durchführung der HPLC Reinigung 12 mg reines Ac-[Nle&sup4;, Asp³, D-Phe&sup7; Lys¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;.

BEISPIEL XIV

Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;, Orn¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;

In 1,0 g p-MBHA Harz (0,7 mmol/g) wurde durch Kupplung gemäß allgemeinem Festphasenverfahren Nα-Boc-Orn(Nγ-z) gegeben. Nach einstündiger Kupplung wurde die Reaktion gestoppt, das Harz gewaschen, neutralisiert und die freie Aminogruppe auf dem Harz mit 2-fachem Überschuß eines 1 : 1 Gemischs aus Essigsäureanhydrid:Pyridin in Dichlormethan 1 Stunde lang acetylisiert. Danach wurden die folgenden Aminosäuren nacheinander mit dem Harz schrittweise gekuppelt: Nα-Boc-Trp(Ni-For); Nα-Boc-Arg- (Ng-Tos); Nα-Boc-D-Phe; Nα-Boc-His(Nim-Tos); Nα-Boc-Asp(β-Bzl); Nα-Boc-Nle. Jede Kupplungsreaktion wurde unter Einhaltung des Kupplungsvorgangs gemäß der allgemeinen Festphasenpeptid-Methodologie erreicht. Nach Kupplung der letzten Aminosäure wurde die Nα-Boc Schutzgruppe entfernt, die N-terminale Aminogruppe neutralisiert und acetylisiert, um das geschützte Peptidharz Ac-Nle-Asp(β-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe- Arg(Ng-Tos)-Trp(Ni-For)-Orn(Nγ-Z)-p-MBHA zu ergeben. Eine Portion von 1,0 g des im Vakuum getrockneten Peptidharzes wurde abgespalten, wie in Beispiel XI beschrieben verarbeitet und ergab 332 mg rohes Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5; D-Phe&sup7;, Orn¹&sup0;]-Alpha- MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;. 105 mg des rohen Heptapeptids wurden wie in Beispiel XI beschrieben gereinigt und ergaben 78 mg lineares Peptid in Form eines weißen Pulvers. 40,0 mg des reinen Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5; D-Phe&sup7; Orn¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2; wurden der in Beispiel XI beschriebenen Zyklisierung unterzogen und ergaben nach ordnungsgemäßer Durchführung 15 mg reines Ac-[Nle&sup4;, Asb&sup5; D-Phe&sup7; Orn¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;.

BEISPIEL XV

Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7; Dab¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;

1,0 g p-MBHA Harz (0,7 mmol/g) wurde gemäß allgemeinem Festphasenverfahren mit Nα-Boc-Dab(Nγ-z) gekuppelt. Nach einstündiger Kupplung wurde die Reaktion gestoppt, das Harz gewaschen, neutralisiert und die unreagierte Aminogruppe auf dem Harz mit 1-fachem Überschuß eines 1 : 1 Gemischs aus Essigsäureanhydrid : Pyridin in Dichlormethan 1 Stunde lang acetylisiert. Danach wurden die folgenden Aminosäuren nacheinander mit dem Harz schrittweise gekuppelt: Nα-Boc-Trp(Ni-For); Nα-Boc-Arg- (Ng-Tos); Nα-Boc-D-Phe; Nα-Boc-His(Nim-Tos); Nα-Boc-Asp-(β-Bzl) und Nα-Boc-Nle. Nach Kupplung der letzten Aminosäure wurde die Nα-Boc Schutzgruppe entfernt, die N-terminale Aminogruppe neutralisiert, wie in Beispiel XI beschrieben acetylisiert und ergab das geschützte Peptidharz Ac-Nle-Asp(β-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)- Trp(Ni-For)-Dab(Nγ-Z)-p-MBHA 1,0 g des im Vakuum getrockneten Peptidharzes wurde abgespalten, verarbeitet und ergab 318,2 mg rohes Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7;, Dab¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;. 100,0 mg des rohen Heptapeptids wurden gereinigt und ergaben 78,2 mg lineares Peptid in Form eines weißen Pulvers. 45,0 mg des reinen Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5; D-Phe&sup7;, Dab¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2; wurden wie oben beschrieben zyklisiert, wie oben beschrieben gereinigt und ergaben 13,2 mg reines Ac-[Nle&sup4;, Ass D-Phe&sup7;, Dab¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;.

