PT84885B - Processo para a preparacao de sais mistos do iao de monofluorofasfato com aminoacidos e cloreto de sodio e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Processo para a preparacao de sais mistos do iao de monofluorofasfato com aminoacidos e cloreto de sodio e de composicoes farmaceuticas que os contem Download PDF

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PT84885B
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Francesco Makovec
Luigi Rovati
Rolando Chiste
Paolo Senin
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Rotta Research Lab
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Description

Memória descritiva referente à patente de invenção de ROTTA RESEARCH LABORATORIUM S.p.A. , italiana» industrial e comercial, com sede em S. Fruttuoso di Monza, Milão, Itália, (inventores: Paolo Senin, Rolando Chiste, Francesco Makovec e Luigi Rovati, residentes na Itália), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE SAIS MISTOS DO IÃO DE MONOFLUOROFOSFATO COM AMINOÃCIDOS E CLORETO DE SÓDIO E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM.
MEMÓRIA DESCRITIVA
A presente invenção refere-se a novos compostos activos em todos os síndromas relativos a deficiente mine ralização do estro ma ósseo da metáfise.
tecido ósseo é um tipo especial de tecido conjuntivo, onde a substância mineral, essencialmente de hidroxiapatite, se deposita sobre o estroma morfologicamente constituído por uma parte proteica (fibrilhas colagéneas), e por cadeias polissacarídicas, chamadas glucosaminoglicanos ou mucopolissacáridos, cujos principais componentes são unidades dissacarídicas, que contêm aminoaçdcares e ácidos urónicos , que são renovados em grau variável.
N.
A tríplice natureza do tecido ósseo, isto é, mineral, proteica e mucopolissacárida, faz com que os desmeta bolismos de qualquer um dos três tipos dos compostos fundamen tais induzam, inevitavelmente, disfunções também nos outros , com consequente aparecimento de doenças osteoarticulares.
A osteoporose, que se caracteriza por tecido ósseo poroso e vacuolar, com reduzida resistência geral e,por tanto, fácil de fracturar, é produzida, como fenómeno macroscópico, por uma deficiente mineralização da matriz osteóide. Porém, a etiologia do fenómeno é, frequentemente, muito complexa, pois pode residir quer numa deficiência enzimática no turnover dos glucosaminoglicanos, quer num desequilíbrio dos compostos da parte mineral, quer ainda num desequilíbrio dos factores hormonais que regulam, directa ou indirectamente, o metabolismo ósseo. Muitas vezes, todos estes factores acabam por estar envolvidos simultaneamente, com interacção recí proca, criando um quadro patológico muito complexo e difícil de resolver.
Para estes casos, têm sido propostas e utilizadas várias terapias} entre elas conta-se o emprego de hormo nas, como a calcitonina e as paratormonas, vitamina D associa da a sais de cálcio, ou ainda a administração simples ou combinada de elementos que constituem a morfologia da parte mine ral do osso, como o flúor, cálcio e o fósforo.
Mas em nenhum caso os resultados se mostraram completamente satisfatórios já que, muito provavelmente, os agentes terapêuticos utilizados possuem tendência para reequi librar ou corrigir apenas uma parte das causas que se encontram na base do estado patológico, sendo os efeitos terapêuti cos insatisfatórios ou efémeros.
Os compostos, objecto do presente invento, constituem uma nova e original proposta terapêutica para o tratamento dos estados patológicos atrás referidos.
Um dos objectos da presente invenção é consti tuido por novos sais do ião monofluorofosfato com aminoácidos, possuindo a seguinte fórmula geralí
AA FPOq n 3 em que AA é um aminoácido da série L;D e D,L e n são um intei ro igual a 1 ou 2. Os compostos abrangidos pela fórmula geral atrás referida mostram-se estáveis apenas na ausência de humi dadej quando expostos ao ar, esses compostos apresentam uma elevada higroscopicidade e, num espaço de tempo entre 10 minu tos e algumas horas (conforme o aminoácido utilizado) e a humidade relativa do ambiente, transformam-se numa massaou óleo viscosos, absolutamente inúteis para qualquer utilização.
Verificou-se que é possível obter a estabilização dos referidos compostos - à excepção dos casos de proli na e de hidroxiprolina, cujos produtos de co-cristalização com fluorofosfato e cloreto de sódio são, porém, higroscópicos - por meio de um processo de co-cristalização com cloreto de sódio, que permite a obtenção de compostos cristalinos estáveis dentro de amplos limites de temperatura e humidade,sen do, assim, perfeitamente utilizáveis para qualquer tipo de aplicação prática, incluindo a preparação de formas farmacêu) ticas orais e parenterais para uso terapêutico.
Um segundo objecto da invehção é, assim, cons tituido por sais mistos com a seguinte fórmula geral:
AA FP0Q.2NaCl n 3 em que AA representa um aminoácido da série e D,L, co-cristalizado com o ião de monofluorofosfato e o cloreto de sódio e n são um número inteiro, com valor 1 ou 2, que representa o coeficiente estequiométrico segundo o qual o aminoáci do entra na constituição do retículo cristalino.
