DE3809002A1 - Verfahren zum schneiden von pflanzenmaterial - Google Patents

Description

In den 1960er Jahren machte man die Feststellung, dass sich aus Pflanzenteilen oder undifferenziertem Callusgewebe Jungpflan­ zen erzeugen lassen. Man bezeichnet diese Technik als Mikrover­ mehrung, bei der es sich also um im Labor erfolgende unge­ schlechtliche Vermehrung von Pflanzen handelt. Ziel der Mikrover­ mehrung ist die Produktion genetisch identischer, wertvoller Eliteindividuen. Die Wahl der Mutterpflanze ist somit eine hoch­ wichtige Arbeitsstufe, da ja die zu produzierenden Pflanzen deren Kopien sind.

Die Mikrovermehrung kann ausgehend von einem von der Mutterpflan­ ze abgetrennten Vegetationspunkt, einer Knospe oder zum Beispiel einem Blattstiel erfolgen. Die Züchtung erfolgt aseptisch auf einem Substrat, welches die von den Pflanzen benötigten Haupt­ nährstoffe und Spurenelemente sowie Vitamine und Hormone enthält, mit denen das Wachstum reguliert wird. Das Substrat wird gewöhn­ lich mit Agar verfestigt.

Bei Beginn der Mikrovermehrung bildet sich aus dem Pflanzenteil ein Spross, der zur Vermehrung aus dem Proberöhrchen in ein grösseres Glasgefäss gebracht wird. Mit Hilfe von Hormonen, hauptsächlich Cytokininen, werden aus den Achselknospen oder z. B. aus den am Pflanzenblatt sich bildenden Adventivknospen neue Sprosse induziert. Nach etwa vierwöchiger Züchtung werden die so gebildeten Sprosse abgetrennt und zwecks weiterer Vermeh­ rung auf neue Substrate gebracht. Dies wird fortgesetzt bis die gewünschte Jungpflanzenzahl erreicht ist.

Zur Wurzelbildung werden die Sprosse gewöhnlich auf ein auxinhal­ tiges Substrat gebracht. Nach Entwicklung der Wurzeln werden die Jungpflanzen in einem Gewächshaus mit hoher Luftfeuchtigkeit in Erde gepflanzt. Durch allmähliche Verstärkung der Beleuchtung bringt man die Assimilation der Pflanzen in Gang.

Der Hauptkostenfaktor bei der Mikrovermehrung ist die hohes berufliches Können erfordernde Arbeit, die hauptsächlich in dem manuellen Schneiden der Pflanzen und der Übertragung von einem Substrat aufs andere besteht. Beim Schneiden kommt es auch leicht zur Beschädigung des empfindlichen Pflanzenmaterials. Das Schneiden mit Messer ist zeitraubend, besonders dann, wenn man mit leicht kontaminierbarem Material arbeitet und dann der Aseptik besondere Beachtung schenken muss.

Man hat nun überraschend die Beobachtung gemacht, dass sich die vorgenannten Probleme durch Verwendung eines Laserstrahls zum Schneiden des Pflanzenmaterials reduzieren lassen.

Lebendes Gewebe wurde bisher mit Laserstrahl nur in der Chirur­ gie geschnitten, wo der Laserstrahl den Vorteil bietet, dass die Adern des Gewebes zugebrannt werden, so dass die Operation infolge unterbundener Blutung - besonders aus den kleinen Adern - erleichtert wird. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfin­ dung hat man hingegen überraschend die Beobachtung gemacht, dass die Leitbündel des Pflanzenmaterials beim Schneiden mit Laser nicht in nachteiliger Weise beschädigt werden, sondern dass vielmehr das Gewebe seine Wasser- und Nährstoffaufnahmefä­ higkeit über die Schnittfläche bewahrt, und dass ausserdem die Totipotenz des Gewebes nahe beim Schnittbereich erhalten bleibt.

Als Vorteile des Lasereinsatzes zum Schneiden von Pflanzenmate­ rial sind ferner einfache Handhabung und hohe Geschwindigkeit zu nennen. Wegen der hohen Aseptik-Forderungen muss beim herkömm­ lichen Schneiden des Pflanzenmaterials mit Messer dieses nach jedem Schnitt durch Benetzen mit Ethanol und Abflammen sterili­ siert werden. Dadurch wird das Schneiden verlangsamt, und in/an das Pflanzenmaterial kann u.U. Ethanol gelangen, das schon in geringer Menge eine Verzögerung des Wachstumsbeginns oder u.U. ein Absterben der Pflanze bewirkt. Das Sterilisieren kann auch durch Erhitzen des Schneidinstrumentes erfolgen. Der Laserstrahl hingegen ist natürlich steril, so dass eine beträchtliche Ver­ besserung der Aseptik erzielt wird. Auch die Schneidgeschwindig­ keit erhöht sich infolge Wegfallens der Sterilisierphase.

