DE3716794C2

DE3716794C2 -

Info

Publication number: DE3716794C2
Application number: DE3716794A
Authority: DE
Inventors: Paolo Senin; Rolando Chiste'; Francesco Monza Mailand/Milano It Makovec; Luigi San Fruttuoso Di Monza Mailand/Milano It Rovati
Original assignee: Rotta Research Laboratorium SpA
Current assignee: Rottapharm SpA
Priority date: 1986-05-20
Filing date: 1987-05-19
Publication date: 1993-02-18
Also published as: IT1190570B; PT84885B; DE3716794A1; PT84885A; FR2599032A1; FR2599032B1; IT8667419A0

Description

Die Erfindung betrifft Aminosäure-monofluorphosphatsalze, die bei sämtlichen Syndromen, die sich aus einer mangelnden Mineralisation des Knochenmethaphysengewebes ergeben, wirksam sind.

Beim Knochengewebe handelt es sich um einen besonderen Typ von Bindegewebe, bei dem mineralische Substanzen, insbesondere Hydroxylapatit, im Stroma abgelagert sind. Das Stroma besteht morphologisch aus einem Proteinteil (Kollagenfibrillen) und aus Polysaccharidketten von Glucosaminglycanen oder Mucopolysacchariden, deren Hauptbestandteile Disaccharideinheiten sind, in denen verschiedenartig substituierte Aminozucker und Uronsäure vorliegen.

Das Knochengewebe weist somit eine dreifache Natur auf, d. h. eine Mineral-, Protein- und Mucopolysaccharidnatur. Daraus resuliert, daß Stoffwechselstörungen eines jeden dieser drei Typen unvermeidlich auch zu Störungen der beiden anderen Typen führen, wodurch osteoartikuläre Erkrankungen auftreten.

Osteoporose ist durch ein schwammartiges und mit Hohlräumen versehenes Knochengewebe bei verringerter allgemeiner Festigkeit und somit erhöhter Bruchanfälligkeit gekennzeichnet. Sie macht sich makroskopisch durch eine mangelhafte Mineralisation der Knochenmatrix bemerkbar. Die Ätiologie dieser Erscheinung ist jedoch häufig sehr kompliziert, da sie auf einen enzymatischen Defekt im Turnover der Glucosaminglycane, auf Störungen in der Verfügbarkeit der Mineralbestandteile oder auf eine Störung der Hormonfaktoren, die direkt oder indirekt den Knochenstoffwechsel steuern, zurückgeführt werden kann. Häufig sind alle diese Faktoren gleichzeitig beteiligt und beeinflussen sich gegenseitig, wodurch schließlich ein pathologisch sehr komplexes und schwierig zu lösendes Erscheinungsbild entsteht.

In diesen Fällen sind unterschiedliche Therapiearten vorgeschlagen und angewandt worden. Hierzu gehören die Anwendung der Hormone Calcitonin und Parathormon, von Vitamin D zusammen mit Calciumsalzen oder die einzelne oder kombinierte Verabreichung von Elementen, die am Mineralstoffwechsel von Knochen beteiligt sind, wie Fluor, Calcium und Phosphor.

In keinem dieser Fälle sind jedoch vollkommen zufriedenstellende Ergebnisse erzielt worden, da bei den eingesetzten Arzneimitteln mit großer Wahrscheinlichkeit die Tendenz besteht, daß nur ein Teil der Ursachen, die dem pathologischen Zustand zugrunde liegen, wieder ins Gleichgewicht gebracht oder korrigiert wird. Somit ergeben sich nur zufriedenstellende oder nur vorübergehende therapeutische Wirkungen.

In der US-PS 40 64 138 werden Fluorphosphatsalze von Aminosäuren der nachstehenden allgemeinen Formeln beschrieben:

(vgl. Spalte 3, Zeile 15 und 20 sowie Spalte 4, Zeile 10)

wobei A und B die Anionen F⊖, H₂PO₄⊖ oder HPO₃F⊖ und D und E das Anion HPO₃F⊖ darstellen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen führen zu einem neuen und eigenständigen Therapievorschlag bei der Behandlung der vorerwähnten pathologischen Zustände.

Gegenstand der Erfindung sind Aminosäure-monofluorphosphatsalze der allgemeinen Formel

AA_nFPO₃

in der AA eine der nachstehenden Aminosäuren bedeutet: Alanin (D; L; D, L), Asparaginsäure (L; D; D, L), Asparagin (L; D; D, L), Cystein (L; D, L), Glutaminsäure (L; D; D, L), Glutamin (L; D), Glycin, Hydroxyprolin (trans-L), Leucin (L; D, L), Methionin (L; D; D, L), Phenylalanin (L; D; D, L), Prolin (L; D; D, L), Serin (L; D; D, L), Threonin (L; D, L), Tryptophan (L; D; D, L), Tyrosin (L; D; D, L) und Valin (L; D; D, L) und
n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 oder 2 ist.

Die der vorerwähnten Formel entsprechenden Verbindungen sind nur in Abwesenheit von Feuchtigkeit stabil. Setzt man diese Verbindungen der Atmosphäre aus, so erweisen sie sich als stark hygroskopisch. In einem Zeitraum von 10 Minuten bis einigen Stunden (je nach der verwendeten Aminosäure und der relativen Luftfeuchtigkeit), verwandeln sie sich in breiartige Produkte oder viskose Öle, die für keinerlei Handhabungsart geeignet sind.

Es wurde festgestellt, daß diese Verbindungen (ausgenommen die Prolin- und Hydroxyprolinverbindung, deren Kokristallisationsprodukte mit Fluorphosphat und Natriumchlorid immer noch hygroskopisch sind) nach einem Verfahren der Kokristallisation mit Natriumchlorid erhalten werden können, das die Herstellung kristalliner, stabiler Produkte innerhalb breiter Temperatur- und Feuchtigkeitsbereiche erlaubt, wobei diese Produkte für beliebige praktische Anwendungsgebiete, einschließlich die Herstellung von oralen und enteralen Darreichungsformen für die therapeutische Verwendung, perfekt geeignet sind.

Gegenstand der Erfindung sind somit ferner Mischsalze der allgemeinen Formel

AA_nFPO₃ · 2 NaCl

in der AA eine der nachstehenden Aminosäuren bedeutet: Alanin (D; L; D, L), Arginin (L), Asparaginsäure (L; D; D, L), Asparagin (L; D; D, L), Cystein (L; D, L), Cystin (L; D), Glutaminsäure (L; D; D, L), Glutamin (L; D), Glycin, Histidin (L), Hydroxyprolin (trans-L), Leucin (L; D, L), Lysin (L), Methionin (L; D; D, L), Phenylalanin (L; D; D, L), Prolin (L; D; D, L), Serin (L; D; D, L), Threonin (L; D, L), Tryptophan (L; D; D, L), Tyrosin (L; D; D, L) und Valin (E; D; D, L) und
n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 oder 2 ist, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

a) Salzbildung der gewählten Aminosäure mit Monofluorphosphorsäure in Aceton, Methyläthylketon, Tetrahydrofuran oder Acetonitril bei einer Temperatur von 0 bis -10°C;
b) Abtrennen des Salzes der allgemeinen Formel AA_nFPO₃aus der Reaktionsmasse bei einer Temperatur nicht über 50°C;
c) Lösen des vorstehenden Salzes in einer wäßrigen Natriumchloridlösung unter Rühren bei einer Temperatur von 35 bis 45°C und Fällung des Mischsalzes durch Zugabe von Aceton, Methyläthylketon, Äthanol, Acetonitril oder Tetrahydrofuran.

