DE3707172A1 - Kreatinasegen, rekombinante dna, enthaltend dieses und verfahren zur herstellung von kreatinase unter verwendung eines stammes, welcher die rekombinante dna enthaelt - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Kreatinasegen, welches von einem Bakterienstamm vom Genus Flavobacterium abstammt, eine rekombinante DNA, welche das Gen enthält, und ein Verfahren zur Herstellung von Kreatinase unter Verwendung eines Stammes, welcher die rekombinante DNA enthält.

Kreatinase (auch als "Kreatinamidinohydrolase" bezeichnet) ist ein Enzym, welches auf Kreatin einwirkt und dieses zu Harnstoff und Sarcosin gemäss der nachfolgenden Reaktionsgleichung hydrolysiert.

Kreatinase ist ein sehr brauchbares Enzym für die Verwendung bei der quantitativen Analyse von Kreatin in Kreatin enthaltenden Substanzen, wie Serum, Urin und dergleichen.

Bisher hat man Kreatinase hergestellt, indem man einen Bakterienstamm, der beispielsweise vom Genus Flavobacterium war und der eine kreatinasebildende Fähigkeit hatte, in Gegenwart von Kreatinin, Kreatin oder Gemischen daraus, kultivierte und dann Kreatinase aus dem kultivierten Produkt (US-PS 40 39 384) gewann.

Bei dem vorerwähnten Herstellungsverfahren für Kreatinase ist es jedoch erforderlich, teures Kreatinin oder Kreatin zu dem Kulturmedium als unabdingbare Bedingung zuzugeben und deshalb ist dieses Verfahren wirtschaftlich wenig vorteilhaft und die Herstellung mühevoll.

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben deshalb zahlreiche Untersuchungen angestellt, um das vorerwähnte Problem zu lösen. Sie haben gefunden, dass man dann, wenn man eine rekombinante DNA herstellt, indem man eine DNA mit einem genetischen Code für Kreatinase in eine Vektor-DNA einführt und die rekombinante DNA zu einem Stamm vom Genus Escherichia gibt, unter Ausbildung eines Stammes, welcher kreatinasebildende Fähigkeiten aufweist, und den Stamm in einem Medium kultiviert, man Kreatinase wirksam herstellen kann, ohne dass man Kreatinin, Kreatin oder eine Mischung daraus zu dem Medium geben muss.

Die Erfinder haben weitere Untersuchungen über einen Kreatinasegen, der von einem Stamm vom Genus Flavobacterium stammt, durchgeführt und es ist ihnen gelungen, das Kreatinasegen zu isolieren, welches aus einem Stamm vom Genus Flavobacterium gewonnen wurde und dessen Struktur erstmalig aufzuklären. Basierend auf diesen Ergebnissen und Erfolgen wurde die vorliegende Erfindung gemacht.

Erfindungsgemäss wird ein Kreatinasegen zur Verfügung gestellt, welcher die in Fig. 2A und 2B gezeigte Grundsequenz aufweist, sowie eine neue rekombinante DNA, die hergestellt wurde, indem man eine DNA mit einer genetischen Codierung für Kreatinase in eine Vektor-DNA einführte. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer Kreatinase, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Stamm vom Genus Escherichia, der eine rekombinante DNA enthält, die hergestellt wurde, indem man eine DNA mit einem genetischen Code für Kreatinase in eine Vektor-DNA einführte und der eine kreatinasebildende Fähigkeit aufweist, in einem Kulturmedium kultivierte, worauf man anschliessend die Kreatinase aus dem kultivierten Produkt sammelt.

In der Zeichnung stellt

Fig. 1 eine Restriktionsenzym- Spaltungskarte des rekombinanten Plasmids pKLS511DNA dar,

Fig. 2A und 2B beschreiben zusammen die Grundsequenz des erfindungsgemässen Kreatinasegens, und

Fig. 3A und 3B beschreiben zusammen die Aminosäuresequenz des aus dem erfindungsgemässen Kreatinasegen erhaltenen Polypeptids-

Die Erfindung wird nachfolgend ausführliche beschrieben.

Zunächst wird die Herstellung der DNA mit einer genetischen Codierung für Kreatinase beschrieben.

Flavobacterium U-188-Stamm (FERM P-Nr. 2922) wird nach der Methode, wie sie in US-PS 40 39 384 beschrieben wird, unter Erhalt eines Kulturproduktes kultiviert. Das kultivierte Produkt wird mit einer Geschwindigkeit von beispielsweise 3000 Upm oder mehr und vorzugsweise 8000 bis 10000 Upm während 5 Minuten oder mehr, vorzugsweise während 10 bis 15 Minuten, zentrifugiert, wobei man Bakterienzellen vom Flavobacterium U-188-Stamm erhält.

