DE3850428T2 - Aktivierte RNase L als Markierung für Virus-Infektionen. - Google Patents

Description

• AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome, erworbenes Immundefizienz-Syndrom) stellt eine schwerwiegende gesundheitliche Bedrohung für die Bevölkerung im zwanzigsten Jahrhundert dar. Wegen seiner biologisch variablen Natur, seiner schleichenden Verbreitungsmethoden von Person zu Person und seiner "latenten" Krankheitsperiode, die sogar die schnelle Feststellung seiner bloßen Anwesenheit verhindert, entwickelte sich AIDS rasch zu einem epidemiologischen Dilemma von noch nie dagewesenem Ausmaß. Auch wenn man die beträchtlichen Geldmittel bedenkt, die bereits in die Steigerung der diagnostischen Möglichkeiten investiert wurden, liefern die zur Verfügung stehenden Technologien noch lange nicht die notwendigen Erfordernisse zur Erreichung einer eindeutigen Kontrolle dieses Problems innerhalb eines beliebigen Sektors der Bevölkerung, vgl. z. B. die Berichte des Workshops mit dem Titel "Erfahrung mit HTLV-III Antikörper-Untersuchungen, eine auf letzten Stand gebrachte Zusammenfassung über Screening, Laboratoriums- und epidemiologische Zusammenhänge", gesponsert vom Center for Drugs and Biologics, FDA, National Institutes of Health, und den Centers for Disease Control, abgehalten am 31. Juli 1985 in den National Institutes of Health Bethesda, Maryland; vgl. auch Budiansky, S. in Nature, Band 316, Seite 96, 11. Juli 1985.
• Es existieren verschiedene unterschiedliche Bezeichnungen für das Humane Immundefizienz- Virus (HIV); LAV ist die Bezeichnung für das im Institut Pasteur, Paris, Frankreich, isolierte HIV-Virus und HTLV-III (Humanes T-Zellen lymphotropes Virus) ist die Bezeichnung für das HIV-Virus, das an den National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA isoliert wurde. Häufig wird in diesem Text das HIV-Virus als Gattungsbegriff genannt oder mit HTLV-III oder LAV bezeichnet, ohne daß die Absicht besteht, zwischen diesen zu unterscheiden. Außerdem umfaßt der Ausdruck "HIV" in der Beschreibung beliebige und alle anderen Viren, die mit der Hervorrufung von AIDS im Zusammenhang stehen, unabhängig davon, ob sie bisher isoliert wurden oder nicht. Das HIV-Virus in der Einzahl ist so gedacht, daß es beliebige HIV-Typen, unabhängig von ihren genomischen Inhalten, umfaßt. In ähnlicher Weise wird allgemein auf die AIDS-Symptome Bezug genommen, um Symptome, die von HIV (nach obiger Definition) verursacht werden, ARC oder AIDS- verwandten Komplex (AIDS related complex), das Lymphadenopathie-Syndrom (LAS) und andere Viren, die im wesentlichen ähnliche klinische Erscheinungsbilder hervorrufen, zu umfassen.
• Die derzeitigen therapeutischen Betrachtungen bedienen sich einer der beiden Richtungen: des immunologischen Weges (Impfstoffproduktion) oder des direkten Angriffs auf das Virus selbst (antivirale Therapie). Obwohl die Impfstoffproduktion anfänglich, zumindest in der Theorie, äußerst vielversprechend erschien, hat die neue Kenntnis der Zusammensetzung des Virus diese Vorhersagen beträchtlich untergraben; das Virus mutiert nämlich offensichtlich sehr leicht oder ändert seine grundlegende biochemische Struktur, sodaß kritische virale antigene "Determinanten" - die notwendig für die Wirksamkeit eines Impfstoffs sind - leicht eine Mutation oder Veränderung erfahren. Beispielsweise haben sich in letzter Zeit HTLV-III-Isolate aus Californien, Maryland und England als voneinander deutlich verschieden erwiesen, als ihre genomischen Inhalte einer strengen Prüfung unterzogen wurden. Die Folge solcher Untersuchungen ist, daß eine Impfung gegen HIV keine so weitverbreiteten andauernden Wirkungen haben wird wie die schlüssigen vorteilhaften und andauernden Erfolge, die in der Geschichte für die meisten Impfstoffe charakteristisch waren, wie etwa jene gegen das Polio-Virus, das Masern- Virus etc.
