DE3800117A1

DE3800117A1 - Semiquantitativer kalzium-schnelltest

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Publication number: DE3800117A1
Application number: DE19883800117
Authority: DE
Inventors: Erfinder Wird Nachtraeglich Benannt Der
Original assignee: LINHART AXEL
Current assignee: LINHART AXEL
Priority date: 1988-01-05
Filing date: 1988-01-05
Publication date: 1989-07-13
Also published as: DE3800117C2

Description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur semiquantitativen Schnellermittlung des Blut-Kalziumgehaltes sowie ein dazu geeignetes Test-Kit.

1. Bisherige Entwicklungen und Veröffentlichungen auf diesem Gebiet

Alle Testverfahren für eine semiquantitative Schnellermittlung des Blut-Kalziumgehaltes basieren auf der Beteiligung des Elementes Kalzium Ca⁺⁺ am Blutgerinnungsvorgang. Daher seien im folgenden die Vorgänge bei der Blutgerinnung und ihre Beziehung zu Ca⁺⁺ kurz dargestellt.

Nach Eder (1976) läßt sich der Ablauf der Blutgerinnung wie folgt darstellen:
Beteiligt am Gerinnungsgeschehen sind sogenannte "plasmatische Faktoren" (im Blutplasma vorkommende Proteine oder Enzyme) und sogenannte "zelluläre Faktoren" (Phospholipide, die aus den Thrombozyten oder anderen Zellen stammen und wichtige Enzymreaktionen katalysieren).

Die Einleitung der Gerinnung kann auf zwei verschiedenen Wegen erfolgen. Sie kann erstens von einer Gewebsverletzung ausgehen und über das "exogene System" ablaufen (= extravasales, äußeres oder "extrinsic system"). Die zweite Möglichkeit stellt das sogenannte "endogene System" dar (= intravasales, inneres oder "intrinsic system"). Beide Systeme haben die Bildung eines Faktor- X-Aktivator-Komplexes als Ziel.

Das auslösende Moment im exogenen System ist eine Gewebsverletzung, wobei verschiedene gerinnungsaktive Substanzen, die unter dem Begriff Thromboplastin (Thrombokinase, Faktor III) zusammengefaßt werden, aus den alterierten Zellen frei werden.

Das endogene Reaktionssystem wird nach dem Kontakt des Blutes mit einer veränderten Oberfläche, wie sie z. B. bei Defekten oder Alterationen der Gefäßintima entsteht, in Gang gesetzt. Dabei wird der Hageman-Faktor (XII) aktiviert, der eine Reihe von Folgereaktionen auslöst, die schließlich den Faktor-X-Aktivatorkomplex bilden. Ab dem aktivierten Faktor Xa verlaufen nun exo- und endogenes System nach einem gemeinsamen Reaktionsmuster. Xa bewirkt zusammen mit Ca⁺⁺, Phospholipiden und dem Plasmafaktor V die Umwandlung von Prothrombin (Faktor II) zu Thrombin (IIa), Hilfsfaktoren hierfür nennt man Prothrombinaktivatoren.

Prothrombin ist ein Produkt der Leber, das sich normalerweise im Plasma befindet, Thrombin ist ein Spaltprodukt davon. Thrombin bewirkt in seiner Eigenschaft als proteolytisches Enzym die Hauptreaktion des Gerinnungsvorganges, nämlich die Umwandlung des Fibrinogens (Faktor I) zu Fibrin. Dabei werden vom Fibrinmolekül zwei Peptide abgespalten, es entstehen Fibrinmonomere, die sich zu Doppelsträngen polymerisieren und damit Fibrinfibrillen bilden.

Dieses Fibrin ist an sich noch löslich und wird erst nach Einwirkung des durch Thrombin und Kalzium aktivierten Faktor (VIII) (FSF) und durch weitere nichtkovalente Ca⁺⁺-Bindung zum kovalent vernetzten Fibrin. Das Blutgerinnsel ist entstanden. In diesem läuft später durch den Einfluß des Thrombozytenfaktors "Retraktoenzym" noch ein Schrumpfungsprozeß der Fibrinfibrillen ab.

Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Bestimmungsmethoden bekannt, die das Blutgerinnungsphänomen für den Kalziumnachweis nutzen. Das Prinzip besteht darin, daß durch Zugabe definierter Mengen an Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Kalziumionen im Blut gebunden werden und somit nicht mehr für die Blutgerinnung zur Verfügung stehen. Werden dabei alle Kalziumionen chemisch gebunden, dann kann die Blutprobe nicht mehr gerinnen. Durch die Kenntnis der vorgelegten Menge an EDTA und des Befundes die Blutprobe ist geronnen oder nicht geronnen, ist festzustellen, ob der Kalziumgehalt im Blut einen vorgegebenen Grenzwert über- oder unterschreitet.

Semiquantitative Blut-Kalziumbestimmung beim Rind nach Mayer, Raggi und Ramberg (1965)

Der erste Schnelltest zur Kalziumbestimmung im Blut, der sich das Blutgerinnungsphänomen für den Kalziumnachweis zunutze machte, wurde 1965 von Mayer, Raggi und Ramberg entwickelt. Er stellt sozusagen die Grundlage für eine Reihe von modifizierten Testverfahren mit Vollblut dar.

