DE3721441C1 - Verfahren zur Herstellung eines Apatits mit daran immobilisierter Glucanase und nach dem Verfahren hergestellte Apatite - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines Apatits mit daran immobilisierter Glucanase und nach dem Verfahren hergestellte Apatite

Info

Publication number
DE3721441C1
DE3721441C1 DE3721441A DE3721441A DE3721441C1 DE 3721441 C1 DE3721441 C1 DE 3721441C1 DE 3721441 A DE3721441 A DE 3721441A DE 3721441 A DE3721441 A DE 3721441A DE 3721441 C1 DE3721441 C1 DE 3721441C1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
apatite
protein
glucanase
immobilized
glutaraldehyde
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE3721441A
Other languages
English (en)
Inventor
Yoshinori Kuboki
Daisaburo Fujimoto
Hideki Aoki
Keijiro Fujita
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dental Chemical Co Ltd
Original Assignee
Dental Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dental Chemical Co Ltd filed Critical Dental Chemical Co Ltd
Application granted granted Critical
Publication of DE3721441C1 publication Critical patent/DE3721441C1/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/52—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an inorganic compound, e.g. an inorganic ion that is complexed with the active ingredient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/66—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/56—Compounds, absorbed onto or entrapped into a solid carrier, e.g. encapsulated perfumes, inclusion compounds, sustained release forms

