DE3687654T2

DE3687654T2 - Verfahren zur durchfuehrung im zusammenhang mit protein- oder nukleinsaeureblotting.

Info

Publication number: DE3687654T2
Application number: DE8686906015T
Authority: DE
Inventors: Goesta Eggertsen
Original assignee: Pharmacia LKB Biotechnology AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1985-10-09
Filing date: 1986-10-08
Publication date: 1993-06-03
Anticipated expiration: 2006-10-09
Also published as: JPH0754325B2; US4826771A; DE3687654D1; EP0241510A1; JPS63501039A; SE8504666D0; ATE85089T1; WO1987002386A1; SE449036B; EP0241510B1

Description

Die Erfindung betrifft ein vereinfachtes Verfahren, welches im Zusammenhang mit dem Blotten von Eiweiß und Nukleinsäuren durchgeführt wird, bei dem das Medium, auf das die Verbindungen transferiert wurden, in einer rotierenden Trommel mit dem Reagenz und den Waschlösungen behandelt wird.
Wenn eine elektrophoretische Trennung durchgeführt wird, wird die Probenlösung gewöhnlich auf eine Gelscheibe oder -platte aufgebracht mit einer Dicke von ungefähr einem Millimeter oder wenigen Millimetern. Danach werden die einzelnen Verbindungen der Probe unter Einwirkung eines elektrischen Feldes dazu gebracht, im Gel zu wandern. Für eine Identifizierung und Analyse der getrennten Verbindungen und wahlweise für ihre Behandlung mit geeigneten Reagenzien ist es unumgänglich, daß die Gesamtmenge der entsprechenden Verbindung zugänglich ist. Da die Verbindungen in einer sogenannten elektrophoretischen Bande diffus vorliegen und sich in das Innere des Gels erstrecken, das heißt sie sind verteilt auf ein Volumen, welches begrenzt ist durch die Oberfläche der Bande und die Dicke des Gels, wurden Methoden entwickelt, bei denen Verbindungsmoleküle vom Gel auf die Oberfläche einer festen Matrix, üblicherweise Nitrozellulosepapier, transferiert werden. Ein Transfer dieser Art wird üblicherweise als "Blotting" bezeichnet. Dadurch, daß ein transferiertes Protein auf der Oberfläche anstatt im Inneren des Gels vorliegt, kann es an einer Vielzahl von Wechselwirkungen teilnehmen. So kann es zum Beispiel mit Antikörpern reagieren. Dies ist ein wichtiges Merkmal für immunologische Zwecke. Einige markante Beispiele für solche praktische Anwendungen sind
- Analyse von Reaktivitäten verschiedener Antikörper, - Analyse von antigenen Strukturen verschiedener Typen, - Identifizierung von einzelnen Proteinen, welche in Gemischen vorkommen, unter Verwendung spezifischer Antisera.
Antikörper, welche an geblottete Proteine gebunden sind, können auf verschiedene Weise nachgewiesen werden. Eine Methode, welche häufig angewendet wird, beinhaltet die Verwendung eines markierten sekundären Antikörpers, welcher gegen den primären Antikörper gerichtet ist. Solch ein sekundärer Antikörper kann beispielsweise in Fällen, wo die primäre Antikörperquelle Kaninchenserum ist, Antikaninchen-IgG sein. Die Markierung des Antikörpers kann unter Verwendung eines radioaktiven Isotops, fluoreszierender Verbindungen oder bestimmter Enzymtypen erzielt werden. In dem letzteren Fall wird die Position des Enzyms auf der festen Matrix durch Nachbehandlung mit geeigneten Substraten angefärbt. Eine zusätzliche Sensitivitätssteigerung kann manchmal erzielt werden, indem man einen sekundären Antikörper verwendet, welcher in einem dritten Schritt mit einem markierten Reagenz reagieren kann. Neuere Techniken verwenden dafür zum Beispiel Biotin-markierte sekundäre Antikörper, welche in einem dritten Schritt mit dem Protein Avidin reagieren; dieses hat multiple Bindungsstellen für Biotin und hat ein Enzym, wie zum Beispiel in den meisten Fällen entweder alkalische Phosphatase oder Peroxidase, an sich gebunden. Mit dieser Technik ist es möglich, Proteinmengen bis hinunter zu ungefähr 100 bis 200 Picogramm zu detektieren.