Er wird von Mayer et al. (1965) folgendermaßen beschrieben:
Die zur Verhinderung der Blutgerinnung benötigte Menge von Natriumsalz des Ethylendiamintetraacetat (EDTA) wird herangezogen, um die Kalziummenge des Blutes abzuschätzen. Es verbinden sich 0,01 ml der wäßrigen Lösung von EDTA in einer bestimmten Konzentration (5 mEq./l) mit 1 Mikrogramm Kalzium.

Für die Durchführung eines Testes werden 6 Blutröhrchen in der Größe 75 mm × 12 mm ⌀ benötigt. In einer Tabelle werden die Mengen EDTA angegeben, die zur komplexen Bindung des Kalziums bei verschiedenen Kalziumkonzentrationen im Blut erforderlich sind. Zur Berechnung der erforderlichen EDTA-Menge wird ein mittlerer Hämatokrit von 33,3% angenommen.

Für die Abfüllung der errechneten Menge an EDTA-Lösung in die Blutröhrchen wird eine exakte Mikrobürette benötigt. Jeder Test erfordert eine Serie von 6 Röhrchen, von denen 5 (entsprechend ihres zu erwartenden Serum- Kalziumgehaltes) mit der entsprechenden Menge Na-EDTA- Lösung (siehe Tabelle) in einer Konzentration von 5 mEq./l beschickt werden. Das 6. Blutröhrchen - ohne EDTA - dient als Vergleich zur Feststellung der Blutgerinnungsfähigkeit.

Die Röhrchen werden wie folgt bezeichnet:

Röhrchen ohne
EDTA-Lösung 0
Röhrchen mit 0,40 ml	EDTA-Lösung 6 = 6 mg/dl
Röhrchen mit 0,47 ml	EDTA-Lösung 7 = 7 mg/dl
Röhrchen mit 0,53 ml	EDTA-Lösung 8 = 8 mg/dl
Röhrchen mit 0,60 ml	EDTA-Lösung 9 = 9 mg/dl
Röhrchen mit 0,67 ml	EDTA-Lösung 10 = 10 mg/dl

Nach Einbringen der EDTA-Lösung wird das Wasser durch Erhitzen auf 105°C verdampft, und alle 6 Röhrchen jeder Serie werden mit einem durchstechbaren Gummistopfen verschlossen. Vor Durchführung der Serum-Kalziumbestimmung mit diesem Test wird eine dünne Kanüle in den Gummistopfen eingestochen, um den Druckausgleich beim Einspritzen des Blutes in die Blutröhrchen zu gewährleisten. Die Blutprobe wird mit einer Plastikspritze (5 ml) unter Verwendung feiner Kanülen entnommen und jeweils exakt 1,0 ml Blut in die Röhrchen 6 bis 10 abgefüllt. Die Röhrchenserie wird anschließend in ein Wasserbad von 37°C gestellt.

Die Beurteilung des Testes ist nach etwa 15 Minuten möglich. Bei Raumtemperatur dauert es laut Angabe von Mayer et al. (1965) bis zu zwei Stunden, bis das Ergebnis ablesbar ist.

Eine Blutprobe gilt als geronnen, wenn sich das Blut bei leichtem Schwenken des umgekehrten Röhrchens nicht vom Röhrchenboden löst.

Der Kaliziumgehalt der Blutprobe wird wie folgt abgelesen:

Gerinnung
Serum-Kalziumgehalt
Gerinnung nur in Röhrchen 0
6 mg/dl
Gerinnung nur in Röhrchen 0, 6	6 mg/dl u. 7 mg/dl
Gerinnung nur in Röhrchen 0, 6, 7	7 mg/dl u. 8 mg/dl
Gerinnung nur in Röhrchen 0, 6, 7, 8	8 mg/dl u. 9 mg/dl
Gerinnung nur in Röhrchen 0, 6, 7, 8, 9	9 mg/dl u. 10 mg/dl
Gerinnung nur in Röhrchen 0, 6, 7, 8, 9, 10	10 mg/dl

Das in den Röhrchen eventuell noch im "Überschuß" befindliche Kalzium läßt einen Blutgerinnungsvorgang gemäß dem endogenen Blutgerinnungssystem ablaufen.

Durch die Testreihe mit verschiedenen hohen EDTA-Mengen läßt sich der Blut-Kalziumwert in einzelnen Stufen gut abschätzen. Die Testtemperatur wurde auf 37°C festgelegt, um im gewählten Zeitraum von 15 Minuten vergleichbare und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.

Harry (1973) kam nach der Durchführung des Tests in der oben beschriebenen Weise zu folgendem Ergebnis:

Tabelle 1

Vergleich der mit dem EDTA-Test ermittelten und der atomabsorptionsspektrometrisch festgestellten Serum-Kalziumgehalt bei 144 klinisch gesunden und 36 festliegenden Kühen

Tabelle 2

Beurteilung des Kalziumgehaltes im Blut von 180 Rindern mit dem semiquantitativen EDTA-Test in Bezug zu den Ergebnissen der quantitativen, atomabsorptionsspektrometrischen Kontrolluntersuchungen gemäß den Untersuchungsergebnissen von Harry (1973)

Von 23 hypokalzämischen Tieren klassifizierte der Test 5 richtig. Demnach hat der Test eine "Empfindlichkeit" von 22%.

Von 157 nicht hypokalzämischen Tieren wurden 81 vom EDTA- Test richtig ausgewiesen. Die "Spezifität" des Testes liegt bei 52%.

Die "Richtigkeit" des Testes ist 48%, da er 86 von 180 Probanden insgesamt richtig klassifizierte. Von 81 Tieren, die der EDTA-Test als hypokalzämisch auswies, hatten nur 5 tatsächlich hypokalzämische Blutwerte. Bei diesem "Prädiktiven Wert des positiven Tests" (Vecchio, 1966), genannten Kriterium erreichte der Test nur einen Wert von 6% (pvT+).