Através dos ensaios experimentais a seguir • apresentados, verifica-se que a actividade in vitro dos com e
. postos segundo o invento, na estimulação da síntese dos glu- 3 -
cosaminoglicanos, tanto celulares como tissulares, 4 de especial interesse para o reequilíbrio de eventuais disfunções da parte mucopolissacárida do estroma ósseo; nota-se igualmente que a actividade daqueles compostos in vivo, em associação com sais de cálcio, revela no tratamento da osteoporose por imobilização, uma acção muitíssimo eficaz na regularização e normalização da estrutura mineral do tecido ósseo.
Os aminoácidos usados na preparação dos sais simples e mistos, segundo a presente invenção, foram os seguintes :
ALANINA (D;L;D,L), ARGININA (l) , ÁCIDO ASPÁRTICO (L;D,D,L), ASPARGINA (L;D;D,L), CISTEÍNA (L;D,L), CISTINA (L;D), ÁCIDO GLUTÂMICO (L;D;D,L), GLUTAMINA (L;D), GLICINA, HISTIDINA (l), HIDROXIPROLINA (trans L), LEUCINA (L;D,L), LISINA (l), METIONINA (L;D;D,L), FENILALANINA (L;D;D,L) , PROLINA (L;D;D,L), SERINA (L;D;D,L), TREONINA (L;D,L), TRIPTOFANO (L;D;D,L), TIROSINA (L;D;D,L) e VALINA (L;D;D,L).
O método geral de síntese dos sais mistos con siste em duas passagens» a primeira é a preparação do monofluorofosfato do aminoacido prèviamente escolhido e a segunda a estabilização do próprio sal através da co-cristalização com cloreto de sódio, para obtenção dos compostos reivindicados no presente pedido de patente.
A primeira passagem consiste essencialmente na suspensão do aminoacido antecipadamente escolhido num solvente polar não oxidrilado, como a acetona metil-etilcetona , tetrahídrofurano, acetonitrilo, em quantidades variáveis entre 5,5 e 7,5 vezes o volume (de preferência 6,5) do peso do aminoacido a salificar; no arrefecimento da massa de reacção a uma temperatura compreendida entre 0 e -10°C (de preferência ~5°C)» no gotejamento da quantidade estequiométrica do ácido monofluorofosfórico, sob agitação, num espaço de tempo entre 2 e 4 horas (de preferência 3), na conservação da massa • de reacção sob agitação, durante um período variável entre 18
e 48 horas (de preferência 24), a uma temperatura equivalente âs atrás indicadas, depois na filtração da substância sólida em suspensão e, por fim, na secagem do fluorofosfato assim obtido, no vácuo, a uma temperatura não superior a 50°C (de preferência 45°C.
A segunda passagem consiste, essencialmente , nas seguintes operaçães» dissolução, sob agitação, do cloreto de sódio seco, numa quantidade de água destilada variável entre 3 e 5 vezes (de preferência 4) o peso do próprio cloreto de sódio, a uma temperatura entre 50 e 7θ°0 ( de preferência 6O°C); seguidamente, conservação da temperatura entre 35 e 45°C (de preferência 40°C); adicionamento, sempre sob agitação, da quantidade estequiométrica do fluorofosfato escolhido antecipadamente, mantendo a temperatura constante até à comple ta dissolução; descida da temperatura até entre 25 e 35°C (de preferência 30°c) e, sempre sob agitação e a temperatura cons tante, precipitação do sal misto desejado, adicionando-se um agente precipitante líquido solúvel na água, onde os produtos a isolar possuam uma solubilidade não superior a 0,l$> (p/V) .
Como precipitante líquido podem utilizar-se , por exemplo, a acetona, a metil-etilcetona, o etanol, o aceto nitrilo ou o tetrahidrofurano, adicionados num volume 8-12 ve zes superior (de preferência 10), ao volume de água destilada, usada na dissolução dos sais. Ê conveniente adicionar-se o precipitaiite no espaço de 5-7 horas (de preferência 6), mantendo-se depois a suspensão do sal misto pretendido ainda durante um período entre 12 e 24 horas (de preferência 18), sob lenta agitação e a uma temperatura ente 25 e 35°C (de preferência 30)» para permitir, tanto a completa precipitação como o correcto engrossamento dos cristais. Decorrido o tempo necessário, arrefece-se a massa de reacção até uma temperatura entre 0 e 10°C (de preferência 5) e filtra-se o sal misto que, depois, é dessecado numa estufa com circulação de ar, até ao peso constante. Obtêm-se produtos cristalinos brancos, ou branco-creme, com um ponto de fusão não definível mas, no
- 5 en-
tanto, resistentes a temperaturas superiores a 200°C.
No Quadro A apresentam-se as cafacterísticas analíticas dos produtos de acordo com o invento, assim como os respectivos rendimentos de reacção. A seguir descrevem-se pormenorizadamente os métodos de síntese dos produtos de maior interesse.
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QUADRO A
Caracteríaticas analíticas dos produtos da invenção
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Num reactor com a capacidade útil de 500 ml, munido de termómetro e agitador mecânico, dissolvem-se em 45 ml de água destilada, 11.05 g de cloreto de sódio (0,189 moles), sob agitação e à temperatura de 60°C· Depois de obtida a completa solubilização, baixa-se a temperatura para 4o°C e adicionam-se, sob agitação e o mais rapidamente possível, 37»07 g (0,09457 moles) de monofluorofosfato de L-glutamina. Conserva-se a massa de reacção sob agitação, a 40°C, até se obter completa solubilização do sal.