Aus den nachstehend wiedergegebenen experimentellen Befunden ergibt sich, daß die in vitro-Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen in bezug auf die Stimulation der Synthese von Glucosaminoglycanen sowohl auf Zellebene als auch auf Gewebeebene sich insofern als besonders interessant erweist, als sich dadurch eine Wiederherstellung des Gleichgewichts von eventuellen Fehlfunktionen auf seiten der Mucopolysaccharide des Knochengewebes ergibt. Ferner zeigen die nachstehenden Ausführungen, daß die in vivo- Aktivität der Verbindungen zusammen mit Calciumsalzen bei der Behandlung von Immobilisations-Osteoporose eine besonders ausgeprägte Wirkung in bezug auf die Regulation und Normalisierung der Mineralstruktur des Knochengewebes ausüben.

Die bei der Herstellung der erfindungsgemäßen einfachen und gemischten Salze verwendeten Aminosäuren sind Alanin (D; L; D,L), Arginin (L), Asparaginsäure (L; D; D,L), Asparagin (L; D; D,L), Cystein (L; D,L), Cystein (L; D), Glutaminsäure (L; D; D,L), Glutamin (L; D), Glycin, Histidin (L), Hydroxyprolin (trans-L), Leucin (L; D,L), Lysin (L), Methionin (L; D; D,L), Phenylalanin (L; D; D,L), Prolin (L; D; D,L), Serin (L; D; D,L), Threonin (L; D,L), Tryptophan (L; D; D,L), Tyrosin (L; D; D,L) und Valin (L; D; D,L).

Das allgemeine Herstellungsverfahren der Mischsalze besteht aus zwei Stufen, wovon die erste Stufe aus der Herstellung des Monofluorphophats der gewählten Aminosäure und die zweite Stufe aus der Stabilisation dieses Salzes durch Kokristallisation mit Natriumchlorid besteht, wodurch man die beanspruchten Verbindungen erhält.

Die erste Stufe besteht im wesentlichen darin, daß man die gewählte Aminosäure in einem polaren, hydroxylgruppenfreien Lösungsmittel, wie Aceton, Methyläthylketon, Tetrahydrofuran oder Acetonitril, in einer Volumenmenge, die dem 5,5- bis 7,5fachen (vorzugsweise 6,5fachen) des Gewichts der zur Salzbildung verwendeten Aminosäure entspricht, suspendiert, die Reaktionsmasse auf eine Temperatur zwischen 0 und -10°C (vorzugsweise -5°C) abkühlt, allmählich unter Rühren und innerhalb eines Zeitraumes von 2 bis 4 Stunden (vorzugsweise 3 Stunden) die stöchiometrische Menge an Monofluorphosphorsäure zutropft, die Reaktionsmasse 18 bis 48 Stunden (vorzugsweise 24 Stunden) im vorstehend erwähnten Temperaturbereich rührt, anschließend den in Suspension befindlichen Feststoff filtriert und schließlich das erhaltene Fluorphosphat unter vermindertem Druck bei Temperaturen nicht über 50°C (vorzugsweise 45°C) trocknet.

Die zweite Stufe umfaßt im wesentlichen folgende Maßnahmen: Das trockene Natriumchlorid wird in einer Menge an destilliertem Wasser, die dem 3- bis 5fachen (vorzugsweise 4fachen) des Gewichts des Natriumchlorids entspricht, bei einer Temperatur von 50 bis 70°C (vorzugsweise 60°C) unter Rühren gelöst; anschließend wird bei einer Temperatur von 35 bis 45°C (vorzugsweise 40°C) unter Rühren die stöchiometrische Menge des gewählten Fluorphosphats zugesetzt, wobei die Temperatur bis zur vollständigen Auflösung konstant gehalten wird; bei einer Temperatur von 25 bis 35°C (vorzugsweise 30°C) wird unter Rühren und Konstanthaltung der Temperatur die Ausfällung des gewünschten Mischsalzes durch Zugabe eines flüssigen, mit Wasser mischbaren Fällungsmittels, in dem die zu isolierenden Produkte eine Löslichkeit von nicht mehr als 0,1 Prozent (Gew./Vol.) aufweisen, ausgefällt.

Als flüssiges Fällungsmittel kann beispielsweise Aceton, Methyläthylketon, Äthanol, Acetonitril oder Tetrahydrofuran verwendet werden. Diese Fällungsmittel werden in Volumenmengen, die dem 8- bis 12fachen (vorzugsweise 10fachen) des Volumens des zur Lösung der Salze verwendeten destillierten Wassers zugesetzt. Vorteilhafterweise wird die Zugabe des Fällungsmittels in einem Zeitraum von 5 bis 7 Stunden (vorzugsweise 6 Stunden) durchgeführt, wonach die Suspension des gewünschten Mischsalzes noch über einen weiteren Zeitraum von 12 bis 24 Stunden (vorzugsweise 18 Stunden) unter leichtem Rühren und bei einer Temperatur von 25 bis 35°C (vorzugsweise 30°C) belassen wird, um eine vollständige Fällung zu gewährleisten und eine angemessene Kristallvergrößerung zu erreichen. Nach der erforderlichen Zeit wird die Reaktionsmasse auf Temperaturen von 0 bis 10°C (vorzugsweise 5°C) gekühlt. Sodann wird das Mischsalz abfiltriert und anschließend in einem Umluftofen bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Man erhält auf diese Weise weiße oder cremefarbig- weiße kristalline Produkte mit nicht-definierbaren Schmelzpunkten, die jedoch bis zu Temperaturen über 200°C beständig sind.

In der Tabelle A werden die charakteristischen analytischen Daten für erfindungsgemäße Produkte zusammen mit den entsprechenden Reaktionsausbeuten angegeben. Für die interessantesten Produkte werden nachstehend ferner detaillierte Angaben für die Herstellungsverfahren gemacht.

Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1 Mischsalz von L-Glutamin-monofluorphosphat und Natriumchlorid Stufe A: Herstellung von L-Glutamin-monofluorphosphat

In einem Reaktionsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 500 ml, das mit einem Thermometer, einem mechanischen Rührer, einem Tropftrichter und einem Gaseinleitungsrohr versehen ist, werden 29,2 g (0,2 Mol) L-Glutamin in 190 ml durch Destillation über Calciumchlorid getrocknetem Aceton suspendiert. Unter einem Strom von trockenem Stickstoff (oder einem anderen inerten, wasserfreien Gas) und unter Rühren wird die Suspension mittels eines Kühlbads auf -5°C gebracht. Zu diesem Zeitpunkt beginnt man unter Beibehaltung der vorerwähnten Bedingungen mit dem Zutropfen von 10 g (0,1 Mol) Monofluorphosphorsäure-anhydrid. Die Zugabe ist innerhalb von 3 Stunden beendet. Um eine vollständige Salzbildung zu gewährleisten, wird die Reaktionsmasse weitere 24 Stunden gerührt (dabei werden folgende Bedingungen konstant beibehalten: Rühren, Temperatur -5°C, trockener Stickstoffstrom). Anschließend wird rasch filtriert, um das in Suspension befindliche Salz zu isolieren. Der feuchte Filterkuchen wird sorgfältig ausgedrückt und sodann in einem Vakuumtrockenschrank bei einer Temperatur von nicht mehr als 45°C getrocknet. Man erhält 37,07 g (94,57 Prozent d. Th.) eines weißen oder cremefarbig- weißen, äußerst hygroskopischen Produkts. Setzt man dieses L-Glutamin-monofluorphosphat der Luft aus, so verwandelt es sich je nach Feuchtigkeits- und Temperaturbedingungen innerhalb von 10 bis 15 Minuten in eine halbfeste, praktisch nicht verwendbare und analytisch nicht identifizierbare Masse. Das Produkt wird daher unmittelbar nach dem Trocknen verwendet oder unter vermindertem Druck in Gegenwart von wasserentziehenden Mitteln aufbewahrt.