Der "Prädiktive Wert des negativen Tests" (pvT-) errreichte einen Wert von 82%, da von 99 als nichthypokalzämisch eingestuften Tieren 81 tatsächlich nicht hypokalzämisch waren.

Um die Aussagekraft des "Prädiktiven Wertes" (pvT+) abschätzen zu können, ist es wichtig, die sogenannte "Prävalenz" der an Hypokalzämie erkrankten Tiere in der untersuchten Gruppe zu kennen. Die "Prävalenz" beträgt in diesem Fall 13%. Dieser Wert beschreibt, daß 23 von 180 Tieren hypokalzämisch waren.

Da gerade die erniedrigten Serum-Kalziumwerte diagnostisch wichtig sind, kam Harry (1973) zu dem Schluß, der Mayer-EDTA-Test habe keinen praktisch-diagnostischen Wert.

Martig et al. (1974) führten den Mayer-EDTA-Test ebenfalls in vorgegebener Form bei 50 Kühen durch und erhielten die in Tabelle 3 zusammengefaßten Ergebnisse:

Tabelle 3

Vergleich der mit dem semiquantitativen EDTA- Test festgestellten Kalziumgehalte im Blut mit den Ergebnissen der quantitativen atomabsorptionsspektrometrischen Kontrolluntersuchungen

Reitz (1978) wählte die Versuchsbedingungen so einfach und praxisnahe wie möglich, entnahm 244 Blutproben mittels einer Recordspritze mit Recordkanülen und schwenkte die Probe zur besseren Lösung des EDTA am Anfang des Versuchs leicht. Als Versuchstemperatur wählte er die herrschende Umwelttemperatur und führte die Beurteilung der Proben dementsprechend erst nach 1-2 Stunden durch. In dieser Zeit wurden die Proben innerhalb von ¹/₂-1 Stunde im Auto zu seinem Labor überbracht und jeweils eine flammenphotometrische Gegenprobe gemacht. Von den 244 Proben konnten 25 nicht ausgewertet werden.

Tabelle 4

Vergleich von 219 mit dem Mayer-EDTA-Test ermittelten Kalziumwerten mit den flammenphotometrisch festgestellten Serum-Kalziumwerten gemäß den Untersuchungsergebnissen von Reitz (1978)

- Testempfindlichkeit: 81%
- Testspezifität: 63%
- Testrichtigkeit: 70%
- pvT+ 61%
- pvT- 81%
- Prävalenz: 42%

Semiquantitative Blut-Kalziumbestimmung beim Rind nach Sandholm, Jönsson, Pehrson und Zewi (1979)

Sandholm et al. (1979) beschrieben einen modifizierten EDTA-Test bei dem das Blutkalzium durch ein Überangebot von K₂-EDTA komplex abgebunden wird und der EDTA-Überschuß dann mit Ca⁺⁺ und Thromboplastin als Reaktionsbeschleuniger "rücktitriert" wird. Es wird hierbei eine künstliche Aktivierung des sehr schnell ablaufenden exogenen Blutgerinnungsweges erzielt. Damit soll der Test innerhalb eines angemessenen Zeitraums (5 Minuten) bis zum Endprodukt der Gerinnung geführt werden, um so Unsicherheitsquellen und Fehler in der Testbeurteilung zu reduzieren.

Im folgenden ist die praktische Ausführung dieses Testes kurz beschrieben:

- Reagenzröhrchen "1":
In ein Kunststoffröhrchen mit 11 mm Durchmesser und einer Markierung bei 10 ml werden jeweils 1 ml Antikoagulationslösung (10,1 mg K₂-EDTA = 25,0 μMol) verbracht und anschließend eingetrocknet.
- Raktionsampullen "2":
In diese kommen jeweils 1 ml Thromboplastinsuspension und 11,7 μMol CaCl₂. Der Inhalt wird gefriergetrocknet und unter Stickstoff verschlossen.
- 1. Das Reagenzröhrchen "1" wird mit Nativblut bis zur Markierung gefüllt. Das Röhrchen wird 20mal gekippt, um den Inhalt gut zu durchmischen (nicht schütteln). Dabei wird das EDTA in Röhrchen "1" das Kalzium des Blutes binden und eine Blutgerinnung verhindern.
- 2. Die Reaktionsampulle "2" wird geöffnet, und etwa 10 Tropfen destilliertes Wasser aus dem Plastiktropfer werden zugefügt. Durch leichtes Schütteln wird das Pulver im Fläschchen gelöst.
- 3. Der Inhalt des Reagenzröhrchens "1" wird zusammen mit dem der Ampulle "2" in ein weiteres Reagenzglas überführt, dieses dann verschlossen und der Inhalt durch 20maliges Kippen vermischt. Dann das Fläschchen stehenlassen. Jetzt wird das Kalzium das überschüssige EDTA zurücktitrieren. Bleiben daraufhin freie Ca- Ionen in der Probe, werden diese mit Hilfe des Thromboplastins die Blutgerinnung einleiten. Wurden dagegen alle Kalzium-Ionen mit EDTA gebunden, kann die Blutgerinnung nicht ablaufen. Die Reaktionszeit beträgt 5 Minuten.
  Der Test wird bei Zimmertemperatur ausgeführt, niedrigere Temperaturen beeinflussen die Reaktionszeit negativ.

