DE3836656A1 - Neue digoxigenin-derivate und ihre verwendung - Google Patents

Neue digoxigenin-derivate und ihre verwendung

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Klaus Muehlegger
Herbert Von Der Dr Rer Na Eltz
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Description

Die Erfindung betrifft neue Digoxigenin-Derivate und ihre Verwendung.
Digoxigenin-Derivate, bei denen das Grundgerüst des Digoxigenins kovalent an ein anderes Molekül oder einen makromolekularen Träger gebunden vorliegt, werden für eine Vielzahl von bioanalytischen Zwecken verwendet. Insbesondere werden solche Digoxigenin-Derivate in immunologischen Tests (Immunoassays) zur im Hinblick auf therapeutische Aspekte wichtigen Bestimmung von kardiotonischen Glycosiden, insbesondere Digoxin, eingesetzt (vgl. G.C. Oliver et al, J.Clin.Invest. 47 (1968), 1035; U.Barbieri und C. Gandolfi, Clin.Chim. Acta 77 (1977), 257; A. Castro und N. Monji, "Immuno­ chemical Methods", Teil B, herausgegeben von J.L. Langone und H.van Vunakis, Academic Press 1981, S. 523; J.A. Hinds et al, Clinical Chemistry 32 (1986) 16). In diesen Tests werden die Digoxigenin-Derivate in Verbin­ dung mit Antikörpern gegen die zu bestimmenden kardioto­ nischen Glycoside eingesetzt, und der Nachweis erfolgt auf der Grundlage des Prinzips der Hapten-Anti-Hapten- Antikörper-Wechselwirkung (vgl. K. Luebke und B. Nieuwe­ boer, "Immunologische Teste für niedermolekulare Wirk­ stoffe", Thieme Verlag Stuttgart, 1978).
Als Digoxigenin-Derivate werden dabei im allgemeinen solche Derivate verwendet, in denen das Digoxigenin über die 3-Stellung des Steroidgerüstes kovalent an das andere Molekül gebunden ist.
Die in den immunologischen Tests bisher verwendeten Digoxigenin-Derivate weisen jedoch einen oder mehrere der folgenden Nachteile auf:
Bei einer über eine Estergruppierung erfolgenden Ver­ knüpfung mit dem Digoxigenin-Steroidgerüst sind die Digoxigenin-Derivate aufgrund der Hydrolyseempfindlich­ keit der Estergruppierung unter basischen Bedingungen sehr basenlabil; dies trifft im besonderen Maße für die üblicherweise verwendeten Hemisuccinate oder Hemigluta­ rate (vgl. CH-PS 6 04 164; US-PS 40 82 747; N. Monji et al, Experientia 36 (1980) 1141) zu; ähnliches gilt z.B. auch für die anstelle der Estergruppierung verwendete Urethangruppierung (vgl. DE-OS 26 07 826). Bei der Anwendung kann es deshalb unter bestimmten Bedingungen zu einer unerwünschten Abspaltung des Digoxigenins kommen.
Außer in der 3-Stellung des Steroidgerüstes besitzt Digoxigenin auch in der 12-Stellung eine reaktive OH-Funktion; bei der Herstellung der Derivate fällt deshalb oft ein Gemisch aus 3- und 12-Derivat an, das sich zum Teil nur unter erheblichem präparativen Auf­ wand in die reinen Stellungsisomeren auftrennen läßt und zum Teil, z.B. im Fall der bevorzugt verwendeten Hemisuccinate und Hemiglutarate, chromatographisch nicht auftrennbar ist. Die Anwendung der nicht aufge­ trennten Gemische kann aber zu fehlerhaften Ergebnissen führen.
In den Derivaten liegt das Steroidgrundgerüst zum Teil derart modifiziert vor, daß eine Erkennung des Haptens durch einen gegen das unmodifizierte Steroidgrundgerüst gerichteten Antikörper stark beeinträchtigt sein kann. Dies kann z.B. bei Digoxigenin-Derivaten, in denen das Sauerstoffatom in der 3-Stellung durch Amino-Stickstoff ersetzt ist, der Fall sein (vgl. z.B. EP-B 1 04 527).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Digoxigenin- Derivate bereitzustellen, die sich gut für immunologi­ sche Tests zur Bestimmung von kardiotonischen Glycosiden eignen und mit denen sich die vorstehend beschriebenen Nachteile vermeiden lassen. Diese Aufgabe wird mit der vorliegenden Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung sind Digoxigenin-Derivate der allgemeinen Formel (I)
worin n eine ganze Zahl von 1 bis 4, und vorzugsweise 1, darstellt, und Z eine Carboxygruppe oder ein davon abgeleitetes funktionelles Derivat ist. Vorzugsweise ist Z die Gruppe -COOH, -CN, -COOR⁵, -CONR¹R², -COONR³R⁴, -CON₃ oder -COOCOR⁵, worin R¹, R², R³ und R⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, eine Aralkylgruppe oder eine Arylgruppe sind, oder R¹ und R² oder R³ und R⁴ zusammen auch ein carbocyclisches oder heterocyclisches Ringsystem bilden können.
