Technisches Gebiet
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Diese Erfindung bezieht sich auf einen Träger für eine
Zellkultur, der ultrafeine Fasern umfaßt und für die Kultur von
Tier- und Pflanzenzellen vorteilhaft ist.
Hintergrund aus dem Stand der Technik
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Verfahren zur Zellkultur werden in 1) Monoschichtkultur, 2)
Suspensionskultur und 3) Einbettungskultur unterteilt, wobei
dies vom angewendeten Träger abhängt. Bei der Monoschichtkultur
haften, erweitern und wuchern die Zellen auf einer Kulturplatte
aus Glas, Kunststoff o. ä. Im allgemeinen können die Zellen nur
wuchern, wenn sie am Träger haften, so daß die
Monoschichtkultur das gegenwärtig am umfangreichsten
angewendete Kulturverfahren darstellt. Im Falle der Kultur von Zellen,
die keine Haftung am Träger benötigen, wird auf der anderen
Seite im allgemeinen die Suspensionskultur angewendet, wobei
Zellen in einem suspendierten Zustand im Kulturmedium gezüchtet
werden. Vom Standpunkt der Leistungsfähigkeit der Kultur ist
die Suspensionskultur die geeignetste. Für von der Adhäsion
abhängige Zellen wurde die Mikroträgerkultur vorgeschlagen, die
zwischen der Monoschichtkultur und der Suspensionskultur liegt.
Es hat sich jedoch gezeigt, daß einige Zellarten, insbesondere
die meisten Epithelzellen, ihre Differenzierungs- und
Proliferationsfunktionen in der Monoschichtkultur und der
Mikroträgerkultur nicht ausüben können. Folglich wird ein
Kulturverfahren intensiv untersucht, durch das die
Differenzierungs- und Proliferationsfunktionen zum Ausdruck
gebracht werden können.
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Es wird in Betracht gezogen, daß die Zellen normalerweise im
Körper differenzieren und wuchern, da die Mikroumgebung der
Zellen für diese Zellen geeignet ist. Insbesondere die
Tatsachen, daß 1) sich das Kapillarsystem um die Zellen
erstreckt und die Zufuhr von Nährstoffen zu und die Entfernung
von Abfallstoffen von den Zellen wirksam in vivo durchgeführt
wird, 2) unterschiedliche Zellarten gleichzeitig existieren und
in vivo miteinander in Wechselwirkung treten und 3) im
Mesenchym Zellen existieren, die in vivo hauptsächlich aus
Kollagenfasern bestehen, so daß sie im dreidimensionalen
Zustand vorhanden sind, regeln die Differenzierung und
Wucherung der Zellen wirksam. Es wird die Anwendung einer
Umgebung im Kultursystem untersucht, die der im Körper ähnlich
ist. Als Simulierung des Kapillarsystems, das die Zufuhr von
Nährstoffen und die Entfernung von Abfallstoffen in vivo
regelt, wurde z. B. ein Kultursystem vorgeschlagen, bei dem die
Zellen auf Membranen aus Hohlfasern gezüchtet werden und bei
dem die Zufuhr der Nährstoffe und die Entfernung der
Abfallstoffe durch die Membranen der Hohlfasern durchgeführt
werden, und es wurde eine Kultur mit höherer Dichte als die
herkömmliche Monoschichtkultur erhalten. Diese Kultur, die die
Hohlfasern verwendet, ist jedoch eine Art der
Monoschichtkultur. Andererseits wurde kürzlich als Simulation
des Mesenchym eine dreidimensionale Zellkultur (eingebettete
Kultur) in Kollagen-Schwamm oder in Kollagen-Gel intensiv
untersucht. Durch Anwendung des Kulturverfahrens mit Kollagen-
Gel wurde die Differenzierung und Wucherung von Epithelzellen
Corpus mammae, Leber-Parenchymzellen, Speicheldrüsenzellen,
Thymuszellen und Pankreaszellen erstmals durchgeführt, die ihre
Differenzierungs- und Proliferationsfunktionen durch
herkömmliche Monoschichtkultur schwer ausüben können. Da die Zellen bei
der herkömmlichen Monoschichtkultur auf der Oberfläche des
Substats gezüchtet werden, haben diese Zellen flache Formen,
die von der normalen Morphologie der Zellen in vivo völlig
verschieden sind. Beim Kulturverfahren mit Kollagen-Gel ähnelt
demgegenüber die Morphologie der Zellen der der Zellen in vivo.