Aus den oben genannten Erläuterungen ist erkenntlich, daß ein Protein, welches durch Blotting auf eine feste Matrix transferiert worden ist, einer Vielzahl von Behandlungsschritten unterzogen werden kann, im Zusammenhang mit Reaktionen, welche weiter oben bereits angegeben wurden. Solche Behandlungen können drei oder mehr Reagenzlösungen einschließlich der dazwischen liegenden Waschstufen umfassen. Dieser Vorgang wird gemäß gängiger Techniken so ausgeführt, daß die Matrix, welche die geblotteten Proteine enthält, in Boxen oder verschweißbaren Kunststoffbeuteln, auf verschiedenen Typen von Schüttlern oder Schüttelvorrichtungen, inkubiert wird. Dabei werden die Reagenzien-Waschlösungen nach vorbestimmten Zeitabständen ausgetauscht. Häufig wird eine Vielzahl von Proben in parallelen Tests, in denen einer oder mehrere der Behandlungsschritte gleich sein können, analysiert. In Fällen, in denen das Protein mit drei Reagenzlösungen behandelt werden muß, gefolgt von drei Waschschritten, bedeutet dies eine Abfolge von zwölf Behandlungsschritten; es ist leicht erkenntlich, daß dies mit den gegenwärtigen Techniken eine mühsame und langwierige Prozedur ist. Es sei außerdem bemerkt, daß eine bestimmte minimale Menge von Reagenz benötigt wird, um eine effektive Inkubation auszuführen; und um den gegenwärtig verwendeten Typen von Behältern gerecht zu werden, ist die minimale Menge unglücklicherweise ein relativ großes Volumen. Dies ist ein signifikanter Nachteil, da einige Reagenzien sehr teuer sind und vielleicht nur in sehr geringen Mengen, wie zum Beispiel bei bestimmten Antikörpertypen, verfügbar sind.
Deshalb besteht im Zusammenhang mit Blotting-Techniken ein Bedarf an einem Verfahren, bei dem - die Anzahl der durchzuführenden Schritte verringert ist; - die Reproduzierbarkeit aufgrund von effizienterem Waschen und Inkubieren verbessert ist; - der Reagenzienverbrauch verringert ist.
Es wurde jetzt gefunden, daß die zuvor genannten Erfordernisse erfüllt sind, wenn man ein Inkubations/Waschsystem verwendet, bei dem das feste Medium gegen die Innenwand einer rotierenden Trommel gelegt und mit den gewünschten Lösungen behandelt wird, während die Trommel rotiert. Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren, welches im Zusammenhang mit dem Blotten von Proteinen und Nukleinsäuren durchgeführt wird, wobei die Streifen, welche diese tragen, in Drehrichtung auf die zylindrische Innenwand einer Trommel gelegt werden, welche ihrerseits mit der Zylinderachse in der horizontalen Ebene angeordnet ist. Danach wird die Trommel gedreht und die Streifen kommen bei jeder Umdrehung mit der Waschlösung oder der Reagenzienlösung, die in der Trommel vorliegt, in Kontakt.
Die Trommel, welche vorzugsweise aus einem durchsichtigen Material wie zum Beispiel Plexiglas ist, hat eine Größe, die zu der Größe der zu behandelnden Streifen paßt. Der Durchmesser kann zum Beispiel 5 bis 10 cm sein, der Umfang ist dann ungefähr 20 bis 75 cm, und die Länge kann zum Beispiel 5 bis 11 cm sein; das hängt davon ab, wieviele Streifen nebeneinander gelegt werden. Die zylindrische innere Oberfläche ist glatt, enthält aber einen Vorsprung, welcher parallel zur Zylinderachse läuft; die Streifen werden dabei so angeordnet, daß sie während der Drehung mit ihren kürzeren Seiten gegen diese Kante zu liegen kommen. Außerdem ist die zylindrische Innenwand mit herausnehmbaren Stiften ausgestattet, welche in gebohrten Löchern stecken und in konzentrischen Kreisen auf der Zylinderwand angeordnet sind, um so die Streifen am Wandern in lateraler Richtung, bedingt durch die Drehbewegung, zu hindern. Die Trommel hat an wenigstens einem Ende einen Deckel, welcher zum Beispiel durch einen O- Ring abgedichtet ist, und durch den die Streifen eingeführt werden. Längere Trommeln haben so einen Deckel vorzugsweise an beiden Enden. Vor den Inkubations- und Waschschritten wird die horizontal liegende Trommel auf ein Gerät gelegt, welches für die Drehung von zylindrischen Gegenständen geeignet ist, zum Beispiel auf zwei Walzen, von denen eine so angeordnet ist, daß sie den anderen Körper durch Reibung in eine Drehbewegung versetzen kann.