Das Laserschneiden lässt sich auch mit Automatik kombinieren. Der manuelle Arbeitsanteil ist dann gering, und das Schneiden wird beträchtlich beschleunigt.

Beim Laserschneiden sind die Pflanzenmaterialschäden hauptsäch­ lich durch Erhitzung bedingt. Zur Verbesserung des Schneidergeb­ nisses setzt man beim Schneiden inerte Schutzgase, wie z.B. Stickstoff, Kohlendioxid oder Argon, ein. Das Schutzgas wird entweder im offenen Raum über eine Düse an die Schnittstelle geleitet, oder das Schneiden erfolgt alternativ in einer schutz­ gasgefüllten Kammer. Die Schutzgasmenge wird so gewählt, dass die Verkohlung möglichst gering bleibt.

In Verbindung mit der vorliegenden Erfindung wurde zum Schneiden von Pflanzenmaterial eine Laseranlage verwendet, deren wichtig­ sten Parameter im folgenden beschrieben sind.

Die Mode des Lasergerätes gibt die Verteilungsform seines Strahls an. Die Schneidversuche erfolgten ausschliesslich mit Mode TEM 00, wobei die Intensität des Strahls nach der Gauss′schen Glockenkurve verteilt ist.

Die Schnittleistung des Lasergerätes gibt die Energiemenge an, die das Gerät pro Zeiteinheit ins zu schneidende Objekt zu über­ tragen vermag. Oft wird nicht die gesamte Leistung vom zu schnei­ denden Objekt absorbiert, sondern teilweise von der Objektober­ fläche reflektiert und/oder an vom Objekt abgehende Dämpfe und Gase absorbiert. Die Schnittleistung lässt sich auch mit Hilfe der Intensität angeben, welche die auf die Strahlfläche bezogene Schnittleistung angibt. Da die Fokussierlinse den Strahl im Brennfleck auf eine sehr kleine Fläche konzentriert, lassen sich auch mit geringer Schnittleistung grosse Intensitätswerte erzielen. Versuche haben gezeigt, dass sogar ein Schneiden von Pflanzen mit einem CO₂-Laser von nur 20 W Leistung möglich ist, jedoch wird dann keine ausreichend hohe Schnittgeschwindigkeit erreicht. In der Fachliteratur ist angegeben, dass eine Leistung von etwa 40 W zum Schneiden lebenden tierischen Gewebes aus­ reicht. Freilich steigt der Lasergerät-Preis fast proportional zum Quadrat der Leistung, so dass die maximale wirtschaftlich vertretbare Lasergerät-Leistung bei etwa 100 W liegt. Auf Grund der vorangehenden Feststellung hat das in Verbindung mit dieser Erfindung passende Lasergerät eine Leistung zwischen 30 und 100 W.

Beim Pulsieren des Laserstrahls sind Impulslänge und zeitlicher Abstand der Impulse so zu wählen, dass das zu schneidende Mate­ rial möglichst wenig erhitzt wird. Passende Werte sind Werte zwischen 0,1 und 10 ms.

Der Durchmesser des Strahls im Brennfleck wirkt sich gleichfalls auf das Schnittergebnis aus, jedoch ist dieser Parameter in der Regel ein Festwert in der Grössenordnung von 0,2 mm oder darunter.

In den folgenden Beispielen wurde als Schneidlaser ein axial geströmter CO₂-Laser (Coherent) mit der Radius-Mode TEM 00 ver­ wendet, dessen Resonator mit ECQ-Modul ausgestattet ist, der ein Pulsieren des Strahls ermöglicht. Die Dauerstrichleistung des Lasergeräts war im Prinzip im Bereich zwischen 90 und 350 W steuerbar, jedoch wollte man die Leistung für den Schneidver­ such mit Spezialgasmischung reduzieren, wobei dann die feste Dauerstrichleistung 61 W betrug. Die Impulsfrequenz konnte im Bereich von ca. 10 ... 2500 Hz, die Länge des einzelnen Laserim­ pulses zwischen 0,1 ms und 10 s gewählt werden. Der Durchmesser des Strahls im Brennfleck betrug ca. 0,2 mm. Als Schutzgas diente Stickstoff mit einem Reinheitsgrad von 99,998%. Die Arbeitssta­ tion bestand aus einem XY-Tisch von 600 mm×600 mm.

Beispiel

Die Versuche wurden mit Birke durchgeführt. Die Auswirkungen des Schnitts wurden an Hand eines Vermehrungsversuchs und daran anschliessender Züchtung im Gewächshaus verfolgt.

Da der Laserstrahl den Schnittbereich erhitzt, kann das pflanzli­ che Zellgewebe u.U. eintrocknen oder verkohlen. Die Schnittflä­ chenbeschädigung wurde mikroskopisch verfolgt. Wurde die Schnitt­ fläche zu starker Leistung ausgesetzt, äusserte sich dies oft in Form von Verkohlung und Leitbündelverschluss, m. a. W. als "<Verschmelzen" des Zellverbandes. Durch Änderung von Gerät-Para­ metern wurde das Schnittergebnis zu verbessern versucht.