• Bei dem zweiten oder direkten antiviralen Weg haben andere Wissenschafter verschiedene Verbindungen, wie AZT, HPA-23, Suramin, Ribavirin, Interferon und Fascarnet, geprüft. Diese Verbindungen wurden bis heute entweder in Laboratoriumsuntersuchungen oder klinischen Studien mit begrenztem oder gültigem Beweis eines therapeutischen Erfolgs eingesetzt. Tatsächlich wurde in nahezu allen Fällen ein gleichzeitiges Auftreten von hoher Toxizität und/oder schweren Nebenwirkungen berichtet (z. B. vgl. die Zusammenfassung von M. Clark, Newsweek, Seite 71, vom 5. August 1985; ebenso C. Wallis, Time, Seiten 40-47, vom 12. August 1985). Keines dieser Arzneimittel ist tatsächlich neu oder imstande, selektiv gegen die grundlegende Störung zu wirken: nämlich die Vermehrung von HIV in bestimmten Zellen. Beispielsweise ist HPA-23 eine Kombination von Schwermetallen (in Erinnerung an die Verwendung von Arsen zur Behandlung von venerischen Krankheiten in den 1920er Jahren oder der Zeit vor dem Penicillin); Suramin ist tatsächlich eine antiparasitär wirkende Verbindung (Schlafkrankheit) und Fascarnet ist eine Verbindung mit Wirkung gegen das Herpes-Virus. Die letztgenannten zwei Verbindungen mögen ein mit HIV im Zusammenhang stehendes Enzym mit der Bezeichnung "reverse Transcriptase" inhibieren, jedoch besteht kaum ein Beweis dafür, daß eine derartige enzymatische Inhibition tatsächlich zu einer signifikanten therapeutischen Verbesserung oder Verhinderung/Linderung der Krankheit führt. AZT mag mit einer geringen Verlängerung der Lebenszeit von AIDS-Opfern zusammenhängen, doch ist es hochgradig toxisch und löscht das HIV nicht endgültig aus (R. Yarchoan et al., Lancet, 15. März, S. 575, 1986; R.E. Chaisson et al., New England Journal of Medicine, Band 315, S. 1611, 1986).
Progressive Merkmale von AIDS
• AIDS folgt der progressiven Zerstörung des Immunsystems, die durch die Infektion mit dem Humanen Immundefizienz-Virus HIV hervorgerufen ist. Im frühen Krankheitsstadium wird die Zell-mediierte Immunität geschwächt durch einen Verlust von T-Zellen (von Thymus stammenden Zellen), die das sogenannte T4 Antigen exprimieren, wobei eine Untergruppe der T-Zellen hauptsächlich aus T-Helfer- und Induzier-Zellen besteht. Der Mangel an T4-Zellen kann zu verschiedenen Defiziten in der Zell-mediierten Immunität führen, inklusive des Defizits an NK (Natürlichen Killerzellen), LAK (Lymphokin-aktivierten Killerzellen) und zytolytischen T-Zellen. Es bestehen bei AIDS auch B-Zell-(von Knochenmark - bone marrow - stammende Zellen)-Defekte.