Während die Zellwucherung bei der Monoschichtkultur gestoppt
wird, wenn die Oberfläche vollkommen durch Zellen bedeckt ist,
wobei die Zellen auf der Oberfläche des Substrats wuchern,
können bei der Kultur mit Kollagen-Gel (dreidimensionale
Kultur) die Zellen ohne Veränderung der Morphologie ständig
wachsen. Folglich liefert die eingebettete Kultur, die von der
Kultur mit Kollagen-Gel repräsentiert wird, eine Umgebung, die
der Mikroumgebung in vivo ähnlich ist. Folglich wurde
anscheinend
eine Umgebung geschaffen, die für die Durchführung der
Differenzierungs- und Proliferationsfunktionen der Zellen
geeignet ist.
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Die oben genannten Tatsachen zeigen, daß die beiden Elemente,
und zwar die Bildung der Wege für die Nährstoffzufuhr und die
Entfernung der Abfallstoffe und die Bildung eines
dreidimensionalen Zellkulturträgers, für die Zelldifferenzierung sehr
wichtig sind.
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Obwohl diese Differenzierung und die Wucherung der Zellen, die
bei der herkömmlichen Monoschichtkultur schwierig waren, durch
die dreidimensionale Kultur unter Anwendung von Kollagen-Gel
erfolgreich erreicht wurden, weist dieses Kulturverfahren
Probleme auf, da die mechanische Festigkeit des Kollagen-Gels
gering ist und das Kollagen-Gel schwer in verschiedene Formen
gebracht werden kann. Dies stellt große Probleme dar, wenn das
Kulturverfahren z. B. bei einer umfangreichen Kultur angewendet
werden soll.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines
Trägers für eine Zellkultur, der die oben genannten beiden
Elemente erfüllt und der auch die oben genannten Probleme der
Kultur mit Kollagen-Gel löst.
Beschreibung dieser Erfindung
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Diese Aufgabe wurde durch Verwendung ultrafeiner Fasern gelöst.
D. h., daß diese Erfindung einen Träger für eine Zellkultur
liefert, der ultrafeine Fasern mit einer Feinheit mit nicht
mehr als 1,0 den umfaßt.
Beste Art der Durchführung dieser Erfindung
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Die in der vorliegenden Erfindung angewendeten ultrafeinen
Fasern haben eine Feinheit von nicht mehr als 1,0 den,
vorzugsweise nicht mehr als 0,5 den.
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Das die ultrafeinen Fasern bildende Polymer kann aus
Polyestern, Polyamiden, Polytetrafluorethylenen, Polyolefinen,
Zellulose, Polyaminosäuren, Kollagen u. ä. geeignet ausgewählt
werden, und Polyester sind besonders bevorzugt.
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Diese Polymere können eine Substituentengruppe mit positiver
Ladung, z. B. eine Diethylaminoethylgruppe, aufweisen.
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Wenn Fasern verwendet werden, die aus einer Vielzahl von
Komponenten zusammengesetzt sind, kann die bleibende
Komponenten aus den oben genannten Polymeren ausgewählt werden
und die anderen mit der bleibenden Komponente zu kombinierenden
Komponenten können geeignet aus Polystyrolen, Polyethylenen,
wasserlöslichen Polyamiden, in wässriger Alkalilösung löslichen
Polyestern, wasserlöslichen Polyvenylalkoholen u. ä. ausgwählt
werden. Die Kombination der Polymere kann für jeden Fall
geeignet ausgewählt werden, dies hängt von den
Spinneigenschaften, der Verarbeitbarkeit, der Leistung u. ä.
ab.
