SE469206B - Foerfarande foer att skaera vaextmaterial foer mikrofoeroekning av vaexter med anvaendning av en pulserad laser-straale - Google Patents

Description

469 206 Det ömtåliga växtmaterialet kan även lätt skadas vid snittet.

Skärning med kniv går långsamt, i synnerhet då man opererar med lätt kontaminerat material, varvid särskild uppmärksamhet bör fästas vid aseptik.

Nu har överraskande konstaterats, att ovannämnda problem kan reduceras genom användning av en pulserad laserstråle för skärning av växtmaterialet.

Levande vävnad har tidigare skurits med laserstråle endast i samband med kirurgi. Fördelen med att använda laserstråle i kirurgiska operationer kan anses vara den, att vävnadens blodådror bränns fast och operationen underlättas då blödningen förhindras i synnerhet från små blodådror. Däremot observerades oväntat i samband med denna uppfinning att växtmaterialets ledsträngar inte tar skada vid laserskärning, utan cellvävnaden bibehåller sin vatten- och näringsupptagningsförmåga via snittytan och dessutom bibehålls totipotentiteten hos cellväv- naden i närheten av snittområdet.

Ytterligare fördelar med laseranvändning för skärning av växtmaterial är lätthanterlighet och snabbhet. På grund av det höga aseptikkravet bör man vid arbete med växtmaterial vanligen sterilisera kniven mellan varje snittincident, genom att väta den i etanol och genom flamning. Detta fördröjer skärningen och etanol kan hamna i växtmaterialet, vilket även i små mängder åstadkommer dröjsmål i tillväxten eller kan ha som följd att växten vissnar. Sterilisering kan också göras genom upphettning av instrumentet. Däremot är laserstrålen naturligt steril, vilket avsevärt förhöjer aseptiken. Snitthastigheten ökar samtidigt, då steriliseringsskedet bortfaller.

Laserskärning kan även kombineras med automation. Då är andelen av manuellt utfört arbete liten och skärandet accelereras märkbart. 469 206 Vid laserskärning beror växtmaterialets skador närmast på upp- hettning. För att förbättra snittresultatet används inerta skydds- gaser såsom kväve, koldioxid eller argon. Skyddsgasen leds till den punkt som skall skäras i öppet utrymme med ett munstycke eller alternativt utförs skärningen i en kammare fylld med skyddsgas.

Mängden av skyddsgas väljs så att det förekommer möjligast lite förkolning.

I samband med föreliggande uppfinning användes för skärning av växtmaterial en laseranordning vars viktigaste parametrar be- skrivs nedan.

Laseranordningens modalvärde anger distributionsformen för dess stråle. Vid skärtesten användes som funktionsmodalvärde fortgående TEM 00, varvid strålens intensitet födelas enligt Gauss klock- formade kurva.

Laseranordningens skärkapacitet anger hur mycket energi anordning- en förmår flytta per tidsenhet till punkten som skall skäras.

Ofta absorberas inte hela effekten i den skurna punkten utan återspeglas från punktens yta och/eller absorberas i ångor och gaser som emanerar från punkten. Skärkapaciteten kan även anges med hjälp av intensiteten, som anger skärkapacitetens stråle per yta. Då focuseringslinsen riktar strålen mot ett mycket litet om- råde i brännpunkten, kan man t.o.m med en liten skärkapacitet uppnå höga intensitetsvärden. Proven har visat att det är möjligt att skära växter med CO laser med en effekt på endast 20 W, men skärhastigheten är då inte tillräcklig. I litteraturen har fram- förts att en effekt på c. 40 W räcker för att skära levande djur- cellvävnad. Å andra sidan stiger laseranordningens pris nästan proportionerligt till effekten i andra potens, så att den högsta effekten för laseranordning som är ekonomiskt motiverad är 100 W.

Följaktligen skall effekten av den lämpliga laseranordnigen en- ligt denna uppfinning vara mellan 30-100 W.

Vid pulsering av laserstrålen_bör pulslängden och tidsvärdena mellan pulserna väljas så att det skurna materialet upphettas så lite som möjligt. Värden mellan 0,1-10 ms är lämpliga.

Stråldiametern i brännpunkten inverkar även på skärresultatet, men i allmänhet är denna parameter konstant och av storleksklas- sen 0,2 mm eller mindre.

I följande exempel användes som skärlaser längsströmningslaser CO (Coherent), vars strålmodalvärde är TEM OO och resonator försedd med ECQ modul, vilket möjliggör pulsering av strålen. La- seranordningens kontinuerliga effekt kunde i princip kontrolleras inom området 90-350 W, men för skärprovet ville man sänka effek- ten med en specialgasblandning, varvid den konstanta kontinuerli- ga effekten var 61 W. Pulsfrekvensen kunde väljas på området c.l0-2500 Hz och den enskilda laserpulsens längd inom området 0,1 ms-10 s. Stråldiametern i brännpunkten var c. 0,2 mm. Som skydds- gas användes kväve med en renhet på 99,998 %. Arbetsstationen be- stod av ett xy-bord, som uppvisade måtten 600 x 600 mm.