Zum Schneiden wurden die Pflanzenteile unter Verwendung mit sterilem Agar (9 g/l) gefüllter kleiner Petrischalen fixiert.

Birke, Betula pendula

Birkensprosse (aus in-vitro-Bestand) wurden mit Laser in je eine Achselknospe enthaltende Teile geschnitten. Für den Kon­ trolIversuch wurden Sprosse mit dem Messer zerteilt. Die Knospen wurden auf Vermehrungssubstrat gebracht und in einem Züchtungs­ schrank (23°C, Feuchte 50%, Beleuchtung 2000 lx, 16/8 h) gezüch­ tet. Es wurden zwei Parallelversuche durchgeführt (3 bis 7 Sprossteile pro Versuch).

Die Wachstumsaufnahme der Knospen wurde verfolgt, und der Vermeh­ rungsfaktor wurde zweimal - 4 und 6 Wochen nach der Übertragung - ermittelt. Beim Schneiden mit Laser wurden die in Tabelle 1 aufgeführten Parameter erprobt.

Tabelle 1. Die beim Laserschneiden von Birke erprobten Parame­ teralternativen.

Die mit Laser geschnittenen Pflanzenteile vermehrten sich gut. Die Vermehrung der auf unterschiedliche Weise geschnittenen Birkenteile nach 4- und 6wöchiger Züchtung gehen aus Fig. 1 hervor.

Die Impulslänge (Tp) wurde bei den Schnittarten 1 bis 3 auf dem Wert 0,1 ms gehalten, jedoch wurde die Regenerierphase (Ts) variiert. Beim Schneiden nach dem Verfahren Nr. 1 betrug die Ruhephase zwischen den Impulsen 0,4 ms, beim Verfahren Nr. 2 hingegen 0,7 ms. Die Schneidgeschwindigkeit konnte in beiden Fällen fast auf gleichem Wert gehalten werden. Eine verlängerte Regenerierphase scheint die Vitalität des Gewebes zu verbes­ sern, was sich in erhöhtem Vermehrungsfaktor äussert. Am lei­ stungsfähigsten scheint sich die Vermehrung bei Anwendung der Schnittarten 5 bis 7 zu gestalten. Bei der 5. Schnittart brach­ ten langer Impuls (1,0 ms) und relativ lange Pause (1,0 ms) bei hoher Fahrgeschwindigkeit (2%/ms^-1) ein gutes Ergebnis. Die Verlängerung der Pause auf 10 ms auf Kosten der Fahrgeschwin­ digkeit führte im Versuch Nr. 6 zum gleichen Vermehrungsergeb­ nis. Der Versuch Nr. 7 brachte überraschend das beste Wachstums­ ergebnis: hier wurden extrem langer Impuls (10 ms) und extrem langer Impulsabstand (10 ms) mit mässiger Fahrgeschwindigkeit (0,6%/ms^-1) kombiniert.

Das im Dauerstrichbetrieb, 61 W, (Versuch Nr. 8) geschnittene Zellgewebe schien sich im Durchschnitt schlechter zu vermehren als das nach dem Impulsverfahren geschnittene Zellgewebe.

Auf Grund des Versuchs kann der Laser als gut geeignet zum Zer­ teilen von Birke gelten; die Vermehrungsleistung war wenigstens ebenso gut wie beim Schneiden mit Messer. Die Birken schlugen nach der auf das Laserschneiden folgenden Vermehrung normal Wurzeln. Das beste Vermehrungsresultat lieferte der Impulsbetrieb von Versuch Nr. 7, bei dem die lange Regenerierzeit offensicht­ lich ein zu starkes Erhitzen und Verbrennen des Zellgewebes verhinderte. Auf Grund der Versuche kann auch geschlossen werden, dass Laser von niedriger Frequenz bei den Pflanzen die geringsten Schäden bewirkt (Verfahren 7).

Claims (8)

1. Verfahren zum Schneiden von Pflanzenmaterial zwecks Pflan­ zenvermehrung, dadurch gekennzeichnet, dass das Schneiden unter Verwendung eines Laserstrahls erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Pflanzenvermehrung um Mikrovermehrung han­ delt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Laser ein CO₂-Laser dient.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekenn­ zeichnet, dass das Schneiden mit Dauerstrich- oder mit Impuls-La­ ser erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass beim Dauerstrich-Laser mit einer Leistung zwischen 30 und 100 W gearbeitet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass beim Impuls-Laser die mittlere Leistung zwischen 5 und 40 W variiert.

7. Verfahren nach irgendeinem der obigen Ansprüche, gekenn­ zeichnet dadurch, dass das zu schneidende Objekt mit Schutzgas umgeben wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Schutzgas ein inertes Gas, vorzugsweise Stickstoff oder Kohlendioxid, dient.