Stufe B: Stabilisierung durch Kokristallisation mit NaCl

In einem Reaktionsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 500 ml, das mit einem Thermometer und einem mechanischen Rührer ausgerüstet ist, werden 11,05 g Natriumchlorid (0,189 Mol) unter Rühren bei 60°C in 45 ml destilliertem Wasser gelöst. Nach vollständiger Lösung wird die Temperatur unter Rühren auf 40°C gebracht. Sodann werden möglichst rasch 37,07 g (0,09457 Mol) L-Glutamin-monofluorphosphat zugesetzt. Die Reaktionsmasse wird bei 40°C gerührt, bis sich eine vollständige Lösung des Salzes ergibt. Zu diesem Zeitpunkt wird die Temperatur unter leichtem Rühren auf 30°C verringert, und man beginnt mit dem Zutropfen von 450 ml Aceton, wobei sich Kristalle des Mischsalzes suspensionsartig abscheiden.

Das Zutropfen von Aceton ist innerhalb von 6 Stunden beendet. Anschließen läßt man die in Suspension befindliche kristalline Masse weitere 18 Stunden bei 30°C rühren. Sodann kühlt man auf 5°C ab, saugt ab und trocknet in einem Umluftofen bei 50°C. Man erhält ein weißes, kristallines, bei Umgebungsbedingungen vollständig stabiles Produkt in einer Ausbeute von 43,3 g (87,9 Prozent d. Th.).[α] = +5,9°(c = 6,3 in H₂O)

Mikroanalyse für C₁₀Cl₂FH₂₂N₄Na₂O₉P:

ber.: 23,58 C%; 4,36 H%; 11,01 N%; 3,73 F%; 6,08P%
gef.: 23,18 C%; 4,41 H%; 10,92 N%; 3,76 F%; 6,12P%

Argentometrische Chloridbestimmung: 98,96 Prozent.

Beispiel 2 Mischsalz von D-Glutamin-monofluorphosphat und Natriumchlorid Stufe A: Herstellung des D-Glutamin-monofluorphosphat

Man verfährt wie in Beispiel 1 unter Verwendung von L-Glutamin anstelle von D-Glutamin. Man erhält 36,45 g (93,0 Prozent d. Th.) eines weißen oder cremefarbig-weißen, äußerst hygroskopischen Produkts.

Stufe B: Stabilisation durch Kokristallisation mit NaCl

Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber 36,45 g (0,093 Mol) D-Glutamin-monofluorphosphat und 10,87 g (0,186 Mol) NaCl. Man erhält ein kristallines, weißes Produkt, das bei normalen Umgebungsbedingungen vollkommen stabil ist, in einer Ausbeute von 40,6 g (85,8 Prozent).[α]= +6,0°(c = 1,75 in H₂O).

Mikroanalyse für C₁₀Cl₂FH₂₂N₄Na₂O₉P:

ber.: 23,58 C%; 4,36 H%; 11,01 N%; 3,73 F%; 6,08P%
gef.: 23,71 C%; 4,34 H%; 10,88 N%; 3,67 F%; 6,02P%

Argentometrische Chloridbestimmung: 98,37 Prozent.

Beispiel 10 Mischsalz aus L-Asparagin-monofluorphosphat und Natriumchlorid Stufe A: Herstellung von L-Asparagin-monofluorphosphat

Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber 26,4 g (0,2 Mol) L-Asparagin und 170 ml wasserfreies Aceton. Sämtliche übrigen Reagentien und Bedingungen werden unverändert belassen. Man erhält 34,46 g (94,62 Prozent) eines weißen oder cremefarbig-weißen, äußerst hygroskopischen Produkts.

Stufe B: Stabilisierung durch Kokristallisation mit NaCl

Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber 34,46 g (0,0946 Mol) L-Asparagin-monoflurophosphat, 11,06 ml (0,1892 Mol) Natriumchlorid, 45 ml H₂O und 450 ml Aceton. Sämtliche übrigen Reagentien und Herstellungsbedingungen werden unverändert belassen.

Beispiel 13 Mischsalz aus L-Cystein-monofluorphosphat und Natriumchlorid Stufe A: Herstellung von L-Cystein-monofluorphosphat

Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber 24,2 g (0,2 Mol) L-Cystein und 145 ml wasserfreies Tetrahydrofuran (das wasserfreie Tetrahydrofuran wird durch 2stündiges Rückflußkochen über Natriumfäden und anschließende Destillation erhalten). Sämtliche übrigen Reagentien und Bedingungen werden unverändert belassen. Man erhält 32,89 g (96,09 Prozent d. Th.) eines weißen oder cremefarbig- weißen, äußerst hygroskopischen Produkts.

Stufe B: Stabilisation durch Kokristallisation mit NaCl

Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber 32,89 g (0,0961 Mol) L-Cystein-monofluorphosphat, 11,24 g (0,1923 Mol) Natriumchlorid, 45 ml H₂O und 495 ml Tetrahydrofuran. Sämtliche übrigen Reagentien und Bedingungen werden unverändert belassen. Man erhält ein weißes, kristallines, unter normalen Umgebungsbedingungen völlig stabiles Produkt in einer Ausbeute von 37,59 g (85,18 Prozent d. Th.).[α] = +7,2°(c = 10 in 1 n HCl).

Mikroanalyse für C₆Cl₂FH₁₆N₂Na₂PS₂:

ber.: 15,69 C%; 3,51 H%; 6,10 N%; 4,14 F%; 6,75P%; 13,97S%
gef.: 15,79 C%; 3,55 H%; 6,04 N%; 4,05 F%; 6,12P%; 14,20S%

Argentometrische Chloridbestimmung: 99,21 Prozent.

Beispiel 25 Mischsalz von L-Lysin-monofluorphosphat und Natriumchlorid Stufe A: Herstellung von L-Lysin-monofluorphosphat

Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber 15,0 g (0,1 Mol) L-Lysin und 99 ml wasserfreies Methyläthylketon. Die übrigen Reagentien und Bedingungen werden unverändert belassen. Man erhält 23,90 g (97,10 Prozent d. Th.) eines weißen oder cremefarbig-weißen, äußerst hygroskopischen Produkts.

Stufe B: Stabilisation durch Kokristallisation mit NaCl

Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber 23,90 g (0,0971 Mol) L-Lysin-monofluorphosphat, 11,35 g (0,1942 Mol) Natriumchlorid, 45 ml H₂O und 450 ml Methyläthylketon. Sämtliche übrigen Reagentien und Bedingungen werden unverändert belassen. Man erhält ein weißes, kristallines, bei normalen Umgebungsbedingungen völlig stabiles Produkt in einer Ausbeute von 31,83 g (90,3 Prozent d. Th.).[α] = +14°(c = 7,3 in H₂O).

Mikroanalyse für C₆Cl₂FH₁₆N₂Na₂O₅P:

ber.: 19,85 C%; 4,44 H%; 7,72 N%; 5,23 F%; 8,53P%
gef.: 20,10 C%; 4,40 H%; 7,83 N%; 5,36 F%; 8,50P%

Argenotometrische Chloridbestimmung: 98,44 Prozent.