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung eines Apatits mit daran immobilisierter Glucanase für die Spaltung von Polysacchariden, die mit Zahnkaries im Zusammenhang stehen, und gemäß Anspruch 4 nach diesem Verfahren hergestellte Apatite mit daran immobilisierter Glucanase. Die Ansprüche 2 und 3 betreffen Ausgestaltungen des Verfahrens.
"Glucanase" ist ein Sammelbegriff für glucanspaltende Enzyme, der in den Ansprüchen und in der Beschreibung die lävanspaltende Lävanase, die dextranspaltende Dextranase und die mutanspaltende Mutanase umfaßt. Der Ausdruck "Apatit" umfaßt in den Ansprüchen und in der Beschreibung Hydroxylapatit und Fluorapatit.
Es ist bekannt, daß das Auftreten von Zahnkaries auf Zahnbelag (Plaque) zurückzuführen ist, der durch Polysaccharide wie z. B. Lävan, Dextran und Mutan, die von verschiedenen Mundbakterien erzeugt werden, gebildet wird. Diese Polysaccharide sollten entfernt werden, um das Auftreten von Zahnbelag zu unterdrücken und dadurch Zahnkaries zu verhindern.
Es ist bekannt, daß verschiedene Verfahren zur Entfernung von Zahnbelag zwecks Verhinderung von Zahnkaries entwickelt worden sind. Zu solchen Verfahren gehören beispielsweise das Abschaben von Zahnbelag unter Anwendung eines Poliermittels wie z. B. Zeolith, Calciumcarbonat, Aluminiumoxid und Siliciumdioxid und die Anwendung von Dextranase zusammen mit einem Stabilisator. Bis jetzt gab es jedoch kein Verfahren zum Immobilisieren von Glucanase, die dazu befähigt ist, Polysaccharide zu spalten, die mit Zahnkaries im Zusammenhang stehen, an Apatit, und es gab keinen Apatit, an dem Glucanase immobilisiert ist.
Bei den Glucanasen handelt es sich um relativ instabile Enzyme. Wenn eine Glucanase mit einem Zahnputzmittel vermischt wird, ohne modifiziert zu werden, nimmt infolgedessen ihre Aktivität mit der Zeit ab und verschwindet schließlich. Gegenwärtig wird bei Zahnputzmitteln Dextranase verwendet, und es werden verschiedene Stabilisatoren hergestellt, um ihre Desaktivierung zu verhindern. Aus den JP-OSS 56-63915 und 56-110609 und der JP-AS 52-49005 sind beispielsweise Kombinationen von Dextranase mit Aluminiumoxid, Carvon oder 1- Menthol und Gelatine oder Pepton bekannt. Da Zahnputzmittel für die Anwendung im Mund vorgesehen sind, unterliegen sie verschiedenen Beschränkungen, wozu solche gehören, die auf Überlegungen basieren, die den Einfluß auf den menschlichen Körper und das Verlangen einer erfrischenden Empfindung nach der Anwendung betreffen. Da selbstverständlich auch die verwendeten Stabilisatoren solchen Beschränkungen unterliegen, bringt die Wahl der Stabilisatoren schwierige Probleme mit sich. Die Verwendung anderer Enzyme als Dextranase wirft dieselben Probleme auf wie die Verwendung von Dextranase.
Ein bekanntes Verfahren zum Immobilisieren von Enzymen beruht darauf, daß Enzyme beispielsweise durch Hydroxylapatit, Aktivkohle, Kaolinit oder Terra alba (Porzellanerde) physikalisch adsorbiert und dadurch immobilisiert werden, und es ist allgemein bekannt, daß die immobilisierten Enzyme so stabil sind, daß sie im Vergleich zu einem unbehandelten Enzym eine geringere Veränderung der Aktivität mit der Zeit zeigen, und bequem zu handhaben sind. Es war folglich lange bekannt, daß Apatit eine bestimmte Proteinart (d. h., bestimmte Enzyme) fest adsorbiert und an sich bindet. Auf die Überlegung gegründet, daß die Immobilisierung von Glucanase zu einer Verminderung der Aktivitätsänderung mit der Zeit führen kann, wurde vermutet, daß auf einfache Weise immobilisierte Glucanase erhalten werden könnte, wenn Glucanase durch die Methode der physikalischen Adsorption mit Apatit, der als Poliermittel für Zahnputzmittel verwendet wird, immobilisiert wird, und daß es in diesem Fall möglich sein könnte, ein erwünschtes Zahnputzmittel zu erhalten, das Poliervermögen mit der Fähigkeit zum Spalten von Polysaccharid in sich vereinigt und die Verwendung eines Stabilisators überflüssig macht. Als Ergebnis von Untersuchungen, die auf der Grundlage einer solchen Vermutung durchgeführt wurden, ist festgestellt worden, daß die Adsorption und das Immobilisieren von Glucanase an Apatit undurchführbar sind, weil die Adsorbierbarkeit von Glucanase an Apatit überaus begrenzt ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines als Poliermittel dienenden Apatits mit daran immobilisierter Glucanase für die Spaltung von Polysacchariden, die mit Zahnkaries im Zusammenhang stehen, bereitzustellen, bei dem kein Stabilisator benötigt wird, wobei die an dem Apatit immobilisierte Glucanase über eine ausgedehnte Zeitspanne Aktivität zeigen soll.