R⁵ ist eine Alkyl- oder Aralkylgruppe, vorzugsweise mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, Isobutyl, Phenyl, Benzyl.
In den vorstehend genannten Resten kann eine Alkylgruppe verzweigt oder vorzugsweise geradkettig sein; vorzugs­ weise besitzt die Alkylgruppe 1 bis 12, und insbesondere 2 bis 8 Kohlenstoffatome. Eine Alkylgruppe kann durch ein oder mehrere Heteroatome wie z.B. Sauerstoff, unterbrochen sein und substituiert oder unsubstituiert sein.
Eine Arylgruppe kann ein ein- oder mehrkerniger carbo- oder heterocyclischer aromatischer Rest mit vorzugsweise 5 bis 14 Ringatomen sein; sie kann substituiert oder unsubstituiert sein und ist insbesondere Phenyl. Eine Aralkylgruppe leitet sich von den vorstehend definier­ ten Alkyl- und Arylresten ab; sie ist z.B. eine Benzyl­ oder Phenylethyl-Gruppe.
Die Gruppierung -CONR¹R² ist z. B. der Rest
in dem die NH₂-Gruppe substituiert sein kann, vorzugsweise durch 4-Azidobenzoyl. Die Gruppe -COONR³R⁴ ist vorzugsweise die N-Hydroxysuccinimidestergruppierung
oder die Gruppierungen
Eine Alkylgruppe R⁵ ist insbesondere Ethyl, Isobutyl oder Benzyl.
In den erfindungsgemäßen Digoxigenin-Derivaten der Formel (I) erfolgt die Bindung zwischen dem Steroidge­ rüst und der Brücke über eine Etherbindung in 3-Stel­ lung, wodurch die mit einer Estergruppierung verbundene Basenlabilität vermieden wird. Außerdem wird dadurch die im Digoxigenin-Steroidgerüst in 3-Stellung vorhan­ dene Funktion (Oxy-Gruppe) aufrechterhalten, wodurch eine bessere Erkennung des Haptens durch den Antikörper, der in der Regel gegen das nicht modifizierte Steroid­ gerüst gerichtet ist, gewährleistet wird. Die erfin­ dungsgemäße Etherbindung in 3-Stellung ermöglicht auch die Darstellung der Verbindungen der Formel (I) und deren Derivate und Konjugate als reine Stellungsisomere, d.h. unter Vermeidung eines Gemisches aus Derivaten, die in 3- und 12-Stellung gebunden sind.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) kann ausgehend von 12-O-Acetyl-digoxigenin (im nachstehenden Reaktionsschema die Verbindung 3) erfolgen, daß aus Digoxin (Verbindung 1) nach Überfüh­ rung in das Pentaacetyl-digoxin (Verbindung 2) und saure Verseifung auf an sich bekannte Weise erhältlich ist. Im 12-O-Acetyl-digoxigenin wird nun die freie OH-Gruppe in 3-Stellung in die Ethergruppierung
überführt. Diese Umsetzung kann mit einem Diazocarbon­ säureester, für n = 1 z.B. mit Diazoessigester, auf an sich bekannte Weise unter Bildung des 3-Alkoxycarbonyl­ alkylethers erfolgen (Z = COOR5; entspricht Verbindung 4). In dem erhaltenen Alkoxycarbonylalkylester kann, wenn erwünscht, die Estergruppierung durch Verseifung in die freie Carboxygruppe (Z = COOH; Verbindung 5) oder eine andere funktionelle Carbonsäuregruppierung Z überführt werden, und, wenn erwünscht, kann in dem so erhaltenen Reaktionsprodukt die Gruppe Z auf an sich bekannte Weise in eine andere Gruppe Z überführt werden. Durch Umsetzung mit N-Hydroxysuccinimid kann die COOH- Gruppe z.B. in die Gruppierung -COONR3R4 (R3 und R4 bilden zusammen den 1,4-Dioxo-tetramethylen-Rest; Verbindung 6) überführt werden; diese Gruppierung läßt sich durch Umsetzung mit einem Amin HNR1R2 in die Verbindung (I) mit Z = CONR1R2 (entspricht Verbindung 7) überführen. Auf diese oder ähnliche, an sich bekannte Weise ist es möglich, eine erhaltene Verbindung der Formel (I), in der Z eine der angegebenen Bedeutungen besitzt, in eine andere Verbindung der Formel (I) mit einer anderen Bedeutung von Z zu überführen.