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Obwohl der Träger für die Zellkultur dieser Erfindung die
ultrafeinen Fasern an sich verwenden kann, die aus den oben
genannten Polymeren hergestellt wurden, ist es üblicherweise
bevorzugt, daß die Fasern in Form einer Struktur bzw. eines
Gefüges vorliegen, z. B. ein Gewebe, ein gewirktes
Textilerzeugnis, Faservlies, gesponnenenes Garn und Baumwolle.
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Bei der Bildung der Struktur können die Fasern, die bereits in
Form der ultrafeinen Fasern vorliegen, so wie sie sind,
angewendet werden. Alternativ kann die Struktur zuerst aus Fasern
gefertigt werden, aus denen durch chemische oder physikalische
Maßnahmen ultrafeine Fasern entstehen können, und diese Fasern
werden dann zu ultrafeinen Fasern gemacht, um eine Struktur zu
erhalten, die aus ultrafeinen Fasern besteht. Diese ultrafeinen
Fasern können durch sorgfältiges Spinnen eines Garns nach einem
herkömmlichen Verfahren erhalten werden. Im Falle der
Verwendung von Polyestern können alternativ ungestreckte Fasern
bei bestimmten Bedingungen zu ultrafeinen Fasern gestreckt
werden.
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Als Fasern, die in einem späteren Schritt zu ultrafeinen Fasern
gemacht werden können, können andererseits die
Mehrkomponentenfasern eingesetzt werden, wie sie in den
japanischen veröffentlichten Patentanmeldungen (Kokoku) Nr. 22126/73
und 22593/78 beschrieben sind, die durch Entfernung oder
Abschälen einer Komponente der Mehrkomponentenfasern zu
Fibrillen oder ultrafeinen Fasern gemacht werden können. Da die
Fasern nach der Behandlung zu ultrafeinen Fasern gemacht werden
können und so die Behandlung durchgeführt werden kann, wenn die
Fasern die übliche Feinheit aufweisen, können bei diesen Fasern
Probleme bei der Verarbeitung, z. B. der Bruch der Fasern und
die Erzeugung von Flaum während verschiedener
Faserbehandlungsschritte beim Weben oder Wirken, minimiert
werden, dies ist folglich bevorzugt. Die Abstände zwischen den
Fasern können vorzugsweise ein Vielfaches von zehn µm,
mindestens 10 µm, betragen.
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Die oben beschriebene Struktur aus ultrafeinen Fasern weist
eine ausreichend hohe mechanische Festigkeit auf, die mit einem
üblichen Gewebe oder gewirkten Textilerzeugnis vergleichbar
ist, und kann in jede Form gebracht werden. Sie kann z. B. in
eine willkürliche Form gebracht werden, z. B. ein Film, dünne
Stäbchen, eine Kugel bzw. ein Kreis (wie z. B. eine Aegagropila
(Haarsteine)), ebene rechtwinklige, gewellte und spiralförmige
Formen, die einen großen Beitrag zur Förderung der Leistung und
Gleichmäßigkeit der Kultur leisten. Die Struktur in Form der
Aegagropila ist besonders bevorzugt. Der so gebildete Träger
kann auch für die Pseudosuspensionskultur verwendet werden, die
Mikroträger anwendet.
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Bevorzugte Ergebnisse können üblicherweise erhalten werden,
indem die Struktur aus ultrafeinen Fasern genoppt bzw. aufgerauht
wird.
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Diese genoppte Struktur bedeutet hier eine Struktur mit
schleifenförmigen Noppen und/oder erhabenen Noppen u. ä. Nicht
begrenzende repräsentative Beispiele der Verfahren zum
Aufrauhen der Struktur umfassen ein Verfahren, bei dem die
Noppen zum Zeitpunkt des Webens oder Wirkens gebildet werden,
wie z. B. bei der Herstellung oder dem Zurechtschneiden
von Flor; ein Verfahren, bei dem die Struktur nach der
Herstellung verarbeitet wird, indem z. B. eine Aufrauhmaschine,
um den Flaum bzw. die Noppen aufzurichten, oder eine
Schermaschine verwendet wird; und in einigen
Fällen ein Schwabbelverfahren unter Verwendung von Sandpapier.