Beispiel 32 Mischsalz von L-Prolin-monofluorphosphat und Natriumchlorid Stufe A: Herstellung von L-Prolin-monofluorphosphat

Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber 23,0 g (0,2 Mol) L-Prolin und 150 ml wasserfreies Aceton. Sämtliche übrigen Reagentien und Bedingungen werden unverändert belassen. Man erhält 31,76 g (96,18 Prozent d. Th.) eines weißen oder cremefarbig-weißen, äußerst hygroskopischen Produkts.

Stufe B: Versuchte Stabilisation durch Kokristallisation mit NaCl

Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber 31,76 g (0,0962 Mol) L-Prolin-monofluorphosphat, 11,24 g (0,1924 Mol) Natriumchlorid, 45 ml H₂O und 450 ml Aceton. Sämtliche übrigen Reagentien und Bedingungen werden unverändert belassen. Man erhält ein weißes bis cremefarbig-weißes, amorphes und immer noch äußerst hygroskopisches Produkt, das nur unter vermindertem Druck und in Gegenwart von entwässernden Mitteln aufbewahrt werden kann, in einer Ausbeute von 36,59 g (85,1 Prozent d. Th.).[α] = -44,3°(c = 1,1 in 0,5 n HCl).

Mikroanalyse für C₁₀Cl₂FH₂₀N₂Na₂O₇P:

ber.: 26,86 C%; 4,51 H%; 6,27 N%; 4,25 F%; 6,93P%
gef.: 26,38 C%; 4,58 H%; 6,15 N%; 4,21 F%; 6,86P%

Argentometrische Chloridbestimmung: 99,07 Prozent.

Beispiel 33 Mischsalz aus D,L-Prolin-monofluorphosphat und Natriumchlorid Stufe A: Herstellung von D,L-Prolin-monofluorphosphat

Man verfährt wie in Beispiel 32 unter Verwendung von L- Prolin anstelle von D,L-Prolin. Man erhält 31,83 g (96,39 Prozent d. Th.) eines weißen oder cremefarbig- weißen, äußerst hygroskopischen Produkts.

Stufe B: Versuchte Stabilisation durch Kokristallisation mit NaCl

Man verfährt wie in Beispiel 32 unter Verwendung von 31,83 g (0,0953 Mol) D,L-Prolin-monofluorphosphat und 11,27 g (0,1928 Mol) Natriumchlorid. Man erhält ein weißes bis cremefarbig-weißes, amorphes und immer noch äußerst hygroskopisches Produkt, das nur unter vermindertem Druck und in Gegenwart von entwässernden Mitteln aufbewahrt werden kann, in einer Ausbeute von 37,24 g (86,4 Prozent d. Th.).

Mikroanalyse für C₁₀Cl₂FH₂₀N₂Na₂O₇P:

ber.: 26,86 C%; 4,51 H%; 6,27 N%; 4,25 F%; 6,93P%
gef.: 26,62 C%; 4,53 H%; 6,14 N%; 4,22 F%; 6,80P%

Argentometrische Chloridbestimmung: 98,12 Prozent.

Die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Produkte auf das Knochen-Knorpel-Gewebe wurde in vitro und in vivo untersucht. Die Ergebnisse sind nachstehend wiedergegeben.

A) In vitro-Aktivität A1) Stimulation der Glucosaminoglycan-Synthese in Mäuseembryo-" Fibroblastenkulturen - Bewertung mittels ³⁵S-Einbau

Es ist bekannt, daß es sich bei embryonalen Fibroblasten um Zellen handelt, deren anschließende Differenzierungen zu unterschiedlichen Bindegewebstypen führen. Diese Zellen stellen ein experimentelles Modell dar, das bei der vorläufigen Bewertung von möglichen pharmakobiologischen Effekten (positiver oder negativer Art) von einer oder mehreren Substanzen auf Gewebe, die sich von diesem Zellsubstrat ableiten, darunter das Knochen-Knorpel-Gewebe, wertvoll ist.

Nachstehend werden Verfahren und Ergebnisse eines Tests unter Untersuchung des ³⁵S-Einbaus in sulfatierte (vorwiegend Chondroitinsulfat) Mucopolysaccharide (Glucosaminoglycane) sowohl im zellulären als auch im extrazellulären Bereich, wo der ³⁵S-Einbau proportional zur Geschwindigkeit ist, in der die Glucosaminoglycane von den Fibroblasten synthetisiert werden, beschrieben.

Erforderlichenfalls werden Primärkulturen von Mäuseembryo- Fibroblasten (Stamm C57BL/6 stCrl), die dem Muttertier am 18. Tag der Trächtigkeit entnommen sind, durch mechanische und enzymatische (in Trypsin-Versene-Gemisch; Microbiological Associates) Zerkleinerung aus dem Embryonen gewonnen.

Als Kulturmedium wird Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium verwendet, das mit 15 Prozent fötalem Kälberserum ergänzt ist.

Die Inkubationsatmosphäre besteht aus 5 Prozent Kohlendioxid in Luft von 37°C. 24 Stunden nach dem Beimpfen wird das Kulturmedium durch ein neues Medium ersetzt, das den zu untersuchenden Arzneistoff und die radioaktive Vorläuferverbindung (Na₂ ³⁵SO₄) für die Messung der Synthese der in Lösung befindlichen und im Gewebe enthaltenen Glucosaminoglycane enthält. Man inkubiert weitere 24 Stunden und trennt anschließend die Fibroblasten (die die im Gewebe befindlchen Glucosaminoglycane enthalten) vom Kulturmedium (das die löslichen Glucosaminoglycane enthält).

Die löslichen Glucosaminoglycane werden vom Kulturmedium durch Fällung mit 5%-Trichloressigsäure in H₂O isoliert, während die restlichen Fibroblasten, die die im Gewebe befindlichen Glucosaminoglycane enthalten, nach wiederholtem Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung mit Dimilume oder Versene, in Lösung gebracht werden. Die Menge des eingebauten ³⁵S in gelöste und im Gewebe befindliche Glucosaminoglycane wird durch Szintillationszählung bestimmt und in cpm (Zählereignisse pro Minute) angegeben.

Für jede Probe werden 5 Messungen durchgeführt, um eine statistisch ausreichende Bewertung zu ermöglichen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen I und II wiedergegeben.

Anmerkungen zu den Tabellen I und II

Die statistische Signifikanz wird nach dem Student-t-Test bewertet. In den mit "t" gekennzeichneten Spalten finden sich die t-Werte gemäß Student und in der mit "p" gekennzeichneten Spalte findet sich die statistische Wahrscheinlichkeit, gemäß der die verglichenen Werte der gleichen Population angehören. Der Ausdruck N. S. bedeutet, daß die verglichenen Werte als unterschiedlich angesehen werden können. Es wird angenommen, daß zwei Werte statistisch unterschiedlich sind, wenn p in Abhängigkeit vom Wert "t" und von den Freiheitsgraden 0,05 ist.
Erläuterungen:
cpm = Zählereignisse pro Minute
E. S. = Standardfehler
n. b. KT = nicht behandelte Kontrolltiere
GAG = Glucosaminglycane

Wie den Tabellen I und II zu entnehmen ist, stimulieren einige der erfindungsgemäßen Produkte die Synthese von sulfatierten Glucosaminoglycanen sowohl exo- als auch endozellulär in in vitro-Kulturen von Mäuseembryo-Fibroblasten. Diese Stimulation erweist sich bei einigen dieser Verbindungen bei der statistischen Auswertung als hochsignifikant (vgl. Beispiel 1, 2, 10, 13, 25, 32 und 34). Diese Tatsache ist von besonderer Wichtigkeit, wenn man berücksichtigt, daß zu den Hauptursachen bei der Entstehung von degenerativen Erkrankungen des osteoartikulären Gewebes, z. B. Arthrose und Osteoporose, sowohl die verminderte Synthese als auch der erhöhte Abbau von Mucopolysacchariden (Glucosaminoglycane) (und insbesondere von Chondroitinsulfat), die in derartigen Geweben enthalten sind, gehören.