Aus den Bakterienzellen kann man eine Chromosom-DNA beispielsweise nach der Methode von Saito und Miura (Biochem. Biophys. Acta., Bd. 72, Seite 619 (1963)) oder der Methode von K.S. Kirby (Biochen. J., Bd. 64, Seite 405 (1956)) erhalten.

Dann wird diese chromosome DNA aufgeschlossen, indem man sie mit einem Restriktionsenzym, welches ein kohäsives Ende ausbildet, wie Sau 3AI (hergestellt von Toyo Boseki K.K.) bei einer Temperatur von 30°C oder mehr, vorzugsweise 37°C, bei einer Enzymkonzentration von 1 bis 10 Einheiten/ml während eines Zeitraums von 20 Minuten oder mehr und vorzugsweise 1 bis 2 Stunden behandelt, unter Erhalt einer Mischung von verschiedenen Chromosom-DNA-Fragmenten.

Aus dieser so erhaltenen DNA-Fragmentmischung wird eine DNA-Fragmentmischung beispielsweise durch übliche Agarosegel-Elektrophorese hergestellt. Sie wird dann weiter durch Phenolextraktion oder andere Reinigungsmethoden gereinigt und wird dann durch eine Ethanolausfällung oder eine andere Konzentrationsmethode konzentriert. Man erhält auf diese Weise ein gereinigtes DNA-Fragmentgemisch, in welchem ein DNA-Fragment, welches ein genetisches Code für Kreatinase enthält, vorhanden ist.

Als Vektor-DNA kann man jede Vektor-DNA verwenden. Beispiele für die Vektor-DNA sind Plasmid-Vektor-DNA, Bakteriophagen-Vektor-DNA und dergleichen.

Plasmid pBR322-DNA (hergestellt von Bethesda Research Laboratories Co., Ltd.) wird hierbei besonders bevorzugt.

Die vorerwähnte Vektor-DNA wird durch Behandlung mit einem Restriktionsenzym, wie Bam HI (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) unter Ausbildung eines kohäsiven Endes bei einer Temperatur von 30°C oder mehr, vorzugsweise bei 37°C, und bei einer Enzymkonzentration von 10 bis 1000 Einheiten/ml während eines Zeitraums von 1 Stunde oder mehr und vorzugsweise 2 bis 3 Stunden unter Erhalt einer aufgespaltenen Vektor-DNA aufgeschlossen.

Anschliessend wird das DNA-Fragmentgemisch, welches eine genetische Code für Kreatinase enthält und aus Flavobacterium U-188 stammt und in der oben erwähnten Weise erhalten wurde, mit der vorerwähnten aufgeschlossenen Vektor-DNA vermischt und die Mischung wird mit E. coli- DNA-Ligase (hergestellt von New England Bio Labs Co.), T4-DNA-Ligase (hergestellt von Boehringer Mannheim Co.) oder dergleichen, vorzugsweise mit der T4-DNA-Ligase, bei einer Temperatur von 4 bis 37°C und vorzugsweise 4 bis 16°C bei einer Enzymkonzentration von 1 bis 100 Einheiten während eines Zeitraums von 1 Stunde oder länger und vorzugsweise 6 bis 24 Stunden unter Erhalt einer rekombinanten DNA behandelt.

Unter Verwendung dieser rekombinanten DNA werden dann beispielsweise E. coli K-12-Stämme, vorzugsweise E.coli HB101 (ATCC 33694), E. coli DHI (ATCC 33849), E. coli X-1776 (ATCC 31244) oder dergleichen, die frei von der allgemeinen Sammlung der American Type Culture Collection erhältlich sind, einer Transformation oder Transduktion unterworfen, unter Erhalt der entsprechenden transformierten oder transduzierten Stämme.

Die Transformation kann man nach der Methode von D.M. Morrison (Methods in Enzymology, Bd. 68, Seiten 326-331 (1979)) durchführen. Die Transduktion kann man nach der Methode von B. Hohn (Methods in Enzymology, Bd. 68, Seiten 299-309 (1979)) durchführen.

Dann wird ein Stamm mit kreatinasebildender Fähigkeit aus den so gebildeten Stämmen ausgewählt und auf diese Weise erhält man einen Stamm vom Genus Escherichia, der eine rekombinante DNA enthält, die erhältlich ist, indem man eine DNA, welche einen Kreatinase-Code-Gen enthält, in eine Vektor-DNA einführt und der eine kreatinasebildende Fähigkeit aufweist.

Aus dem so erhaltenen Stamm kann man eine neue rekombinante DNA erhalten, z. B. nach der Methode von P.Guerry et al (J. Bacteriology, Bd. 116, Seiten 1064-1066 (1973)) oder der Methode von D.B. Clewell (J. Bacteriology, Bd. 110, Seiten 667-676 (1972)).

