DE3686888T2

DE3686888T2 - Verfahren zum nachweis und zur quantitativbestimmung von immunologischen stoffen.

Info

Publication number: DE3686888T2
Application number: DE8686308568T
Authority: DE
Inventors: Alberto F Lopapa; Philip J Wyatt
Original assignee: CENTER FOR IMMUNOLOGICAL STUDI
Current assignee: CENTER FOR IMMUNOLOGICAL STUDI
Priority date: 1986-11-03
Filing date: 1986-11-03
Publication date: 1993-03-04
Anticipated expiration: 2006-11-04
Also published as: EP0266461B1; US4621063A; ATE81208T1; EP0266461A1; DE3686888D1

Description

Der Nachweis und die Quantitativbestimmung von chemischen Substanzen einschließlich immunologischer Substanzen stellt ein andauerndes Problem für viele verschiedene Disziplinen dar. Auf dem Gebiet der Umwelt zum Beispiel werden für den Nachweis von gefährlichen Verbindungen in Luft, Wasser und Erde oft intensive chemische Tests und Analysen benötigt. Gewisse Karzinogene sind durch Vorschrift auf jedem Niveau in Trinkwasser ausgeschlossen, doch ist ihr Nachweis selbst bei relativ hohen Pegeln oft unmöglich wegen eines Mangels an Empfindlichkeit eines herkömmlichen Tests. Währende mehrere Substanzen als für die menschliche Gesundheit als gefährlich erkannt werden, werden neue Tests und analytische Techniken benötigt.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung ist der Nachweis und die Quantitativbestimmung relativ kleiner Beträge von speziellen immunologischer Substanzen wie Immunglobulin IgE besonders wichtig für die Diagnose und die Behandlung allergischer Reaktionen gewisser Einzelpersonen. Allgemein sind solche Substanzen mit einem extrem niedrigen Pegel im menschlichen Serum vorhanden. Folglich kann der Nachweis und die Quantitativbestimmung gewisser Typen von IgE und ihr Zusammenhang mit bestimmten Allergenen gut mit speziellen Allergien korreliert werden, die bei dem Serumgeber erfahren werden.
Ein weiteres Gebiet, auf dem der Nachweis und die Quantitativbestimmung einer bestimmten chemischen Substanz wünschenswert wenn nicht notwendig ist, ist das Gebiet der Virologie. Von Viren wird allgemein angenommen, daß sie komplexe DNA-Moleküle sind, die von einer Proteinhülle umgeben sind und als solche wird ihnen nachgesagt, daß sie die kleinsten Lebensformen darstellen.
Es wird angenommen, daß sie die verursachenden Mittel für viele Krankheiten wie Hepatitis, Herpes, Mumps, Poliomyelitis unter anderem sind, und sie sind auch mit verschiedenen Arten von Krebs identifiziert worden. Die Wichtigkeit des Nachweises solcher Vieren zu einem frühen Stadium kann natürlich nicht überbetont werden.
Somit ist der Nachweis der oben aufgeführten chemischen Substanzen und anderer ähnlicher Substanzen eine kritische aber höchst schwierige und in manchen Fällen unmögliche Aufgabe gewesen.
Extensive analytische sepektroskopische, radioisotopische und biologische Testverfahren sind bei einem Versuch, diese Nachweisanforderungen zu erfüllen, entwickelt worden. Viele herkömmliche Verfahren sind jedoch relativ unempfindlich aber schnell, während andere Verfahren sehr empfindlich jedoch relativ langsam sind.
Typischerweise sind spezifische chemische Substanzen, die man nachzuweisen suchte, durch ein oder zwei am besten spezialisierte Techniken oder Verfahren bestimmt worden. Trotz der Unzahl von Verfahren stellt keine einzige Methodik eine ideale Lösung für die Mehrzahl spezifischer Substanzen dar, und kein einzelnes Verfahren bietet sich für eine allgemeine Anwendung an. Radioimmunoassay-Techniken haben jedoch weite Bereiche der Anwendbarkeit für chemische Substanzen biologischen Ursprungs.
Neue Zugänge für solche Nachweis- und Quantitativbestimmungen werden dauernd gesucht, und mit jeder wird ein entsprechender neuer Bereich von Nachweismöglichkeiten dadurch erschlossen.