Der Test ist auf den Grenzwert von 2,0 mMol Kalzium pro dl Serum ausgelegt (= 8 mg/dl), da dieser als unterste Grenze für den physiologischen Blut-Kalziumwert von Kühen angesehen wird (Sandholm et al., 1979).

Auswertung:

Die Ablesung erfolgt nach 5 Minuten

- Probe koaguliert:
Der Kalziumgehalt der Probe liegt über dem gewählten Grenzwert von 8 mg/dl.
- Probe nichtkoaguliert:
Der Kalziumgehalt der Probe liegt unter 8 mg/dl = Hypokalzämie.
- Probe an der Grenze zur Koagulation:
(Schlieren und kleine Koagula werden sichtbar.) Der Kalziumgehalt der Probe liegt sehr nahe am Grenzwert.

Von allen Probanden wurden parallel Blutproben mittels eines Atomabsorptionsspektrophotometers auf ihren Kalzium- und Magnesiumgehalt untersucht und zudem der Hämatokritwert ermittelt.

Tabelle 5

Vergleich der Ergebnisse von 158 mit dem EDTA- Test nach Sandholm et al. (1979) durchgeführten semiquantitativen Kalziumbestimmungen mit denen der quantitativen atomabsorptionsspektrometrischen Untersuchung

- Testempfindlichkeit: 89%
- Testspezifität: 94%
- Testrichtigkeit: 91%
- pvT+ 96%
- pvT- 84%
- Prävalenz: 56%

Schnelltest zur semiquantitativen Bestimmung des Blut- Kalziumgehaltes beim Rind nach Linhart (1984)

Entwickelt von Axel Linhart im Rahmen einer Inaugural- Dissertation zur Erlangung der tiermedizinischen Doktorwürde an der tierärztlichen Fakultät München unter der Leitung von Prof.Dr.Dr.h.c. G. Dirksen 1984).

Funktionsprinzip:

Die Na₂-EDTA-Vorlage im Teströhrchen ist so berechnet, daß 0,466 mg Kalzium (das ist die absolute Menge Gesamtkalzium, die im Serum von 10 ml Vollblut enthalten ist, wenn der Hämatokrit 33,5 Vol.-% und die Kalziumkonzentration im Serum 7 mg/dl beträgt) komplex abgebunden werden können. Dieses Kalzium steht dann nicht mehr für die Blutgerinnung zur Verfügung. Sind nun im Serum mehr als 7 mg/dl Kalzium vorhanden, so kann der exogene Blutgerinnungsweg noch ablaufen, und das Testblut gerinnt innerhalb von 5 Minuten nach Zugabe des Thromboplastins.

Sind jedoch weniger als 7 mg Kalzium pro dl vorhanden, so ist praktisch das gesamte Kalzium durch EDTA abgebunden, und eine Gerinnung des Testblutes ist damit unmöglich. Aus dem Testergebnis "geronnen/nicht geronnen" ist auf diese Weise eine Aussage darüber möglich, ob der Blut-Kalziumgehalt des Tieres unter dem Grenzwert von 7 mg/dl abgesunken ist oder nicht.

Da der Reaktionsablauf bei einer geringen Restmenge von nicht an EDTA gebundenem Kalzium sehr langsam ist und bis zu 2 Stunden dauern kann (Mayer et al., 1965), wird das Thromboplastin als Reaktionsbeschleuniger eingesetzt. Mit der ermittelten Thromboplastinmenge ist es möglich, im positiven Fall den Koagulationsendpunkt und damit das Testergebnis schon innerhalb 5 Minuten zu erreichen.

Auswertung der Reaktion:

5 Minuten nach Ansetzen des Testes wird die Reaktion wie folgt beurteilt:

- Probe koaguliert:
Der Kalziumgehalt der Probe liegt über dem gewählten Grenzwert von 7 mg/dl.
- Probe nicht koaguliert:
Der Kalziumgehalt der Probe liegt unter 7 mg/dl.
- Probe an der Grenze zur Koagulation:
(Schlieren und kleine Koagula sind sichtbar, beim Kippen des Röhrchens fließt das Blut.) Der Kalziumgehalt der Probe liegt nahe am Grenzwert.

Ausführung des Kalziumtestes:

- Nachdem einige Tropfen Blut aus der, in die Jugularvene eingeführten Kanüle abgeflossen sind, wird die Spritze bis über die 10,0-ml-Marke hinaus mit Blut abgefüllt und davon anschließend soviel verworfen, bis sich ein blasenfreier Inhalt von 10,0 ml ergibt.
- Im Rahmen der eigenen Versuche wurden außerdem noch je ein Reagenzröhrchen aus Kunststoff zur quantitativen Bestimmung des Kalziumgehaltes mittels der flammenphotometrischen Referenzmethode sowie zur Ermittlung des Hämatokritwertes mit Blut gefüllt.
- Die 10,0 ml Blut werden nun in das Reagenzröhrchen mit der Na₂-EDTA-Vorlage verbracht, dieses sofort verschlossen und zirka 10mal geschwenkt (nicht geschüttelt), um den Inhalt gut zu durchmischen.
- 0,1 ml der Thromboplastinlösung wird mit einer 100-Mikroliter-Pipette zusätzlich einpipettiert, und das Röhrchen wiederum etwa 10mal zum Durchmischen geschwenkt.
- Jede volle Minute wird durch Kippen überprüft, ob eine Koagulation eingetreten ist.
- Testende nach 5 Minuten.