Nessa altura, baixa-se a temperatura para 3θ° C e inicia-se o gotejamento, sob lenta agitação, de 450 ml de acetona, com consequente separação, na suspensão, dos cristais de sal misto.
gotejamento da acetona fica concluído no es paço de 6 horas, e depois a massa cristalina em suspensão deve permanecer sob agitação a 30°C, durante mais 18 horas. Arrefece-se até 5°C, filtra-se por sucção e desseca-se até ao peso constante, numa estufa com circulação de ar e a 50°C.
produto é branco, cristalino e completamente estável nas normais condições de ambiente. Obtidos: 43,3 g (87,9%); /’^°= + 5,9 (c=ó,3 em Η£θ)
Microanálise em: C^^C1„FH„Jtf^Na^O^P C% H% N% F% P%
Cal. 23,58 4,36 11,01 3,73 6,08
Enc. 23»18 4,41 10,92 3,76 6,12
Título argentométrico dos cloretos: 98,96%
Exemplo2
Sal misto de mono fluo ro fosfato d e D-G-lutamina, com cloreto de sódio
- FASE A: Preparação do monofluorofosfato de D-Glutamina:
- 13 Exemplo 1
Sal misto de monofluorofosfato de L-G-lutamina com cloreto de sódio
- FASE A» Preparação do monofluorofosfato de L-glutamina:
Num reactor com a capacidade útil de 500 ml , munido de termómetro, agitador mecânico, funil de gotas e ligação para passagem do gás, suspendem-se 29,2 g (0,2 moles) de L-glutamina em 190 ml de acetona pré-anidrifiçada por destilação de cloreto de cálcio.
Numa corrente de azoto seco (ou de outro gás inerte desde que seja anidro) e sob agitação, põe-se a suspensão a -5°C, por meio de um banho refrigerador. Mantendo-se estas condições constantes, dá-se então início ao gotejamento de 10 g (0,l moles) de ácido monofluorofosfórico anidro, que fica concluído no espaço de 3 horas. Para assegurar a completa salificação, deixa-se a massa de reacção sob agitação durante 24 horas (mantendo-se as condições constantes, ou seja: agitação, temperatura a -5°C> fluxo de azoto seco), e em seguida filtra-se rapidamente, para isolar o sal em suspensão.
Depois, o painel húmido, cuidadosamente espre mido, é dessecado numa estufa de vácuo, a uma temperatura não superior a 45°C . Obtêm-se 37»θ7 g (94,57%) de um produto bran co ou branco-creme, extremamente higroscópico. 0 monofluorofodfato de L-glutamina, quando exposto ao ar, transforma-se , no espaço de 10-15 minutos, dependendo das condições de humidade e temperatura ambientes, numa massa semi-sólida práticamente não utilizável e quimicamente não identificável.
Assim, o produto deve ser usado imediatamente depois de dessecado, ou conservado no vácuo, em presença de agentes anidrificantes.
- FASE B: Estabilização por co-cristalização com NaCl:
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Procede-se tal como no exemplo 1, mas em vez de L-Glutamina utiliza-se D-Glutamina.
Obtêm-se 36,45 g (93%) de um produto branco ou branco-creme, extremamente higroscópico.
- FASE Β: Estabilização por co-cristalização com NaCl:
Procede-se tal como no exemplo 1 e utiliza-se
36,45 g de D-Glutamina monofluorofosfato (0,093 moles) e 10,87 g de NaCl (0,186 moles).
ambiente.
Resulta um produto branco, cristalino, comple tamente estável nas condições normais de _ -20
Obtidos: 4o,6 g (85,8%) ; = +6 h2o)
Microanálise em; C-^Cl^H^N^Na^P C%
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TÍtulo argentométrico dos cloretos: 98,37%
Exemplo 10
Sal misto de monofluorofosfato de L-Aspargina sódio com cloreto de
- FASE A: Preparação do monofluorof osf ato de L-Aspargina:
procedimento é o mesmo do exemplo 1, empregando-se:
L-Aspargina: 26,4 g (0,2 moles)
Acetona anidra: 170 ml
Todos os outros reagentes e condições de síntese mantêm-se sem alteração.
Obtêm-se 34,46 g (94,62%) de um produto branco ou branco-creme, extremamente higroscópico.
- FASE B: Estabilização por co-cristalização com NaClí procedimento é igual ao do exemplo 1, utili zando-se:
L-Aspargina monofluorofosfato: 34,46 g (0,0946 moles)
Cloreto de sódio : 11,06 ml (0,1892 moles)
HgO s 45 ml
Acetona :450 ml
Todos os outros reagentes e condições de síntese mantêm-se inalterados.
Ex e mplo 13
Sal misto de monofluorofosfato de L-Cisteína com cloreto de sódio
FASE At Preparação do monofluorofosfato de L-Cisteína5
Procede-se do mesmo modo indicado no exemplo
1, utilizando-se:
L-Cisteína í 24,2 g (0,2 moles)
Tetrahidrofurano anidro : 145 ml
Todos os outros reagentes e condições de síntese mantém-se sem alteração.
Obtêm-se 32,89 g (96,09/°) de um produto branco ou branco-creme, extremamente higroscópico.