Unter diesen Zugängen sind eine Mehrzahl von speziellen Assays/- Proben, die optische Analysatoren benutzen, zum Beispiel solche, die in den folgenden US-Patenten offenbart sind, die an Phillip J. Wyatt als einzigem oder gemeinsamen Erfinder erteilt sind: 3.624.835- Microparticle Analyzer Emnloying a Spherical Detector Array, (30. November 1971); 3.730.842- Process für Determining Bacterial Drug Sensitivity zusammen mit R. M. Berkman und D. T. Phillips (1. Mai 1973); 3.754.830- Scattering Gell Employing Electrostatic Means for Supporting a Particle zusammen mit D. T. Phillips, H. H. Brooks und G. R. Liu (28. August 1973); 3.770.351- Optical Analyzer for Microparticles (6. November 1973); 3.815.000- Levitator zusammen mit D. T. Phillips, H. H. Brooks und C. R. Liu (4. Juni 1974); 3.928.140- Apparatus and Process for Testina Microparticle Response to its Environment zusammen mit V.R. Stull, W.L. Proctor und I. L. Miller (25. Dezember 1975); 4.101.383- Apparatus and Process for Testing Microparticle Response to its Environment zusammen mit V.R. Stull, W.L. Proctor und I. L. Miller (18. Juli 1978); und 4.140.018- Proqrammable Action Sampler System zusammen mit L. V. Maldarelli, D. T. Phillips, W. L. Proctor und T. G. Urquhart (20. Februar 1979).
Daher haben die Fachleute eine beträchtliche Notwendigkeit für eine empfindliche und doch relativ schnelle Nachweis- und Quantitativbestimmungstechnik erkannt, die sich selbst für einen breiten Bereich von Anwendungen anbietet. Die EP-A-0167335 offenbart ein Verfahren zum Nachweisen einer Bindungsreaktion zwischen einem Liganden und einem Anti-liganden, bei der ein vorbestimmtes Muster des Antiliganden auf einer Oberfläche gebildet wird, wobei darauf folgend die Oberfläche mit dem Liganden reagiert und dann so bestrahlt wird, daß die auffallende Strahlung einer Bragg-Streuung unterzogen wird. Die gestreute Intensität wird danachgewiesen, wodurch ein Hinweis auf die Bindungsreaktion gegeben wird, die aufgetreten ist. Eine ähnliche Technik ist in der EP-A-0112721 beschrieben, bei der Material, das eine zu untersuchende Art binden kann, auf eine zuvor gebildete Oberfläche geschichtet wird, das bevorzugt ein Gitter ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf verbesserte Verfahren und eine einzigartige Instrumentierung zum Nachweis und zur Quantitativbestimmung von chemischen Substanzen, und sie weist insbesondere eine Anwendung zum Nachweis und zur Quantitativbestimmung von immunologischen Substanzen auf.
Das erfinderische Verfahren weist die Schritte auf a) Anbringen an einer Oberfläche eines Reaktionsmateriales, von dem bekannt ist, daß es mit der nachzuweisenden immunologischen Substanz reagiert und sich damit verbindet oder dazu eine hohe Affinität aufweist, wobei die Substanz in mindestens einem Medium vorhanden ist; b) Beschießen der befestigten Oberfläche mit einer Quelle von kohärenter Strahlung; c) Messen eines Speckelmusters, der von der befestigten Oberfläche gestreuten Strahlung; d) Reagierenlassen der befestigten Oberfläche mit mindestens einem Medium, das die immunologische Substanz enthält; e) Beschießen der befestigten Oberfläche, die reagiert hat, mit im wesentlichen der gleichen kohärenten Strahlung mit im wesentlichen dem gleichen Winkel und der Orientierung, wie sie beim Ausführen des Schrittes b) benutzt wurden; f) Messen eines Speckelmusters der von der befestigten Oberfläche, die reagiert hat, gestreuten Strahlung, wobei das Muster der gestreuten Strahlung aus der Änderung der einfallenden Strahlung resultiert, die mit ihrer Änderung der Richtung, der Änderung der Frequenz, der Änderung der Intensität oder der Änderung der Polarisation einhergeht; und g) Vergleichen der in den Schritten b) und f) erhaltenen Speckelmuster der Strahlung zum Bestimmen irgendwelche Differenzierungen dazwischen.