BEISPIEL XVI

Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5; D-Phe&sup7; Dpr¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;

1,0 g p-MBHA Harz (0,7 mmol/g) wurde gemäß allgemeinem Festphasenverfahren mit Nα-Boc-Dpr(Nβ-Z) gekuppelt. Nach einstündiger Kupplung wurde die Reaktion gestoppt, das Harz gewaschen, neutralisiert und die unreagierte Aminogruppe mit 2-fachem Überschuß eines 1 : 1 Gemischs aus Essigsäureanhydrid : Pyridin in Dichlormethan 1 Stunde lang acetylisiert. Danach wurden die folgenden Aminosäuren nacheinander mit dem Harz schrittweise gekuppelt: Nα-Boc-Trp(Ni-For); Nα-Boc-Arg-(Ng-Tos); Nα-Boc-D-Phe; Nα-Boc-His(Nim-Tos); Nα-Boc-Asp(β-Bzl); Nα-Boc-Nle. Nach Kupplung der letzten Aminosäure wurde die Nα-Boc Schutzgruppe entfernt, die N-terminale Aminogruppe neutralisiert, wie in Beispiel M beschrieben acetylisiert und ergab das geschützte Peptidharz Ac-Nle-Asp(β-Bzl)-His(Nim-Tos)-D-Phe-Arg(Ng-Tos)-Trp (Ni-For)-Dpr(β-Z)-p-MBHA. 1,0 g des im Vakuum getrockneten Peptidharzes wurde abgespalten, wie unter Punkt 1 beschrieben verarbeitet und ergab 310,8 mg rohes Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5; D-Phe&sup7;, Dpr¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;. 115,0 mg des rohen Heptapeptids wurden wie in Beispiel XI beschrieben gereinigt und ergaben 82,5 mg lineares Peptids in Form eines weißen Pulvers. 38,3 mg des reinen Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5; D-Phe&sup7;, Dpr¹&sup0;]-Alpha- MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2; wurden zyklisiert, wie oben beschrieben gereinigt und ergaben 11,3 mg reines Ac-[Nle&sup4;, Asp&sup5;, D-Phe&sup7; Dpr¹&sup0;]-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;
Die biologische Wirksamkeit des Alpha-MSH, die linearen und die zyklischen Analogone wurden durch ihre Fähigkeit bestimmt, die Melanosomdispersion in vitro in der Bioprüfüng an Frosch- und Eidechsenhaut zu stimulieren. Diese in vitro Prüfungen ergeben scharf begrenzte Dosiswirkungskurven (zwischen 2,5 · 10&supmin;¹¹ und 4 · 10&supmin;¹&sup0; M) und können eine minimale Alpha-MSH-Konzentration von ca. 10&supmin;¹¹ M nachweisen. Die Prüfungen basierten auf der Zentrifugaldispersion der Melanosome (Melaninkörnchen) innerhalb der Dendritprozesse integumentaler, dermaler Melanophoren, die zu einer Verdunklung der Haut führen. Alle Testlösungen wurden mittels serieller Verdünnung einer Vorratslösung (10&supmin;&sup4;) hergestellt. Die für diese Auswertungen verwendeten Frösche (Rans pipiens) stammten von Kons Scientific, Germantown, WI, und die Eidechsen (Anolis carolinensis) von der Snake Farm, La Place, LA. Die biologischen Aktivitäten der zyklischen Alpha-Melanotropin-Analogone sind der folgenden Tabelle zu entnehmen: Analogon Biologische Wirksamkeit Frosch Eidechse Restaktivität Alpha-MSH
Unsere vorhergehenden Patente (US-A-4.457.864 und 4.485.039), auf deren Beschreibungen sich insgesamt bezogen wird, zeigten die Bedeutung der Konformationsbeschränkung der aktiven Position des Alpha-MSH. Der Zyklisierungszwang des Alpha- MSH an den Positionen 4 und 10 unter Verwendung der pseudo-isosterischen Substitution von Met-4 und Gly-10 durch Cys-Aminosäuren führte zu einer vielfachen Steigerung der Melanocyten-Dispersionsaktivität des synthetisierten Analogons. Die Wirksamkeitssteigerung der zyklischen Analogone verglichen mit der ihrer linearen Vorläufer hing deutlich von der durchgeführten Bioprüfung ab. Unser Hauptinteresse lag in dem Erhalt von Analogonen mit hoher Wirksamkeit auf Eidechsenhaut, da die Aktivität der letzteren Bioprüfung linear mit der Aktivität in Säugetiersystemen in Wechselbeziehung steht. Die Hauptmerkmale der zyklischen Analogone [Cys&sup4;, Cys¹&sup0;]-Alpha-MSH bestanden darin, daß sie eine geringe Aktivität in der Bioprüfung an Eidechsenhaut und eine hohe Wirksamkeit an Froschhaut aufwiesen; und dies auch bei 500-facher Reduzierung