• AIDS scheint eine progressive Krankheit zu sein, obwohl die Übergangsgeschwindigkeit von einer Phase zu der anderen unterschiedlich sein kann. Diese Phasen werden zum Zweck der Klassifizierung herangezogen. Es gibt asymptomatische mit HIV infizierte Personen, die manchmal seropositiv genannt werden, was durch die Anwesenheit von zirkulierenden Antikörpern gegen das Virus beurteilt wird (M.G. Sarngadharan et al., Science, Band 224, S. 506, 1984). Wenn sie keine anderen Marker aufweisen, sind diese Patienten solche der Stufe WR1 nach der Einteilung von Walter Reed (R.R. Redfield et al., New England Journal of Medicine, Band 314, S. 131, 1986). Sie wurden auch als Personen mit pre-ARC (ARC = AIDS related complex) bezeichnet, obwohl manche von diesen Personen nie die ARC-Symptomatologie entwickeln. Manche dieser Patienten können Lymphadenopathie (WR2) entwickeln und zeigen ein T4-Zelldefizit (WR3); als nächstes nimmt die Fähigkeit der Lymphozyten, eine Antigen-stimulierte Proliferation einzugehen und eine Antigen-stimulierte Interferon-gamma-Produktion zu entwickeln, ab und die WR4-Patienten beginnen, die verzögerte cutane Hypersensitivität zu verlieren. WR5-Patienten sind in der Regel anergisch. Sie weisen Herpes Zoster Infektionen, orale Candidiasen (Mundfäule) oder ARC Symptome auf, die langanhaltendes Fieber, Nachtschweiß, Müdigkeit, Durchfälle und/oder Gewichtsverlust beinhalten. Diese Periode des ARC ist im allgemeinen auch durch einen progressiven Immunverfall gekennzeichnet. Schließlich erleiden WR6 Patienten opportunistische Infektionen, die "voll ausgebrochenes" oder deutliches AIDS darstellen, wobei 50% der Patienten innerhalb von 12 Monaten sterben (H.W. Murray et al., New England Joumal of Medicine, Band 310, S. 883, 1984).
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
• Fig. 1 ist eine Photographie einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Platte die 7 Spuren und Banden oder Zonen entlang jeder Spur zeigt; und
• Fig. 2 ist eine Darstellung des 2'-5'-Oligoadenylat/RNase L - Pfades.
Zusammenfassung der Erfindung
• Es wurde eine Inhibitorsubstanz entdeckt, die von Zellen, die mit dem Humanen Immunodefizienz-Virus infiziert sind, freigesetzt oder zur Freisetzung veranlaßt wird. Dieser Inhibitor scheint physikalisch an dem Enzym RNase L, dem Endprodukt des 2'-5'-Oligoadenylat/RNase L - Pfades, zu hängen, wodurch das gesamte Immunsystem nicht mehr funktioniert und es den Viren erlaubt wird, sich unkontrolliert zu vermehren. Es werden Verfahren zur Identifizierung dieser Inhibitoren entweder auf direktem oder auf indirektem Weg durch Fehlen der RNase L oder Inaktivität der RNase L oder durch die Anwesenheit von Inhibitoren biochemischer Zwischenprodukte in dem 2'-5'A/RNase L-Pfad geoffenbart, wobei der Inhibitor oder die Inhibitoren als Marker dient bzw. dienen, um die Anwesenheit von HIV oder damit zusammenhängender Viren, die im wesentlichen ähnliche klinische Zustände verursachen, festzustellen. Eine prognostische Signifikanz dieses Markers im Hinblick auf die Entwicklung von voll ausgebrochenem AIDS bei Patienten, insbesondere solchen, die Antikörper gegen HIV in ihrem peripheren Blut und in bluthaltigen Geweben, Blutfraktionen, Zellen von Transplantationsorganen und Zellextrakten haben, wird auch diskutiert.
Störungen in der zellulären "ersten Abwehrlinie" (2'-5'-Oligoadenylat-Pfad) bei AIDS
• Verschiedene Studien deuten darauf hin, daß der 2'-5'-Oligoadenyl-Pfad (in der medizinischen Literatur auch als Interferon-2'-5'-Weg bezeichnet) bei AIDS nicht funktioniert. Dieser Pfad ist ein integraler Teil des Körperabwehrsystems gegen Infektionen. Bei AIDS und verschiedenen Vorstufen (z. B. ARC) oder LAS (Lyrnphadenopathiesyndrom) werden die proximalen Enzyme/Faktoren des Pfades "eingeschaltet" oder aktiviert, doch das AIDS-Virus vermehrt sich immer noch. Zum Beispiel ist der Interferon-Spiegel in der Regel erhöht und das Enzym 2-5A-Synthetase ist ebenfalls erhöht. Jedoch waren der Mechanismus dieser Erhöhungen und insbesondere das Nichtablaufen des Pfades, wenn sie zumindest zum Teil eingeschaltet waren, um das HIV zumindest bis zu einem gewissen Ausmaß zu inhibieren, bis zu den hier berichteten Untersuchungen ein vollständiges Rätsel.