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß zu einer wäßrigen Lösung, die eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5,6 bis 9,0 ist, in der Glucanase, Protein und Apatit in einem gemischten Zustand vorhanden sind, Glutaraldehyd zugetropft wird, wobei die auf das Protein bezogene Menge des Glutaraldehyds 0,3% bis 6% beträgt.
Eine besondere Ausgestaltung der Erfindung besteht in nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Apatiten mit daran immobilisierter Glucanase.
Die Erfindung wird nachstehend näher erläutert.
Apatit wird in einer wäßrigen Phosphat- Pufferlösung mit einer Konzentration von 0,01 bis 0,05 mol/l, in der Glucanase und ein Protein, das eine starke Adsorption an Apatit zeigt und keine nachteilige Wirkung auf den menschlichen Körper hat, gelöst sind, suspendiert. Dann wird zu der erhaltenen Suspension bei einer unterhalb von Raumtemperatur liegenden Temperatur unter heftigem Rühren bzw. Schütteln Glutaraldehyd zugetropft. Das eingesetzte Protein kann beispielsweise aus Albumin, Casein, Lysozym und Cytochrom C ausgewählt werden. In Abhängigkeit von der Art des Proteins gibt es Unterschiede hinsichtlich des Gehalts bzw. der Konzentration der resultierenden immobilisierten Glucanase und der Bindekraft an Apatit. Wie aus den Ergebnissen der nachstehenden Elutionsprüfung hervorgeht, werden jedoch z. B. Lysozym und Cytochrom C bevorzugt. Die verwendete Glucanase kann, wie bereits erwähnt wurde, beliebig aus Lävanase, Dextranase und Mutanase ausgewählt werden. Gewünschtenfalls können Mischungen solcher Enzyme verwendet werden. Die betreffende Reaktion findet bei einem pH-Wert statt, bei dem kein Abbau von Apatit eintritt, d. h., bei einem pH-Wert von 5,6 bis 9,0. Ein über 9,0 liegender pH- Wert hat eine nachteilige Wirkung auf die Adsorption von Protein. Der am meisten bevorzugte pH-Wert liegt in der Gegend von 7,0.
Es ist erwünscht, daß die Teilchengröße des eingesetzten Apatits so gleichmäßig wie möglich ist, jedoch sind für diesen besonderen Zweck Apatitteilchen geeignet, wie sie im allgemeinen als Poliermittel für Zahnputzmittel verwendet werden. Apatit mit einer Teilchengröße von 2 bis 200 µm wird bevorzugt, weil er leicht zu handhaben ist. Die verwendete Menge des Apatits ist 10- bis 100mal so groß wie die Menge des Proteins. Für ein wirksames Schütteln bzw. Rühren ist es erwünscht, daß im Vergleich zu der verwendeten Menge des Apatits eine größere Wassermenge eingesetzt wird. Die Wassermenge wird derart eingestellt, daß der Feststoffgehalt in der Reaktionsphase 4 bis 20% beträgt. Die Verwendung faktisch äquivalenter Mengen von Protein und Glucanase wird bevorzugt. Ein großer Unterschied zwischen den Mengen dieser beiden Bestandteile, insbesondere die Verwendung von Glucanase in einer geringeren Menge als Protein, sollte vermieden werden, weil in diesem Fall eine Abnahme des Gehalts der resultierenden immobilisierten Glucanase eintritt. Die verwendete Menge des Glutaraldehyds hat einen sehr großen Einfluß auf den Gehalt der immobilisierten Glucanase. Eine zu geringe Menge des zuzutropfenden Glutaraldehyds führt im allgemeinen dazu, daß die immobilisierte Glucanase eine niedrige Bindekraft an Apatit zeigt und im Verlauf der Zeit in beträchtlichem Maße desaktiviert wird. Eine große Glutaraldehydmenge hat eine Abnahme des Gehalts der resultierenden immobilisierten Glucanase zur Folge, und eine weitere Zunahme seiner Menge führt zur Desaktivierung der