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Durch Aufrauhen der Struktur aus ultrafeinen Fasern ergibt sich
eine Vergrößerung der Kontaktfläche der Zellen, eine Förderung
der Weichheit der Struktur, so daß sie der morphologischen
Veränderung der Zellen folgen kann, und eine Förderung der
Porösität, die die Zufuhr der Nährstoffe und die Entfernung der
Abfallstoffe regelt, so daß die Leistung als Träger für eine
Zellkultur gefördert wird.
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Die Struktur aus ultrafeinen Fasern kann mit Kollagen-Gel
imprägniert werden. Durch Kombination dieser Struktur mit dem
Kollagen können die Probleme des herkömmlichen Kollagen-Gels
gelöst werden, und zwar seine geringe mechanische Festigkeit
und schlechte Formbarkeit.
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Der erfindungsgemäße Träger kann zur Kultur verschiedener Tier-
und Pflanzenzellen verwendet werden. Obwohl die zu züchtenden
Zellen nicht begrenzt sind, ist dieser Träger für die Kultur
der von der Adhäsion abhängigen Zellen besonders geeignet.
Spezifische Beispiele von Zellen, die gezüchtet werden können,
umfassen Endothel- und Epithelzellen,, wie vaskuläre
Endothelzellen, homogene Muskelzellen, hepatische
Parenchymazellen, Pankreas-β-Zellen, Epithelzellen und
Darmzellen; Fibroblasten; und andere Organ-Parenchymazellen.
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Die Zellen können durch herkömmliche Kulturverfahren unter
Anwendung des erfindungsgemäßen Trägers gezüchtet werden.
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Das charakteristischste Merkmal des erfindungsgemäßen Trägers
ist, daß der Träger für die Zellkultur aus ultrafeinen Fasern
besteht. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß die
Differenzierungs- und Proliferationsfunktionen der Zellen in
dem Träger aus ultrafeinen Fasern über einen langen Zeitraum
erhalten bleiben. Obwohl der Mechanismus dieses Phänomens noch
nicht ganz klar ist, wird folgendes angenommen: Wie es oben
festgestellt wurde, sind die meisten Zellen von der Adhäsion
abhängig, sie können nur wachsen, wenn sie an einer Oberfläche
haften. Folglich besteht die wichtigste Eigenschaft, die von
einem Träger für eine Zellkultur gefordert wird, in der
Bereitstellung einer ausreichenden Gerüstfläche, die von den
Zellen berührt werden kann. Die spezifische Oberfläche (die von
den Zellen berührt werden kann) pro Volumeneinheit der Struktur
aus ultrafeinen Fasern ist viel größer als die einer Struktur
aus Fasern mit üblicher Feinheit, wodurch eine geeignete
Umgebung für die von der Adhäsion abhängigen Zellen geschaffen
wird.