Anschliessend wird die vorerwähnte, gereinigte, neue rekombinante DNA abgebaut, indem man sie beispielsweise mit einem Restriktionsenzym Sal I (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) bei einer Temperatur von 30°C oder mehr, vorzugsweise bei 37°C, und mit einer Enzymkonzentration von 5 bis 20 Einheiten/ml während eines Zeitraums von 0,5 bis 2 Stunden, vorzugsweise etwa 1 Stunde, behandelt, unter Erhalt einer DNA-Fragmentmischung.

Aus der so erhaltenen DNA-Fragmentmischung kann man eine DNA, die den Kreatinase-Code-Gen enthält, nach der Methode von T. Maniatis et al ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Seiten 173-178 (1982)) isolieren.

Kreatinase wird dann hergestellt, indem man den vorerwähnten Stamm vom Genus Escherichia verwendet, der eine rekombinante DNA enthält, die erhältlich ist, indem man eine DNA, die den Kreatinase-Code-Gen enthält, in eine Vektor-DNA einführt und eine kreatinasebildende Fähigkeit aufweist, verwendet. Dies wird vorzugsweise soweit wie möglich mittels eines Flüssigkulturverfahrens ausgeübt, obwohl übliche Festkulturverfahren auch anwendbar sind.

Als Kulturmedium zum Kultivieren des verwendeten Stammes kann man beispielsweise ein Medium verwenden, das hergestellt wurde, indem man ein oder mehrere anorganische Salze (wie primäres Kaliumphosphat, sekundäres Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Ferrichlorid, Ferrisulfat, Mangansulfat und dergleichen) zu ein oder mehreren Stickstoffquellen, wie Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maismeische, Sojabohnenextrakt, Weizenkleieextrakt und dergleichen, gibt und gewünschtenfalls Zuckersubstanzen, Vitamine und dergleichen, soweit erforderlich, zugibt.

Der Anfangs-pH-Wert des Mediums wird vorzugsweise auf 7 bis 9 eingestellt. Die Kultivierung wird bei einer Temperatur von 30 bis 42°C und vorzugsweise etwa 37°C während 4 bis 24 Stunden und vorzugsweise 6 bis 8 Stunden durchgeführt und zwar mittels einer Belüftungs-Bewegungs- Eintauchkultur, Schüttelkultur, Stehkultur oder dergleichen.

Nach Beendigung der Kultivierung kann man Kreatinase aus dem kultivierten Produkt in üblicher Weise, wie sie zum Sammeln von Enzymen bekannt ist, gewinnen.

Beispielsweise werden die Bakterienzellen mit Ultraschallwellen zerstört oder einer Mahlbehandlung unterworfen. Man kann auch das beabsichtigte Enzym mittels eines bakteriolytischen Enzyms, wie einem Lysozym und dergleichen, extrahieren. Ebenso ist es möglich, die Bakterienzellen zu schütteln oder in Gegenwart von Toluol und dergleichen stehen zu lassen, wodurch die Zellen sich selbst verdauen und das beabsichtigte Enzym aus den Zellen freigegeben wird. Nach der Entfernung von Feststoffen aus der erhaltenen Flüssigkeit durch Filtration oder Zentrifugation und gegebenenfalls Entfernen von Nucleinsäuren durch Behandlung mit Streptomycinsulfat, Protaminsulfat oder Mangansulfat, wird das Filtrat durch Zugabe von Ammoniumsulfat, Alkohol, Aceton oder dergleichen fraktioniert. Der erhaltene Niederschlag wird gesammelt, gegen Wasser dialysiert und dann im Vakuum getrocknet, unter Erhalt einer rohen Enzymprobe.

Aus der so erhaltenen rohen Probe kann man eine hochreine Probe der Kreatinase erhalten, indem man entweder die rohe Probe durch eine Adsorptions-Elutionsmethode unter Verwendung von Ionenaustauschmaterial, wie DEAE-Cellulose (Diethylaminoethylcellulose, hergestellt von Brown Co., USA), DEAE-Sephadex^R (Diethylaminoethyl-Sephadex, hergestellt von Pharmacia Co., Schweden), QAE-Sephadex (hergestellt von Pharmacia Co., Schweden) und dergleichen, verwendet oder indem man es durch eine geeignete Kombination einer Gelfraktionsmethode unter Verwendung von Sephadex G-200 (hergestellt von Pharmacia Co., Schweden), Sephalose 6B (hergestellt von Pharmacia Co., Schweden) und dergleichen, Adsorptions-Eluierungsmethode unter Verwendung von Hydroxyappatit (Biogel HT, hergestellt von BIORAD Co., USA), Elektrophorese, unter Verwendung von Polyacrylamidgel etc., reinigt.

