NL8800760A - Werkwijze voor het snijden van plantmateriaal. - Google Patents

Description

s

N.0.35.068 1 V

Werkwijze voor het snijden van plantmatertaal.

Men heeft in de zestiger jaren gemerkt dat het mogelijk bleek planten uit plantdelen of uit ongedifferentieerd ongevoelig weefsel te genere-5 ren. Deze techniek wordt microvoortplanting genoemd hetgeen derhalve een asexuele reproduktie van planten in het laboratorium is. Het doel van microvoortplanting is het genereren van genetisch identiek waarde-volle individuele eliteplanten. Derhalve is de keuze van de moederplant een essentieel belangrijke stap daar de te genereren planten de klonen 10 daarvan zullen zijn.

Microvoortplanting kan gestart worden vanuit het groeipunt, knop of bijvoorbeeld bladstengel, gesneden uit de moederplant. De cultivatie wordt op aseptische wijze uitgevoerd op een substraat dat de hoofd- en spoornutriënten bevat nodig voor de planten, en vitaminen en hormonen 15 door middel waarvan de groei wordt geregeld. Het substraat wordt gewoon! ijk vaster gemaakt met behulp van agar.

Bij het begin vormt het plantdeel een loot, die vanuit de testbuis in een groter glazen vat wordt overgeplant voor de voortplanting. Door hormonen te gebruiken, hoofdzakelijk cytokinen, worden uit oksel standi -20 ge knoppen of bijvoorbeeld uit bijkomende knoppen, die gevormd worden in een blad van de plant, nieuwe loten geïnduceerd. Na bij benadering vier weken groei worden de voortgeplante loten afgesneden en voor de voortplanting op nieuwe substraten overgeplant. De voortplanting wordt voortgezet totdat het gewenste aantal planten is gegenereerd.

25 Voor de wortel vorming worden de loten gewoonlijk op een substraat overgeplant dat auxin bevat. Na de ontwikkeling van wortels worden de planten overgeplant in aarde in een broeikas met een hoge luchtvochtigheid. Door een geleidelijke toename van licht wordt de fotosynthese van de plant geïnduceerd.

30 De meest belangrijke kostenfactor bij de microvoortplanting is de grote hoeveelheid werk waarvoor professionele vaardigheid nodig is, hetgeen in hoofdzaak bestaat uit het manuaal snijden van de planten en de overplanting daarvan van het ene substraat naar het andere.

In verband met het snijden wordt het volgende opgemerkt. Het ge-35 voelige plantmateriaal kan eveneens gemakkelijk worden beschadigd. Het snijden met een mes is langzaam, in het bijzonder wanneer met een ge-makkelijk te vervuilen materiaal wordt gewerkt, in welk geval speciale aandacht aan de asepsie moet worden besteed.

Het is nu verrassenderwijs gebleken dat de bovenvermelde problemen 40 verminderd kunnen worden door voor het snijden van plantmateriaal een . 8 8 0 0 7 6 Γ 'r * ’ 2 laserbundel te gebruiken.

Alleen bij de chirurgie heeft men levend weefsel door middel van een laserbundel gesneden. Bij chirurgische operaties kan de cauterisa-tie van de bloedvaten in het weefsel als een voordeel worden beschouwd, 5 waarbij het snijden wordt vergemakkelijkt wanneer bloeding wordt verhinderd, in het bijzonder bloeding uit kleine bloedvaten. In samenhang met de uitvinding is het daarentegen verrassenderwijs gebleken dat de vasculaire bundels van plantmateriaal in samenhang met lasersnijden niet nadelig worden beschadigd, maar dat het weefsel zijn vermogen voor opname van water en voedingsstoffen via het gesneden oppervlak behoudt en dat verder het weefsel dicht bij het gesneden oppervlak zijn totipotent ie behoudt.

Onder de voordelen van het gebruik van een laserbundel bij het snijden van plantmateriaal valt eveneens het gemak van het gebruik en I5 de snelheid van de werkwijze. Als gevolg van de hoge eisen van de asep-sie, wanneer plantmateriaal wordt bewerkt conventioneel onder toepassing van een mes, moet het mes tussen de snijbewerkingen in worden gesteriliseerd door het in ethanol te dompelen en door het door een vlam te voeren.

20 Deze bewerking maakt het snijden een langzame bewerking en even eens kan ethanol in het plantmateriaal doordringen. Zelfs kleine hoeveelheden ethanol zullen een vertraging in de start van de groei veroorzaken of zullen tot gevolg hebben dat de plant sterft. De sterilisatie kan eveneens worden uitgevoerd door het instrument te verhitten.

25 Daarentegen is de laserbundel van nature steriel, waardoor de asepsie aanzienlijk wordt verbeterd. Op soortgelijke wijze neemt de snelheid van het snijden toe doordat de sterilisatiestap wordt opgeheven.

Eveneens kan bij het lasersnijden automatisering worden ingevoerd. In dit geval is het aandeel van het manuale werk minder en wordt het 30 snijden aanzienlijk versneld.