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Andererseits bildet die Oberfläche der Fasern bei der Struktur
aus Gewebe, Gewirke oder Faservlies einen dreidimensionalen
Raum, so daß eine Morphologie geschaffen wird, die der des
Mesenchym ähnlich ist, das hauptsächlich aus Kollagenfasern
besteht. Wie es oben festgestellt wurde, kann der größte Teil der
Epithelzellen seine Differenzierungs- und
Proliferationsfunktionen wie in vivo nur dann ausüben, wenn sie
durch ein dreidimensionales Kulturverfahren gezüchtet werden,
wobei Kollagen-Gel verwendet wird. Dies beruht darauf, daß die
morphologische Veränderung der Zellen in der dreidimensionalen
Kultur geringer als die in der zweidimensionalen Kultur
(Monoschichtkultur) ist, und daß die Zellen eine Morphologie
aufweisen, die der der Zellen in vivo sehr ähnlich ist. Während
die Proliferation in der zweidimensionalen Kultur begrenzt ist,
da diese Proliferation in einer Ebene durchgeführt wird, wird
die Proliferation außerdem in der dreidimensionalen Kultur
nicht unterbrochen, da der dreidimensionale Raum ausgenutzt
wird. Dies stellt ebenfalls einen wichtigen Punkt dar. Der
dreidimensionale Raum, der von den ultrafeinen Fasern gebildet
wird, ist flexibler als der, der von Fasern mit üblicher
Feinheit gebildet wird, so daß er der morphologischen
Veränderung der Zellen folgen kann. Als Folge kann er es
ermöglichen, daß die Zellen eine stärkere physiologische
Morphologie anwenden. Wie es oben erwähnt wurde, wird
angenommen,
daß die Zellkultur unter Anwendung dieser flexiblen
Struktur (dreidimensionaler Raum), die von den ultrafeinen
Fasern geschaffen wird, den Zellen eine bequemere Umgebung
schafft.
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Als weiteres wichtiges Element für die gezüchteten Zellen, und
zwar die Zufuhr von Nährstoffen und die Entfernung von
Abfallstoffen durch Anwendung der ultrafeinen Fasern, werden
die Porösität, die die Zufuhr der Nährstoffe und die Entfernung
der Abfallstoffe regelt, als auch deren Gleichmäßigkeit
gefördert. Bei einer Zellkultur in einer Struktur aus ultrafeinen
Fasern sind folglich die Aufnahme der Nährstoffe von und die
Abscheidung der Abfallstoffe an die äußere Umgebung viel
leichter als im Falle der Anwendung einer Struktur aus Fasern
mit üblicher Feinheit. Außerdem ist diese Eigenschaft viel
besser als die, die das herkömmliche Kollagen-Gel liefert. Dies
beruht darauf, daß die Diffusionsgeschwindigkeit der
Substanzen, insbesondere die Diffusionsgeschwindigkeit von
mittleren bis großen Molekülsubstanzen in der erfindungsgemäßen
Struktur größer als die im Kollagen-Gel ist. Vom Standpunkt der
Nährstoffzufuhr und der Abfallstoffentfernung liefert folglich
diese Struktur aus ultrafeinen Fasern wiederum eine geeignete
Umgebung für die gezüchteten Zellen.
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Da der Träger für die Zellkultur, der aus ultrafeinen Fasern
besteht, eine große mechanische Festigkeit hat und leicht in
verschiedene Formen gebracht werden kann, ist es möglich,
diesen Träger in einer umfangreichen Kultur anzuwenden.
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Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen
konkret beschrieben.
Beispiel 1
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Es wurde ein Gewebe hergestellt, wobei Verbundfasern 150D-42f
(mit einer Feinheit des Einzelfadens von etwa 0,1 den)
verwendet wurden, die in dem japanischen veröffentlichten Patent
(Kokoku) Nr. 22126/73 definiert sind, wobei diese Fasern 50
Teile "inselbildende" Polyesterkomponenten und 50 Teile
"seebildende" Polystyrolkomponenten enthielten und 16 "Inseln"
beinhalteten. Nach dem Schrumpfen wurde das Gewebe in
Trichlorethylen getaucht, um das Polystyrol zu entfernen, und
getrocknet.
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Nach der Sterilisation in einem Autoklav wurde das Gewebe in
eine Petrischale gegeben und 10 ml menschliche
Bindegewebszellen (mit einer Zellpopulation von 1 x 10&sup5;
Zellen/ml) wurden in das Gewebe eingespritzt. Die Kultur wurde
4 Tage lang bei 37ºC in einem Kohlendioxidgas-Inkubator
durchgeführt. Die Zelldichte betrug am 4. Tag 1,6 x 10&sup7; Zellen/
25 cm²/10 ml. Zur Kontrolle wurde ein ähnlicher Versuch unter
Anwendung einer Petrischale aus Kunststoff durchgeführt, wobei
eine abschließende Zelldichte von etwa 5 x 10&sup6; Zellen/25 cm²/
10 ml erhalten wurde. Es hat sich bestätigt, daß die Zelldichte
der gezüchteten Zellen stark gefördert wird, wenn das
erfindungsgemäße Kultursubstrat verwendet wird.