Die physikochemischen Eigenschaften der nach den vorerwähnten Reinigungsverfahren gewonnenen, gereinigten Kreatinase sind die gleichen wie von Kreatinase, wie sie in US-PS 40 39 384 beschrieben werden:

(1) Wirkung und Substratspezifität:

Dieses Enzym ist in der Lage Kreatinin zu Harnstoff und Sarcosin zu hydrolysieren K _m (Michaelis-Konstante) für Kreatinin ist 4,0 × 10^-2 Mol (37°C, pH 7,7). Es zeigt keine Wirkung auf Kreatinin.

(2) Optimaler pH und stabiler pH-Bereich:

Der optimale pH-Wert beträgt 7,7 und der stabile pH-Bereich beträgt 5,0 bis 9,0.

(3) Methode zum Messen der Enzymaktivität:

Zu 0,8 ml einer 0,1 M Kreatinlösung werden 0,1 ml 0,3 M Phosphatpuffer (pH 7,7) und 0,1 ml einer Lösung des Enzyms mit einer entsprechenden Konzentration gegeben und die erhaltene Mischung wird während 10 Minuten bei 37°C umgesetzt. Dann gibt man 2 ml einer 2% (G/V) p-Dimethylaminobenzaldehyd-Lösung (hergestellt durch Auflösen von 2 g p-Dimethylaminobenzaldehyd in 100 ml 99,5%-igem Ethanol, Zugabe von 15 ml konzentrierter Salzsäure und Verdünnung der Mischung mit destilliertem Wasser auf die 2-fache Menge) zu und die erhaltene Mischung lässt man 30 Minuten bei 25°C stehen. Dann wird die Absorption (O.D.-Wert) bei 435 mµ mit einem fotoelektrischen Colorimeter gemessen. Die Menge des gebildeten Harnstoffs wird anhand einer Kalibrierungskurve für Harnstoff, die man zuvor hergestellt hat, festgestellt. Die Menge des Enzyms, die erforderlich ist, um 1 Mikromol Harnstoff pro Minute bei 37°C zu bilden, wird als eine Einheit bezeichnet.

(4) Optimaler Temperaturbereich:

Dieser liegt im Bereich von 20 bis 45°C. Eine Temperatur von etwa 37°C wird besonders bevorzugt.

(5) Wärme- und pH-Stabilität:

Es verliert die Aktivität bei einem pH-Wert oberhalb 10. Es verliert die Aktivität vollständig innerhalb von 10 Minuten bei 50°C.

(6) Inhibierung, Aktivierung und Stabilisierung:

Es wird durch p-CMB und Quecksilberchlorid inhibiert. Es wird durch Glutathion (reduzierte Form), L-Cysteinhydrochlorid und 2-Mercaptoethanol stabilisiert.

(7) Molekulargewicht:

Das Molekulargewicht dieses Enzyms wird durch Gelfiltration über Sephaded G-200 (hergestellt von Pharmacia Co., Schweden) nach der Methode von Andrews (P. Andrews, Biochem. J., 96, 595 (1965)) bestimmt. Es beträgt etwa 60.000. Die Säule wird mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 8,0), enthaltend 0,1 M NaCl und 1 mM 2-Mercaptoethanol, ins Gleichgewicht gebracht und die Eluierung wird bei 5°C durchgeführt.

Aus dem vorhergehenden geht hervor, dass man beim Kultivieren des erfindungsgemässen Stammes vom Genus Escherichia, der eine rekombinante DNA enthält, die erhältlich ist, indem man Kreatinasegen einführt, in einem Kulturmedium, Kreatinase mit hoher Effizienz herstellen kann, ohne dass man Kreatin, Kreatinin oder eine Mischung davon zugeben muss. Deshalb ist das erfindungsgemässe Verfahren technisch äusserst vorteilhaft.

Die Erfindung wird ausführlicher in dem nachfolgenden Beispiel, das keineswegs limitierend auszulegen ist, beschrieben.

Beispiel (1) Herstellung von Chromosom-DNA von Flavobacterium U-188-Stamm:

Flavobacterium U-188 (ATCC 31200, FERM-P Nr. 2922) wurde in 100 ml T-Y-Medium (1% (G/V) Bacto-trypton (hergestellt von Difco Co.), 0,5% (G/V) Bacto-Hefeextrakt (hergestellt von Difco Co.), 0,5% (G/V) NaCl (pH-Wert 7,2) inokuliert und 8 Stunden einer Schüttelkultur bei 30°C unterworfen, wobei man ein kultiviertes Produkt erhielt.

Dieses kultivierte Produkt wurde in üblicher Weise mit einer Geschwindigkeit von 10.000 Upm während 10 Minuten zentrifugiert, unter Erhalt von 0,5 g eines feuchten Bakterienkörpers, aus dem man Chromosom-DNA nach der Methode von Saito und Miura (Biochem. Biophys. Acta, Bd. 72, Seite 619 (1963)) erhielt.