Weiterhin weist das erfindungsgemäße Gerät in Kombination auf:
a) eine Oberfläche zum Anbringen eines reagierenden Materiales, von dem bekannt ist, daß es mit der nachzuweisenden immunologischen Substanz reagiert;
b) einen Laser zum Erzeugen kohärenter Strahlung und Mittel zum Richten der Strahlung in einen Weg zum Auftreffen auf die Oberfläche;
c) Mittel zum Halten der Oberfläche an einer festen Position und Orientierung in Bezug auf die einfallende kohärente Strahlung;
d) Mittel zum Messen eines Speckelmusters der von der Oberfläche gestreuten Strahlung, wobei das Mittel ein Feld von strahlungsempfindlichen Detektoren aufweist, ein Signal von jedem der Detektoren durch eine elektronische Analog-Digital-Wandeleinrichtung gewandelt wird und in einer Speichereinrichtung gespeichert wird; und
e) digitale Computermittel zum Vergleichen des Speckelmusters der Strahlung mit einem Speckelmuster der Strahlung, die nach Reaktion von der Oberfläche erzeugt ist.
Das Streuen des kohärenten Lichtes von einer Oberfläche resultiert daher in der Bildung von Speckelmustern, die durch jedes herkömmliche Mittel beobachtet werden können, wie das unbewaffnete Auge, oder auf einen Schirm projiziert werden können. Der Grad der Speckel wird bevorzugt quantitativ durch geeignete Meßmittel wie ein photometrischer Detektor oder ähnliches gemessen. Weiterhin können Nachweismittel, mit denen die relative Änderung des Speckelmusters beobachtet werden kann und gleichmäßige niederfrequente Frequenzmerkmale über einem Hintergrund von relativ hochfrequenten Speckeln wie durch räumliches Filtern nachgewiesen werden, benutzt werden zum Vergleichen der vorhergehend gemessenen Muster und dadurch Bestimmen irgendwelcher Differenzierungen dazwischen.
In einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform werden das erfindungsgemäße Verfahren und die Instrumentation in Zusammenhang mit einer festen Tragoberfläche wie ein durchsichtiges Glasfläschchen oder Teströhrchen benutzt, die einen Diffusor an einem Basisabschnitt davon aufweisen. Bei geeigneter Positionierung in Bezug auf die Quelle der kohärenten Strahlung ermöglicht eine Verschiedenheit komplexer interner Reflexionen das Belichten der befestigten Oberfläche mit der kohärenten Strahlung, und ein Abschnitt einer solchen Strahlung wird durch und aus einem offenen Abschnitt des Röhrchens heraus übertragen. Die heraustretende Strahlung aus dem Röhrchen wird zu einer Linsen- und Öffnungseinrichtung in Abhängigkeit des Grades des gewünschten Frequenzfilterns geführt.
Folglich ermöglicht die obige Ausführungsform räumliches Filtern hoher oder niedriger Frequenzmerkmale des Speckelmusters, dessen Sichtbarkeit durch Mustererkennungsverfahren, drehende Gitter und Masken wie auch andere Arten von Signalverarbeitung- und Verstärkungstechniken erhöht werden.
Wenn insbesondere das Musterabbild auf eine Multipixelnachweisvorrichtung projiziert wird, dann ergibt jede Auflösungszelle des Bildes, die der Größe des Pixels entspricht, einen digitalen Wert zum Speichern in zum Beispiel einer Computerspeichervorrichtung, der für den auf das Pixel während der Zeitdauer auffallenden Photonenfluß typisch ist.
In einer anderen Ausführungsform der Verbindung sind Mittel zum periodischen Drehen der befestigten Oberfläche zum bevorzugten Drehen der Oberfläche koaxial mit der einfallenden kohärenten Strahlungsquelle zum Erzeugen einer Drehung des Streumusters vorgesehen. Beim Drehen der Oberfläche und entsprechend Drehen des Streumusters kann das Muster mit geeigneten Analyseverfahren analysiert werden und über die Zeit und/oder Ausrichtung gemittelt werden zum Erhöhen der Genauigkeit des letzten analytischen Bestimmung.
Die einzigartige Instrumentierung dafür sieht ein vollständiges System zum bequemen, genauen quantitativen Messen der immunologischen Substanzen vor, die nachgewiesen werden sollen. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Instrumentation sehen folglich extrem empfindliche aber relativ schnelle Mittel für quantitative und qualitative Analyse vor, die eine breite Anwendung auf biologischen Gebieten darstellt.