Somit ist es offensichtlich, daß Substanzen, die zur Stimulation der Synthese von Mucopolysacchariden sowohl innerhalb als auch außerhalb der Zellen in der Lage sind, eine positive Wirkung bei der Behandlung der vorerwähnten Funktionsstörungen ausüben können.

Interessant ist die Feststellung, daß Natriummonofluorphosphat in der gleichen molaren Konzentration wie die erfindungsgemäßen Produkte nicht zur signifikanten Stimulation der Synthese von Glucosaminoglycanen, sowohl der löslichen als auch der im Gewebe befindlichen, in der Lage ist. Natriumfluorid übt in der gleichen Konzentration sogar eine Depressionswirkung aus, was offensichtlich eine toxische Wirkung auf die Fibroblasten anzeigt.

Entsprechende Überlegungen gelten auch für die übrigen erfindungsgemäßen Verbindungen, die keine signifikante Stimulationswirkung oder sogar eine Depressionswirkung auf die Synthese von Glucosaminoglycanen bei Mäuseembryonen ausüben.

Schließlich wird darauf hingewiesen, daß das Mischsalz aus L-Glutamin-monofluorphosphat und Natriumchlorid (Beispiel 1) die stärkste stimulierende Wirkung sowohl auf lösliche als auch auf im Gewebe befindliche Glucosaminoglycane ausüben. Diese Wirkung bleibt auch dann statistisch signifikant, wenn man die Konzentration des Produkts im Kulturmedium auf 50 Prozent verringert.

A2) Stimulation der Synthese von Glucosaminoglycanen in Kulturen von Knochenknorpeln von Ratten - Bewertung durch den ³⁵S-Einbau

Bei den Fibroblasten handelt es sich, wie bereits erwähnt, um nichtdifferenzierte embryonale Zellen, aus denen während der fötalen Entwicklung sämtliche Mesenchymgewebe entstehen, die normalerweise als Bindegewebe bezeichnet werden. Diese Zellen erweisen sich als sehr nützlich für ein vorläufiges Screening, da sie leicht handhabbar sind und eine gute experimentelle Reproduzierbarkeit gewährleisten. Sie haben jedoch nicht die morphologischen Eigenschaften eines Gewebes, so daß die an in vitro-Kulturen dieses Typs erhaltenen vorläufigen Ergebnisse keinen absoluten Wert haben, sondern an in vitro-Kulturen von echtem Bindegewebe bestätigt werden müssen. Dies wurde mit den erfindungsgemäß wichtigsten Verbindungen (Beispiele 1, 2, 10, 13, 25, 32 und 34), und mit den Verbindungen, die signifikant die Glucosaminoglycan-Synthese sowohl im Bindegewebe als auch in löslicher Form unterdrücken (Beispiel 6), sowie mit Natriummonofluorphosphat und Natriumfluorid als Vergleichsverbindungen durchgeführt. Die angewandte Methodik ist nachstehend beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.

Weibliche Ratten mit einem durchschnittlichen Gewicht von 220 g werden durch einen Schlag auf den Kopf getötet. die Knochen-Knorpelkapseln der proximalen femoralen Epiphyse des Oberschenkelkopfes werden entnommen. Gruppen von jeweils 6 Proben werden in 5 ml Tilbecco-modifiziertem Medium (MEM) der Firma Microbioligal Associates, das mit 15 Prozent fötalem Kälberserum, 500 Einheiten/ml Kalium-Penicillin G und 500 µg/ml Streptomycinsulfat ergänzt ist, 16 Stunden bei 37°C in einer Atmosphäre mit einem Gehalt an 15 Prozent CO₂ inkubiert.

Das Medium ist vorher mit 5 uci/ml Na₂ ³⁵SO₄ (spezifische Aktivität 92 uci/mMol) und den verschiedenen, zu untersuchenden Produkten in bestimmten Konzentrationen versetzt worden.

Nach der Inkubation werden die Proben gewaschen, mit Trypsin- Versene-Gemisch (500 mg Trypsin 1/250 und 200 mg Versene/ Liter physiologische Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium) 1 Stunde bei 37°C behandelt, mehrmals mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, durch 3stündige Behandlung mit 0,5 ml 6 n HCl bei 95°C in Lösung gebracht und nach Zugabe von 20 ml Dimilume-Packard der Szintillationsanalyse unterzogen, bei der aufgrund der Menge des ³⁵S-Einbaus in die Glucosaminoglycane des Knorpelgewebes die Wirkung der erfindungsgemäßen Produkte auf die Synthese von Mucopolysacchariden bestimmt wird (vgl. Tabelle III).

Anmerkung zur Tabelle III

Für die Bedeutung von t und p gelten die Ausführungen zu Tabelle I und II.

Die in Tabelle III wiedergegebenen Ergebnisse bestätigen für den Gewebebereich zumindest qualitativ die vorstehenden Beobachtungen für den exo- und endozellulären Bereich an in vitro-Kulturen von embryonalen Fibroblasten.

Die in bezug auf die Synthese von zellulären Glucosaminoglycanen aktivsten Produkte besitzen auch im Gewebebereich eine entsprechende Wirkung. So zeigt das Mischsalz von L-Glutamin (Beispiel 1) eine starke, dosisabhängige, bei sämtlichen untersuchten Dosen statistisch signifikante Wirkung, was bestätigt, daß diese Verbindung zumindest im Hinblick auf ihre Wirkung auf das Knorpelgewebe am interessantesten ist. Auch bei den Derivaten von D-Glutamin (Beispiel 2), L- und D,L-Prolin (Beispiele 32 und 34), L- Asparagin (Beispiel 10) und L-Lysin (Beispiel 25) läßt sich die vorerwähnte Aktivität bestätigen, während das Mischsalz von L-Cystein eine nicht dosisabhängige Wirkung zeigt, was einer weiteren eingehenden Untersuchung bedarf. L-Asparagin, das im zellulären Bereich eine verringernde Wirkung aufweist, bestätigt diese Tendenz nur trendmäßig in schwachem Umfang. Die Wirkung ist nicht dosisabhängig und nicht statistisch signifikant.

Auch im Fall von Natriummonofluorphosphat und Natriumfluorid werden die früheren experimentellen Befunde in dem Sinn bestätigt, daß die erstgenannte Verbindung zumindest im Knorpelbereich (zellulär und im Gewebe) keine Wirkung hervorzurufen scheint, während sich bei der zweiten Verbindung die senkende und somit toxische Wirkung bestätigt, was ihre weitverbreitete therapeutische Anwendung in Frage stellt.

B) In vivo-Aktivität Osteoporose durch Immobilisierung bei der Ratte

Auch noch so exakte und ausgeklügelte pharmakologische in vitro-Tests bringen zahlreiche Unsicherheiten mit sich, die darauf zurückzuführen sind, daß das in vitro-Versuchsmodell von der tatsächlichen physiologischen Realität relativ weit entfernt ist, was dazu führt, daß die biochemischen Reaktionen von noch im Prüfungsstadium befindlichen Substanzen mit großer Skepsis aufgenommen werden, solange keine Bestätigung durch in vivo-Tests vorliegt.