- FASE B: Estabilização por co-cristalização com NaCl:
0 procedimento é igual ao do exemplo 1, com
utilização de:
L-Cisteína monofluorofosfato : 32,89 s (0,0961 moles)
Cloreto de sódio : 11,24 s (,01923 moles)
H2° e 4 45 ml
Tetrahidrofurano : 495 ml
Mantêm-se todos os outros reagentes e condições de sintese sem alteração.
Resulta um produto branco, cristalino, comple tamente estável nas normais condições ambientais.
Obtidos: 37,59 g (85,18%) = +7,2 (C»10 em HC1 IN)
Microanálise em:
C6C12PH16N2Na2°7PS2 C% H% N% F% P% S%
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Título argentométrico dos cloretos: 99,21% (jf)s Obtém-se o tetrahidrofurano anidro por refluxo, durante horas, sobre um filamento de sódio, seguido de destila ção.
Exemplo 25
Sal misto de monofluorofosfato de L-Lisina com cloreto de sódio “ FASE At Preparação do monofluorofosfato de L-Lisina:
Procede-se conforme referido no exemplo 1 e utiliza-se»
L-Lisina : 15 g (0,1 moles)
Metil-etilcetona anidra : 99 ml
Mantêm-se inalterados todos os outros reagentes e condições de síntese.
Obtêm-se 23,90 S (97,10%) de um produto branco ou branco-creme, extremamente higroscópico.
- FASE B; Estabilização por co-cristalização com NaCl:
Procede-se como no exemplo 1 e emprega-ses
L-Lisina monofluorofosfato i 23,90 g (0,0971 moles)
Cloreto de sódio : 11,35 g (0,19^2 moles)
H20 : 45 ml
Metil-etilcetona :450 ml
Todos os outros reagentes e condições de síntese permanecem sem alteração.
Resulta um produto branco, cristalino, comple tamente nas condições normais de ambiente.
Obtidos: 31>83 g (90,3%)? /1X7*° x +lk (c=7> ,3 em h20)
Microanálise em: C6C12PH16 N2Na205P C% H% N% F% P%
Cal. 19>85 4,44 7,72 5,23 8,53
Enc. 20,10 4,4o 7,83 5,36 8,50
Titulo argentometrico dos cloretos: 98,44%
Exemplo 32
Sal misto de monofluorofosfato de L-Prolina com cloreto de sódio
- FASE A: Preparação do monofluorofosfato de L-Prolina:
Procede-se conforme referido no exemplo 1 e utiliza-se:
L-Prolina
Acetona anidra
Todos os outros sem alteração.
I 23 g (0,2 moles) : 150 ml reagentes e condições de síntese permanecem
Obtêm-se 31>76 g (96,18%) de um produto branco ou branco-creme, extremamente higroscópico.
- FASE B: Tentativa de estabilização por co-cristalização com NaCl:
procedimento é igual ao do exemplo 1, com
utilização de:
L-Prolina monofluorofosfato : 31,76 g (0,0962 moles)
Cloreto de sódio : 11,24 g (0,1924 moles)
H2° 1 45 ml
Acetona :450 ml
Mantêm-se inalterados todos os outros reagentes e condições de síntese.
Resulta um produto branco, branco-creme, amor foj por sua vez extremamente higroscópico, só conservável no vácuo e em presença de agentes anidrificantes.
Obtidos: 36,59 g (85,1%) (c=i ,1 em HC1 0,5N)
Microanálise em: C1OC12FH 20N2Na2°7P C% H% N% F% P%
Cal. 26,86 4,51 6,27 4,25 6,93
Enc. 26.38 4.58 6,15 4.21 6.86
TÍtulo argentométrico dos cloretos: 99,07%
Exemplo 34
Sal misto de monofluorofosfato de D,L-Prolina com cloreto de sódio ” FASE A; Preparação do monofluorofosfato da D,L-Prolina:
Procede-se tal como no exemplo 32 mas, em vez da L-Prolina, emprega-se a D,L-Prolina.
Obtêm-se 31,83 g (96,39%) de um produto branco ou branco-creme, extremamente higroscópico,
- FASE B: Tentada a estabilização por co-cristalização com
NaCl:
Procede-se como no exemplo 32, empregando-se
31,83 g (θ,°953 moles) de D,L-Prolina monofluorofosfato • (0,0964 moles) e 11,27 g de cloreto de sódio (0,1928 moles).
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- 18 Resulta um produto branco, branco-creme, amor fo, por sua vez extremamente higroscópico e só conservável no vácuo e em presença de agentes anidrificantes.
Obtidos: 37»24 g (86,4%)
Microanálise em: C^QCl„FH„oN„Na„O„P C% H% N% F% P%
Cal. 26,86 4,51 6,27 4,25 6,93
Enc. 26,62 4,53 6,14 4,22 6,80
Título argentométrico dos cloretos: 98,12%
X X X X X
As actividades biológicas que os produtos, ob jecto do presente invento, conseguem efectuar no tecido osteo cartilagíneo, foram avaliadas tanto ”in vitro como in vivo”. Descrevem-se a seguir os resultados obtidos e os métodos utilizados.
A) Actividade in vitro
Al) Estimulação da síntese dos glucosaminoglicanos em culturas de fibroblastos de embrião do rato - Avaliação efec--~--tuada por uptake de___S.