Die obigen und andere Aufgaben und Vorteile werden aus der folgenden detaillierteren Beschreibung der Erfindung offensichtlich, die in Zusammenhang mit den Zeichnungen zu nehmen ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine chematische Zeichnung einer darstellenden Ausführungsform zum Durchführen eines Verfahrens des Nachweises und der Quantitativbestimmung einer chemischen Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung;
Fig. 2 ist eine schematische Zeichnung einer zweiten darstellenden Ausführungsform zum Ausführen eines Verfahrens des Nachweises und Quantitativbestimmung einer chemischen Substanz, wobei eine befestigte Oberfläche benutzt wird, die vorgeschriebene Durchlaßeigenschaften aufweist;
Fig. 3 stellt schematisch eine noch weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, die ein vollständiges System für qualitative und quantitative Analyse einer nachzuweisenden Substanz vorsieht;
Fig. 4 stellt schematische eine gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung dar, bei der eine räumliche Filtertechnik zum Nachweis von Oberflächenänderungen benutzt wird; und
Fig. 5 stellt ein einmaliges Mittel zum periodischen Drehen der befestigten Oberfläche koaxial mit dem einfallenden kohärenten Richtungsstrahl dar, wodurch eine Drehung des Streumusters erzeugt wird.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die vorliegende Erfindung beschreibt einen einmaligen Zugang zu Nachweisprozeduren und verschiedenen Instrumentationsverwirklichungen davon auf der Grundlage der Benutzung von kohärenter Strahlung.
Lange vor der Entwicklung des Lasers sind die Messung und die Theorie kohärenter Strahlung entwickelt worden von von Laue, van Cittert, Berek, Zernike, Wolf unter anderen. Eine Technik benutzte die Interferenz zwischen zwei Lichtquellen P&sub1; und P&sub2; an einem entfernten Punkt Q. Der Grad der Interferenz am Punkt Q hängt von dem Grad der Kohärenz der Quellen P&sub1; und P&sub2; ab.
Mit der Ankunft des Lasers und seinen extrem großen Kohärenzeigenschaften wurde eine Vielzahl von Quellenkohärenzeffekten sofort bemerkt, und eines der vordersten solcher Effekte was das Phänomen der Speckel.
Das Speckelphänomen wird normalerweise beobachtet, wenn ein Laserstrahl von einer Oberfläche reflektiert wird. Da die einfallende Laserwellenfront kohärent ist, ist jeder reflektierter Anteil hochkohärent in Bezug auf alle anderen. Beim Beobachten des reflektierten Lichtes beobachtet man ein speckelförmiges Aussehen der beleuchteten Oberfläche. Man glaubt, daß dies aufgrund der Interferenzen zwischen einzelnen Wellen auftritt, die an verschiedenen Teilen der Oberfläche entstehen.
Wäre die Oberfläche absolut glatt, würde man keine Speckel beobachten, die der inhärenten Rauigkeit der beobachteten Oberfläche entsprechen. Wenn der Winkel zwischen der Richtung der einfallenden Quelle und der Richtung der Beobachtung größer wird, nimmt im allgemeinen der Grad der Speckel zu.
Folglich ist es daher für eine Quelle kohärenter Strahlung wie ein Laser sehr schwierig, diese Effekte auszuschließen, selbst wenn der Laserstrahl durch verschiedene Diffusoren vor dem Auftreffen auf die Oberfläche geht. Es wird daher gesagt, daß Laserlicht eine sehr große Kohärenzlänge aufweist.
Das Streuen von kohärentem Licht von einer Oberfläche resultiert daher in der Bildung Speckelmustern, die durch das unbewaffnete Auge beobachtet werden können oder auf einen Schirm projiziert werden können. Der Grad der Speckel oder das gespränkelte Aussehen ist proportional zu der inhärenten Rauigkeit der untersuchten Oberfläche als auch dem Einfallswinkel des Lichtes, dem Beobachtungswinkel des gestreuten oder durchgelassenen Lichtes und der Wellenlänge und Polarisation des einfallenden Lichtes.
Folglich erzeugt jede Änderung in den Oberflächeneigenschaften, die die Rauigkeit oder Gleichmäßigkeit beeinflußt, eine zugeordnete Änderung in dem erzeugten Speckelmuster, obwohl diese Änderungen relativ gering sein können. Daher beeinflussen das Anhaften an einer Oberfläche oder die Erosion von einer Oberfläche, die zum Beispiel von einer chemischen Reaktion herrühren, das resultierende Muster, das von der reagierende Oberfläche erzeugt wird.
Die vorliegende Erfindung sieht einmalige Verfahren und Instrumentierung zum Nachweis und zur Quantitativbestimmung von immunologischen Substanzen vor, die zum Beispiel in einem gasförmigen, fluidförmigen oder festen Medium oder einer Kombination davon vorhanden sind.