• Als Ergebnis meiner Forschungen habe ich einen Inhibitor identifiziert, der sekundär zu einer bestehenden HIV-Infektion ist, und habe festgestellt, daß dieser Inhibitor den antiviralen Abwehrmechanismus lähmt und damit zum vollen Ausbruch von AIDS beiträgt.
• Fig. 1 liefert eine Charakterisierung von RNase L in ARC/AIDS-Patienten, die HIV-Beladungen während einer dsRNA-Therapie (AMPLIGEN R, eine eingetragene Handelsmarke von HEM Research, Inc. in Rockville, Maryland, USA) in dem peripheren Blut rasch ausklaren. Die Anwesenheit oder das Fehlen von aktivierter RNase L in zytoplasmischen Extrakten von mononuclearen Zellen des peripheren Blutes (PBMC) von Patienten wurde durch die Fähigkeit bestimmt, spezifische Spaltungsprodukte (SCP) aus 28S und 18S rRNA gemäß den Verfahren von K. Kariko und J. Ludwig, Biochem. Bionhvs. Research Communication, Band 128, S.
• 695, 1985; D.H. Wreschner et al., Nucleic Acid Research, Band 9, S. 1571, 1981, zu erzeugen. Ribosomale RNA (die zwei Molekülspezies mit der Bezeichnung 28S und 18S enthält) verhält sich ähnlich der viralen (z. B. HIV) RNA, indem sie der Spaltung durch aktivierte RNase L, jedoch nicht durch inaktive RNase L, zugänglich ist. Aktivierte RNase L ist dadurch gekennzeichnet, daß sie an ihre Molekularstruktur ein Übermaß an 2-5A-Oligomeren gebunden und eine geringe, wenn überhaupt vorhandene, Bindung von Inhibitor aufweist. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Fig. 1 gezeigt, einer Photographie einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Platte. Tabelle I ist eine Zusammenfassung von Daten, die von 10 Patienten, die eine Therapie mit Ampligen erhielten, zusammengefaßt wurden.
• Extrakte von HL929 Zellen (RNase L minus), die als Quelle für ribosomale RNA verwendet wurden, wurden 1 Stunde in Abwesenheit (Spur 1) oder Anwesenheit (Spur 2) von PBMC zytoplasmischen Extrakten von einer gesunden Vergleichsperson oder von ARC- oder AIDS-Patienten (alle codiert) vor der Ampligen-Therapie (Spuren 3 und 4 sind Vorbehandlungsproben der Patienten 3 bzw. 7) inkubiert. Die Spuren 1, 3 und 4 zeigten, wie durch die Banden in dem (den) SCP Bereich(en) des Gels angedeutet, keinen Beweis für irgendeine aktivierte RNase L.
• Vor der Therapie zeigten auch die Extrakte aller ARC/AIDS-Patienten keine Aktivierung (keine SCP), selbst wenn exogene bioaktive Oligoadenylate [2'5'-p&sub3;A&sub3; (10&supmin;&sup8;M)] zugeführt wurden (nicht dargestellte Gele), was die Nichtverfügbarkeit irgendwelcher funktioneller RNase L Moleküle in den Lymphozyten des Patienten vor der Ampligen-Behandlung bestätigte. Im Gegensatz dazu wurde gleichzeitig mit der Ampligen- Behandlung eine progressive in vivo Aktivierung von RNase L beobachtet: bei ARC Patient 3 (Spur 5 nach 8 Wochen und Spur 6 nach 16 Wochen Therapie); bei AIDS Patient 7 (Spur 7 nach 8 Wochen) und den verschiedenen Patienten von Tabelle 1 (nicht gezeigtes Gel). Die Pfeile deuten auf die Positionen spezifischer Spaltungsprodukte (SCP) von RNase L. Nur der Patient Nummer 5 aktivierte keine RNase L bei der dsRNA-Therapie und als wahrscheinliches Ergebnis davon starb er an einer zweiten opportunistischen Infektion.