Unter den besonders bevorzugten Verbindungen der Erfindung, deren in vitro-Aktivität in bezug auf eine Stimulation der Synthese und des Einbaus von Glucosaminoglycanen im Zellbereich oder im Gewebebereich von besonderem Interesse ist, wurden einige auch in vivo einem Test unterworfen, der einer gut bekannten Funktionsstörung des osteoartikulären Gewebes sehr nahe kommt. Dieses unter der Bezeichnung Osteoporose bekannte Syndrom ist makroskopisch durch eine schwammartige Knochenkonsistenz gekennzeichnet, wobei im Knochengewebe sowohl radiologisch als auch histologisch gut identifizierbare Lücken vorliegen. Diese durch eine unregelmäßige Mineralisation aufgrund einer Stoffwechselstörung in der Knochenmatrix selbst hervorgerufene Situation führt bei den an dieser Krankheit leidenden Patienten zu einer Verminderung der Elastizität und der Beständigkeit gegen Beanspruchungen, wodurch sich häufig Knochenbrüche ergeben, die anschließend nur schwer vollkommen verheilen.

Um die in vitro-Ergebnisse auch in vivo zu bestätigen, wurden einige der erfindungsgemäß besonders bevorzugten Verbindungen zusammen mit einem Calciumsalz dem Osteoporosetest bei der Ratte unterzogen.

Gleichzeitig und in Verbindung mit einem Calciumsalz wurden auch Natriummonofluorphosphat, Natriumfluorid und eines der erfindungsgemäßen Produkte, das bei den in vitro- Tests eines senkende und nicht-stimulierende Wirkung zeigte, untersucht.

Zwei Gruppen von Tieren wurden auch mit dem L-Glutaminderivat (Beispiel 1) allein und mit einem Calciumsalz allein behandelt.

Nachstehend sind die Verfahrensweise, die bei der Bewertung in Betracht gezogenen Paramter und die erzielten Ergebnisse angegeben.

An weiblichen Ratten vom Sprague-Dawley-Stamm aus der Zucht Charles-River-Italia mit einem Alter von 2 Monaten und einem durchschnittlichen Körpergewicht von etwa 200 g wurden unter Äthernarkose und nach exakter Rasur Hautinzisionen an der gesamten linken hinteren Gliedmasse vorgenommen, um die Haut abzulösen. Der Ischiasnerv wurde isoliert und durchtrennt, ebenso wie der im vorderen Medialbereich des Schenkels gut sichtbare Femoralnerv. Der Fuß wurde exartikuliert und die Gliesmasse so festgesteckt, daß sie praktisch vollständig immobilisiert war. Diese Situation ruft bei der betreffenen linken hinteren Gliedmasse eine offensichtliche Osteoporose mit den bereits beschriebenen Folgen hervor. Die auf diese Weise vorbereiteten Tiere wurden oral mit den zu untersuchenden Substanzen bei täglicher Verabreichung über 60 Tage hinweg behandelt. Die Dosen entsprachen 0,35 mg/kg Fluor und 12,5 mg/kg Calcium. Das Calcium wurde in Form von Calciumchlorid verabreicht. Die Kontrollgruppe erhielt nur eine physiologische Lösung.

Nach 60 Tagen wurden die Tiere getötet. Das Schienbein der immobilisierten linken hinteren Gliedmasse und der entsprechenden rechten hinteren Gliedmasse wurde entnommen und einer Bewertung unterzogen. Jede Gruppe bestand aus 10 Tieren. Folgende Parameter wurden in Betracht gezogen:

1. Beständigkeit gegen Bruchbelastung mit dem horizontalen Dynamometer gemäß Amsler.
2. Prozentualer Calciumgehalt.
3. Länge

Die Ergebnisse sind in den Tabellen IV, V und VI zusammengestellt.

Anmerkung zu den Tabellen IV, V und VI:

In bezug auf die Bedeutung der Symbole t und p wird auf die Tabelle I verwiesen.

Aus den in Tabelle IV, V und VI zusammengestellten Ergebnissen geht hervor, daß bei den auf die vorstehend beschriebene Weise immobilisierten Gliedmaßen sich eine klare Osteoporose ergibt, die durch eine verminderte Bruchbelastung, durch eine Abnahme des prozentualen Calciumgehalts und durch eine Verkürzung des Knochens selbst charakterisiert ist.

Die Wirkung der erfindungsgemäßen Substanzen, insbesondere bei gemeinsamer Verabreichung mit Calciumsalzen, ist ebenfalls klar, da sich feststellen läßt, daß die Bruchbelastung der betroffenen Gliedmaßen bei den behandelten Tieren signifikant höher als bei den nicht behandelten Tieren ist, wobei sich bei den kontrolateralen rechten Schienbeinen keinerlei Festigkeitsunterschiede ergeben. Analoge Feststellungen gelten für den prozentualen Calciumgehalt. Unter Bestätigung der die Bruchbelastung betreffenden Ergebnisse bewirkt die Verabreichung der erfindungsgemäßen Mischsalze eine unveränderte Aufrechterhaltung des Mineral-Turnovers, so daß es nicht möglich ist, signifikante Unterschiede für den in Betracht gezogenen Parameter zwischen immobilisierten Schienbeinen und den kontrolateralen Schienbeinen innerhalb der Gruppen festzustellen. Dagegen ergeben sich hochsignifikante Mineralisationsunterschiede zwischen immobilisierten Kontrollschienbeinen und den Schienbeinen der mit den erfindungsgemäßen Produkten zusammen mit Calciumsalzen behandelten Versuchstiere.

Was jedoch die Länge betrifft, so läßt sich feststellen, daß sämtliche Knochen der immobilisierten Gliedmaßen unabhängig davon, ob sie zur Kontrollgruppe oder zur Behandlungsgruppe gehören, signifikant kürzer als die entsprechend kontrolateralen Knochen sind. Dieser Befund ist jedoch auf einen Fehler des experimentellen Modells zurückzuführen, bei dem die stillgelegte Gliedmasse in praktisch absoluter Bewegungslosigkeit gehalten wird, was drastische Wirkungen auf das Knochenwachstum der noch jungen und in rascher Entwicklung befindlichen Tiere hat.

Außerdem ergibt sich, daß unter den verglichenen Behandlungsarten nur diejenige, bei der das Natriummonofluorphosphat mit Calciumsalzen kombiniert ist, in der Lage ist, zumindest auf das Knochengewebe eine analoge Wirkung wie die erfindungsgemäßen Verbindungen auszuüben.

Calciumchlorid allein erweist sich als absolut unwirksam, während sich bei der Kombination Natriumfluorid/Calciumchlorid zwar ein positiver Trend für die in Betracht gezogenen Parameter ergibt, jedoch in keinem Fall Ergebnisse erzielt werden, die statistisch signifikant sind.

Von besonderem Interesse sind schließlich die bei Verabreichung des Produkts von Beispiel 1 ohne Kombination mit einem Calciumsalz erzielten Ergebnisse. Obgleich die bei kombinierter Verabreichung mit einem Calciumsalz erzielte Wirkung dabei nicht wiederholt werden kann, zeigt sich jedoch eine offensichtliche Aktivität sowohl im Hinblick auf die Normalisierung der Beständigkeit der Knochen der immobilisierten Gliedmaßen gegen eine Bruchbelastung im Vergleich zu den kontrolateralen Gliedmaßen als auch auf eine Erhöhung (und in diesem Fall statistisch signifikant) dieser Beständigkeit im Vergleich zu den immobilisierten Gliedmaßen der Kontrollgruppe. Auch in bezug auf den prozentualen Calciumgehalt ist die Wirkung zumindest in der Tendenz offensichtlich. Dieses Ergebnis läßt darauf schließen, daß das erfindungsgemäße Mischsalz mit großer Wahrscheinlichkeit dazu in der Lage ist, im physiologischen Bereich eine verbesserte Calciumverwertung, entweder endogen oder exogen, hervorzurufen.