Bij het lasersnijden wordt de beschadiging aan het plantmateriaal hoofdzakelijk door verhitting veroorzaakt. Inerte afschermgassen, zoals stikstof, koolstofdioxide of argon worden gebruikt om het resultaat van het snijden te verbeteren. Het afschermgas wordt naar het in open 35 ruimte te snijden voorwerp gericht door middel van een uitlaat, of op alternatieve wijze wordt het snijden uitgevoerd in een met afschermgas gevulde kamer. De hoeveelheid afschermgas wordt zodanig gekozen dat verschroeiing zo insignificant mogelijk is.

Met betrekking tot de ontwikkeling van de uitvinding was de voor 40 het snijden van plantmateriaal gebruikte apparatuur een laserinrichting .8000760 3 waarvan de meest belangrijke parameters verder worden beschreven.

De mode van het laserinstrument geeft de vorm van de verdeling van zijn bundel aan. Bij de snijexperimenten was de bedrijfsmode continu de TEM 00 mode, in welk geval de intensiteit van de bundel volgens de 5 Gaussisehe bel kromme is verdeeld.

Het snijvermogen van het laserinstrument geeft aan hoeveel energie het instrument in staat is per tijdseenheid aan het te snijden voorwerp over te dragen. Vaak wordt niet de gehele energie in het te snijden voorwerp geabsorbeerd maar wordt het gedeeltelijk vanaf het oppervlak 10 van het voorwerp gereflecteerd en/of geabsorbeerd in dampen en gassen die vanuit het voorwerp uittreden. Het snijvermogen kan eveneens in termen van intensiteit worden uitgedrukt, hetgeen het snijvermogen per oppervlaktegebied van de bundel aangeeft. Daar de focusseerlens de bundel in het brandpunt over een zeer klein oppervlak focusseert is het 15 zelfs mogelijk om met een laag snijvermogen hoge intensiteitswaarden te bereiken. Experimenten hebben aangetoond dat het mogelijk is planten te snijden met zelfs een COg laser met een vermogen van slechts 20 W. In dit geval echter is de snijsnelheid niet voldoende. Men heeft in de literatuur voorgesteld dat een vermogen van bij benadering 40 W voldoende 20 is voor het snijden van levend dierweefsel. Daarentegen neemt de prijs van een laserinstrument vrijwel in directe verhouding tot de tweede macht van het vermogen toe, en op deze manier is het hoogste economisch verantwoorde vermogen voor een laserinstrument bij benadering 100 H. Op basis van het bovengestelde behoort het vermogen van een laserinstru-25 ment, dat geschikt is voor gebruik in samenhang met de uitvinding, in het bereik van 30 tot 100 W liggen.

Wanneer de laserbundel wordt gepulseerd, moeten de waarden voor de breedte van de puls en het interval tussen de pulsen zodanig gekozen worden dat het te snijden materiaal zo weinig mogelijk wordt verhit.

30 Waarden tussen 0,1 en 10 ms zijn geschikte waarden.

De diameter van de bundel in het brandpunt beïnvloedt eveneens het resultaat van het snijden, maar in het algemeen is deze parameter constant en ligt in de orde van grootte van 0,2 mm of minder.

Bij de volgende voorbeelden was de gebruikte snijlaser een langs-35 stroom CO2 laser (coherent), waarvan de bundel mode TEM 00 was en waarvan de resonator verschaft werd met een ECQ module waardoor de bundel kon worden gepulseerd. Het continue vermogen van het laserinstrument was in principe instelbaar in het bereik van 90 tot 350 W, maar voor het snijexperiment was het gewenst om het vermogen te verla-40 gen met behulp van een speciaal gasmengsel, in welk geval het constante .8800760 # 4

V

continue vermogen gelijk was aan 61 W. De pulsfrequentie was selecteer-baar binnen het bij benadering aangegeven bereik van 10 tot 2500 Hz, en de breedte van een afzonderlijke laserpuls was selecteerbaar binnen het bereik van 0,1 ms tot 10 s. De diameter van de bundel in het brandpunt 5 was bij benadering. De diameter van de bundel in het brandpunt was bij benadering 0,2 mm. Het gebruikte afschermgas was stikstof met een zuiverheid van 99,998 %. Het werkstation was van een xy tafel gemaakt waarvan de afmeting 600 x 600 mm bedroeg.

Voorbeel d 10 De experimenten werden op berk uitgevoerd. De effecten van het snijden werden waargenomen met behulp van een voortplantingsexperiment en een opvolgende cultivatie in een broeikas.

Daar een laserbundel het voorwerp dat wordt gesneden verhit, kan het plantweefsel droog of verschroeid worden. De beschadiging aan het 15 gesneden oppervlak werd met behulp van een microscoop gecontroleerd. Wanneer het gesneden oppervlak aan een te hoog vermogen werd blootgesteld was dit vaak zichtbaar als verschroeiing en als een totale insnoering van de vasculaire bundels, d.w.z. "samensmelting" van het weefsel. Door de parameters van het instrument te veranderen werden 20 pogingen gedaan om het spoor of prent van het snijden te verbeteren.