Nach der Blottingstufe wird die Trägermatrix, beispielsweise Nitrozellulosepapier, in Streifen gewünschter Breite und Länge geschnitten, um dann auf die zylindrische Innenwand gelegt zu werden (wahlweise nach einigen Behandlungsschritten, welche nicht für alle Streifen gleich sind), und zwar so, daß ihre kurzen Seiten an der bereits erwähnten Kante aufliegen und ihre langen Seiten in Richtung der Drehbewegung zeigen. Falls gewünscht, können die Streifen durch die bereits genannten Stifte lateral fixiert werden.
Reagenz und Waschlösungen werden so auf den Boden der Trommel gebracht, daß die Streifen während jeder Umdrehung mit der jeweiligen Lösung in Kontakt kommen. In einer bevorzugten Anwendungsform dieser Erfindung ist die Trommel nur teilweise mit der entsprechenden Lösung gefüllt; dies ist eine viel effizientere Methode als die, in der die Streifen während der gesamten Drehung in der Lösung liegen. Es ist vorteilhaft, eine Flüssigkeitsmenge von wesentlich weniger als 50% des Trommelvolumens zu verwenden, vorzugsweise nur ungefähr 5 bis 10%. Die Geschwindigkeit und die Dauer der Drehung werden entsprechend angepaßt, um so die gewünschten Reaktionsbedingungen zu erzielen.
Wie bereits oben erwähnt, ist die erfindungsgemäße Methode genauso für die Durchführung von Nukleinsäureanalysen geeignet, zum Beispiel für Analysen von membranimmobilisierten Nukleinsäuren durch DNA-DNA-Hybridisierung oder alternativ dazu für die DNA-RNA-Hybridisierung, wobei die Sonde, um nachgewiesen werden zu können, in jedem dieser Fälle markiert ist. Die Nukleinsäure kann entweder direkt auf die Membran aufgebracht werden (ein sogenannter Dot Blot), oder mit geeigneten Transfertechniken aus einem Elektrophoresegel heraustransferiert werden. Die erforderliche Behandlung der Nukleinsäure mit der Prehybridisierungslösung, der Hybridisierungslösung und den Waschlösungen wird in ähnlicher Weise wie in dem oben beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Um die Effizienz zu verbessern, kann das erfindungsgemäße Verfahren mit einer Temperaturkontrolle ausgestattet werden, so daß die Reaktionen bei einer gewünschten konstanten Temperatur ablaufen.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren, welches in Verbindung mit dem Blotten von Proteinen und Nukleinsäuren durchgeführt wird. Streifen, welche die tatsächlichen Verbindungen enthalten, werden in Drehrichtung auf die zylindrische Innenwand einer Trommel, welche ihrerseits mit der Zylinderachse in der horizontalen Ebene angeordnet ist, aufgebracht, danach wird die Trommel gedreht, und die Streifen werden während jeder Umdrehung mit Waschlösung oder Reagenzlösung, welche in der Trommel vorhanden ist, behandelt.
Dieses Verfahren für die Behandlung von blottierten Substanzen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen und Nukleinsäuren, bei dem die blottierten Verbindungen mit Behandlungsflüssigkeiten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Waschlösungen und Reagenzlösungen, behandelt werden, wird vorzugsweise in folgenden Schritten ausgeführt:
(i) wenigstens ein Streifen, welcher die geblotteten Substanzen enthält, wird auf die Innenwand einer zylindrischen Drehtrommel, welche mit ihrer Achse in der horizontalen Ebene liegt, aufgebracht, und zwar werden die Streifen dann so auf die Innenwand der Trommel fixiert, daß sie ihrer Länge nach in die Drehrichtung der Trommel weisen;
(ii) Einbringung von Behandlungsflüssigkeit in die Trommel, und nach den Schritten (i) und (ii)
(iii) Drehung der genannten Trommel, welche die Streifen und die Behandlungsflüssigkeit enthält.
In einer bevorzugten Anwendungsform wird Schritt (i) vor Schritt (ii) ausgeführt.
Die Erfindung wird durch das nachfolgende, nicht eingrenzende Beispiel erläutert.