Tabelle 6

Vergleich der Ergebnisse von 104 mit dem EDTA- Test durchgeführten semiquantitativen Kalziumbestimmungen mit denen der quantitativen flammenphotometrischen Untersuchung

- Testempfindlichkeit: 75%
- Testspezifität: 95%
- Testrichtigkeit: 87%
- pvT+ 92%
- pvT- 84%
- Prävalenz: 42%

"Ca-Test Graeub" (Rehagstr. 83, CH-3018 Bern; Vertieb Deutschland: Fa. Albrecht, Aulendorf)

Der 1985 veröffentlichte Reaktionsablauf dieser Testanordnung entspricht dem chemischen Reaktionsprinzip des von Sandholm et al. (1979) beschriebenen Ca-Testes.

Es wird also das Blutkalzium durch ein Überangebot von EDTA komplex abgebunden und der EDTA-Überschuß anschließend mit Ca⁺⁺ und Thromboplastin als Reaktionsbeschleuniger "rücktitriert". Dazu befindet sich eingedampftes EDTA am Röhrchenboden und ein nicht näher beschriebenes Gemisch aus Thromboplastin und CaCl₂ in einem eindrückbaren Stöpselmechanismus. Dieses "Gemisch" wird durch Eindrücken einer Stöpseltrennwand der Blutmenge beigemischt, die entsprechend dem gewünschten Testwert (5, 7, 8 mg/dl) vorher durch Schwenken des Röhrchens mit dem EDTA-Überschuß vermischt worden war. Anschließend wird das Röhrchen ¹/₂ Minute zur Durchmischung der Reagenzien geschwenkt, 5 Minuten stehengelassen und dann das Testergebnis wie vorher beschrieben abgelesen. Das Testurteil geronnen/nicht geronnen wird bezüglich des gewählten Testwertes interpretiert.

Bewertungen des Ca-Test-Graeub sollen im Rahmen einer Doktorarbeit an der Tierärztlichen Fakultät Bern erstellt worden sein. Sie konnten leider bisher noch nicht eingesehen werden.

Bislang sind dem Großtierpraktiker vor Ort und fernab des eigenen Praxislabors zur raschen Beurteilung des Kalzium-Blutwertes des Patienten und als Entscheidungshilfe für die Wahl der richtigen Therapie nur die vorab beschriebenen semiquantitativen Ca-Schnelltests zur Wahl gestellt.

Auf dem Bereich der "Trockenchemie" ist von der Firma Boehringer Mannheim ein mehrschichtiger Teststreifen zur Blut-Ca-Bestimmung angekündigt, der colorimetrisch mittels eines transportablen Reflektionsphotometers ausgewertet werden kann. Nachteil dieser Methode ist, daß hierfür erst das teure Gerät zur Bestimmung angeschafft werden muß und stets im Auto mitgeführt werden muß, was durch Verschmutzung und Erschütterung im Fahrzeug zur vorschnellen Alterung des Präzisionsgerätes beiträgt.

2. Die zum Schutz angemeldete Neuentwicklung nach Dr. Axel Linhart

Dieser Kalzium-Schnelltest basiert auf den Erkenntnissen der unter 1 beschriebenen bisherigen Entwicklungen von semiquantitativen Kalzium-Schnelltests.

Die Idee wurde im Juli 1982 gefunden, als ich mich mit der vorgegebenen Dissertationsarbeit beschäftigte. In der Folgezeit wurde dann diese Idee in vielen Entwicklungsstufen weiterverfolgt und immer wieder unter Praxisverhältnissen zum Einsatz gebracht. Zur Zeit liegen über 400 ausgewertete Testansätze zur Beurteilung bereit. Entwicklungsziel war, die bekannten Nachteile der bisherigen semiquantitativen Ca-Schnelltests (incl. des mittlererweile dazugekommenen "Ca-Test-Graeub") abzubauen bzw. zu vermeiden und den Testvorgang nach folgenden Kriterien zu gestalten:

- Einfache und billige Materialien,
- unkomplizierter Reaktionsablauf,
- lange Haltbarkeit der Reagenzien und des Testansatzes
- einfache Handhabung,
- sicheres Erreichen des Testendpunktes innerhalb von 5 Minuten,
- möglichst große Genauigkeit und Verläßlichkeit der Testaussage.

3. Nachteile der bis dahin vorgestellten semiquantitativen Blut-Kalziumbestimmungsmethoden 3.1 Der Test nach Mayer et al. (1965)

Nachteile bei diesem Testansatz sind vor allem die geringe Testmenge des Blutes von 1 ml und das Fehlen einer zufügbaren Substanz, die selbst bei geringstem Überschuß an Kalzium zuverlässig und unabhängig von der Umgebungstemperatur den Reaktionsendpunkt und damit die Testaussage innerhalb von 5 Minuten erreichen läßt.

0,1 ml Einfüllmengenfehler bedeuten bei 1 ml Testblutmenge einen Fehler von 10%, bei 10 ml Testblutmenge aber nur einen Aussagefehler von 1% bezüglich des Testgrenzwertes.

3.2 Der Test nach Sandholm et al. (1979)

Der von Sandholm et al. (1979) beschriebene Kalzium- Schnelltest wurde von der Fa. Orion Diagnostica, Helsinki auf dem Markt eingeführt, aber kurze Zeit später die Produktion wieder eingestellt.