Anschliessend wurden 0,2 mg der erhaltenen Chromosom-DNA und 1,45 Einheiten des Restriktionsenzyms Sau 3AI (hergestellt von Toyo Boseki K.K.) mit 10 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung, enthaltend 50 mM NaCl, 10 mM MgSO₄ und 1 mM Dithiothreitol (pH 7,4) vermischt und 1 Stunde bei 37°C umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch in üblicher Weise unter Verwendung von 0,7% (G/V) Agarosegel (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) elektrophoretisiert und ein DNA-Fragment mit einer Grösse von 4 bis 8 Kb (kilo base pair) wurde nach der Methode von R.C.A. Yang et al (Method in Enzymology, Bd. 68, Seiten 176-182 (1979)) eluiert unter Erhalt eines Eluats. Das Eluat wurde mit Phenol in üblicher Weise extrahiert und das Extrakt wurde mit Ethanol ausgefällt, wobei man 10 µg Chromosom-DNA vom Flavobacterium U-188-Stamm, aufgeschlossen durch Sau 3AI, erhielt.

(2) Herstellung der neuen rekombinanten Plasmid- pKLS511-DNA:

Zu 50 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung, enthaltend 100 mM NaCl und 10 mM MgSO₄ (pH 7,4) wurden 10 µg von Plasmid-pBR322-DNA (hergestellt von Bethesda Research Laboratories) und 40 Einheiten Restriktionsenzym Bam HI (hergestellt von Takara Shuzo K.K.) gegeben. Die Mischung liess man 2 Stunden bei 37°C reagieren unter Erhalt einer aufgeschlossenen Lösung. Die aufgeschlossene Lösung wurde einer Phenolextraktion unterworfen und dann in üblicher Weise mit Ethanol ausgefällt unter Erhalt einer Plasmid-pBR322-DNA, aufgeschlossen durch Bam HI.

Dann wurden 10 µg dieser pBR322-DNA (Plasmid, aufgeschlossen durch Bam HI), 10 g Chromosom-DNA-Fragment von Flavobacterium U-188, aufgeschlossen mittels Sau 3AI, erhalten gemäss (1), und zwei Einheiten T4-DNA-Ligase (hergestellt von Boehringer Mannheim) zu 66 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung, enthaltend 6,6 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreitol und 10 mM ATP (pH 7,5) gegeben und dann 10 Stunden bei 16°C umgesetzt, unter Erhalt einer verbundenen DNA.

Anschliessend wurde nach der Methode von D. M. Morrison (Methods in Enzymology, Bd. 68, Seiten 326-331 (1979)) E. coli HB101-Stamm (ATCC 33694), zuvor mit Calciumchlorid behandelt, mit der oben erwähnten verbundenen DNA transformiert unter Erhalt von 3200 stransformierten Stämmen, die amicillinveständig und tetracyclinempfindlich sind.

Ob die so transformierten Stämme eine Kreatinaseaktivität aufwiesen oder nicht, wurde in folgender Weise bestimmt:

Jeder Stamm wurde in 5 ml T-Y-Medium, enthaltend 0,2% (G/W) Kreatin (hergestellt von Sigma Co.) und 50 µg/ml Ampicillin inokuliert und 24 Stunden bei einer Temperatur von 30°C kultiviert, unter Erhalt einer Flüssigkultur, die dann 10 Minuten mit 3500 Upm zentrifugiert wurde, unter Erhalt von feuchten Bakterienkörpern. Nach dem Suspendieren der Bakterienkörper in 1 ml einer 10 µM Phosphatpufferlösung (pH 7,0), enthaltend 1% (G/V) Kreatin, wurden 20 Mikroliter Toluol zugegeben und die Mischung wurde 1 Stunde bei 37°C umgesetzt und dann 5 Minuten bei 100°C wärmebehandelt, unter Erhalt einer Flüssigkeit, in welcher die Umsetzung abgebrochen war.

Dann wurde die Flüssigkeit 10 Minuten in üblicher Weise mit 3500 Upm zentrifugiert, unter Erhalt einer Reaktionsflüssigkeit. Zu der Reaktionsflüssigkeit wurden 0,1 ml von jeweils 0,3 Einheiten/ml Sarcosinoxidase (hergestellt von Seishin Seiyaku K.K.), 0,07% (G/V) 4-Aminoantipyrin, 0,2% (G/V) 2,4-Dichloro-phenolsulfonierte Lösung und 70 Einheiten/ml Peroxidase (hergestellt von Toyo Boseki K.K.) gegeben. Dabei wurde die Reaktionsflüssigkeit rot und es handelte sich dabei um einen transformierten Stamm mit Kreatinaseaktivität.

Die so erhaltenen E. coli HB101 (pKLS511), die ein transformierter Stamm mit Kreatinaseaktivität sind, wurden im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Japan, unter FERM BP-992 gemäss dem Budapester Vertrag hinterlegt.