Glucanase. Obwohl die verwendete Menge des Glutaraldehyds in Abhängigkeit von der Art der Glucanase und des Proteins ein wenig verschieden sein kann, beträgt die je verwendetes Gramm Protein verwendete Menge des Glutaraldehyds im allgemeinen 3 bis 60 mg und vorzugsweise 6 bis 20 mg. Die betreffende Reaktion wird bei einer Temperatur, die Raumtemperatur nicht überschreitet, und vorzugsweise bei einer Temperatur um 5°C durchgeführt. Während eine Suspension, in der Protein, Glucanase und Apatit gleichzeitig vorhanden sind, heftig gerührt wird, wird zu der Suspension eine wäßrige Lösung von Glutaraldehyd langsam zugetropft. Nach dem Zutropfen wird mehrere Stunden lang bei derselben Temperatur gerührt, um die Reaktion zu beenden. Nach Beendigung der Reaktion wird filtriert. Der erhaltene Apatit wird zur Entfernung von mitgerissenem Protein und Enzym gründlich mit Wasser oder mit der verwendeten Pufferlösung gewaschen. Dann wird er zur Verfestigung bei einer niedrigeren Temperatur gehalten oder gefriergetrocknet und dann bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Der Apatit mit daran immobilisierter Glucanase kann auch folgendermaßen hergestellt werden: Apatit wird unter ausreichendem Schütteln bzw. Rühren zu einer wäßrigen Pufferlösung, in der das Protein gelöst ist, hinzugegeben, wodurch das Protein bis zur Sättigung an den Apatit adsorbiert wird. Danach wird der Apatit, der das Protein adsorbiert hat, gesammelt und zu einer Pufferlösung, in der Glucanase gelöst ist, hinzugegeben. Während die erhaltene Lösung heftig gerührt wird, wird eine wäßrige Lösung von Glutaraldehyd langsam dazugetropft. Die Temperatur und die anderen Bedingungen, die zu diesem Zweck angewandt werden, sind dieselben, die vorstehend erwähnt wurden.
Der Apatit mit daran immobilisierter Glucanase, der in dieser Weise erhalten worden ist, ist stabil, verändert sich weniger mit der Zeit und ist leicht zu handhaben.
Es ist geklärt worden, daß Apatit eine bestimmte Proteinart gut adsorbiert. Es ist auch bekannt, daß Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel zum Immobilisieren von Enzym verwendet wird. Obwohl der Mechanismus, durch den die Immobilisierung von Glucanase an Apatit erreicht wird, noch unklar ist, wird angenommen, daß gleichzeitig mit einer Vernetzung von Protein und Glucanase eine Adsorption von Protein, das durch Apatit leicht adsorbiert wird, an Apatit stattfindet, wodurch der Apatit mit daran immobilisierter Glucanase erhalten wird.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Beispiel 1 Immobilisierung von Lävanase an Hydroxylapatit
100 mg Lysozym und 100 mg Lävanase wurden in 50 ml reinem Wasser gelöst, und zu der erhaltenen Lösung wurden als Poliermittel 2 g Hydroxylapatit hinzugegeben, worauf auf 4°C abgekühlt wurde. Während die Temperatur unter heftigem Rühren bei 4°C gehalten wurde, wurden 2 ml einer Lösung, die 28 mg Glutaraldehyd in 100 ml Wasser enthielt, langsam zugetropft. Nach Beendigung des Zutropfens wurde 2 h lang gerührt, während die Temperatur bei 4°C gehalten wurde. Dann wurde zentrifugiert, wobei ein festes Produkt erhalten wurde, das seinerseits unter Rühren bzw. Schütteln dreimal mit 50 ml reinem Wasser gewaschen wurde, wobei ungetrockneter Hydroylapatit mit daran immobilisierter Lävanase erhalten wurde. (Dieses Produkt kann gewünschtenfall als solches verwendet werden). Durch Gefriertrocknen wurden 2,05 g eines Pulvers erhalten. Zu 1 g dieses Pulvers wurden 10 ml einer 1 M Kaliumphosphat- Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,8 hinzugegeben. Es wurde 1 h lang gerührt, worauf zentrifugiert wurde, um das Filtrat zu sammeln. Derselbe Vorgang wurde mit dem Rückstand zweimal wiederholt. Die erhaltenen Filtrate wurden vereinigt, um durch die Lowry-Methode den Proteingehalt zu ermitteln. Nach dem Waschen mit Wasser wurde der Rückstand getrocknet, um seine Masse zu bestimmen. Dabei wurde festgestellt, daß an je ein Gramm Hydroxylapatit 11,7 mg Protein gebunden waren. Die Messung der Lävanase-Aktivität des ungetrockneten Hydroxylapatits mit daran immobilisierter Lävanase durch das nachstehend beschriebene Verfahren zeigte, daß je Gramm des an Hydroxylapatit gebundenen Proteins 0,47 g Lävan gespalten wurden.