Die einzelnen, vorstehend genannten Verfahrensschritte, wie z.B. die Umsetzung mit Diazoessigester, die Versei­ fungsstufen, die Umsetzung mit N-Hydroxysuccinimid und die Umsetzung mit einem Amin HNR1R2 kann auf eine für diese Umsetzung übliche Weise erfolgen, wie z.B. in den nachfolgenden Beispielen erläutert.
Ein weiteres wichtiges Einsatzgebiet für Digoxigenin- Derivate ist auch ihre Verwendung zur Markierung und Detektion von Nucleinsäuren und Nucleinsäurederivaten. In den deutschen Patentanmeldungen der gleichen Anmelde­ rin P 38 00 644.8 (vom 12. Januar 1988) und P 38 13 278.8 (vom 20. April 1988) wird ein Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren durch Hybridisierung mit einer komplementären Nucleinsäure-Sonde, die über eine chemische Verbindung mindestens ein Hapten als Markie­ rung gebunden enthält, beschrieben. Als Hapten verwen­ det man ein Steroid, das an mindestens eine Position der Nucleinsäure-Sonde, die nicht an der Wasserstoff­ brückenbildung beteiligt ist, über eine Brücke von mindestens 4 Atomen Länge gebunden ist; die hybridi­ sierte Sonde weist man über einen markierten Anti-Hap­ ten-Antikörper nach. Als Steroid wird vorzugsweise Digoxigenin oder Digoxin verwendet. Wird das Hapten in die Nucleinsäure-Sonde fotochemisch mit Hilfe eines Foto-Haptens eingebaut (vgl. Nucl.Acid Res. 13 (1985) 745 bis 761; und M.Wilchek und E.A. Bayer, Anal. Bio­ chem. 171 (1988) 1), so verwendet man als Foto-Hapten vorzugsweise Foto-Digoxigenin, d.h. ein über eine Brücke mit dem 4-Azido-benzoylrest verbundenes Digoxi­ genin. Bei UV-Bestrahlung entsteht unter Abspaltung von Stickstoff aus der Azidogruppe ein Nitrenradikal, das dann kovalent an die Nucleinsäure bindet. Als Foto-Di­ goxigenin wird das Digoxigenin-3-hemisuccinat-(N′-(4- azidobenzoyl))-8-amino-3,6-dioxaoctylamid verwendet.
Aufgrund ihrer Eigenschaften, insbesondere aufgrund der Basenstabilität und des unmodifizierten Steroidgerüstes, eignen sich die erfindungsgemäßen Digoxigenin-Derivate der Formel (I) sehr gut als Markierungshapten für das vorstehend genannte Verfahren zum Nachweis von Nuclein­ säuren. Als Foto-Hapten (Foto-Digoxigenin; Bindung des Haptens auf fotochemischem Wege, vgl. Nucl. Acid Res. 13 (1985) 745 bis 761; und M.Wilchek und E.A.Bayer, Anal. Biochem. 171 (1988) 1) wird ein erfindungsgemäßes Digoxigenin-Derivat der Formel (I) verwendet, worin einer der Reste R1, R2, R3, R4 und/oder R5 eine 4-Azido­ benzoyl-Gruppe trägt, wie z.B. das N-(N-(4-Azidobenzoyl)- 8-amino-3,6-dioxaoctyl)-3-carbamoylmethyl-digoxigenin (Verbindung 7 des Reaktionsschemas).
Mit den erfindungsgemäßen Digoxigenin-Derivaten der allgemeinen Formel (I) ist es möglich, die 3-Position des Steroids mit dem dort vorhandenen Sauerstoff, also ohne Modifizierung des Grundgerüstes, über ein Brücken­ molekül an ein immunogenes Trägermaterial, wie ein Protein- oder Polypeptid-Trägermaterial, oder an eine Nucleinsäure zu binden.
Die erfindungsgemäßen Digoxigenin-Derivate der Formel (I) eignen sich auch sehr gut zur Herstellung von markierten Konjugaten (labeled conjugates), wie sie zur Bestimmung von kardiotonischen Glycosiden, insbesondere von Digoxin, in üblichen Immunoassays verwendet werden. Geeignete Konjugate können z.B. in Übereinstimmung mit Standardmethoden radioaktiv markiert oder mit einer Fluoreszenz-Gruppierung markiert sein. Die markierte Struktureinheit (labeling moiety) ist in den bevorzug­ ten homogenen Techniken z.B. ein Enzymsubstrat, eine prostetische Gruppe, ein Enzymmodulator oder ein Enzym, das mit den erfindungsgemäßen Digoxigenin-Derivaten der Formel (I) zum Konjugat gekuppelt ist.
