DE3813465A1 - Trans-hydroxyviolacein, verfahren zu seiner reindarstellung und seine verwendung zur prophylaxe und therapie von viruserkrankungen - Google Patents

Trans-hydroxyviolacein, verfahren zu seiner reindarstellung und seine verwendung zur prophylaxe und therapie von viruserkrankungen

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Description

Die Erfindung betrifft Trans-Hydroxyviolacein, ein Verfahren zu seiner Reindarstellung und seine Verwendung zur Prophylaxe und Therapie von Viruserkrankungen.
Hydroxyviolacein ist der Hauptbestandteil eines blauschwarzen Pigmentes in Chromobacterium violaceum, ein aus Erde und Gewässer tropischer Gebiete erhältlicher (kultivierbarer?) Mikroorganismus, wobei als Nebenbestandteil Violacein auftritt. Hydroxyviolacein und Violacein sind seit langem bekannt (vgl. J. of Infect. Dis. 76, 1, Seite 47 (1645); Black M. E. and Shahan, J., J.A.M.A. 110, 1270 (1938); R. D. De Moss: Antibiotics, Vol. 2, Ed: D. Gottlieb and P. D. Shaw, Seite 77, Springer 1967; N. Duran et al., An. Acad. bras. Cienc. 55 (3), 231 (1983)).
Chemisch ist Hydroxyviolacein 3-1,2-dihydro-5-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)- 2-oxo-3H-pyrol-3-ylidene-1,3-dihydro-2H-indol-2-one mit der Summenformel C₂₀H₁₃N₃O₃ (Molekulargewicht 343,33). Hydroxyviolacein ist in Wasser nahezu unlöslich, jedoch gut löslich in Aceton, Ethanol und Dioxan.
Die Strukturformel für Hydroxyviolacein wurde durch NMR spektrometrische Untersuchungen wie folgt gefunden:
Hydroxyviolacein kann weiterhin durch sein UV-Absorptionsspektrum in Methanol charakterisiert werden: λ max = 570 nm; λ min = 426 nm; λ max = 366 nm.
Zum Vergleich das Absorptionsspektrum des Nebenbestandteils Violacein: λ max = 560 nm; λ min = 434 nm; λ max = 370 nm.
Es ist auch bekannt, daß Roh-Violacein eine breite bakteriostatische Wirkung besitzt (vgl. Lichstein et al., J. of Infect. Dis. 76, No. 1, Seite 47 (1945); De Moss in Antibiotics, Vol. 2, Seite 77 Ed; Gottlieb and P. D. Shaw, Springer (1967).
Neuere Untersuchungen haben ergeben, daß die isolierte Pigment-Rohfraktion in mehrere Einzelkomponenten aufgetrennt werden kann, die analoge Verbindungen darstellen, wobei die jeweiligen Einzelverbindungen jedoch ein deutlich unterschiedliches Löslichkeitsverhalten sowie unterschiedliche antibakterielle Wirkungen besitzen. Siehe zum Beispiel N. Dutan et al., An. Acad. brasil. Cienc., 55 (3), 231 (1983).
Eine antivirale Wirksamkeit ist jedoch weder für das Roh-Violacein noch für eine der Einzelkomponenten bekannt.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Trans-Hydroxyviolacein aus Chromobacterium violaceum eine gute antivirale Wirkung gegen DNS- und RNS-Viren aufweist.
1. Herstellung des Roh-Produkts
Roh-Violacein kann aus Kulturen von Chromobacterium violaceum, Janthinobacterium- lividum und Chromobacterium lividum isoliert werden.
Die als Ausgangsmaterial verwendeten Bakterien kann man auf festen oder flüssigen Nährmedien kultivieren, zum Beispiel nach dem von P. H. A. Sneath beschriebenen Verfahren (P. H. A. Sneath, J. Gen. Microbiol. 15, 70-98, 1956). Vorzugsweise werden die Bakterien in flüssigen Nährmedien gezüchtet, wobei sie aus dem Nährmedium durch Zentrifugation leicht abgetrennt werden können. Das abzentrifugierte Bakteriensediment lyophilisiert man und extrahiert anschließend mit Ethanol das Roh-Violacein. Das Lösungsmittel entfernt man durch Abdampfen im Vakuum.
Die Bakterien können in flüssigen oder festen Nährmedien gezüchtet werden. Zur Züchtung auf festen Nährböden ist ein Nährboden folgender Zusammensetzung geeignet:
Fleischextrakt: 3,0 g
Pepton aus Fleisch: 5,0 g
Agar: 18,0 g
Aqua dest.: 1000 ml
pH-Wert 7,5
Der nach Bebrütung gewachsene Bakterienrasen wird abgekratzt und gefriergetrocknet. Die Extraktion des Roh-Violacein erfolgt mit Alkohol im Soxhlet. Der Alkohol wird im Vakuum abdestilliert.
Zur Züchung in flüssigen Kulturen ist ein Nährmedium z. B. folgender Zusammensetzung geeignet:
Trinatriumcitrat: 3,0 g
MgSO₄7 H₂O: 0,5 g
Na₂HPO₄: 1,0 g
K₂HPO₄: 0,5
NH₄Cl: 0,5 g
Aqua dest.: 1000 ml
pH-Wert 7,0
Nach der Züchtung in flüssigen Nährmedien werden die Bakterien abzentrifugiert, das Sediment gefriergetrocknet und wie bei den Bakterien von festen Kulturen der Farbstoff isoliert.
2. Reindarstellung von γ-Hydroxyviolacein
Zur Isolierung von Hydroxyviolacein extrahiert man das Roh-Violacein zweimal mit n-Heptan und filtriert ab. Den Rückstand löst man in einem Gemisch aus Chloroform/Aceton/Pyridin 50 : 40 : 10 und trennt das Farbstoffgerüst mittels Kieselgel-Dünnschichtchromatographie auf.
Im fertigen Chromatogramm lassen sich vier Einzelfraktionen mit folgenden Charakteristika identifizieren:
  • (a) eine blaue Zone mit Rf 0,58,
    (b) eine schwach blau gefärbte Zone mit Rf 0,2,
    (c) eine stark violette Zone mit Rf 0,64,
    (d) eine schwach violette Zone mit Rf 0,71.
Die Zone (d), die auf der feuchten DC-Platte rein violett gefärbt erscheint, entspricht Violacein und die Zone (c), die auf der Platte tief preußischblau gefärbt erscheint, entspricht Hydroxyviolacein.
Zur Weiterreinigung kratzt man die Zonen mit Hydroxyviolacein und/oder Violacein ab und eluiert den Farbstoff mit Chloroform (Violacein) oder Chloroform/Methanol 80 : 20 oder 50 : 50 für Hydroxyviolacein.
Nach Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum reinigt man den Rückstand wiederum durch DC-Chromatographie, und zwar mit dem Lösungsmittelgemisch Chloroform/Aceton/Pyridin 60 : 30 : 10 für Vilocalein und Chloroform/Aceton/ Pyridin 50 : 40 : 10 für Hydroxyviolacein.
Man kratzt die entsprechenden Zonen wiederum ab, eluiert den Farbstoff mit Chloroform/Methanol 80 : 20 für Violacein oder 50 : 50 für Hydroxyviolacein und entfernt das Lösungsmittel durch Abdampfen im Vakuum bei 35°C Badtemperatur. Den Rückstand nimmt man in wenig Pyridin auf. Anschließend entfernt man das Pyridin im Vakuumexsikkator über konzentrierter H₂SO₄. Den schwarz-violetten Rückstand trocknet man bei 65°C im Ölpumpenvakuum.
3. Antivirale Aktivität
Die Prüfung der virostatischen Wirkung erfolgt nach dem Farbtest wie von Vinter (J. Gen. Virol. 5, 419 (1060)) beschrieben. Der Test beruht darauf, daß die durch Virus zerstörten Zellen nicht mehr gefärbt werden können. Je mehr Zellen durch die virostatische Wirkung einer Substanz geschützt werden, um so mehr Farbstoff kann aufgenommen werden. Der Farbstoff der gefärbten Zellen läßt sich extrahieren und seine Menge kann in einem Fotometer bei 546 nm gemessen werden. Damit erlaubt der Test meßbare und reproduzierbare Angaben sowohl über die virostatische, wie auch über die zytotoxische Wirkung von Substanzen.
5 mg Hydroxyviolacein wurden in 100 ml Ethylalkohol gelöst. Unter Verwendung der Gewebekultur-Lösung wurde eine Konzentration von 0,25 µg/ml Hydroxyviolacein eingestellt. Diese Konzentration wird in Zweierstufen weiterverdünnt und auf 24 Stunden alte Hela-Zellen gegeben, nachdem diese vorher 45 Minuten mit Herpes-Viren infiziert worden waren. Die Zellen mit Virus und Hydroxyviolacein werden 72 Stunden bei 37°C bebrütet. Anschließend werden die Zellen fixiert und für 15 Minuten gefärbt. Nach gründlicher Waschung wird der an die Zellen gebundene Farbstoff mit Alkohol extrahiert und in einem Fotometer die Extinktion gemessen. Man erhält folgende Werte:
Tabelle I
Der 50%-Zellwert (ZK + VK)/2 liegt bei 0,355.
Der 50%-Schutzwert beträgt 0,198 µg/ml.
Da das Hydroxyviolacein keine wesentliche zytotoxische Eigenschaft besitzt, kann seine antivirale Schutzwirkung in Prozent auch nach folgender Formel berechnet werden:
E₃ = Extinktion der Zellkontrolle, E₂ Extinktion der Viruskontrolle,
E₃ = Extinktion mit Virus und Hydroxyviolacein.
Tabelle II
Die Berechnung für das Poliovirus Typ 1 ergibt folgende Werte:
Tabelle III
Als LD₅₀-Wert für Hydroxyviolacein wurde ein Wert von 25 mg/kg bei der Maus gefunden.