Beispiel 2 Immobilisierung von Lävanase an Fluorapatit
Es wurden dieselben Bedingungen wie in Beispiel 1 angewandt, außer daß anstelle von Hydroylapatit Fluorapatit verwendet wurde, wobei 2,05 g eines gefriergetrockneten Produkts erhalten wurden. Die Messung des gebundenen Proteins, die in derselben Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, zeigte, daß an je ein Gramm Fluorapatit 13,4 mg Protein gebunden waren. Ferner zeigten die Ergebnisse der Messung der Lävanase- Aktivität des ungetrockneten Fluorapatits, daß je Gramm des gebundenen Proteins 0,54 g Lävan gespalten wurden.
Beispiel 3 Immobilisierung von Mutanase an Hydroxylapatit
Es wurden dieselben Bedingungen wie in Beispiel 1 angewandt, außer daß anstelle von Lävanase Mutanase verwendet wurde, wobei Hydroxylapatit mit daran immobilisierter Mutanase erhalten wurde. Die Spaltung wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß an je ein Gramm Hydroxylapatit 15,0 mg Protein gebunden waren. Die Mutanase-Aktivität des Produkts wurde durch das nachstehend beschriebene Verfahren zur Messung der Mutanase-Aktivität gemessen. Dabei wurde ermittelt, daß je Gramm des an Hydroxylapatit gebundenen Proteins 0,48 g Mutan gespalten wurden.
Beispiel 4 Immobilisierung von Mutanase an Fluorapatit
Es wurden dieselben Bedingungen wie in Beispiel 2 angewandt, außer daß anstelle von Lävanase Mutanase verwendet wurde, wobei als Produkt ein Fluorapatit mit daran immobilisierter Mutanase erhalten wurde. Die Ergebnisse der Analyse und der Messung seines Gehalts, die in derselben Weise wie in Beispiel 3 durchgeführt wurden, zeigten, daß an je ein Gramm Fluorapatit 17 mg Protein gebunden waren und daß je Gramm des gebundenen Proteins 0,45 g Mutan gespalten wurden.
Beispiel 5 Immobilisierung von Dextranase an Hydroxylapatit
5 g Hydroxylapatit, der als Poliermittel verwendet wurde, und 50 ml einer 0,05 M Kaliumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,8 wurden zu einer Mischung von 50 mg Lysozym mit 50 mg Dextranase hinzugegeben. Das erhaltene Produkt wurde auf 4°C abgekühlt und wurde heftig gerührt. Während diese Temperatur aufrechterhalten wurde, wurden 125 µl einer 0,2%igen wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd unter Rühren zugetropft, worauf 5 h lang weiter gerührt wurde. Das Reaktionsprodukt wurde durch Filtrieren gesammelt und dreimal mit 100 ml der vorstehend erwähnten Pufferlösung gewaschen, wobei ungetrockneter Hydroxylapatit mit daran immobilisierter Dextranase erhalten wurde. Durch Gefriertrocknung wurden 5,07 g pulverförmiger Hydroxylapatit mit daran immobilisierter Dextranase erhalten.
1 ml des ungetrockneten Hydroxylapatits mit daran immobilisierter Dextranase wurden zentrifugiert, wobei ein Niederschlag erhalten wurde. Zu dem Niederschlag wurden 2 ml einer 1 M Kaliumphosphat- Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,8 hinzugegeben, und die erhaltene Lösung wurde zum Desorbieren des gebundenen Proteins 3 h lang gerührt, worauf zentrifugiert wurde. Mit dem erhaltenen Niederschlag wurde derselbe Vorgang wiederholt. Die Filtrate wurden vereinigt, um die Menge des darin enthaltenen Proteins durch die Lowry-Methode zu messen, und die Niederschläge wurden mit Wasser gewaschen und dann getrocknet, um ihre Masse zu bestimmen. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß an je ein Gramm Hydroxylapatit 13,8 mg Protein gebunden waren. Die Ergebnisse der Messung der Dextranase-Aktivität durch das nachstehend beschriebene Verfahren zur Messung der Dextranase-Aktivität zeigten, daß je Gramm des gebundenen Proteins 0,415 g Dextran gespalten wurden.
Beispiel 6 Immobilisierung von Dextranase an Fluorapatit