(3) Isolierung von rekombinanter Plasmid-pKLS511-DNA:

E. coli HB101 (pKLS511)-Stamm wurde 18 Minuten bei 37°C in einem Medium, enthaltend 1% (G/V) Trypton, 0,5% (G/V) Hefeextrakt und 0,5% (G/V) NaCl, vorkultiviert. 20 ml der Vorkultivierungs-Flüssigkeit wurden in 1 l des gleichen Mediums wie oben inokuliert und dann 3 Stunden bei 37°C einem Schüttelkultur-Verfahren unterworfen. Anschliessend wurden zu der Kulturflüssigkeit 0,2 g Chloramphenicol gegeben und die Flüssigkeit wurde dann bei der gleichen Temperatur während 20 Stunden kultiviert, unter Erhalt einer Kulturflüssigkeit.

Die so erhaltene Kulturflüssigkeit wurde in üblicher Weise mit 10.000 Upm während 10 Minuten unter Erhalt von feuchten Bakterienkörpern zentrifugiert. Nachdem man die feuchten Bakterienkörper in 20 ml eines 50 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 25% (G/V) Saccharose, suspendiert hatte, wurden 10 mg Lysozym, 8 ml 0,25 M EDTA-Lösung (pH 8,0) und 8 ml einer 20%-igen (G/V) Lösung von Natriumdodecylsulfat zugegeben und die erhaltene Mischung wurde 30 Minuten bei 60°C zum Zwecke einer Bakteriolyse gehalten. Auf diese Weise erhielt man eine bakteriolysierte Flüssigkeit.

Zu der bakteriolysierten Flüssigkeit wurden 13 ml 5 M NaCl-Lösung gegeben und die Mischung wurde bei 4°C während 16 Stunden behandelt und dann in üblicher Weise mit 15.000 Upm während 30 Minuten zentrifugiert, unter Erhalt einer Extraktlösung. Die Extraktlösung wurde einer Phenolextraktion und einer Ethanolausfällung in üblicher Weise unterworfen, wobei man einen Niederschlag erhielt.

Nach dem Trocknen des Niederschlags unter vermindertem Druck in üblicher Weise wurde der Niederschlag in 6 ml einer 10 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung (pH 7,5), enthaltend 1 mM EDTA, aufgelöst und dann wurden 6 g Cäsiumchlorid und 0,2 ml einer 10 mg/ml Ethidiumbromidlösung zugegeben und die erhaltene Mischung wurde einer Gleichgewichts- Dichte-Gradientenzentrifugierung mittels einer Ultrazentrifuge bei 39.000 Upm während 42 Stunden in üblicher Weise unterworfen und die rekombinante Plasmid-pKLS511-DNA isoliert.

Nach dem Entfernen von Ethidiumbromid mittels n-Butanol wurde die rekombinante Plasmid-pKLS511-DNA gegen 10 mM Tris- salzsäure-Pufferlösung (pH 7,5), enthaltend 1 mM EDTA, dialysiert, unter Erhalt von 950 µg gereinigter, rekombinanter Plasmid-pKLS511-DNA.

(4) Bildung einer Restriktionsenzym-Spaltungskarte von rekombinanter Plasmid-pKLS511-DNA:

Die gemäss (3) isolierte rekombinante Plasmid-pKLS511-DNA wurde durch Wirkung der Restriktionsenzyme Eco RI, Sal I, Bgl II und Xho I (alle hergestellt von Takara Shuzo K.K.) unter Erhalt einer Restriktionsenzym-Spaltungskarte aufgeschlossen.

Das Aufschlussverfahren für das rekombinante Plasmid mittels Sal I wird nachfolgend als ein Beispiel für das Aufschlussverfahren unter Verwendung der vorerwähnten Restriktionsenzyme erläutert. 2 µg der isolierten rekombinanten Plasmid-pKLS511-DNA und 10 Einheiten Sal I wurden zu 50 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung, enthaltend 100 mM NaCl und 10 mM MgSO₄ (pH 7,4) gegeben und 2 Stunden bei 37°C zum Aufschliessen des Plasmids umgesetzt. Die aufgeschlossene Mischung wurde mittels Agarosegel- Elektrophorese aufgetrennt und mit 2 µg/ml einer wässrigen Lösung von Ethidiumbromid gefärbt und das Aufschlussmuster wurde durch Ultraviolettbestrahlung analysiert, um die Stellen der Spalung mittels des Restriktionsenzyms zu bestimmen. Die erzielten Ergebnisse werden in Fig. 1 gezeigt.