Die Verbindungen der Beispiele 1 bis 48 und insbesondere die Mischsalze von Natriumchlorid und Monofluorphosphaten des L-Glutamins (Beispiel 1), D-Glutamins (Beispiel 2), L-Asparagins (Beispiel 10), L-Cysteins (Beispiel 13), L-Lysins (Beispiel 25), L-Prolins (Beispiel 32) und D,L-Prolins (Beispiel 34) können vorteilhafterweise in oralen pharmazeutischen Darreichungsformen und in Dosen, die einer Fluormenge von 5 bis 10 mg entsprechen, in Verbindung mit Calciumsalzen entsprechend einer Calciummenge zwischen 100 und 250 mg, bei der Behandlung sämtlicher Syndrome verabreicht werden, die sich aus einer mangelhaften Mineralisation des Knochengewebes (z. B. Osteoporose) ergeben. Ferner können sie als Adjuvantien bei der Behandlung von Knochentraumata oder im posoperativen Stadium nach chirurgischen Eingriffen am osteoartikulären Bindegewebe verwendet werden.

Versuchsbericht A. Einleitende Beschreibung der durchgeführten Versuche

Um den Unterschied zwischen den in vorliegender Anmeldung beschriebenen Produkten und denen der Druckschrift (US-A-40 64 138) herauszustellen, wurden die nachstehenden Versuche durchgeführt:

1. Herstellung des Monofluorphosphorsäuresalzes von L- Glutamin nach dem Verfahren von Schritt A in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung, jedoch unter den Bedingungen von Beispiel VIII der Entgegenhaltung.
2. Herstellung des Mischsalzes des im vorstehenden Punkt 1 beschriebenen Produkts mit Natriumchlorid gemäß Schritt B aus Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung.
3. Bewertung der in vitro-Wirkung der Produkte der vorstehenden Punkte 1 und 2 durch einen Test der auf der Stimulierung der Synthese von Glucosaminoglycanen (GAG) in Mausembryo-Fibroblastenkulturen durch ³⁵S-Aufnahme beruht. Dieser Test wurde bereits für die vorläufige Bewertung der erfindungsgemäßen Produkte verwendet und beschrieben. Das Mischsalz von Glutaminmonofluorphosphat mit NaCl gemäß Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung wurde als Vergleichsstandard verwendet.
4. Bewertung der in vitro-Wirkung eines Gemisches aus L- Glutamin, Natriumfluorid und Natriummetaphosphat im selben stöchiometrischen Verhältnis von Glutamin, Fluor und Phosphor, wie im vorstehenden Punkt 1 beschrieben, mit vorstehendem Test.
5. Bewertung der in vitro-Wirkung von Natriummonofluorphosphat, Natriumfluorid und Natriummetaphosphat wie vorstehend.

B. Beschreibung der Syntheseverfahren und der Ergebnisse der in vitro-Wirkungstests 1. Herstellung des Produkts gemäß vorstehendem Punkt A1

58,5 g L-Glutamin werden in 150 ml Wasser mit 20 g Monofluorphosphorsäure umgesetzt (da in Beispiel VIII der Entgegenhaltung die Umsetzungstemperatur und die Umsetzungszeit nicht offenbart sind, wurde die Umsetzung bei etwa 20°C durchgeführt und das Gemisch ca. 20 Minuten gerührt, bis die Lösung vollständig war).

Die so erhaltene Lösung wurde in 1500 ml eines Gemisches 1 : 1 (V/V) aus Methanol und absolutem Ethanol gegossen, wobei augenblicklich ein weißer Niederschlag entstand.

Das so erhaltene Produkt wurde filtriert, mit Methanol gewaschen und in einem Vakuumtrockenschrank bei 40°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Ein nicht hygroskopisches weißes Produkt mit erdiger Beschaffenheit wurde erhalten.

Die Elementaranalyse ergab nachstehende Ergebnisse:

C: 30,01%; H: 5,70%; N:14,59%; F: 4,68%; P: 8,02%.

Bemerkung: Die Elementaranalyse stimmt mit einer Verbindung aus zwei Molen Glutamin und einem Mol Monofluorphosphonsäure überein, deren berechnete Elementaranalysendaten wie nachstehend sind:

C: 30,62%; H: 5,65%; N:14,28%; F: 4,84%; P: 7,90%.

2. Herstellung des Produkts nach vorstehendem Punkt A2

37,7 g des vorstehend erhaltenen Produktes wurden gemäß Schritt B von Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung behandelt.

Im Unterschied zu den Ergebnissen von Beispiel 1 ist das erhaltene Produkt nach Acetonzugabe nicht kristallin, sondern dünn mit einer Neigung an den Gefäßwänden zu haften.

Nach Filtrieren und Trocknen bis zur Gewichtskonstanz wurde ein weiß-cremiges leicht-klebriges Pulver erhalten.

Die Elementaranalyse ergab nachstehende Ergebnisse:

C: 23,92%; H: 4,48%; N:10,88%; F: 3,63%; P: 6,14%.

Bemerkung: Die Elementaranalyse stimmt mit derjenigen des in Beispiel 1 beschriebenen Produktes der vorliegenden Erfindung überein, d. h.:

C: 23,18%; H: 4,41%; N:10,92%; F: 3,76%; P: 6,12%.

Weiterhin ergab die argentometrische Chloridbestimmung einen Wert von 101,12%; berechnet für dieselbe molekulare Zusammensetzung.

3. In vitro-Wirkung der gemäß den vorstehenden Punkten B1 und B2 erhaltenen Verbindungen

Die in B1 und B2 beschriebenen Produkte (nachfolgend B1 und B2 bezeichnet) wurden mit dem Mischsalz von L-Glutaminmonofluorphosphat und NaCl nach Beispiel 1 der Erfindung (nachfolgend E1) gemäß dem im experimentellen Teil der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Test verglichen.

Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen 1 und 2 dargestellt.

Aus den analytischen Daten der Produkte B1 und B2 und aus den Ergebnissen des in vitro-Tests der Glucosaminglycansynthese können die nachstehenden Schlüsse gezogen werden.

1. B1 und B2 haben dieselbe analytische Zusammensetzung wie die in Beispiel 1 der Anmeldung beschriebenen Produkte der Verfahrensstufen A bzw. B.
2. B1 ist nicht hygroskopisch im Gegensatz zu dem Produkt, das sich gemäß dem Syntheseschritt A aus Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung ergibt.
3. B2 unterscheidet sich morphologisch von dem Produkt E1, das bei der Synthese gemäß Schritt B aus Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung erhalten wird (B2 ist ein klebriges Pulver, E1 ist ein kristalliner Feststoff).
4. Die Wirkung von E1 auf die Synthese von GAG-Gewebe bestätigt eine statistisch signifikante Stimulierung, wohingegen B1 und B2 einen, wenn auch nicht statistisch signifikanten, negativen Trend aufweisen.
5. Die Wirkung von E1 auf die Synthese löslicher GAG bestätigt eine starke Stimulierung, die hoch signifikant ist.

B1 und B2 zeigen zwar eine positive Wirkung im Sinne der erfindungsgemäßen Aufgabe, sie ist jedoch bei weitem nicht so ausgeprägt wie die von E1: Sie ist bestenfalls signifikant im Falle von B1 und nur als Tendenz erkennbar im Falle von B2.

