JPS63501039A - ブロットされたタンパク質または核酸の処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質プロッティングまたは核酸プロッティングと連係して行われるべき手 順本発明は、タンパク質または核酸成分が移行しｆ二媒質を回転ドラム中で試薬 および洗浄溶液と接触さ仕ることよりなる、タンパク質プロッティングまたは核 酸プロッティングと連係して行われるべき簡素化された手順に関する。

電気泳動分離を行う場合、検体溶液は通常的１　ｕ乃至数Ｕの肉厚を有するゲル ディスクまｆ二はプレート上に適用されるが、その後検体の個々の成分は電場の 作用下にゲル中を移行する。分離された成分を同定しそして分析するには、そし て所望によりそれらを適当な試薬で処理するには、考慮される成分の全量を利用 可能とすることがどうしても必要である。いわゆる電気泳動バンドにおいては成 分がゲル内部に及ぶ程の拡散状態にある（すなわち、それらはバンドの表面積と ゲルの肉厚によって規定される体積内に分布されている）ことから成分分子をゲ ルから固体マトリクス（通常はニトロセルロース紙）の表面に移動する方法が開 発されている。このような「移動（トランスファー）」は一般に「プロッティン グ」といわれている。ゲル内部ではなくて表面に位置することにより、プロット されたタンパク質は、多くの相互反応に関与させることができる。すなわち、例 えばそれは抗体と反応できるが、これは免疫学的目的にとって重要な特徴で°あ る。かかる実用的な用途のいくつかの際立った例としては次のものが挙げられろ 。

−各種抗体の反応性の分析。

−各種タイプの抗原構造の分析。

−特異抗血清を用いＬ混合物中に存在する個々のタンパク質の同定。

プロットされたタンパク質に結合した抗体は様々な方法で検出することができる 。よく選択される方法は一次抗体に対する標識された二次抗体を用いることより なる。

かかる二次抗体は、例えば−次抗体源がウサギ血清である場合には抗ウサギ−１ ｇＧであってよい。抗体の標識は一部の放射性アイソトープ、蛍光化合物または ある種の酵素を用いて行うことができる。この後者の場合、固体マトリクス上の 酵素位置は適当な基質で後処理することにより染色される。第３段階で標識試薬 と反応させられる二次抗体を用いることにより、時によって感度増を得ることが できる。最近の方法は、例えば第３段階でタンパク質のアビジンと反応すること となるビオチン−標識二次抗体を用いているが、これはビオチンに対する多重的 結合部位を有し、そして酵素（例えば多くの場合アルカリ性ホスファターゼかペ ルオキシダーゼである）を結合している。この方法によれば約１００〜２００ピ コグラムまでもの少量のタンパク質を検出することができる。

前述の説明から、プロッティングにより固体マトリクスに移されたタンパク質は 前述の種類の反応に関連して多くの処理段階にかけられることが分かるであろう 。かかる処理は従って３またはそれ以上の試薬溶液および間に挿入された洗浄段 階を伴うことがある。この方法は、現在の技術によればプロットされたタンパク 質を含むマトリクスを様々なタイプの振盪または揺動装置上のボックスまたはシ ール可能なプラスチック製バッグ中でインキュベートし、試薬／洗浄液を所定の 時間後に交換することによって行われる。−またはそれ以上の処理段階が同じで あってもよい並行テストで多数の検体を分析することがしばしばある。タンパク 質を３つの試薬溶液およのシーケンスを伴うこととなるが、現在の技術ではこれ が煩雑で長時間を要する手順であることは容易に理解されよう。更にインキュベ ーションを効果的に行うにはあるタイプの容器に適合化させるには、この最小量 は残念ながら比較的多量とならざるを得ない点に留意しなければならない。この ことは著しい欠点である。、何故ならば、試薬によっては極めて高価なものがあ り、またほんの小量でしか入手できないことがあるからである（例えばあるタイ プの抗体）。

従って、プロッティング技術に関しては、−操作取扱い段階の数が少なくて済み ；−洗浄およびインキュベーションの効率向上により再現性が改善され； 一試薬の消費が少なくて済む 手順が必要とされている。