In Fig. 1 bedeutet das Symbol "" DNA-Fragment, enthaltend Kreatinasegene, die vom Flavobacterium U-188-Stamm stammen, und das Symbol "" bedeutet DNA-Fragment, das von pBR322 stammt. E, S, Bg und X stellen Restriktionsenzyme Eco RI, Sal I, Bgl II bzw. Xho I dar.

(5) Isolierung von DNA, enthaltend Kreatinasegen:

10 µg von Plasmid-pKLS511-DNA und 10 Einheiten Sal I wurden zu 50 mM Tris-salzsäure-Pufferlösung, enthaltend 100 mM NaCl und 10 mM MgSO₄ (pH 7,4) gegeben und 30 Minuten bei 37°C unter Aufschluss des Plasmids umgesetzt. Die Reaktionsflüssigkeit wurde elektrophoretisch unter Verwendung von 5% (G/V) Polyacrylamid auf Basis der Restriktionsenzymkarte, hergestellt in (4), aufgetrennt. Weiterhin wurde das DNA-Fragment von 1,7 Kb aus dem Polyacrylamidgel nach der vorerwähnten Methode von Maniatis et al eluiert, unter Erhalt von 5 µg DNA-Fragment, enthaltend Kreatinasegen.

(6) Analyse der Grundsequenz in der Kreatinasegen enthaltenden DNA:

Die gemäss (5) erhaltene DNA wurde zu M13 mp 18 und mp 19 Phage-Vektor-DNA (hergestellt von Amersham Japan Co.), die mit dem gleichen Restriktionsenzym oder mit Restriktionsenzymen, die das gleiche kohäsive Ende bilden, gespalten worden war, geklont. Die Sequenzbildung wurde durchgeführt nach der Didesoxy-Kettenterminationsmethode unter Verwendung von M13-Sequenzkit (hergestellt von Takara Shuzo K.K.).

Das Verfahren war das folgende: JM 101-Stamm (ATCC 33 876), der vom E. coli K12-Stamm abstammte, wurde mit der vorerwähnten M13-Phage-Vektor-DNA, in welches DNA-Fragment geklont worden war, infiziert und zu einem Phage-Teilchen reifen gelassen. Aus dem Phage wurde einstrangige Phage-DNA, mit welcher einer der DNA-Stränge von DNA-Fragment (Doppelstrang), enthaltend Kreatinasegen, kombiniert war, extrahiert und dann gereinigt. Unter Verwendung einer einstrangigen Phage-DNA als Matrize, einer sehr kurzen einstrangigen DNA mit einer komplementären Nucleotidsequenz, um sie dem DNA-Fragment, welches mit der einstrangigen Phage-DNA kombiniert worden war, als ein Primer und dATP, dTTP, dGTP und [alpha-³²P]dCTP als Substrat wurde eine DNA-Synthese durchgeführt. Dabei wurden vier Arten von DNA-Syntheseinhibitoren, nämlich ddATP, ddTTP, ddGTP oder ddCTP, in geeigneten Konzentrationen zugegeben. Gab man diese Inhibitoren zu der DNA, so hörte die DNA-Synthese auf. Dann wurde der DNA-Strang in Einzelstränge aufgeteilt und mittels 8%-iger (G/V) Polyacrylamid-Elektrophorese und Radioautografie analysiert. Auf Basis der Länge der synthetisierten DNA konnte der Grundaufbau an der 3′-Endgruppe bestimmt werden.

In der vorerwähnten Weise wurde die Grundsequenz in der vom Flavobacterium U-188-Stamm stammenden DNA festgestellt und die einzige offene Rahmenregion, die 1000 bp (base pair) überstieg, wurde als Kreatingen angesehen. Es wurde angezeigt, dass das Polypeptid, welches sich aus diesem Gen ergab, ein Molekulargewicht von etwa 44.000 hatte.

Die Grundsequenz des so bestimmten Kreatinasegens wird in Fig. 2A und 2B gezeigt. Die Aminosäuresequenz des Polypeptids, welches sich aus diesem Gen ergibt, wird in Fig. 3A und 3B gezeigt.

(7) Herstellung von Kreatinase unter Verwendung von E. coli HB101 (pKLS511)-Stamm und Isolierung und Reinigung des Enzyms:

2 l eines Mediums, enthaltend 1% (G/V) Trypton, 0,5% (G/V) Hefeextrakt und 0,5% (G/V) Natriumchlorid, wurden in den Kulturtank einer kleinen mit einem Rührer versehenen Kulturvorrichtung (hergestellt von Iwashiya Co.) gegeben und bei erhöhtem Druck in üblicher Weise sterilisiert. Andererseits wurde E. coli HB101 (pKLS511)- Stamm zuvor unter Schütteln in einem Medium der gleichen Zusammensetzung wie oben 24 Stunden bei 37°C kultiviert. 20 ml der Kulturflüssigkeit wurden mit den vorerwähnten 2 l eines Mediums inokuliert und einer belüfteten Schüttelkultur während 8 Stunden bei 37°C unterworfen. Indem man dieses Verfahren 5 mal wiederholte, konnte man 30 g feuchte Bakterienkörper erhalten.