Die Bindung an das Trägermaterial, an die Nucleinsäure oder an die markierte Struktureinheit erfolgt über die Gruppierung -O-(CH2) n -Z, wobei die Gruppierung Z vorzugs­ weise abhängig vom Trägermaterial und den mit Z reagie­ renden Gruppen oder Bindungen ausgewählt wird. Vorzugs­ weise erfolgt die Verknüpfung des Trägermaterials mit der -O-(CH2) n -Z-Gruppierung über primäre oder sekundäre Aminogruppen, die mit einer aktivierten Carbonsäurefunk­ tion Z umgesetzt werden, z.B. mit dem N-Hydroxysuccini­ mid-ester (Z = -COONR3R4, R3 und R4 bilden zusammen den 1,4-Dioxotetramethylen-Rest); die Umsetzung erfolgt dabei auf für eine solche Reaktion an sich bekannte Weise. Die Gruppierung -O-(CH2) n -Z kann aber auch nach der fotochemischen Methode (vgl. Nucl.Acid Res. 13 (1985) 745 bis 761; und M.Wilchek und E.A. Bayer, Anal.Biochem. 171 (1988) 1) an den Träger, z.B. die Nucleinsäure, gebunden werden; in diesem Fall wird das Trägermaterial, z.B. die Nucleinsäure-Sonde, in Gegen­ wart des vorstehend genannten Foto-Digoxigenins (siehe Reaktionsschema, Verbindung 7) mit sichtbarem Licht mit UV-Anteil bestrahlt, wobei unter Abspaltung von Stick­ stoff (N2) ein Nitrenradikal entsteht, das kovalent an die Nucleinsäure bindet.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch die Verwendung von Digoxigenin-Derivaten der allgemeinen Formel (I) zur Herstellung von markierten Konjugaten (labeled conjugates) zur Bestimmung von kardiotonischen Glycosi­ den, insbesondere von Digoxin, in üblichen Immunoassays und ihre Verwendung als Markerhapten zum Nachweis von Nucleinsäuren durch Hybridisierung mit einer komplemen­ tären Nucleinsäure-Sonde, die über eine chemische Verbindung mindestens ein Hapten als Markierung gebun­ den enthält.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind auch die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Digoxigenin-Deri­ vate der Formel (I) hergestellten neuen Digoxigenin-Kon­ jugate der Formel (II)
worin der Träger ein immunogenes Trägermaterial, wie z.B. ein immunogenes Protein- oder Polypeptid-Trägerma­ terial, eine Nucleinsäure oder die markierte Struktur­ einheit eines markierten Digoxigenin-Konjugates für die Verwendung in Immunoassays bedeutet, y im Durchschnitt eine Zahl von 1 bis zu der Zahl der im Träger verfügba­ ren Kupplungsstellen bedeutet, und vorzugsweise 1 bis 20 ist, und Y die durch Umsetzung der Carboxylfunktion Z der erfindungsgemäßen Digoxigenin-Derivate der Formel (I) mit den reagierenden Stellen des Trägermaterials gebildete Gruppierung ist, z.B. eine Amidgruppe.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwen­ dung der Digoxigenin-Konjugate der Formel (II), worin der Träger ein Immunogen darstellt, zur Immunisierung von zur Antikörper-Bildung geeigneten Organismen. Auf diese Weise können mit den erfindungsgemäßen Digoxige­ nin-Konjugaten der Formel (II), worin der Träger ein Immunogen darstellt, Antikörper hergestellt werden, die dann in einem der üblichen Immunoassay-Verfahren zur Bestimmung von Digoxin (z.B. Agglutinationstechniken, Radioimmunoassays, heterogene Enzym-Immunoassays, heterogene Fluoreszenz-Immunoassays, und homogene Immunoassays) eingesetzt werden können. Die Herstellung und Isolierung dieser Antikörper, einschließlich mono­ klonaler Antikörper kann auf eine dafür übliche und allgemein bekannte Weise erfolgen.
Ein weiterer Gegenstand ist auch die Verwendung der Digoxigenin-Konjugate der Formel (II), in denen der Träger die markierte Struktureinheit eines markierten Digoxigenin-Konjugates darstellt, in üblichen Immuno­ assays zur Bestimmung von kardiotonischen Glycosiden, insbesondere von Digoxin.
Die nachfolgenden Beispiele sollten die Erfindung näher erläutern, ohne sie darauf zu beschränken. Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich die Mengenangaben auf Gewichtsteile und Temperaturangaben auf °C. Unter Raumtemperatur wird eine Temperatur von 25 ± 2°C ver­ standen.
Beispiele
Das nachfolgende Reaktionsschema A gibt einen Überblick über die in den Beispielen gezeigte Synthese der erfin­ dungsgemäßen Digoxigenin-Derivate der Formel (I) und deren gegenseitige Überführung.