Claims (6)

1. Verwendung von Hydroxyviolacein zur Behandlung von Viruserkrankungen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus ein Herpesvirus ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus ein Poliovirus ist.
4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Hydroxyviolacein aus Chromobacterium violaceum isoliert wird.
5. Verfahren zur Isolierung von Hydroxyviolacein aus Chromobacterium violaceum, bei dem man die Bakterien aus dem Zellmedium durch Zentrifugation abtrennt, das Sediment lyophilisiert, daraus durch Ethanol- Extraktion Roh-Violacein isoliert, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung von Hydroxyviolacein
  • (i) das Roh-Violacein zweimal mit n-Heptan extrahiert,
  • (ii) den Rückstand einer DC-Chromatographie mit dem Lösungsmittelgemisch Chloroform/Aceton/Pyridin 50 : 40 : 10 unterwirft,
  • (iii) die Zone mit einem Rf von 0,64 abkratzt, den Farbstoff mit einer Mischung aus Chloroform/Methanol 80 : 20 oder 50 : 50 eluiert und die Substanz einer nochmaligen DC-Chromatograpie wie in Schritt (ii) unterwirft, die in diesem Chromatogramm enthaltene Zone mit dem Rf 0,64 wiederum abkratzt und wie oben beschrieben isoliert, anschließend
  • (iv) das Lösungsmittel entfernt, den Rückstand in Pyridin aufnimmt, und das Pyridin im Vakuum über H₂SO₄ abdampft und den Rückstand bei 65°C im Vakuum trocknet.
6. Verfahren zur Isolierung von Violacein aus Chromobacterium violaceum, bei dem man die Bakterien aus dem Zellmedium durch Zentrifugation abtrennt, das Sediment lyophilisiert, daraus durch Ethanol- Extraktion Roh-Violacein isoliert, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung von Violacein
  • (i) das Roh-Violacein zweimal mit n-Heptan extrahiert,
  • (ii) den Rückstand einer DC-Chromotograpie mit dem Lösungsmittelgemisch Chloroform/Aceton/Pyridin 50 : 40 : 10 unterwirft,
  • (iii) die Zone mit einem Rf von 0,71 abkratzt, den Farbstoff mit Chloroform eluiert und die Substanz einer nochmaligen DC-Chromotographie wie in Schritt (ii) unterwirft, die in diesem Chromatogramm enthaltene Zone mit dem Rf 0,71 wiederum abkratzt und wie oben beschrieben isoliert, anschließend
  • (iv) das Lösungsmittel entfernt, den Rückstand in Pyridin aufnimmt, und das Pyridin im Vakuum über H₂SO₄ abdampft und den Rückstand bei 65°C im Vakuum trocknet.
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