der Aktivität nach Ringgrößenreduzierung (22-gliedriger Ring) oder Vergrößerung (24-gliedriger Ring) im Vergleich zu der optimierten Ringgröße (23-gliedriger Ring). Der Konformationszwang des Alpha-MSH durch Lactambindung zwischen Aminosäuren an den Positionen 5 und 10 führte zu einer Gruppe zyklischer Verbindungen, die einen Teil der vorliegenden Erfindung enthalten. Die bei dem 23-gliedrigen Ring zentrierte Ringgröße ergab bei Bindung 17 die stärkste biologische Wirksamkeit in Eidechsenhaut ohne nennenswerte Veränderung der Wirksamkeit bei der Froschhautprüfung. Die Steigerung der Wirksamkeit zwischen dem zyklischen Analogon und dem linearen Vorläufer liegt bei einer zehnfachen Größenordnung. Die Wirksamkeit des zyklischen Analogons 16 wird im Vergleich mit dem linearen Analogon nicht sehr beeinflußt. Es tritt aber eine bedeutende Änderung mit dem Auftreten der verlängerten Aktivität in dem zyklischen Analogon ein. Das C-terminale Tripeptid, Gly-Pro-Val, hat auf die Wirksamkeit dieser Analogone, wie in Bindung 15 zu erkennen, keine Auswirkungen. Ein wichtiger Faktor bei diesen zyklischen Lactam-Peptiden ist die Verlängerung der Aktivität des zyklischen Analogons verglichen mit dem linearen Analogon. Die Bindungen der vorliegenden Erfindung sind hinsichtlich einem oder mehreren der folgenden Merkmale höherwertiger als das Alpha- MSH: Wirksamkeit gemäß Messung mittels in vivo und in vitro Bioprüfungen an Froschund/oder Eidechsenhaut; Dauer des in vivo Effekts bei derartigen Prüfungen; und/oder Widerstandsfähigkeit gegen den Abbau durch Blutserumenzyme.
Die Präparate gemäß der vorliegenden Erfindung können transdermal verabreicht werden und werden in geeigneten Zusammensetzungen je nach beabsichtigter Verabreichungsart in Übereinstimmung mit den in der Technik wohlbekannten Methoden und Verfahren angesetzt. Beispielsweise können die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeigneten Präparate je nach gewünschter Anwendungsart der Ingredienzen auf der Haut eines Individuums mit verschiedenen herkömmlichen Grundstoffen wie Cremes, Salben, Gelen, Lotionen oder Sprays angesetzt oder gemischt werden. Bei der Herstellung dieser Präparate kann die Masse auch mit herkömmlichen Eindickungsmitteln, Weichmachern, Tensiden, Pigmenten, Parfüms, Konservierungsmitteln, Füllstoffen und Emulgatoren gemischt werden. All diese sind wohlbekannt und werden normalerweise in Mischungsansätzen transdermaler Präparate benutzt. Bezeichnenderweise werden diese nichtaktiven Ingredienzen den größeren Teil des Endpräparats ausmachen. Vorzugsweise sollten die Zusammensetzungen so hergestellt werden, daß eine verzögerte oder zeitlich gesteuerte Abgabe möglich ist.
Durch die bemerkenswerten Eigenschaften des Präparats der vorliegenden Erfindung ist es ebenfalls als Ersatz für Alpha-MSH und [Nle&sup4;]-Alpha-MSH in der derzeitigen diagnostischen und therapeutischen Forschung sowie in der Grundlagenforschung geeignet. Im Bereich der Diagnoseverfahren ist es offensichtlich, daß die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, insbesondere diejenigen, die radiojodiert oder mit Gammastrahlen gekuppelt wurden, außergewöhnlich gut geeignet sind zur Lokalisierung und/oder differentiellen Beschreibung von Melanom-Zellen auf der Grundlage der Assoziierung mit Melanotropin-Rezeptoren in diesen Zellen. Die Serumstabilität der Verbindungen der vorliegenden Erfindung macht sie äußerst bedeutend für die genannten selektiven Arzneimittelliefersysteme für Zielgewebe mit hoher Konzentration von Melanotropin-Rezeptoren. Die relativ starke Wirksamkeit und die verlängerte Aktivität der Verbindungen der Erfindung hinsichtlich des Phänomens der Farbänderung verdoppeln sich voraussichtlich im Kontext mit anderen biologischen Effekten, die zuvor bei dem natürlichen Auftreten von Melanocyten stimulierenden Hormonen und synthetischen Analogonen festgestellt wurden.