Reaktionsschema A
Beispiel 1 Herstellung von Pentaacetyl-digoxin (2)
78 g (0,1 mol) Digoxin werden in 1 l Acetanhydrid gelöst und mit 49,2 g (0,6 mol) Natriumacetat (wasser­ frei) versetzt. Man läßt 1 Stunde unter Rückfluß rühren. Dann dampft man die Lösung am Wasserstrahlvakuum ein, löst den Rückstand in 1 l Essigester und filtriert von eventuell unlöslichen Bestandteilen ab. Das Filtrat wird dreimal mit je 0,5 l Wasser gewaschen, mit 50 g Na2SO4 getrocknet und im Wasserstrahlvakuum eingedampft. Das Rohprodukt enthält noch Acetanhydrid.
Ausbeute: 110 g zähes Öl.
DC: Kieselgel, Essigester/Chloroform 1:1; Rf = 0,33.
Beispiel 2 Herstellung von 12-O-Acetyl-digoxigenin (3)
Der nach Beispiel 1 erhaltene Eindampfrückstand (Verbin­ dung 2) wird in 2 l Methanol gelöst, mit 2 l 0,1 n H2SO4 versetzt und 1 Stunde unter Rückfluß gerührt. Danach wird einmal mit 1,8 l und einmal mit 600 ml Chloroform extrahiert, die vereinigten Extrakte zweimal mit je 1 l Wasser gewaschen, mit 50 g Na2SO4 getrocknet und am Wasserstrahlvakuum eingedampft. Das erhaltene Öl (95 g) wird unter leichtem Erwärmen in 250 ml Essigester gelöst und bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach kurzer Zeit tritt Kristallisation ein. Man läßt etwa 4 Stunden bei Raumtemperatur und weitere 2 Stunden bei +4°C kristallisieren, dann saugt man den Feststoff ab und wäscht kurz mit ca. 100 ml Essigester.
Ausbeute: 31 g farblose Kristalle.
DC: Kieselgel, Essigester; Rf = 0,50.
Beispiel 3 Herstellung von 12-O-Acetyl-digoxigenin-3- cme-ethylester (4)
28,1 g (65 mmol) der nach Beispiel 2 erhaltenen Verbin­ dung (3) werden in 250 ml Tetrahydrofuran (THF) suspen­ diert und im Verlauf von 5 Stunden 69 ml (0,65 mol) Diazoessigester in 50 ml THF unter Rühren zugetropft. Zum Reaktionsstart und nach jeweils 1 Stunde werden je 50 mg Rhodium(II)-acetat zugegeben. Da dabei eine leichte Erwärmung der Reaktionslösung auftritt, empfiehlt es sich, die Lösung mit einem Wasserbad (25°C) zu kühlen. Man läßt 16 Stunden bei Raumtemperatur rühren, dann werden nach den oben beschriebenen Verfahren nochmals 69 ml Diazoessigester und insgesamt 250 g Rhodiumacetat zugegeben. Nach weiteren 16 Stunden wird der gesamte Vorgang ein drittes Mal wiederholt. Man läßt anschließend noch 1 Tag nachreagieren, versetzt dann mit 250 ml Methanol und dampft die Lösung im Vakuum ein. Der ölige Rückstand wird dreimal mit je 1 l Petrolether digeriert und nach Dekantieren in 100 ml Chloroform/Essigester = 2/1 gelöst. Man gibt das Roh­ produkt auf eine Kieselgel-Säule (8,5×50 cm) und eluiert mit Chloroform/Essigester = 2/1. Die das reine Produkt (4) enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, und das Lösungsmittel im Wasserstrahlvakuum entfernt.
Ausbeute: 18,2 g zähes Öl.
DC: Kieselgel, Essigester/Petrolether 2:1, Rf = 0,60.
Beispiel 4 Herstellung von Digoxigenin-3-carboxymethyl­ ether (cme) (5)
15,5 g (30 mmol) der nach Beispiel 3 erhaltenen Verbin­ dung (4) löst man in 470 ml Methanol und versetzt mit einer Lösung von 6,05 g (60 mmol) KHCO3 in 100 ml Wasser. Man läßt unter Rückfluß rühren und kontrolliert den Umsatz halbstündlich mittels DC. Wenn die Konzentra­ tion des Edukts nur noch ca. 5% beträgt (etwa nach 3,5 Stunden), wird die Reaktion abgebrochen. Man stellt den pH mit Eisessig auf 5,0, dampft das Methanol im Wasser­ strahlvakuum ab und verdünnt mit Wasser auf ca. 500 ml. Das Rohprodukt wird mit zweimal je 200 ml Essigester extrahiert, mit 200 ml Wasser gewaschen und die organi­ sche Lösung mit 30 g Na2SO4 getrocknet. Nach dem Eindamp­ fen löst man die verbleibenden 11 g Öl in 40 ml Essig­ ester/Eisessig = 9/1 und läßt bei Raumtemperatur stehen. Nach kurzer Zeit tritt Kristallisation ein. Man kühlt noch 1 Stunde bei +4°C, saugt den Feststoff ab und wäscht mit ca. 20 ml Essigester/Eisessig = 9/1 nach. Man erhält 3 g Produkt (5), das im Exsikkator über KOH getrocknet wird.