Ten behoeve van het snijden werden de plantdelen op hun plaats gehouden door kleine steriele met agar (9 g/1) gevulde Petri schotels te gebruiken.

Berk, Betula pendula 25 Berk-loten (vanuit een in vitro populatie) werden gesneden in stukken die elk een oksel standi ge knop bevatten, met behulp van het laserinstrument. Het stuurexperiment werd uitgevoerd door loten met een mes te snijden. De knoppen werden op een voortplantingssubstraat geplaatst en in een incubator (23°C, luchtvochtigheid 50 %, licht 2000 30 lux, 16/8 h) gecultiveerd. Parallelle experimenten werden in duplo uitgevoerd (3 tot 7 lootstukken per experiment).

Het beginnen van de groei van de transplanten werd waargenomen en de voortplantingscoëfficiënt werd tweemaal berekend na 4 en na 6 weken ten opzichte van de tijd van de overplanting. De in tabel A aangegeven 35 parameters werden bij het lasersnijden ondervonden.

.8800760 5 *

Tabel A.

Parameter alternatieven bij het experiment met lasersnijden van berk.

5 Snij- Pulseerparameters Maximum Gem.

werkwijze Tp/ms Te/ms T/ms f/Hz snelheid vermogen/W

no.__% 1 m/s_ 1 0,1 0,4 0,5 2000 0,5-0,6 15,5 10 2 0,1 0,7 0,8 1250 0,4-0,5 10,5 3 0,1 1,0 1,1 909 0,2 8,5 5 1,0 1,0 1,0 500 2,0 33 6 1,0 10 11 91 0,2 12 7 10 10 20 50 0,6 32 15 8 continu vermogen 2,4 61

De laser-gesneden transplanten plantten zich goed voort. De voortplanting van de berken, gesneden op verschillende manier, na 4 weken en na 6 weken van groei is in figuur 1 aangegeven.

20 De breedte van de puls (Tp) werd bij de snijwerkwijzen 1-3 op 0,1 ms gehouden, maar de herstelfase (Te) werd gevarieerd. Toen het snijden met de werkwijze 1 werd uitgevoerd bedroeg de rustfase tussen de pulsen 0,4 ms en toen het snijden met de werkwijze 2 werd uitgevoerd bedroeg de rustfase 0,7 ms. Het was mogelijk om de snijsnelheid op 25 vrijwel dezelfde waarde in beide werkwijzen te houden. De verlengde herstelfase lijkt de vitaliteit van het weefsel te verbeteren hetgeen zich als een toegenomen voortplantingscoëfficiënt manifesteerde. De voortplanting scheen het meest effectief wanneer de snijwerkwijzen 5,6 en 7 werden toegepast. Bij het experiment 5 realiseerden de brede puls 30 (1,0 ms) en het vrij lange interval (1,0 ms) gedurende een snelle bewerking (2 %/ms-l) een goed resultaat. Een verlenging van het interval tot 10 ms ten koste van de werksnelheid bracht hetzelfde voortplantings-resultaat bij het experiment 6 op. Het experiment 7 verschafte verrassenderwijs het beste groeiresultaat: hierbij werden een zeer brede puls 35 (10 ms) en een zeer kort pulsinterval (10 ms) gecombineerd met een gematigde werksnelheid (0,6 %/ms-l).

Een weefsel snede onder toepassing van een continu vermogen van 61 W (experiment 8) scheen gemiddeld zich zwakker voort te planten dan een weefsel snede met een gepulseerde bundel.

^ Op basis van de experimenten kan geconcludeerd worden dat een .8800760 * 6 laserbundel zeer geschikt is voor het snijden van berk. De voortplanting was ten minste even effectief als bij het snijden met een mes. De berken schoten op normale wijze wortel na de voortplanting volgend op het lasersnijden. De beste voortplanting werd verkregen met de pulse-5 ring van experiment 7, waarbij van de lange herstel tijd werd aangenomen dat deze verhinderd heeft dat het weefsel teveel verhit en verbrand wordt. Eveneens kan op basis van het experiment worden geconcludeerd dat een laserbundel, die op een lage frequentie oscilleert, de planten het minst beschadigt (werkwijze 7).

.8800760

Claims (8)

1. Werkwijze voor het snijden van plantmateriaal ten behoeve van de voortplanting van planten, met het kenmerk, dat het snijden wordt uitgevoerd onder toepassing van een laserbundel.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de voort planting van planten een microvoortplanting is.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de toegepaste laser een CO2 laser is.

4. Werkwijze voglens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat het 10 snijden wordt uitgevoerd onder toepassing van continu vermogen of door de bundel te pulseren.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het toegepaste continue vermogen een vermogen is binnen het bereik van 30 tot 100 W.

6. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat gedurende het pulseren het gemiddelde vermogen varieert binnen het bereik van 5 tot 40 W.

7. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat een afschermgas wordt toegepast rond het te snijden voorwerp.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat het toege paste afschermgas een inert gas, bij voorkeur stikstof of koolstofdioxide, is. ********** ,88 0 i' 7 -