Claims

1. Ein lineares Alpha-MSH-Analogon, das ein Ac-Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;-Analogon ist mit der allgemeinen Formel:

Ac[Nle&sup4;, Xxx&sup5;, D-Phe&sup7;, Yyy¹&sup0;]Alpha-MSH&sub4;&submin;&sub1;&sub0;NH&sub2;

worin Xxx Glu oder Asp und Yyy Lys, Orn Dab oder Dpr ist.

2. Ein lineares Alpha-MSH-Analogon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH&sub2;

Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH&sub2;

Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH&sub2;

Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH&sub2;

Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Gly-NH&sub2;

Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH&sub2;

Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH&sub2;

Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Orn-NH&sub2;

Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Orn-NH&sub2;

Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Dab-NH&sub2;

Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dab-NH&sub2;

Ac-Nle-Asp-His-D-Plie-Arg-Trp-Dpr-NH&sub2;

Ac-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Lys-NH&sub2;

Ac-Nle-Asp-His-Phe-Arg-Trp-Lys-NH&sub2;

3. Ein zyklische Alpha-MSH-Analogon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-Gly-Pro-Val-NH&sub2;

Ac-Nle-Glu-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH&sub2;

Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-NH&sub2;

Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Orn-NH&sub2;

Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dab-NH&sub2;

Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Dpr-NH&sub2;

4. Ein pharmazeutisches Präparat bestehend aus einer Verbindung nach einem der obigen Ansprüche und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel.

5. Ein kosmetisches Präparat bestehend aus einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zusammen mit einem kosmetisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel.

6. Die Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Medikaments mit melanotroper Wirkung.

7. Die Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Arzneimittel-Liefersystems.

8. Die Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Diagnosemittels.