Aus den vorstehenden Ergebnissen wird ersichtlich, daß E1 und B2, obwohl sie dieselbe Zusammensetzung besitzen, unterschiedliche chemische Eigenschaften und biologische Wirkungen haben. Der Grund dafür ist wie folgt:

Die Herstellung der Verbindung nach Beispiel VIII der Entgegenhaltung erfolgt in einem wäßrigen Medium. Aus der Literatur (vgl. Anhang 1) ist bekannt, daß Monofluorphosphorsäure in einem wäßrigen Medium gemäß der Gleichung

H₂FPO₃ + H₂O → H₃PO₄ + HF

dissoziiert.

Die in den Tabellen 1 und 2 der vorliegenden Anmeldung angegebenen Daten zeigen, daß das Fluoridion einen stark unterdrückenden Effekt auf die Synthese von unlöslichen und löslichen GAG ausübt. Die wahrscheinlichste Erklärung für den Wirkungsunterschied zwischen E1 einerseits und B1 oder B2 andererseits ist daher, daß die Spezies, die in wäßrigem Medium unter den in der Entgegenhaltung beschriebenen Bedingungen mit der Aminosäure reagiert, nicht nur Monofluorphosphorsäure ist, sondern ein Gemisch von Monofluorphosphorsäure, Flußsäure und Phosphorsäure in relativen Verhältnissen, die hier nicht weiter bestimmt wurden. Daraus entsteht ein Gemisch des Fluorphosphats, Fluorids und Metaphosphats der umgesetzten Aminosäure gemäß dem Ausdruck:

X · AA-NH₃ + · HFPO₃^- + Y · AA-NH₃⁺ · F^- + Z · AA-NH₃⁺ · 1/3PO^3-₄

wobei AA eine Aminosäure bedeutet und X+Y+Z gleich 1 ist.

Dieses Gemisch, das nachstehend als MIX bezeichnet wird, hat unter der Bedingung, daß X+Y+Z=1 ist, dieselbe analytische Zusammensetzung wie E1, jedoch hängt sein biologisches Verhalten vom relativen Verhältnis der Fluorphosphat-, Fluorid- und Metaphosphationen ab.

Im Gegensatz dazu besitzt das Produkt E1 unter den in Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Bedingungen immer dieselbe Zusammensetzung, da die Umsetzung in einem wasserfreien Medium durchgeführt wird und deshalb keine Dissoziation der Monofluorphosphorsäure stattfindet. Die Entstehung von Fluoridionen, die eine unterdrückende Wirkung sowohl auf die Synthese löslicher GAG als auch im Gewebe unlöslicher GAG ausüben, ist nicht möglich.

Zur Bestätigung der vorstehenden Ausführungen wurde ein Gemisch aus Glutamin, NaF und NaPO₃ (Natriummetaphosphat) entsprechend der analytischen Zusammensetzung von B1, B2 und E1 hergestellt und seine Wirkung auf die GAG-Synthese im Vergleich zu Natriumfluorid und Natriummonofluorphosphat überprüft.

Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4 angegeben.

Zu diesen Ergebnissen ist folgendes zu bemerken:
Wie in vorliegender Anmeldung ausgeführt, übt das Fluoridion auf im Gewebe unlösliche sowie auf lösliche GAG in einer statistisch signifikanten Weise immer eine unterdrückende Wirkung aus. Im Gegensatz dazu bewirkt das Monofluorphosphation zumindest unter den untersuchten experimentellen Bedingungen einen positiven Trend. Der Unterschied in der Wirkung zwischen Natriummonofluorphosphat und Monofluorphosphatsalzen von Aminosäuren, bzw. den NaCl-Mischsalzen davon auf die Synthese von GAG ist somit der synergistischen Wirkung der verwendeten Aminosäuren zuzuschreiben.

Aus den in den Tabellen 3 und 4 angeführten Ergebnissen kann man im Vergleich zu den in den Tabellen 1 und 2 angegebenen in allen Fällen das Ausmaß der positiven Wirkung der Substanzen wie folgt angeben: E1<B1 und/oder <B2<MIX. Das Fluoridion besitzt die stärkste unterdrückende Wirkung, wohingegen das Monofluorphosphation einen leichten Stimulationstrend und das Phosphation überhäuft keinen relevanten Effekt aufweisen.

Diese Tatsache stimmt mit der Annahme überein, daß unter den Bedingungen des Beispiels VIII der Entgegenhaltung ein Salzgemisch entsteht, dessen Bestandteile die Aminosäure und Fluorid-, Monofluorphosphat- und Phosphationen in vom Anmelder nicht weiter bestimmten Verhältnissen sind.

Die MIX genannte Zusammensetzung in den Tabellen 3 und 4 stellt den Extremfall dar, bei dem das Monofluorphosphation völlig verschwunden ist und nur noch Fluorid und Phosphat verblieben sind. Die Wirkung von MIX und diejenige von B1 und/oder B2 erscheint völlig logisch und mit dem vorgeschlagenen Mechanismus übereinstimmend.

Das Gemisch MIX erzeugt die stärkste unterdrückende Wirkung, da in diesem Gemisch (die Aminosäuremenge ist dieselbe), die höchste Fluoridkonzentration vorliegt, welche offensichtlich nicht ausgeglichen oder neutralisiert wird durch die positive Wirkung des Monofluorphosphations.

In B1 und/oder B2 konkurriert die unterdrückende Wirkung des Fluoridions mit der stimulierenden Wirkung des Monofluorphosphations, während E1 nur und ausschließlich die auf das Monofluorphosphation zurückzuführende stimulierende Wirkung zeigt.

Tabelle III

Aktivität auf die Synthese von Glucosaminoglycanen im Gewebe (unlöslich) in in vitro- Kulturen von Mäuseembryo-Fibroblasten

Tabelle VIII

Aktivität auf die Synthese von löslichen Glucosaminoglycanen in in vitro-Kulturen von Mäuseembryo-Fibroblasten

Tabelle IX

Tabelle X

Claims

1. Aminosäure-monofluorphosphatsalze der allgemeinen Formel AA_nFPO₃ · 2 NaClin der AA eine der nachstehenden Aminosäuren bedeutet; Alanin (D; L; D, L), Arginin (L), Asparaginsäure (L; D; D, L), Asparagin (L; D; D, L), Cystein (L; D, L), Cystin (L; D), Glutaminsäure (L; D; D, L), Glutamin (L; D), Glycin, Histidin (L), Hydroxyprolin (trans-L), Leucin (L; D, L), Lysin (L), Methionin (L; D; D, L), Phenylalanin (L; D; D, L), Prolin (L; D; D, L), Serin (L; D; D, L), Threonin (L; D, L), Tryptophan (L; D; D, L), Tyrosin (L; D; D, L) und Valin (L; D; D, L) und
n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 oder 2 ist,
gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

2. Verbindungen der allgemeinen Formel AA_nFPO₃in der AA eine der nachstehenden Aminosäuren bedeutet:
Alanin (D; L; D, L), Asparaginsäure (L; D; D, L), Asparagin (L; D; D, L), Cystein (L; D, L), Glutaminsäure (L; D; D, L), Glutamin (L; D), Glycin, Hydroxyprolin (trans-L), Leucin (L; D, L), Methionin (L; D; D, L), Phenylalanin (L; D; D, L), Prolin (L; D; D, L), Serin (L; D; D, L), Threonin (L; D, L), Tryptophan (L; D; D, L), Tyrosin (L; D; D, L) und Valin (L; D; D, L) und
n eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 oder 2 ist.

3. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel AA_nFPO₃ · 2 NaClin der AA und n wie in Anspruch 1 definiert sind, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

4. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 2 als Zwischenprodukte der Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1.

5. Verwendung eines Salzes nach Anspruch 1 zur Behandlung von degenerativen Syndromen des Knochens.