Der Nachteil dieser Testanordnung unter Praxisverhältnissen besteht darin, daß 3 Reaktionsgefäße, 1 sterile Nadel und Spritze und 1 Pipettenröhrchen mit destilliertem Wasser verwendet werden müssen, um letztendlich eine Testaussage zu erhalten. Die Handhabung ist dadurch fehlerträchtig und umständlich, läßt somit von einer häufigen Verwendung Abstand nehmen.

Produktionstechnisch besteht eine Schwierigkeit darin, daß pro Produktionsreihe eine neue Eichkurve für das Thromboplastin nötig ist, da die "Aktivität" von Thromboplastin nicht "standardisiert" ist und somit die benötigte Thromboplastinmenge für den Testansatz immer wieder neu bestimmt werden muß.

3.3 Der Test nach Linhart (1984)

Für den semiquantitativen Kalzium-Schnelltest, der von mir im Rahmen der Dissertationsarbeit entwickelt wurde gilt, daß die vorab beschriebenen Nachteile der Testanordnungen so weit wie damals möglich beseitigt wurden. Aber auch hier steht eine Serienreife entgegen, daß das Thromboplastin in seinem "Aktivitätsgehalt" nicht standardisierbar ist, also seine benötigte Menge für den Testansatz immer wieder neu bestimmt werden muß. In flüssiger Form ist das Thromboplastin außerdem nur für kurze Zeit bei Raumtemperatur haltbar, muß also zur Haltbarmachung lyophilisiert werden.

Für die Handhabung beim Testvorgang bedeutet dies wiederum den Nachteil, daß entweder 2 Röhrchen hintereinander mittels Umfüllung des Testblutes verwendet werden müssen, oder daß ein ähnlich komplizierter wie anfälliger und fehlerträchtiger Stöpselmechanismus wie beim Ca-Test- Graeub zur Anwendung kommen muß, der das Thromboplastin erst frei gibt, wenn sich das Testblut mit der EDTA- Vorgabe vermengt hat.

3.4 Der Ca-Test-Graeub

Beim Ca-Test-Craeub wiederum wurde der Versuch gemacht, die Vorteile des Ca-Schnelltestes nach Sandholm et al. (1975) mit denen der, in der Dissertationsarbeit nach Linhart (1984) veröffentlichten, zu vereinen.

Wieder einmal zeigen sich seine Nachteile erst bei der Anwendung unter Praxisverhältnissen:

- Das Röhrchen ist zu dick für die herkömmlichen Reagenzglasständer.
- 3 mögliche Einfüllmengen bzw. Testwerte verwirren und führen schnell zu falscher Einfüllmenge.
- Der Stöpselmechanismus ist teuer, schwer einzudrücken und öffnet sich oft nur unzureichend, wodurch eine vollständige Vermengung des Ca-Thromboplastingemenges mit dem Blut erschwert wird. Verfälschte Testaussagen (±2 mg/dl Blut-Ca; gemäß eigenen Untersuchungen) sind hierdurch und durch die Tatsache möglich, daß sie bis zu 1,5 ml in den Ritzen und Ecken des Stöpselmechanismus durch Adhäsion und Spontangerinnung zurückbleiben können.

4. Die zum Schutz angemeldete Neuentwicklung

Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, den Kalziumtest so durchzuführen, daß eine exakt definierte Menge eines Komplexbildners vorgelegt wird, das Blut zugegeben und die eventuell eintretende Gerinnung des Blutes durch Thrombin beschleunigt wird.

Die erfindungsgemäße Verwendung von Thrombin weist den Vorteil auf, daß Thrombin mit standardisierter Aktivität im Handel als Pulver erhältlich ist, während das bislang verwendete Thromboplastin in seinem Aktivitätsgehalt nicht standardisierbar ist und für jeden Testansatz neu bestimmt werden müßte.

Als Komplexbildner sind alle bekannten Chelatbildner geeignet, die die freien Kalziumionen im Blut komplexieren können, ohne dabei jedoch die Gerinnung des Blutes zu beeinflussen. Geeignete Verbindungen sind zum Beispiel Ethylendiamintetraacetat sowie dessen Natrium und Kaliumsalze.

Der semiquantitative Schnelltest kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:
Eine vorgegebene Menge des Komplexbildners wird mit dem Blut vermischt und kurze Zeit später mit dem Thrombin als Gerinnungsbeschleuniger versetzt. Durch die Vorgabe einer definierten Menge an Komplexbildner wird ein Grenzwert festgesetzt, bis zu dem alle vorhandenen Kalzium- Ionen im Blut komplexiert werden. Auch nach der Zugabe von Thrombin erfolgt innerhalb der Testzeit keine Gerinnung des Blutes. Wird dieser Grenzwert überschritten, so bewirken die nicht komplexierten Kalzium-Ionen in Gegenwart von Thrombin eine Blutgerinnung innerhalb von 5 Minuten. Die Grenzwerte können in Abhängigkeit der Spezies und der Indikationsstellung durch den Gehalt an Komplexbildner variiert werden. Für einen Kalziumgrenzwert von 7 mg/dl sind 4,313 mg Na₂-EDTA und ca. 2 bis 8 i.E. Thrombin einzusetzen.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren in einen einfach handzuhabenden Test- Kit zusammengefaßt. Der Test-Kit besteht aus einem verschließbaren Röhrchen (z. B. ein Reagenzglas) aus Glas oder Kunststoff. In diesem Röhrchen wird die gewünschte Menge des Komplexbildners vorgelegt. Dies kann z. B. dadurch erfolgen, daß eine entsprechend molare Lösung des Komplexbildners in dem Röhrchen vorgelegt und eingedampft wird oder aber der Komplexbildner in Form einer leicht lösbaren Tablette oder Kapsel eingebracht wird. Dem Fachmann sind Verfahren zur Herstellung solcher Tabletten oder Kapseln hinreichend bekannt, so daß dies nicht näher erläutert werden muß.