Sabe-se que os fibroblastos embrionários são as células, cujas diferenciações sucessivas dão origem aos vá rios tipos de tecido conjuntivo} por isso, essas células cons tituem um modelo experimental muito útil na avaliação prelimi nar dos eventuais efeitos farmacobiológicos (quer positivos, quer negativos), provocados por uma ou mais substâncias sobre os tecidos provenientes desse substrato celular, entre os quais o tecido osteocartilagíneo.
Apresentam-se aqui os métodos e as resultan35 tes de um ensaio relativo ao uptake de S nos mucopolissacáridos (glucosaminoglicanos) sulfatados (principalmente sulfato de condroitina), tanto a nível celular como extracelular,
ζ e onde, consequentemente, o uptake” de é proporcional à velocidade de sintetização dos GAG pelos fibroblastos.
No momento oportuno, prepararam-se culturas primárias de fibroblastos de embriões de ratos (estirpe 6 stCrl), retirados da mãe no 18* dia de gravidez; a preparação das culturas efectuou-se por dissociação mecânica e enzimática em mistura de Tripsina Versene (Microbiological Associates) dos embriões.
meio de cultura foi o de Eagle modificado por Dullbecco e completado com 15% de soro fetal de vitelo.
A atmosfera de incubação era constituída por 5% de anidrido carbónico em ar a 37°θ· Decorridas 24 horas de inoculação, substituiu-se o meio por outro contendo o fármaco 3 rç em estudo e o precursor radioqctivo (Na^ para medição da síntese dos glucosaminoglicanos solúveis e tissulares. Dei xou-se incubar durante mais 24 horas e depois separou-se o meio de cultura (contendo os GAG solúveis), dos fibroblastos (contendo os GAG tissulares).
Os GAG solúveis foram isolados do meio de cul tura, por precipitação com uma solução gelada de ácido triclo roacético a 5% em H^O, enquanto que os fibroblastos de resíduo, que continham os GAG tissulares, foram solubilizados com DIMILUME ou VERSENE, após repetidas lavagens com soro fisioló 35 gico. Contou-se a quantidade de S incorporada quer nos GAG solúveis, quer nos tissulares, pelos métodos de cintilação normais, e indicou-se em c.p.m. (pancadas por minuto).
Efectuaram-se cinco repetições para cada amos tra, a fim de permitir suficiente avaliação estatística.
Os resultados obtidos com os produtos, objecto do presente invento, estão apresentados nos Quadros 1 e 2.
Notas aos Quadros 1 e 2
Avaliou-se o significado estatístico pelo tes te t de Student; assim, nas colunas assinaladas com £ apresentam-se os valores de ’*t” de ^tudent para comparação entre os valores considerados, e nas colunas marcadas com p , a probabilidade estatística de os valores comparados pertencerem à mesma população; portanto, a indicação N.S. significa que, estatisticamente, os valores comparados não se podem con siderar diferentes. Porém, considera-se que duas séries de va lores são estatisticamente diferentes, quando p, dependente do valor de t e dos graus de liberdade, é de 0,05.
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QUADRO 2: ACTIVIDADE DOS PRODUTOS DO INVENTO SOBRE A SÍNTESE DOS GLUC OSAMINOGLICANOS SOLÚVEIS EM CULTURAS IN VITRO DE FIBROBLASTOS DO EMBRIÃO DO RATO
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Como se pode verificar pelo Quadros 1 e 2, al guns dos produtos, objecto de presente invenção, estimulam a síntese dos glucosaminoglicanos sulfatados, tanto eso- como endocelulares em culturas in vitro de fibroblastos do embrião do ratinho. Tal estimulação efectuada por alguns deles 4 altamente significativa na avaliação estatística (vejam-se os exemplos 1-2-10-13-25-32-34), e esse facto assume especial importância, se se considerar que entre as causas fundamentais que contribuem para o aparecimento de doenças degenarativas do tecido osteoarticular, tais como, por exemplo, a artrose e a osteoporose, se podem salientar tanto uma síntese reduzida como um aumento da degradação dos mucopolissacáridos (glucosa minoglicanos) (e, sobretudo, do sulfato de condroitina), contidos nesses tecidos.
Assim, é obvio que as substâncias que conseguirem estimular a síntese mucopolissacárida, tanto no interior como no exterior das células, podem exercer um efeito po sitivo no tratamento das disfunções atiús indicadas.
Ê interessante notar que o monofluorofosfato de sódio, na mesma concentração molar dos produtos do invento, não consegue estimular significativamente a síntese dos GAG, tanto solúveis comó tissulares; o fluoreto de sódio, também na mesma concentração, exerce mesmo uma acção redutora, cujo significado tóxido relativamente aos fibroblastos parece evid ent e.
mesmo se aplica aos outros compostos, objec to do invento, que não estimulam de maneira apreciável, ou re duzem mesmo a síntese dos GAG do embrião de rato.