Exempel Proven utfördes på björk. Följderna av skärningen observerades med hjälp av reproduktionsprov och påföljande växthusodling.

Eftesom laserstrålen upphettar den skurna punkten, kan växtcell- vävnaden torka eller brinna under förkolning. Snittytans skador observerades i mikroskop. Om en allför stor effekt riktades mot snittytan, tog det sig ofta uttryck som förkolning och förkrympning av ledsträngarna, dvs cellvävnadens "smältning".

Genom att ändra anordningens parametrar försökte man förbättra skärresultatet.

För skärningen fästes växtdelarna med sterila små petriskålar fyllda med agar (9 g/1). 469 206 Björk, Betula pendula Björkskott (från in vitro-bestånd) styckades med laser till styc- ken som innehöll en bladvecksknopp. Kontrollprov gjordes genom att skära skotten med kniv. Knopparna placerades på reproduktions- underlaget och odlades i odlingsskåp (23 C, fuktighet 50 %, ljus 2000 lux, 16/6 h). Två parallelprov utfördes (3-7 skottstyc- ken per prov).

Ymparnas tillväxt övervakades och reproduktionskoefficienten ut- räknades två gånger, 4 och 6 veckor efter förflyttningen. Vid la- serskärningen prövades parametrarna i tabell l.

Tabell 1. Alternativa parametrar som prövats vid laserskärning av björk.

Skärsätt nr. Pulseringsparametrar Max.hastighet Genomsnittlig Tp/ms Te/ms T/ms f/Hz % l m/s effekt/W l 0,1 0,4 0,5 2000 0,5-0,6 15,5 2 0,1 0,7 0,8 1250 0,4-0,5 10,5 3 0,1 1,0 1,1 909 0,2 8,5 5 1,0 1,0 2,0 500 2,0 33 6 1,0 10 11 91 0,2 12 7 10 10 20 50 0,6 32 8 kontinuerlig effekt 2,4 61 De laserskurna transplantaten reproducerades väl. Reproduktionen av björkar skurna på olika sätt efter 4 och 6 veckors odling visas i figur 1.

Pulsens längd (Tp) hölls vid 0,1 ms i skärsätt 1-3, men åter- gångsskedet (Te) varierade. Vid skärning med metod nr l var vi- loskedet mellan pulserna 0,4 ms och med metod nr 2 var den 0,7 ms.

Snitthastigheten kunde hållas nästan lika i vardera. Det längre 469 206 återgångsskedet verkar förbättra cellvävnadens livskraft, vilket märktes som stegrad reproduktionskoefficient. Reproduktionen verkade effektivast med skärningssätten 5, 6 och 7. För den femte provindividen gav den långa pulsen (1,0 ms) och rätï långa pausen (1,0 ms) ett gott resultat vid snabb drift (2 %/ms ). En för- längning av pausen till 10 ms på bekostnad av drifthastigheten gav samma reproduktionsresultat i prov nr. 6. Provindivid nr. 7 gav överraskande det bästa tillväxtresultatet: där kombinerades den mycket långa pulsen (10 ms) och mycket långa pulsintervallen (10 ms) i en rimlig drifthastighet (0,6 %/ms- ).

Med kontinuerlig effekt, 61 W (provindivid nr. 8) verkade den skurna cellvävnaden reproduceras i genomsnitt sämre än en cell- vävnad som skurits med pulserad stråle.

På basen av provet kan man anse att laser lämpar sig väl för styckning av björk. Reproduktionen var minst lika effektiv som vid snitt med kniv. Björkarna rotade sig normalt efter reproduk- tionen efter laserskärningen. Den bästa reproduktionen uppnåddes med pulseringen i prov nr. 7, där man antar att den långa åter- gångstiden hindrade cellvävnaden att upphettas och brinna för mycket. På basen av provet kan man dra den slutsatsen att en la- ser som vibrerar med liten frekvens skadar växterna minst (metod 7).

Claims (5)

f'469 206 Patentlmav

1. Förfarande för att skära växtmaterial för mikrcförölmirmg av växter, kännetecknat av, attslärnirngenutförsgenonxanvärmdnirngaven pulserad laser-stråle.

2. Förfarandeenl. krav1,kännetecknat av, attsømlaser användsCbz-laser.

3. Förfarandeerxl. kravleller 2, kännetecknat av, att under pulsering den genonsnittliga effekten varierar mellan 5 och 40 W.

4. Förfarande enl. något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t a v, att lming objekten, som skall skäras används en skyddsgas.

5. Förfarandeenl. krav4, kännetecknat av, attscxn används en inert gas, företrädesvis kväve eller køldioxid.