Die Mutterlauge wird eingedampft und der Rückstand (ca. 7,5 g) auf eine Kieselgel-Säule (8,5×40 cm) aufgetra­ gen. Nach Elution mit Essigester/Eisessig = 9/1 und Eindampfen der entsprechenden Fraktionen werden nochmals 2,2 g Produkt (5) erhalten, das noch Spuren von 12-O- Acetyl-digoxigenin-3-cme enthalten kann.
Ausbeute: 5,2 g farbloser Feststoff.
DC: Kieselgel, Essigester/Eisessig 9:1, Rf = 0,42.
Beispiel 5 Herstellung von Digoxigenin-3-cme-O-succin­ imid (6)
4,49 g (10 mmol) der nach Beispiel 4 erhaltenen Digoxi­ genin-Carbonsäure (5) werden zusammen mit 1,27 g (11 mmol) N-Hydroxysuccinimid in 140 ml wasserfreiem THF gelöst und mit einer Lösung von 2,27 g (11 mmol) N,N′-Di­ cyclohexylcarbodiimid in 20 ml wasserfreiem THF versetzt. Man läßt 20 Stunden bei Raumtemperatur rühren, dann filtriert man vom ausgefallenen Harnstoff ab und dampft die Lösung im Wasserstrahlvakuum ein. Den Rückstand löst man in 150 ml Essigester, filtriert und wäscht mit 100 ml Wasser. Die organische Lösung wird danach sofort mit 5 g Na2SO4 getrocknet und eingedampft. Man löst das Rohprodukt in ca. 30 ml Essigester, filtriert und gießt unter Rühren langsam in 200 ml Diisopropylether. Der ausgefallene Ester (6) wird abgesaugt und im Exsikkator über Phosphorpentoxid getrocknet.
Ausbeute: 5,1 g farbloses Pulver.
DC: Kieselgel RP-18, Nitromethan/Ethanol 9:1; Rf 0,66.
Beispiel 6 Herstellung von Photodigoxigenin (7)
272 mg (0,5 mmol) des nach Beispiel 5 erhaltenen Aktiv­ esters (6) werden in 10 ml Dioxan gelöst und mit einer Lösung von 161 mg (0,55 mmol) N-(4-Azidobenzoyl)-1,8- diamino-3,6-dioxaoctan in 5 ml Wasser versetzt. Man läßt 2 Stunden bei Raumtemperatur rühren, dann dampft man das Dioxan im Wasserstrahlvakuum ab und verdünnt mit 50 ml Wasser. Die wäßrige Phase wird mit zweimal je 50 ml Essigester extrahiert, die vereinigten organischen Extrakte mit 5 g Na2SO4 getrocknet und eingedampft. Den Rückstand digeriert man mit 100 ml Diisopropylether, saugt ab und trocknet im Exsikkator über CaCl2.
Ausbeute: 216 mg farbloses Pulver.
DC: Kieselgel RP-18, Nitromethan/Ethanol 9:1; Rf = 0,36.
Das folgende Reaktionsschema B zeigt schematisch die schrittweise Herstellung von Dig-11-dUTP, das z.B. als Markerhapten zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung mit einer komplementären, markierten Nukleinsäure verwendet werden kann, gemäß den Beispie­ len 7 bis 9.
Reaktionsschema B
Beispiel 7 Digoxigenin-3-carboxymethylether-ε-amido­ capronsäure (9)
C₃₁H₄₇NO₈ (MG: 561,3)
In einem 250 ml-Rundkolben werden 465 mg Digoxigenin-3- carboxymethylether-N-hydroxysuccinimidester (8) (0,85 mmol) in 15 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst und dazu eine Suspension von 112 mg 6-Aminocapronsäure (0,85 mmol) und 0,12 ml Triethylamin in 2 ml DMF gegeben. Man rührt über Nacht bei Raumtemperatur magnetisch, wobei allmäh­ lich eine homogene Lösung entsteht. Nach dieser Zeit ist die Umsetzung laut Dünnschichtchromatographie (Kieselgel; Essigsäureethylester/Petrolether/Ethanol 1:1:1, Detektion: Besprühen mit einer Mischung von 10 ml Eisessig + 0,2 ml konz. H2SO4 + 0,1 ml Anisaldehyd und Erhitzen auf 120°C bis zum Erscheinen blauschwarzer Flecke; Rf ca. 0,7; Rf Digoxigenin-OSu-ester ca. 0,85) praktisch vollständig.