Die so erhaltenen Bakterienkörper wurden in 100 ml 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH 8,0), enthaltend 1 mM 2-Mercaptoethanol, suspendiert. Nach dem Zerstören der Bakterienkörper mit Ultraschall in üblicher Weise wurde die Mischung mit 15.000 Upm während 30 Minuten in üblicher Weise zentrifugiert unter Erhalt von 120 ml (0,8 Einheiten/ml) einer rohen Enzymlösung von Kreatinase.

Nach Entfernen der Nucleinsäure aus der rohen Enzymlösung mit Streptomycinsulfat wurde die Enzymlösung durch eine DNA-Cellulose-Säule, die zuvor mit 0,05 M Phosphatpufferlösung, enthaltend 1 mM 2-Mercaptoenthanol, ins Gleichgewicht gebracht worden war (2 cm Durchmesser × 30 cm Länge) laufen gelassen und die nicht-adsorbierte Fraktion gesammelt. Dann wurde die Fraktion auf einer DEAE-Sephadex A-50-Säule (1,4 cm Durchmesser × 40 cm Länge), die mit dem gleichen Puffer wie oben ins Gleichgewicht gebracht worden war, adsorbiert und das adsorbierte Material wurde nach der Natriumchlorid- Konzentrationsgradienten-Elutionsmethode (0 bis 1,5 M) eluiert. Auf diese Weise erhielt man ein Kreatinase enthaltendes Eluat in dem Natriumchlorid-Konzentrationsbereich von 0,1 bis 0,3 M.

Das kreatinasehaltige Eluat wurde durch eine Sephalose 6B-Säule (2 cm Durchmesser × 108 cm Länge), die zuvor mit dem gleichen Puffer wie oben ins Gleichgewicht gebracht worden war, laufen gelassen und die kreatinaseaktive Fraktion wurde gesammelt. Nach dem Konzentrieren und Gefriertrocknen der Fraktion in üblicher Weise wurden 43 Einheiten gereinigter pulverförmiger Kreatinase erhalten. Die Ausbeute betrug 45%.

Claims (14)

1. Kreatinasegen, dadurch gekennzeichnet, dass es die Grundsequenz gemäss nachfolgender Fig. 2A und 2B aufweist:

2. Kreatinasegen gemäss Anspruch 1 mit einer Codierung für die Aminosäuresequenz gemäss Fig. 3A und 3B:

3. Kreatinasegen gemäss Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Kreatinasegen von Bakterien vom Genus Flavobacterium stammt.

4. Kreatinasegen gemäss Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Kreatinasegen vom Flavobacterium U-188-Stamm stammt.

5. Neue rekombinante DNA, hergestellt durch Einsetzen einer DNA mit einer genetischen Codierung für Kreatinase in eine Vektor-DNA.

6. Neue rekombinante DNA gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA mit einer genetischen Codierung für Kreatinase eine DNA ist, die vom Flavobacterium U-188-Stamm stammt.

7. Neue rekombinante DNA gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der genetische Code für Kreatinase ein Kreatinasegen, dargestellt durch die Grundsequenz gemäss Fig. 2A und 2B von Anspruch 1, ist.

8. Neue rekombinante DNA gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der genetische Code für Kreatinase für die Aminosäureaequenz gemäss Fig. 3A und 3B von Anspruch 2 kodiert.

9. Neue rekombinante DNA gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Vektor-DNA pBR322-DNA ist.

10. Verfahren zur Herstellung von Kreatinase, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem Kulturmedium einen Stamm vom Genus Escherichia, enthaltend eine rekombinante DNA, die hergestellt wurde, indem man DNA mit einem genetischen Code für Kreatinase in eine Vektor-DNA einführte, mit einer kreatinasebildenden Fähigkeit kultiviert und anschliessend die Kreatinase aus dem kultivierten Produkt sammelt.

11. Verfahren zur Herstellung von Kreatinase gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA mit einem genetischen Code für Kreatinase eine DNA ist, die vom Flavobacterium U-188-Stamm abstammt.

12. Verfahren zur Herstellung von Kreatinase gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der genetische Code für Kreatinase ein Kreatinasegen ist, der die Grundsequenz, wie sie in Fig. 2A und 2B von Anspruch 1 gezeigt wird, hat.

13. Verfahren zur Herstellung von Kreatinase gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der genetische Code für Kreatinase für eine Aminosäuresequenz, wie sie in Fig. 3A und 3B von Anspruch 2 gezeigt wird, codiert.

14. Verfahren zur Herstellung von Kreatinase gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Vektor-DNA Plasmid pBR322-DNA ist.