Es wurden dasselbe Herstellungsverfahren, dieselbe Analyse und dieselbe Messung des Gehalts wie in Beispiel 5 angewandt, außer daß anstelle von Hydroxylapatit Fluorapatit verwendet wurde. Dadurch wurden 5,08 g eines Fluorapatits mit daran immobilisierter Dextranase erhalten, bei dem an je ein Gramm Fluorapatit 15,2 mg Protein gebunden waren. Je Gramm des gebundenen Proteins wurden 0,43 g Dextran gespalten.
In Tabelle 1 sind die Ergebnisse angegeben, die unter veränderten Bedingungen erhalten wurden. Die Bedingungen für die Behandlung waren dieselben wie bei den vorstehenden Beispielen.
Messung des Gehalts der Glucanasen
1 ml des in jedem der Versuche erhaltenen ungetrockneten Apatits mit daran immobilisierter Glucanase wurde zu 10 ml einer 1%igen Lösung des entsprechenden Substrats hinzugegeben. Nachdem die erhaltene Lösung 2 h lang bei 37°C gerührt worden war, wurde die Menge des darin gebildeten Monomers gemessen. Ferner wurde das Protein, das an 1 ml des ungetrockneten Apatits mit daran immobilisierter Glucanase gebunden war, durch das vorstehend beschriebene Verfahren ermittelt. Der Gehalt jeder immobilisierten Glucanase wurde dann in Form der Menge des Monomers je Gramm des an jeden Apatit gebundenen Proteins ausgedrückt.
Die verwendeten Substrate waren Dextran für Dextranase, Mutan für Mutanase und Lävan für Lävanase. Die Mengen der Dextranase und der Mutanase wurden aus der Glucose ermittelt, die durch Spaltung mittels der Glucoseoxidase-Methode erhalten wurde, und die Menge der Lävanase wurde aus der Fructose ermittelt, die durch Spaltung unter Anwendung der Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie (eine Säule: Zucker-Füllung I) in üblicher Weise erhalten wurde.
Prüfung der Elution des gebundenen Proteins
Der erhaltene Apatit mit daran immobilisierter Glucanase wurde in eine Säule gefüllt und mit verschiedenen Konzentrationen einer Pufferlösung gewaschen, um die zum Eluieren des gebundenen Proteins erforderliche Konzentration zu ermitteln. Die Bindekraft des Proteins an Apatit wurde dann in Form des erhaltenen Meßwertes ausgedrückt. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse, die bei Hydroxylapatit mit daran immobilisierter Dextranase erhalten wurden. Das verwendete Elutionsmittel war eine Kaliumphosphat- Pufferlösung mit einer Konzentration von 1 mmol bis 1 mol/l und einem pH-Wert von 6,8, und als Vergleichsprobe wurde Hydroxylapatit verwendet, an den nur Dextranase gebunden war. Die Ergebnisse zeigen, daß Lysozym der bevorzugte Träger ist.
Aktivität der immobilisierten Glucanasen im Verlauf der Zeit
Die Veränderungen der Aktivität mehrerer Proben der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Apatite mit daran immobilisierter Glucanase im Verlauf der Zeit wurden geprüft. Die verwendeten Proben waren alle ungetrocknete Produkte mit immobilisierter Glucanase. Die Aktivität jeder Probe wurde durch das vorstehend beschriebene Verfahren gemessen, wobei die in Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse erhalten wurden. Es wurde festgestellt, daß die Aktivität aller erhaltenen Apatite mit daran immobilisierter Glucanase vom Anfang an im Verlauf der Zeit zunahm und nach einem bestimmten Zeitraum einen Höchstwert zeigte und daß die Aktivität dann allmählich abnahm.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann Glucanase sehr einfach an Apatit immobilisiert werden. Der erhaltene Apatit mit daran immobilisierter Glucanase ist leicht zu handhaben und stabil und verändert sich weniger mit der Zeit. Ferner vereinigt der Apatit mit daran immobilisierter Glucanase in sich das Poliervermögen des Apatits mit der Fähigkeit zum Spalten der mit Zahnkaries im Zusammenhang stehenden Polysaccharide. Infolgedessen wird die Verwendung des Produkts für ein Zahnputzmittel im Hinblick auf den Wunsch nach der Verhinderung von Zahnkaries bevorzugt. Die Erfindung ist aus diesen Gründen für die Erhaltung einer guten Mundhygiene in hohem Maße vorteilhaft.
Tabelle 1
TrägerElutionskonzentration
Vergleichsprobe0,08 mol/l Lysozym0,18 mol/l Albumin0,12 mol/l Casein0,15 mol/l
Tabelle 3
Veränderung der Enzymaktivität des Apatits mit daran immobilisierter Glucanase mit der Zeit (spezifische Aktivität)