• Fall 1 - Der biologische Pfad in normalen Personen, inklusive jenen, die die HIV-Infektion überwanden, ist in Fig. 2 gezeigt.
• Fall 2 - AIDS und vorhergehende Krankheiten, inklusive ARC, LAS, asymptomatische HIV seropositive Personen, die zu AIDS übergehen, etc. (Bezugnahme auf Fig. 2)-- Stufen [A], [B] und [C] sind überfunktionell, da RNase L in dem Inhibitor gebunden ist [Stufe D ist nicht funktionell] und können den Pfad nicht beenden; daher kann der Pfad wegen des Mangels an "Feedback Steuerung" nicht ordnungsgemäß abgeschlossen werden und das HIV vermehrt sich sogar in Anwesenheit hoher Konzentrationen von Interferon, 2- 5A Synthetase und bioaktiven 2-5 Oligomeren (besonders aktiv sind Trimere und Tetramere von 2-5A).
• Experimentelle Daten: Es wurde zum ersten Mal beobachtet, daß 2-5A Oligomere in signifikanten Konzentrationen in Lymphozyten unbehandelter Personen über das ganze klinische Spektrum von AIDS hinweg anwesend waren. Jedoch war, nicht wie bei normalen Personen (Spur 2 des Polyacrylamidgels von Fig. 1), in unbehandelten ARC- und AIDS-Patienten (Spuren 3 und 4) die RNase L inaktiv. Ich habe weiters beobachtet, daß, wenn ich Präparate von inaktiver RNase L aus ARC/AIDS-Patienten erhielt und sie (vor dem Assay) ausführlich wusch, inklusive der Verwendung von Trichloressigsäure (TCA), die RNase L-Präparate ihre Funktion wiedererhielten, d. h. sie katalysieren die spezifische Spaltung (in den Gelen mit SCP bezeichnet) oder makromolekulare RNA und sind als aktiv zu bezeichnen. Durch eine Reihe von Rekonstitutionsversuchen wurde bestimmt, daß ein Inhibitor von RNase L eluiert oder weggebrochen worden war, der, wenn er wieder zurückgegeben wurde, die RNase L-Reaktion neuerlich beendete, d. h. inhibierte.

Claims (5)

1. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von HIV oder eines anderen Virus, das im wesentlichen ähnliche klinische Erscheinungsbilder zeigt, welches Verfahren die Bestimmung der Anwesenheit von aktivierter RNase L durch Messen des Vorliegens von vorherbestimmten Spaltungsprodukten von 28S rRNA und 18S rRNA sowie bioaktiven 2'-bis 5'A-Oligomeren in einem Zellextrakt eines Patienten umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung der Anwesenheit von okkulten humanen Immundefizienz-Viren in einem Menschen, welches Verfahren die Feststellung des Vorliegens von aktivierter RNase L in humanen biologischen Flüssigkeiten oder Zellen umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei welchem die biologische Flüssigkeit Blut oder eine Fraktion desselben ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, bei welchem die Zellen aus einer Transplantationshaut oder einem transplantierbaren menschlichen Organ stammen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Bestimmung des geplanten Auftretens von HIV in einem Tier, welches Verfahren die Prüfung eines Extrakts eines Gewebes des Tieres und die Bestimmung der Anwesenheit oder des Fehlens von aktivierten RNase L Molekülen umfaßt, wobei das Fehlen auf die geplante Anwesenheit von HIV positiv hindeutet.