Finalmente, há que assinalar que o sal misto da L-glutamina com monofluorofosfato e cloreto de sódio (EXEM PLO 1), manifesta a maior actividade estimulante, tanto sobre os GAG solúveis como sobre os tissulares; esta actividade man tém o seu significado estatístico, mesmo se se reduzir a con28
cent ração do produto no banho de cultura em 50%·
A2) Estimulação da síntese dos glucosaminoglicanos em culturas de cartilagem articular do rato - Avaliação efectuada ------por uptake de o
Conforme jó anteriormente referido, os fibroblastos são células embrionárias indiferenciadas onde, durante o desenvolvimento fetal, se originam todos os tecidos de génese mesenquimatosa, geralmente conhecidos pela designação genérica de tecido conjuntivo} estas células mostram-se muito úteis no screening preliminar, pois são relativamente fáceis de manipular e conseguem assegurar uma boa reprodutibili dade experimental} não possuem, porém, as características mor fológicas de um tecido e, por isso, os resultados obtidos em fase preliminar sobre culturas deste tipo ”in vitro” não apre sentam valor absoluto, devendo ser confirmados em culturas in vitro de verdadeiro tecido conjuntivo} isto foi efectuado, tomando-se em consideração, tanto os produtos de maior in teresse do presente invento (Exemplos 1-2-10-13-25-32-34), co mo os que actuam reduzindo significativamente a síntese dos GAG, tissulares e solúveis (EXEMPLO 6), assim como o monofluo rofosfato de sódio e o fluoreto de sódio como comparados.
Apresentam-se a seguir os métodos utilizados; os resultados obtidos estão indicados no Quadro 3·
Sacrificaram-se ratazanas (fêmeas) com o peso médio de 220 g, por trauma craniano e retiraram-se as cápsulas articulares cartilagíneas das epífises femurais proximais (cabeças do fémur). Incubaram-se grupos de 6 amostras em 5 ml de meio MEM modificado por Dulbecco, da Microbiological Associates completado com 15% de soro fetal de vitelo, 5θθ unidades/ml de penicilina G potássica e 5θθ de sulfato de es treptomicina a 37°C, durante 16 horas em atmosfera contendo 15% de C02.
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Prèviamente adicionaram-se ao meio 5 uci/ml o e de Na2 “^SO^ (actividade específica 92 uci/mmoles), e os vários produtos em estudo, nas concentrações determinadas.
Decorrido o período de incubação, lavaram-se as amostras, trataram-se com Mistura de Tripsina Versene (500 mg de Tripsina 1/250 + 200 mg de Versene/litro de solução salina compensada, sem cálcio nem magnésio), durante uma hora a 37°C, voltou-se a lavá-las repetidamente com soro fisiológico, solubilizou-se cada uma delas em 0,5 ml de HC1 6N a 95° C durante 3 horas e, depois de se lhes adicionar 20 ml de Dimilume Packard, submeteram-se a análise por cintilação, a fim de se determinar - através da quantidade de incorporada nos glucosaminoglicanos do tecido cartilagíneo - o efeito dos pro dutos, objecto do presente invento, sobre a sínrese mucopolissacarídica (veja-se o Quadro 3)·
Nota ao Quadro 3;
Quanto ao significado de t e £, veja-se a nota aos Quadros 1
- 30 QUADRO 3: ACTIVIDADE DE ALGUNS PRODUTOS DO INVENTO SOBRE A SÍNTESE DOS GLUCOSAMTNOGLICANOS, EM CULTURAS «IN VITRO DE CARTILAGEM ARTICULAR DA RATAZANA
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Os resultados apresentados no Quadro 3 confir mam, a nível tissular e, pelo menos qualitativamente, as observações já anteriormente descritas, a nível eso- e endocelu lar sobre culturas in vitro de fibroblastos embrionários.
Os produtos mais activos na estimulação da síntese dos GAG celulares confirmam a sua actividade também a nível tissular; assim, o sal misto da L-glutamina (EXEMPLO 1) revela uma potente actividade, dependendo da dose, estatisticamente significativa com todas as doses experimentadas, confirmando ser, pelo menos do ponto de vista da actividade sobre o tecido cartilagíneo, a molécula de maior interesse entre as que foram referidas. Também os derivados da D-glutaminafEXEMPLO 2), L e D,L prolina (EXEMPLO 32-34), L-aspargina (EXEMPLO 10) e L-lisina (EXEMPLO 25), confirmam as actividades anteriormente observadas, enquanto o sal misto da L-cisteína revela um efeito não dependente da dose, que necessitaria de ser mais aprofundado; pelo contrário, a L-aspargina, que exerce uma actividade redutora a nível celular, confirma esta tendência só como tal e, de resto, muito escassa, não de pendente da dose, portanto, não significativa sob o ponto de vista estatístico.
Também no caso do mono fluo ro fosfato de sódio e do fluoreto de sódio confirmam-se as observações experimentais anteriores,no sentido de que o primeiro não parece provocar efeito, pelo menos a nível cartilagíneo (celular e tissular), enquanto o segundo confirma uma acção redutora e, portanto, tóxica, que parece colocar um ponto de interrogação quanto à sua aplicação terapêutica, largamente difundida.
B) Actividade in vivo
Osteoporose de imobilização na ratazana:
Qualquer tipo de teste farmacológico in vitro, por muito rigoroso e aperfeiçoado que seja, dá sempre azo a numerosas incertezas, pela circunstância evidente de o modelo experimental in vitro estar muito longe da efectiva
- 33 realidade fisiológica} por consequência, este tipo de veredic to bioquímico relativamente a substâncias em fase de estudo, deve ser sempre considerado com muita reserva, se não estiver confirmado pelos devidos testes in vivo.