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung eines Apatits mit daran immobilisierter Glucanase für die Spaltung von Polysacchariden, die mit Zahnkaries im Zusammenhang stehen, dadurch gekennzeichnet, daß zu einer wäßrigen Lösung, die eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5,6 bis 9,0 ist, in der Glucanase, Protein und Apatit in einem gemischten Zustand vorhanden sind, Glutaraldehyd zugetropft wird, wobei die auf das Protein bezogene Menge des Glutaraldehyds 0,3% bis 6% beträgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protein Lysozym eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Apatit mit einer Teilchengröße von 2 bis 200 µm eingesetzt wird.
4. Nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 hergestellte Apatite mit daran immobilisierter Glucanase.
DE3721441A 1986-04-22 1987-06-29 Verfahren zur Herstellung eines Apatits mit daran immobilisierter Glucanase und nach dem Verfahren hergestellte Apatite Expired DE3721441C1 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP61091332A JPS62248487A (ja) 1986-04-22 1986-04-22 グルカナーゼを固定化したアパタイトおよびその製造法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE3721441C1 true DE3721441C1 (de) 1988-12-29

Family

ID=14023487

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3721441A Expired DE3721441C1 (de) 1986-04-22 1987-06-29 Verfahren zur Herstellung eines Apatits mit daran immobilisierter Glucanase und nach dem Verfahren hergestellte Apatite

Country Status (5)

Country Link
JP (1) JPS62248487A (de)
AU (1) AU602149B2 (de)
DE (1) DE3721441C1 (de)
FR (1) FR2617867B1 (de)
GB (1) GB2206585A (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0477339A1 (de) * 1990-04-16 1992-04-01 Harvard College Hydroxyapatit-antigen-konjugate und verfahren zur auslösung einer poly-ig-immunantwort.

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5009898A (en) * 1988-09-29 1991-04-23 Kabushiki Kaisha Sangi Antimicrobial hydroxyapatite powders and methods for preparing them
US5268174A (en) * 1988-09-29 1993-12-07 Kabushiki Kaisha Sangi Antimicrobial hydroxyapatite powders containing hinokitiol, protamine or sorbic acid
DE69024323T2 (de) * 1989-10-27 1996-10-17 Procter & Gamble Antimikrobielles Verfahren und Formulierung unter Verwendung von Endoglycosidase vom Typ II und antimikrobielles Mittel
US5041236A (en) * 1989-10-27 1991-08-20 The Procter & Gamble Company Antimicrobial methods and compositions employing certain lysozymes and endoglycosidases
US5258304A (en) * 1989-10-27 1993-11-02 Genencor International, Inc. Method of removing microorganisms from surfaces with Type II endoglycosidase
US5238843A (en) * 1989-10-27 1993-08-24 Genencor International, Inc. Method for cleaning a surface on which is bound a glycoside-containing substance
CA2072616A1 (en) * 1989-11-01 1991-05-02 Shigeaki Maruo Stabilized immobilized enzyme
ES2174248T3 (es) 1996-04-16 2002-11-01 Novozymes As Composiciones para la eliminacion de una placa dental.
US6413501B2 (en) 1997-10-17 2002-07-02 Novozymes A/S Plaque-inhibiting oral compositions
FR2773170B1 (fr) * 1997-12-31 2000-10-13 Ase & Bio Soc Civ Enzymes immobilisees sur un support a base d'alumine, leurs procedes de preparation et leurs applications
CN112111479A (zh) * 2020-09-30 2020-12-22 江苏海洋大学 一种右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料及其制备方法和用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0171258B1 (de) * 1984-08-02 1992-01-02 Stabra AG Ladung auf einer Säule