BEISPIEL

Screening von monoklonalen Maus-Antikörpern, welche gegen menschliches C3 gerichtet sind

Komplementfaktor C3 ist eine der wichtigsten Verbindungen des sogenannten Komplementsystems; er ist ein Protein, welches aus zwei Ketten besteht und welches ein Gesamtmolekulargewicht von ungefähr 185.000 hat.
Ungefähr 200 ug von reduziertem C3 und try-C3c (einem Fragment von C3, welches durch tryptischen Verdau erhalten wird) wurden auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen (11% Gel mit 4,8% Spacer); daraufhin wurde eine SDS-Elektrophorese nach Neville et al., Methods in Enzymology 32 (1974), Seite 92 bis 102, durchgeführt. Die getrennten Polypeptide wurden auf Nitrozellulosepapier elektro-geblottet (NAHY) 304FO; Millipore Corp., Bedford, USA. Die Blockierung und die Verdünnungen der Überschichtungslösungen wurden mit 10% hitze-inaktiviertem Rinderserum (0,02 M Phosphatpuffer, 0,15 M NaCl und 0,2% Tween 20) durchgeführt. Die Waschschritte wurden mit 0,5% Rinderserumalbumin (0,02 M Phosphatpuffer, 0,15 M NaCl und 0,1% Tween 20) durchgeführt. Das Nitrozellulosepapier wurde in Streifen von 5 mm Breite geschnitten. Von diesen wurden Nr. 1 bis 7 mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern in einer 1/100-Verdünnung inkubiert (3 ml/Streifen in verschweißbaren Plastikbeuteln auf Schüttlern, für eine Nacht im Kühlraum). Streifen Nr. 8, welcher als Vergleich diente, wurde mit 3 ml eines Antikörpers inkubiert, welcher gegen try-C3c (1/1000) gerichtet war. Die Streifen wurden dann gemäß dieser Erfindung in die Trommel eingebracht und dreimal mit 10 ml Lösung - jedesmal für 5 Minuten - gespült. Danach wurden sie mit 5 ml Biotin-markiertem Kaninchen-Anti- Maus-IgG (1/500-Verdünnung) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Gefolgt wurde dieser Vorgang von einem Waschschritt wie oben beschrieben, und dann von einer erneuten Inkubation, welche diesmal mit 5 ml einer Lösung aus Avidin, welches an Peroxidase gekoppelt war, durchgeführt wurde (Sigma Chem, St. Louis, Missouri, USA). Danach wurde der Waschschritt wiederholt, bevor mit 4-Chlor-1-naphthol angefärbt wurde (Anal. Biochem. 119 (1982), Seite 142 bis 147).
Die mit diesem Verfahren erzielten Ergebnisse sind eindeutig vergleichbar mit Ergebnissen aus herkömmlichen Blotting-Verfahren, dies trotz der großen verfahrensmäßigen Vereinfachung, welche durch diese Erfindung erzielt werden konnte.

Claims

1. Verfahren zur Durchführung im Zusammenhang mit dem Blotten von Proteinen und Nucleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß diese enthaltende Streifen in Rotationsrichtung auf die zylindrische Innenwand einer Trommel, die mit ihrer Zylinderachse in der horizontalen Ebene angebracht ist, aufgebracht werden, worauf die Trommel rotiert wird und die Streifen in der Zeitspanne jeder Umdrehung mit einer zugesetzten Wasch- oder Reagenslösung, die in der Trommel vorliegt, in Kontakt gebracht werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß weniger als 50% des Trommel-Innenvolumens mit der Behandlungsflüssigkeit gefüllt werden.