Man destilliert DMF im Hochvakuum restlos ab und löst das verbleibende Öl in 5 ml H2O unter Zugabe von konz. Ammoniaklösung. Dann wird durch Zufügen von 22,5 ml wäßriger Zitronensäurelösung (100 g Zitronensäure/l) die "freie" Digoxigeninamidocapronsäure abgeschieden. Die harzig-zähe Masse wird durch Anreiben mit Wasser fest; man saugt ab, wäscht mehrfach mit H2O nach und trocknet letztlich über P2O5 im Ölpumpenvakuum.
Ausbeute: 325 mg = 68% der Th.
Beispiel 8 Digoxigenin-3-carboxymethylether-e-amido­ capronsäure-N-hydroxysuccinimidester (10)
C₃₅H₅₀N₂O₁₀ (MG: 658,8)
In einem 100 ml-Rundkolben werden 320 mg Digoxigenin-3- carboxymethylether-ε-amidocapronsäure (9) (0,57 mmol) in 2 ml wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) gelöst, und nacheinander mit 70 mg N-Hydroxysuccinimid (0,6 mmol), sowie 130 mg Dicyclohexylcarbodiimid (0,63 mmol) ver­ setzt. Man rührt über Nacht bei Raumtemperatur, saugt anderntags vom abgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab und zieht das DMF im Ölpumpenvakuum ab. Das zurückblei­ bende Öl wird in 2 ml Essigsäureethylester aufgenommen und in ca. 15 ml eiskalten (-20°C) Petrolether einge­ rührt. Das ausgefallene, anfangs noch harzig-zähe Produkt reibt man mehrfach mit eiskaltem trockenem Petrolether bis zum Festwerden durch. Nach Trocknung über P2O5 im Vakuum erhält man 315 mg = 84% der Th.
Elementaranalyse:
berechnet:
C 63,8%, H 7,6%, N 4,2%;
gefunden:
C 63,2%, H 7,6, N 4,0%.
Beispiel 9 Digoxigenin-3-carboxymethylether-ε-amidocaproyl-[5-(amidoallyl)-2′-desoxy-uridin-5′-triphosphat]-Te­ tranatiumsalz (11)
(Dig-11-dUTP)
C₄₃H₆₁N₄Na₄O₂₁P₃ (MG: 1154,7)
245 mg Digoxigenin-3-carboxymethylether-e -amidocapron­ säure-N-hydroxysuccinimidester (10) (0,37 mmol) werden in 7 ml DMF gelöst und zu einer Lösung von 20 mg 5-Allyl­ amino-2′-desoxy-uridin-5′-triphosphat-Tetralithiumsalz (0,37 mmol) in 6 ml H2O gegeben. Man fügt dem Gemisch 6,2 ml 0,1 mol/l Natriumboratpuffer, pH 8,5 zu und rührt bei Raumtemperatur über Nacht (ca. 15 Stunden).
In der Papierelektrophorese (0,05 mol/l Citratpuffer, pH 5,0) beobachtet man im UV-Licht nach dieser Zeit neben etwas unumgesetztem Allylamino-dUTP einen etwas tiefer laufenderen Fleck der gewünschten Verbindung (alternativ: Dünnschichtchromatographie (DC) auf Kiesel­ gel, Fließmittel Isobuttersäure/konz. Ammoniaklösung/H2O = 66 : 1 : 33, Detektion im UV oder Besprühen mit Anisalde­ hyd-Reagenz - siehe Beispiel 7 -; Rf-Werte: 5-Allylamino­ dUTP 0,2; Dig-amidocapronsäure-OSu-ester 0,7; Dig-11- dUTP 0,45).
Zur Aufreinigung wird das Reaktionsgemisch im Ölpumpen­ vakuum bis zum festen Rückstand eingedampft, in 200 ml H2O aufgenommen und auf eine Ionenaustauschersäule (DEAE-Sephadex A25, HCO3-Form, Säulendimension 1,5× 30 cm) gegeben. Nach Aufziehen wird kurz mit Wasser gewaschen, dann mit einem Gradient von je 1 l H2O auf 0,4 mol/l TEAB (Triethylammoniumbicarbonat), pH 8 eluiert. Die reines Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und durch mehrfaches Eindampfen mit Methanol von überschüssigem TEAB befreit (kein Geruch von freiem Triethylamin mehr!). Man nimmt den Kolbeninhalt in wenigen ml Wasser auf, passiert die Lösung über eine kurze Kationenaustau­ schersäule DOWEX 50 WS8 (1×10 cm) in der Na⁺-Form, wäscht die Säule bis zur ODE-Freiheit des Waschwassers (Messung im UV bei 240 nm) und dampft im Vakuum bis auf ca. 20 ml ein. Nach Lyophilisation werden 195 mg (45% der Th.) Dig-11-dUTP-Na4 als weißes Pulver erhalten.