本発明者等は今般、固体媒質が回転ドラムの内壁に載置されそしてそのドラムが 回転している間に所望の溶液と接触するようになしたインキュベーション／洗浄 （ｒｉｎｓｉｎｇ）システムを用いれば前述の願望が満たされることを見出した 。

（好ましくは透明材料例えばプレキシグラス（ｐｌｅｘｉ−ｇｌａｓｓ）製の） 前記ドラムには、被処理ストリップの寸法にふされしい寸法が与えられる。直径 は例えば５〜１ＯＣＸであってよく、その場合円周は２０〜７５ｃｉであり、そ して長さは、何枚のストリップを並置するかに応じて例えば５〜１ｌｃｉとして もよい。円筒内面は滑らかであるが円筒軸に対し並行に走る突起（Ｉｅｄｇｅ） が設けられており、そしてストリップの短端縁は回転中前記突起に載るように配 置される。更に、円筒内面には円筒壁上の同心円状サークルに沿ったネジ穴に固 定された着脱自在のビンを設けることによって、ストリップが回転運動中に側方 に動かないようにしてもよい。ドラムの少なくとも一方の端縁には蓋を設けるが 、その蓋は例えばＯ−リングによりシールされ、またその蓋を通してストリップ が挿入される。長いドラムにはこのような蓋を両端縁に各々設けるのが好ましい であろう。インキュベーションおよび洗浄段階にかける前に、そのドラムをその 中心線が水平面にくるようにして、何らかの種類の既知の円筒体回転装置、例え ば一方のローラがその他のボディを摩擦により動かして回転運動に移行させる２ 個のローラに置く。

プロッティング段階の後、レシーバ−・マトリクス、例えばニトロセルロース紙 を所望の幅および長さに分割し、次いでそれらを（所望により、すべてのストリ ップに対し共通している訳ではない操作段階の後に）それらの短端縁が前記突起 に載りモして長辺が回転方向に延びるようにして円筒内面に載置する。所望によ り前述のピンによりそれらストリップを側方に動かないようにする。

試薬および洗浄溶液をドラム底部に適用して回転している間にストリップが各回 転時間の間それぞれの溶液と接触するようにする。本発明の好ましい態様の一つ においては、ドラムには意図する溶液のほんの一部しか充填しないが、これはス トリップが全回転中に溶液中を移動する場合に比べはるかに効率的な手順である 。ドラム容積の５０％よりも相当少ない量、好ましくはわずか約５−〜ＩＯ％の 量の液体を用いるのが有利である。それに従って回転速度および回転時間を適合 させ、それによって所望の反応条件を作り出す。

前述のとおり、本発明の手順は核酸分析、例えばＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド化 またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド化による膜固定核酸の分析（いずれの場合に もプローブは検出可能なように標識される）などに対しても適している。

核酸は膜に直接適用でき（いわゆるドツト・プロット）、あるいは適切な移動方 法によって電気泳動ゲルから移してもよい。予備ハイブリッド化溶液、ハイブリ ッド化溶液および洗浄溶液に対して必要とされるような核酸の接触は前述の手順 と同様の方法で行われる。

効率を更に高めるために本発明の手順に温度制御を補って反応が所定の一定温度 で進行するようにしてもよい。

従って本発明はタンパク質および核酸のプロッティングと連係して実施される手 順に関する。実際の化合物を含むストリップは、その円筒軸が水平面にくるよう に配置されたドラムの円筒内壁上に回転方向に載置し、次にそのドラムを回転さ せそしてストリップを各回転時間中、ドラム中に存在する洗浄溶液まには試薬溶 液の供給物と接触させる。

タンパク質および核酸よりなる群より選択されるプロットされた物質を洗浄液お よび試薬液よりなる群より選択される処理液で処理することによるこの前記プロ ットされた物質の処理方法は好ましくは以下の段階を踏んで（ｉ）　プロットさ れた物質を含む少なくとも一つのストリップを、その軸が水平位となるように置 かれた円筒状回転ドラムの内壁面に載置し、そして該ストリップをドラム回転方 向に向かって長手方向に延びるようにドラム壁土に配置し、 （１１）処理液をドラムに導入し、そして段階（１）および（ｉｉ）の後で、 （ｉｉｉ）　前記ストリップと処理液を含む前記ドラムを回転する。