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICHTS ERMITTELT *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0477339A1 (de) * 1990-04-16 1992-04-01 Harvard College Hydroxyapatit-antigen-konjugate und verfahren zur auslösung einer poly-ig-immunantwort.
EP0477339A4 (en) * 1990-04-16 1993-04-21 The President And Fellows Of Harvard College Hydroxyapatite-antigen conjugates and methods for generating a poly-ig immune response
US5443832A (en) * 1990-04-16 1995-08-22 Institut Swisse De Recherches Experimentales Sur Le Cancer Hydroxyapatite-antigen conjugates and methods for generating a poly-Ig immune response

Also Published As

Publication number Publication date
GB2206585A (en) 1989-01-11
JPH0441597B2 (de) 1992-07-08
FR2617867B1 (fr) 1990-03-09
JPS62248487A (ja) 1987-10-29
AU7460187A (en) 1989-01-05
AU602149B2 (en) 1990-10-04
GB8715448D0 (en) 1987-08-05
FR2617867A1 (fr) 1989-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3721441C1 (de) Verfahren zur Herstellung eines Apatits mit daran immobilisierter Glucanase und nach dem Verfahren hergestellte Apatite
DE2839170C2 (de) Chromatographisches Material
DE2527884C2 (de)
EP0000028B1 (de) Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Enzympräparats
DE3520465A1 (de) Antibiotisches mittel
DE2405316A1 (de) Stabilisierte enzyme auf anorganischen traegern
DE3722102C2 (de)
CH641046A5 (de) Verfahren zur herstellung bestaendiger urokinasemittel.
DE2219063A1 (de) Enzymatisch aktive Substanz, deren Herstellung und Verwendung
US4812404A (en) Apatite immobilized glucanase
DE2163318C3 (de) Verfahren zur Herstellung von zur passiven Agglutination geeigneten Tra gerteilchen aus mit Formaldehyd be handelten Mikroorganismen
DE3623846A1 (de) Zusammensetzung zur selektiven bestimmung einer biologisch aktiven substanz
DE1901517C2 (de) Reagens und Verfahren zur Bestimmung von α-Amylasen oder Dextranasen
DE3722103C2 (de)
DE131251T1 (de) Immobilisierte enzymzusammensetzung und verfahren zu deren herstellung.
DE2850950B2 (de) Verwendung von nativem oder thermisch modifiziertem Cytochrom c als Stabilisator für ein immunochemisches Meßreagens, immunochemisches Meflreagens sowie Pufferlösung zur Probenverdünnung bei immunchemischen Meßverfahren
DE3721443A1 (de) Zahnputzmittel
DE19726626C1 (de) Verfahren zur Herstellung eines eine Hyaluronidase enthaltenden Präparats
DE2714718A1 (de) Zahnreinigungsmittel
DE2215160C3 (de) In Wasser oder wäßrigen Medien unlösliches Trägerenzym und Verfahren zu seiner Herstellung
DE2517219B2 (de) Verfahren zur gewinnung eines hypothyreoten kontrollserums, danach hergestelltes hypothreotes kontrollserum und verwendung desselben
EP0337053B1 (de) Teststreifen zur Bestimmung der Sauerstoffkonzentration in einer Flüssigkeit sowie Verfahren zu seiner Herstellung.
Ericson et al. Sedimentation method for studies of adsorption of microorganisms onto apatite surfaces in vitro
AT392288B (de) Verfahren zur herstellung von moranolinderivaten
DE4231266A1 (de) Dextran modifizierte Glutamat-Dehydrogenase

Legal Events

Date Code Title Description
8100 Publication of the examined application without publication of unexamined application
D1 Grant (no unexamined application published) patent law 81
8364 No opposition during term of opposition
8328 Change in the person/name/address of the agent

Free format text: TIEDTKE, H., DIPL.-ING. BUEHLING, G., DIPL.-CHEM. KINNE, R., DIPL.-ING. GRUPE, P., DIPL.-ING. PELLMANN, H., DIPL.-ING. GRAMS, K., DIPL.-ING., PAT.-ANWAELTE, 8000 MUENCHEN

8339 Ceased/non-payment of the annual fee