Analytik: H2O-Bestimmung: 7,9%
Elementaranalyse: (unter Berücksichtigung des H2O-Ge­ haltes):
berechnet:
C 41,2%, H 5,3%, N 4,4%, P 7,4%;
gefunden:
C 41,0%, H 5,4%, N 4,6%, P 7,2%.
UV-Spektrum (Phosphatpuffer pH 7,0): Maxima: 220 nm, 290 nm.
Dig-11-dUTP kann nach der "Random primed"-DNA-Markie­ rungsmethode (DNA-Labeling and Detection Kit Nonradio­ active, Best.Nr. 1093657, Fa. Boehringer Mannheim,; Feinberg, A.P. und Vogelstein, B., Anal. Biochem. 132, (1983) 6) in eine Nukleinsäure eingeführt werden, wobei eine Nukleinsäuresonde, die Digoxigenin als Markierungs­ hapten enthält, zum Nachweis dazu komplementärer Nuklein­ säuren erhalten wird.

Claims (11)

1. Digoxigenin-Derivate der allgemeinen Formel (I) worin n eine ganze Zahl von 1 bis 4 darstellt, und Z eine Carboxygruppe oder ein davon abgeleitetes funktionelles Derivat ist.
2. Digoxigenin-Derivate der Formel (I) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Z die Gruppe -COOH, -CN, -COOR⁵, -CONR¹R², -COONR³R⁴, -CON₃ oder -COOCO-R⁵, worin R¹, R², R³ und R⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe, eine Aralkylgruppe oder eine Arylgruppe sind, oder R¹ und R² oder R³ und R⁴ zusammen auch ein carbo- oder heterocyclisches Ringsystem bilden können, und R⁵ eine Alkyl- oder Aralkylgruppe ist.
3. Digoxigenin-Derivate der Formel (I) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Z bedeutet:
4. Digoxigenin-Derivate der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß n = 1 ist.
5. Verfahren zur Herstellung der Digoxigenin-Derivate der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man im 12-O-Acetyl-digoxigenin die freie OH-Gruppe in 3-Stellung durch Umsetzung mit Diazo­ essigester in an sich bekannter Weise in eine Verbindung der Formel (I) überführt, worin Z = COOC2H5 ist, und, wenn erwünscht, in dem erhalte­ nen Reaktionsprodukt in an sich bekannter Weise die COOC2H5-Gruppe in die COOH-Gruppe oder in eine andere funktionelle Carbonsäuregruppe Z überführt, und, wenn erwünscht, in den so erhaltenen Reaktions­ produkten die Gruppe Z in an sich bekannter Weise in eine andere Gruppe Z überführt.
6. Das in den Beispielen beschriebene Verfahren zur Herstellung der Digoxigenin-Derivate der Formel (I).
7. Verwendung der Digoxigenin-Derivate der Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung von markierten Konjugaten (labeled conjugates) zur Bestimmung von kardiotonischen Glycosiden, insbeson­ dere von Digoxin, in Immunoassays.
8. Verwendung der Digoxigenin-Derivate der Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 als Markerhapten zum Nachweis von Nucleinsäuren durch Hybridisierung mit einer komplementären Nucleinsäure-Sonde, die über eine chemische Verbindung mindestens ein Hapten als Markierung gebunden enthält.
9. Digoxigenin-Konjugate nach der Formel (II) worin der Träger ein immunogenes Trägermaterial, eine Nukleinsäure oder die markierte Strukturein­ heit eines markierten Digoxigenin-Konjugates für die Verwendung in Immunoassays bedeutet, y im Durchschnitt eine Zahl von 1 bis zu der Zahl der im Träger verfügbaren Kupplungsstellen bedeutet, und Y die durch Umsetzung der Carboxylfunktion Z der Digoxigenin-Derivate der Formel (I) nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und den reagierenden Stellen des Trägermaterials gebildete Gruppierung ist.
10. Verwendung der Digoxigenin-Konjugate der Formel (II) nach Anspruch 9, worin der Träger ein immuno­ genes Trägermaterial darstellt, zur Immunisierung von zur Antikörper-Bildung geeigneten Organismen.
11. Verwendung der Digoxigenin-Konjugate der Formel (II) nach Anspruch 9, worin der Träger die markier­ te Struktureinheit eines markierten Digoxigenin- Konjugates darstellt, in Immunoassays zur Bestim­ mung von kardiotonischen Glycosiden, insbesondere von Digoxin.
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