本発明を次の非限定的実施例により説明する。

実施例 ヒトＣ３に対するモノクローナルマウス抗体のスクリーニング 補体因子Ｃ３は、いわゆる補体系の最重要成分のうちの一つである。それは２本 鎖よりなりそして約１８５，０００の総分子量を有するタンパク質である。

約２００ｕＬｉの還元Ｃ３およびｔｒｙ−Ｃ３ｃ（トリプシン消化により得られ るＣ３の断片）をポリアクリルアミドゲル（４，８％スペーサを有する１１％ゲ ル）に適用して、Ｎｅｖｉｌｌｅｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ ｚｙｍｏｌｏｇｙ　３２（１９７４）、　ｐ、　９２〜１０２によるＳＤＳ電気 泳動を行った。分離されたポリペプチドをニトロセルロース紙（ＮＡＨＹ）　３ ０４ＦＯ（米国ＢｅｄｆｏｒｄのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、社）上にエレ クトロ−プロッティングした。オーバーレイ（ｏｖｅｒｌａｙ）のクエンチング と希釈は１０％熱失活仔牛血清（０，０２Ｍ　ホスフェート緩衝剤、０．１５Ｍ 　ＮａＣＱ　および０．２％Ｔｗｅｅｎ　２０）中で行った。洗浄段階は０．５ ％牛血清アルブミン（０，０２Ｍホスフェート緩衝剤、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ２ および０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０）中で行った。そのニトロセルロース紙を５　 ｕ幅のストリップに切断した。

これらのうちＮｏ、１〜７を各種の異なるモノクローナル抗体（１／ｌｏｏ希択 率）と共にインキュベートした（３．ｌＩＱ／ストリップを冷室内の揺動器上の シール可能なプラスチックバック内に入れ一部インキユベートした）。参照とし て役立つストリップＮ０１８はｔｒｙ−Ｃ３ｃに対する３　ｍＱの抗体（１／１ ０００）と共にインキュベートした。次に六れらのストリップを本発明によるド ラムに移しそして１０１１Ｑの溶液で３回（各１回につき５分間）洗浄した後そ れらを５　ｍ（１のビオチン標識ウサギ−抗マウス−１ｇＧ（１１５００希釈） と共に室温で１時間インキュベートした。この後で前述の如く洗浄を行った後再 びインキュベーションを行ったが、それは今回はペルオキシダーゼに結合された アビジン（米国ミズーリ州セントルイス、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ社）の溶液５ｘ Ｑを用いて行った。次いで洗浄手順を繰り返した後に４−クロロ−１−ナフトー ルで染色した（　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

本発明によって極めて大きな手順上の簡素化が図られるにもかかわらずこの手順 により得られる結果は伝統的プロッティング後の相当する結果憾明らかに匹敵す るも−のであった。

ｌｍｍｖａｌ＊、、ａｌ　ａｓ＠＋１ｃｊ１＋＠Ｍ　ｓａ　”　Ｔ／　ｓε８６ １００４６１

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．タンパク質および核酸を含むストリッブを、その円筒軸が水平面内にあるよ うに配役されたドラムの円筒内壁上に回転方向に載置し、次いでそのドラムを回 転しそして前記ストリッブを各回転時間の間に核ドラム内に存在する洗浄溶液ま たは試薬溶液の供給物と接触させることを特徴とする、タンパク質および核酸の ブロツティングと連係して行われるべき手順。
2. ２．タンパク質および核酸よりなる群より選択されるブロツトされた物質を洗浄 液および試薬液よりなる群より選択される処理液で処理することによる前記ブロ ツトされた物質の処理方法であって、 （ｉ）前記ブロットされた物質を含む少なくとも一つのストリッブを、その軸が 水平位となるように置かれた円筒状回転ドラムの内壁面に載置し、そして該スト リツブをドラム回転方向に向かって長手方向に延びるようにドラム壁上に配置す る段階、 （ｉｉ）処理液をドラムに導入する段階および段階（ｉ）および（ｉｉ）の後で 、 （ｉｉｉ）前記ストリツブと処理液を含む前記ドラムを回転する段階 を含む前記処理方法。
3. ３．段階（ｉｉ）が段階（ｉ）後に行われる請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．ドラム内容積の５０％よりも少ない容積が処理液で充填される請求の範囲第 ２項記載の方法。