Alguns dos compostos de mais interesse do pre sente invento, possuidores de actividades in vitro extremamente interessantes, tanto a nível celular como tissular, por estimularem a síntese e a incorporação dos glucosaminoglicanos, foram experimentados também in vivo, num teste que reproduzia de muito perto uma disfunção bem conhecida, que ataca o tecido osteoarticular} esse síndroma, conhecido pela designação de osteoporose, distingue-se macroscopicamente pela consistência esponjosa dos ossos, com lacunas no tecido osteóide, bem perceptíveis, tanto radiológica como histológicamen te. Esta situação, provocada por uma mineralização irregular da matriz osteóide - em consequência de um desmetabolismo da própria matriz osteóide - provoca, nos ossos dos indivíduos atingidos pela doença, tanto uma diminuição da elasticidade como da resistência ao esforço, com incidência consequentemen te elevada de fracturas, que depois dificilmente se curam na totalidade.
Para se observar também in vivo os resultados observados pelos testes in vitro, alguns dos produtos de maior interesse referidos no invento em associação com um sal de cálcio, foram submetidos ao teste da osteoporose induzida na ratazana.
Simultaneamente, efectuaram-se também ensaios, sempre em associação com um sal de cálcio, do monofluorofosfa to de sódio, fluoreto de sódio e um dos produtos do presente invento que, nos testes in vitro, revelaram actividade redu tora e não estimulante.
Trataram-se também dois grupos de animais só com o derivado da L-glutamina (EXEMPLO 1) e só com um sal de cálcio.
- 34 ~ ·.....y A seguir apresenta-se o método utilizado, os pa râmetros considerados na avaliação final e os resultados obti dos.
Ratazanas (fêmeas) Sprague Dawley, provenientes da criação Charles-River, Itália, com 2 meses de vida e um pe so médio aproximado de 200 g, com anestesia por éter e cuidadosa tricotomia, foram submetidos a incisão cutânea do todo o membro posterior esquerdo, para se poder despegar a pelei iso lou-se o nervo ciático, que foi cortado, tal como o nervo femural, bem visível na região anteromedial da coxa. 0 pé foi desarticulado e o membro embrulhado, ficando uma posição de quase completa imobilização. Esta situação provocou uma nítida osteoporose no membro posterior esquerdo, com as consequên cias já referidas. Os animais assim preparados foram tratados diariamente, por via oral, com as substancias em ensaio, durante 60 dias. Utilizaram-se doses correspondentes a 0,35 mg/ kg de flúor e a 12,5 mg/kg de cálcio. Administrou-se o cálcio sob a forma de cloreto de cálcio, enquanto o grupo de controlo recebeu apenas soro fisiológico.
Decorridos 60 dias, sacrificqram-se os animeis e extraiu-se a tíbia do membro imobilizado (posterior esquerdo), para se efectuar a avaliação, assim como a tíbia do membro contralateral correspondente (posterior direito).
Todos os grupos eram constituídos por 10 animais cada um.
Os parâmetros considerados foram:
1. Resistência à carga de rotura, por meio de um dinamómetro horizontal de AMSLER.
2. Teor percentual de cálcio.
3» Comprimento.
Os resultados estão indicados nos Quadros 4, 5 e 6.
Notas aos Quadros 4, 5 e 6:
Relativamente ao significado de t e £, veja-se a Nota ao Quadro 1 ·
QUADRO 4: RESISTÊNCIA À CARGA DE ROTURA DE TÍBIAS PERTENCENTES A UM MEMBRO IMOBILIZADO DE RATAZANAS TRATADAS COM AS SUBSTÂNCIAS DO INVENTO - COMPARAÇÃO COM AS TÍBIAS CONTRALATERAIS, NÃO IMOBILIZADAS, E COM AS TÍBIAS DE MEMBROS IMOBILIZADOS DE ANIMAIS NÃO TRATADOS, CONSIDERADOS COMO CONTROLO PARA A OSTEOPOROSE
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QUADRO 6t COMPRIMENTO (em mm) DE TÍBIAS DO MEMBRO IMOBILIZADO DE RATAZANAS TRATADAS COM AS SUBSTÂNCIAS DO INVENTO - COMPARAÇÃO COM AS TÍBIAS CONTRALATERAIS NÃO IMOBILIZADAS E COM AS TÍBIAS DE MEMBROS IMOBILIZADOS DE ANIMAIS NÃO TRATADOS, CONSIDERADOS COMO CONTROLO PARA A OSTEOPOROSE.
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Pelos resultados indicados nos Quadros 4, 5 e 6, verifica-se, nos ossos dos membros imobilizados pelo processo atrás referido, o aparecimento de uma nítida osteoporose, caracterizada por menor resistência â carga de rotura, re dução do teor percentual do cálcio existente e encurtamento do próprio osso.
efeito das substâncias, objecto do presente invento, é igualmente evidente, sobretudo quando associadas a sais de cálcio, pois verifica-se que a resistência à carga de rotura dos ossos provenientes dos referidos membros dos animais tratados e significativamente superior à dos animais não tratados, sendo de molde a não mostrar qualquer diferença em relação à resistência das tíbias contralaterais direitas. 0 mesmo se aplica ao teor percentual de cálcio. De facto, e con firmando os resultados relativos à carga de rotura, a adminis tração dos sais mistos referidos no invento consegue manter inalterado o turnover mineral, de modo que não é possível distinguir diferenças significativas, quanto ao parâmetro con siderado, entre tíbias imobilizadas e as contralaterais, no interior dos gruposj em contrapartida, são altamente significativas as diferenças de mineralização entre as tíbias imobilizadas dos animais de controlo e as dos animais tratados com os produtos do invento, associados a sais de cálcio.