Zusätzlich zu dem Komplexbildner wird eine weitere Tablette in dem Röhrchen vorgelegt, die aktives Thrombin enthält. Wesentlich ist hierbei, daß sich die Thrombin enthaltende Tablette erst dann löst, wenn die Komplexbildung zwischen dem Komplexbildner und den Kalzium- Ionen im Blut abgeschlossen ist. Dies wird dadurch erreicht, daß der Thrombintablette entsprechende Füllstoffe und/oder Sprengmittel zugesetzt werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Test-Kit steht dem Großtierpraktiker erstmals ein einfacher, unkomplizierter semiquantitativer Kalzium-Schnelltest zur Verfügung, der vor Ort eine zuverlässige Kalzium-Grenzwertbestimmung ermöglicht.

Die wesentlichsten Vorteile des erfindungsgemäßen Test-Kits sind:
In einem Röhrchen laufen zeitversetzt 2 Reaktionen ab, das bedeutet weniger Fehlerquellen. Der zugefügte "Reaktionsbeschleuniger" ist Thrombin. Diese Substanz ist international bezüglich ihrer Aktivität standardisiert, das bedeutet, daß eine bestimmte Menge der Substanz immer eine fest zugeordnete Aktivität besitzt. Außerdem ist diese Substanz billig und in lyophilisierter Form ohne Aktivitätsverlust sehr lange haltbar (mindestens 2 Jahre). Die Haltbarkeit dieser Substanz ist alleinig begrenzend für die Lagerfähigkeit der vorgefertigen Teströhrchen.

Thrombin setzt in der Kette der Blutgerinnungsabläufe sehr spät ein. Es aktiviert zusammen mit den Ca-Ionen den Faktor XIII zum Faktor XIIIa, der seinerseits wiederum mit Thrombin und Ca⁺⁺ das Fibrinogen zu Fibrin umwandelt. Dieses Fibrin vernetzt sich letztendlich durch den, durch Thrombin und durch Ca⁺⁺ aktivierten Faktor VIII (FSF) und durch weitere nichtkovalente Ca⁺⁺-Bindungen. Das späte Einsetzen des Thrombins in die Kette der Blutgerinnungsabläufe hat somit weitere Vorteile bei seinem Einsatz als Blutgerinnungsbeschleuniger im Testansatz: Es macht den Testablauf und damit die Testaussage unabhängig von einer ganzen Reihe von "Gerinnungsfaktoren", die zum Beispiel beim Einsatz von Thromboplastin benötigt würden, um erst körpereigenes Prothrombin zu Thrombin umzuwandeln, damit dieses wiederum die weiteren Gerinnungsabläufe einleiten kann. Da viele Gerinnungsfaktoren genau wie auch das Prothrombin von der Leber synthetisiert werden, bedeutet dies, daß die Testaussage unabhängiger vom Zustand der Leber des Testpatienten wird und auch weniger Falschaussagen im Falle eines vollständigen Fehlens von einzelnen Gerinnungsfaktoren entstehen können.

Nur ein Teströhrchen bei der Anwendung bedeutet einfachere und sichere Handhabung.

Die große Menge von 10 ml Blut als Testmenge bedeutet eine Verminderung der Gefahr von Falschaussagen des Testergebnisses durch Pipettier- oder Abfüllungsfehler. Nur ein Testwert verhindert Fehlreaktionen des Anwenders (falsche Blutmenge = veränderte Testaussage). Temperaturschwankungen beeinflussen die Reaktionszeit nur unwesentlich, das Testergebnis und somit die Testaussage stellt sich sicher innerhalb von spätestens 5 Minuten Reaktionszeit ein.

Die nachfolgenden Beispiele und Vergleichstests sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie jedoch in ihrem Umfang zu beschränken.

Material:

- 1 Teströhrchen, aus Kunststoff gefertigt, mit flexiblem glattflächigem Kunststoffstöpsel und glattem Boden, der ein eigenständiges Stehen des Röhrchens ermöglicht. Der Querdurchmesser des Reagenzröhrchens erlaubt auch ein Aufbewahren in handelsüblichen Reagenzglasständern.
- In das Röhrchen sind 0,00431279 g Na₂-EDTA eingedampft.
- Eine weitere Tablette ist zusätzlich in die Röhrchen verbracht worden, die 3 i.E. lyophilisiertes Thrombin, eingepreßt in ihrer Füllsubstanz, eine leicht lösliche Glucose, enthält.

Testausführung:

- 10 ml Vollblut werden blasenfrei mittels einer handelsüblichen Kunststoffeinmalspritze in das Teströhrchen eingefüllt. Das Röhrchen wird anschließend verstöpselt und 2 Minuten lang behutsam gekippt (nicht schütteln, damit kein Schaum entsteht), um den Inhalt gut zu durchmischen. Dabei löst sich das eingedampfte, flockige Na-EDTA zunächst innerhalb von Sekunden auf, vermischt sich mit dem Vollblut und komplexiert das, im Vollblut enthaltene Kalzium. Innerhalb der 2 Minuten Schwenkzeit löst sich zudem die Thrombintablette vollständig auf.
- Nun wird das Teströhrchen für die Testzeit von 5 Minuten ruhig hingestellt.