Beispiel 2
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Das in Beispiel 1 gewonnene Gewebe wurde auf eine Petrischale
aus Kunststoff gegeben und Leberzellen der Ratte wurden mit
einer Zellpopulation von etwa 5 x 10&sup4; Zellen/ml eingespritzt. Das
Kulturmedium war RPMI 1640 (das 10% FCS enthielt). Die Kultur
wurde in einem Kohlendioxidgas-Inkubator durchgeführt. Nach 6
Tagen hatte sich die Zellpopulation auf etwa 3,2 x 10&sup5; Zellen/ml
erhöht und die Leberzellen blieben mehr als 2 Wochen lang am
Leben. Auf der anderen Seite wurde in der gleichen Weise eine
Kultur als Kontrolle durchgeführt, außer daß eine Petrischale
verwendet wurde, die mit der Zellmatrix überzogen war. Bei
diesem Kontrollversuch starben die meisten Zellen innerhalb von
6 Kulturtagen. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Leben der
Leberzellen stark verlängert wird, wenn das erfindungsgemäße
Kultursubstrat verwendet wird.
Beispiel 3 und Vergleichsbeispiel
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Das in Beispiel 1 erhaltene Gewebe wurde mit einem
Schleifpapier zu Noppen bzw. einem Flaum aufgerauht, die Fasern
wurden mit einem Wasserstrom mit hohem Druck verfilzt. Das
Gewebe wurde dann zu Kreisen mit 1,5 cm Durchmesser
geschnitten, und diese Kreise wurden in Vertiefungen einer Mikroplatte
mit 24 Vertiefungen gelegt. Dann wurden 5 x 10&sup4; homogene
Muskelzellen von der Thoraxaorta eines Hasen in 1,5 ml
Kulturmedium suspendiert, und diese Suspension wurde zum Gewebe
gegeben. Das Kulturmedium war modifiziertes Eagle MEM-Medium
von Dulbecco, das 20% Kalbsfötus-Serum enthielt, die Kultur
wurde durch sanftes Schütteln der Mikroplatte in einem CO&sub2;-
Inkubator bei 37ºC 7 Tage lang durchgeführt. Nach der Kultur
wurden alle Zellen gelöst, indem die Zellen mit 0,005% Trypsin
in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) 10 Minuten lang bei
37ºC behandelt wurden, und die Anzahl der Zellen wurde mit
einer Zählkammer gezählt. Die Anzahl der Zellen betrug
4,0 x 10&sup5;.
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Die Anzahl der Zellen im Vergleichsbeispiel, die auf einem
ähnlichen aufgerauhten Gewebe aus Fasern mit einer Feinheit von
1,4 den gezüchtet wurden, betrug 0,8 x 10&sup5;, und die Anzahl der
Zellen, die auf einer Mikroplatte mit der gleichen Fläche
gezüchtet worden waren, betrug 0,2 x 10&sup5;.
Industrielle Anwendbarkeit
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Da der erfindungsgemäße Träger für die Zellkultur eine große
Flexibilität aufweist, so daß er der morphologischen
Veränderung der Zellen ausreichend folgen kann, ist dessen
Verträglichkeit mit Zellen hoch. Er ermöglicht es folglich den
Zellen, ihre Differenzierungs- und Proliferationsfähigkeit über
einen langen Zeitraum beizubehalten. Außerdem weist er eine
hohe mechanische Festigkeit auf und kann leicht geformt werden,
wodurch er als Träger für eine umfangreiche Kultur vorteilhaft
ist.