Porém, quanto ao comprimento, verifica-se que todos os ossos dos membros imobilizados, quer pertencentes
I aos grupos de controlo, quer aos de tratamento, se apresentam consideravelmente mais curtos do que os correspondentes contralaterais. Este facto é, porém, atribuível a deficiência in trínseca do modelo experimental, que obriga o membro embrulha do a uma imobilidade pràticamente absoluta, com gravíssimas consequências no desenvolvimento ósseo de indivíduos ainda jó vens ou em fase de rápido desenvolvimento.
Ha que salientar ainda que, entre as terapias • consideradas como termo de comparação, só a que combina o mo39
nofluorofosfato de sódio com sais de cálcio consegue desenvol ver, pelo menos no tecido ósseo, uma actividade análoga â dos compostos do invento.
cloreto de cálcio, por si só, mostra-se absolutamente ineficaz, enquanto a associação de fluoreto de so dio/cloreto de cálcio, embora apresente uma tendência positiva nos parâmetros considerados, em nenhum caso demonstra resultados absolutamente aceitáveis, sob o ponto de vista de si gnifiçado estatístico.
Finalmente, os resultados obtidos pela administração do produto descrito no Exemplo 1, não associado ao sal de cálcio, mostram-se de especial interesse; de facto, em bora não consiga produzir um efeito igual ao obtido em associação, demonstra, porém, uma nítida actividade, tantã pela normalização da resistência dos ossos dos membros imobilizados à carga de rotura, em comparação com a dos contralaterais, como pelo aumento - e aqui de um modo estatisticamente significativo - dessa resistência em relação à dos membros imobili zados dos animais no grupo de controlo. Também a nível de teor percentual do cálcio, o efeito é nítido, pelo menos a nível de tendência, e este resultado leva a concluir que, muito provavelmente, o sal misto em questão é susceptível de provocar a nível fisiológico, uma melhor utilização do cálcio, tan to endógeno como exógeno.
Os compostos indicados nos Exemplos 1-48 mas, de preferência, os sais mistos de cloreto de sódio e ião de monofluorofosfato com L-glutamina (EXEMPLO 1), D-glutamina (EXEMPLO 2), L-aspargina (EXEMPLO 10), L-cisteína (EXEMPLO 13), L-lisina (EXEMPLO 25), L-prolina (EXEMPLO 32), D,L-proli na (EXEMPLO 34), podem ser administrados com vantagem, sob formas farmacêuticas orais e em dosagens correspondentes a uma quantidade de flúor entre 5 e 10 mg e em associação com sais de cálcio equivalentes a uma quantidade de cálcio entre 100 e 250 mg - em todos os síndromas relativos a uma deficien f v;
te mineralização do tecido osteóide (como, por exemplo, a osteoporose), como coadjuvantes no tratamento de traumas ósseos, ou no período pós-operatório de intervenções cirúrgicas em te eidos osteoarticulares.

Claims (2)

  1. Processo para a preparação de sais mistos do ião de monofluorofosfato com aminoácidos e cloreto de sódio , com a fórmula geral:
    AA FP0o.2 NaCl n 3 na qual AA é um aminoácido da série L;D; e D,L e n um inteiro com o valor 1 ou 2, caracterizado pelo facto de compreender os passos de:
    a) Salificar o aminoácido previamente escolhido com o ácido monofluorofosfórico, num solvente orgânico não oxidrilado, separando, da massa de reacção, o sal simples com a fórmula geral:
    AA FPO„ n 3
    b) Dissolução do sal simples em água, em presença de cloreto de sódio, e nova precipitação do sal misto com cloreto de sódio, pela adição de um solvente solúvel na água.
    Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o solvente orgânico não oxidrilado, utilizado na fase a), ser escolhido entre o grupo constituído por metil
    -etiloetona, tetrahidrofurano e acetonitrilo.
    - 3* -
    Processo de acordo com as reivindicações 1 ou
  2. 2, caracterizado por a reacção de salificação ser efectuada pela adição de ácido monofluorofosfórico a uma suspensão do aminoácido escolhido antecipadamente no solvente, mantendo-se a temperatura entre O e -1O°C, sob agitação, sendo o fluorofosfato assim obtido separado por filtração e dessecado no vá cuo, a uma temperatura não superior a 50°C ·
    - 4s -
    Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por na fase b) o monofluorofosfato de aminoácido ser adicionado a uma solução aquosa de clore to de sódio, sob agitação, conservando-se a temperatura entre 35 e 45°C, adicionando-se para a precipitação do sal misto, um dos solventes escolhido no grupo formado por acetona, metil- etilc etona , etanol, acetonitrilo e tetrahidrofurano.
    - 5» Processo para a preparação de composições far macêuticas caracterizado por se incorporarmm ingrediente activo um composto quando preparado de acordo com as reivindica ções anteriores em combinação com um veículo farmaceuticamen- 42 te aceitável»
    A requerente declara que o desta patente foi depositado na Itália em 20 sob o n? 67.419 A/86.
PT84885A 1986-05-20 1987-05-18 Processo para a preparacao de sais mistos do iao de monofluorofasfato com aminoacidos e cloreto de sodio e de composicoes farmaceuticas que os contem PT84885B (pt)

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