Funktionsprinzip des Ca-Tests:

Die Na₂-EDTA-Vorlage im Teströhrchen ist so berechnet, daß 0,466 mg Kalzium (das ist die absolute Menge Gesamt- Kalzium, die im Serum von 10 ml Vollblut enthalten ist, wenn der Hämatokrit 33,5 Vol.-% und die Kalziumkonzentration im Serum 7 mg/dl beträgt) komplex abgebunden werden können.

Ist aber nun mehr als 7 mg/dl Kalzium in der Probe vorhanden, so bleiben noch freie Ca-Ionen in der Probe zurück, die mit Hilfe des, mit der Tablette zugefügten Thrombins als Reaktionsbeschleuniger die Blutgerinnung einleiten. Wurden dagegen alle Kalzium-Ionen mittels der EDTA-Vorlage abgebunden, kann die Blutgerinnung nicht mehr ablaufen.

Auswertung:

Die Ablesung erfolgt nach 5 Minuten nach folgendem, auch für die anderen Ca-Schnelltests gültigem Schema:

- geronnen = Ca⁺⁺-Wert über 7 mg/dl
- nicht geronnen = Ca⁺⁺-Wert unter 7 mg/dl
- nur Koagulationspunkte oder gallertige, noch fließfähige Beschaffenheit der Probe = Grenzwert 7 mg/dl.

Resultate:

Erste Resultate dieses modifizierten Ca-Tests stammen aus dem Jahre 1985. Zu diesem Zeitpunkt sah der Testablauf noch vor, das Thrombin nach dem Vermischen mit dem EDTA flüssig zuzugeben.

Hierzu wurde das Thrombin als Topostasin® (Fa. La Roche) käuflich erworben. Hier liegt ein lyophilisiertes Pulver mit 3000 N.i.H. Einheiten vor, das dann auf eine solche Verdünnungsstufe gebracht wurde, daß 0,1 ml Flüssigkeit einer Aktivitätsmenge von 3 i.E. Thrombin entsprechen. Ansonsten wurde wie oben beschrieben verfahren.

Die Testergebnisse von 236 Untersuchungen an Kühen sind in Tabelle 7 dargestellt. Zur Kontrolle wurden die Kalziumwerte noch photometrisch bestimmt.

Tabelle 7

Vergleich der mit dem erfindungsgemäßen Test ermittelten und dem photometrisch bestimmten Serum- Kalziumgehalt bei 236 Kühen. Testgrenzwert ist 7 mg/dl

- Testempfindlichkeit: 98%
Von 168 hypokalzämischen Tieren wurden 165 richtig erkannt.

- Testspezifität: 75%
Von 68 nichthypokalzämischen Tieren wurden 51 richtig erkannt.

- Testrichtigkeit: 92%
216 von insgesamt 236 Probanden wurden richtig klassifiziert.

- pvT+ 91%
165 von 182 als hypokalzämisch ausgewiesenen Probanden waren tatsächlich hypokalzämisch.

- pvT- 94%
51 von 54 als normokalzämisch ausgewiesenen Probanden waren tatsächlich normokalzämisch.

- Prävalenz: 71%
Um die Aussagekraft des pvT+- Wertes abschätzen zu können, ist es wichtig, die "Prävalenz" der an Hypokalzämie erkrankten Tiere in der Patientengruppe zu kennen. Hier sind es 168 von 236 Tieren!

In der Tabelle 8 sind die Testergebnisse bisher bekannter Kalziumtests mit dem erfindungsgemäßen aufgeführt.

Diese Ergebnisse belegen, daß der erfindungsgemäße Test nicht nur einfach durchzuführen ist, sondern auch eine große Zuverlässigkeit aufweist. Besonders hervorzuheben ist eine Prävalenz von 71%, da dieser Wert etwas über die Zuverlässigkeit der hypokalzämischen Bestimmung aussagt. Gerade die Hypokalzämie erfordert die schnelle und richtige Therapie des Großtierpraktikers.

Tabelle 8

Vergleich der verschiedenen Testergebnisse in %

Die Bewertung hinsichtlich aller Testkriterien läßt sich noch verbessern, wenn die vorher beschriebenen Thrombintabletten zum Einsatz kommen, da nun eine gleichbleibende Aktivitätsmenge und eine größere Haltbareit des Reagens Thrombin erzielt wird. Dies kann an folgendem Beispiel kurz exemplarisch aufgezeigt werden:

Wie aus obiger Tabelle ersichtlich ist, ermöglicht der erfindungsgemäße Test eine bessere Bestimmung des vorgegebenen Grenzwertes von 7 mg Ca⁺⁺/dl.

Claims

1. Verbessertes Verfahren zur semiquantitativen Bestimmung des Kalziumgehaltes im Blut, bei dem die Kalzium-Ionen in einer Blutprobe entsprechend eines vorgegebenen Kalziumgrenzwertes mit einer definierten Menge eines Komplexbildners ganz oder teilweise komplexiert werden und anschließend die eventuell einsetzende Gerinnung durch einen Gerinnungsbeschleuniger aktiviert wird, dadurch gekennzeichnet, daß der Gerinnungsbeschleuniger Thrombin ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Thrombin als Tablette zugesetzt wird.

3. Test-Kit zur semiquantitativen Serum-Kalziumbestimmung bestehend aus einem verschließbaren Probengefäß enthaltend eine definierte Menge eines Komplexbildners und eine Thrombintablette mit verzögerter Wirkstofffreisetzung.