Bei einer Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Verfahren die Schritte auf: a) Befestigen auf einer Oberfläche eines reagierenden Mittels, das bekannt ist, das es mit der nachzuweisenden immunologischen Substanz reagiert zum damit Verbinden oder eine relativ hohe Affinität dazu hat, wobei die Substanz in mindestens einem Medium vorhanden ist; b) Beschießen der befestigten Substanz mit einer Quelle kohärenter Strahlung; c) Messen eines Speckelmusters der von der befestigten Substanz gestreuten Strahlung; d) Reagierenlassen der befestigten Oberfläche mit mindestens einem Medium, das die immunologische Substanz enthält; e) Beschießen der befestigten Substanz, die reagiert hat, mit im wesentlichen der gleichen kohärenten Strahlung unter im wesentlichen dem gleichen Winkel und Orientierung, wie sie beim Ausführen des Schrittes b) benutzt worden sind; f) Messen eines Speckelmusters einer Strahlung, die von der befestigten Oberfläche, die reagiert hat, gestreut ist, wobei das Muster der gestreuten Strahlung aus der Änderung in der einfallenden Strahlung resultiert, die mit der Änderung der Richtung, der Änderung der Frequenz, der Änderung der Intensität oder der Änderung der Polarisation verknüpft ist; und g) Vergleichen der in den Schritten b) und f) erhaltenen Speckelmuster der Strahlung zum Bestimmen einer Differenzierung dazwischen. Die erfindungsgemäßen Verfahren und einmalige Instrumentation sehen dadurch ein extrem empfindliches doch relativ schnelles Mittel zur quantitativen und qualitativen Analyse vor, das auf einen breiten Bereich biologischer Gebiete anwendbar ist.
Unter Bezugnahme auf die Beschreibung der Erfindung hierin werden die folgenden Definitionen für ein Verständnis des Geistes und des Umfanges der Erfindung sein, wenn sie auf den Nachweis und die Quantitativbestimmung immunologischer Substanzen angewendet wird.
Der Ausdruck "immunologische Substanz" bezieht sich allgemein auf jede Form eines natürlichen oder komplexen Proteins oder einer Mischung von Verbindungen, die eine spezielle Affinität für andere chemische Gruppen oder Verbindungen aufweisen, die nur durch den auslösenden Effekt des Immunsystemes erzeugt ist. Solche Substanzen enthalten, sind jedoch nicht darauf begrenzt, natürliche und/oder komplexe Proteine, die auf Zellenoberflächen gefunden werden zum Beispiel Antikörper, Antigene und Allergene.
Der Ausdruck "Antikörper" bezieht sich allgemein auf ein resultierendes Protein, das von dem Immunsystem eines Tieres als Reaktion auf die Stimulierung durch das Einführen eines fremden Proteins erzeugt wird.
Der Ausdruck "Antigen" bezieht sich allgemein auf eine Substanz oder den Teil einer Substanz, die eine Immunreaktion und darauf folgend die Produktion von dafür spezifischen Antikörpern stimuliert.
Der Ausdruck "Allergen" bezieht sich allgemein auf eine Substanz, die eine Antikörperreaktion in einem Menschen oder anderen tierischen Leben erzeugt einschließlich mono- und polyklonaler Antikörper.
Der Ausdruck "Strahlung" bezieht sich allgemein auf elektromagnetische Strahlung wie Licht, Röntgenstrahlen, infrarote und/oder andere elektromagnetische Wellen.
Der Ausdruck "Streuung" bezieht sich allgemein auf ein Phänomen, das mit der Änderung einer einfallenden Strahlung verbunden ist, die mit einer Änderung der Richtung, Frequenz, Intensität und/oder Polarisation verknüpft ist, aber nicht darauf begrenzt ist.
Der Ausdruck "Oberfläche" bezieht sich allgemein auf eine Schnittstelle, die zwei Medien und/oder Phasen trennt.
Es wird jetzt auf die Zeichnungen Bezug genommen, in Fig. 1 ist in schematischer Form eine illustrative Ausführungsform zum Durchführen eines Verfahrens des Nachweises und der Quantitativbestimmung einer immunologischen Substanz, zum Beispiel von Antikörpern, die in einem Flüssigmedium wie ein menschliches Serum vorhanden sind, gezeigt.
Eine Oberfläche 10 wie ein Mikroskopobjektträger oder ähnliches weist daran befestigt eine immunologische Substanz, zum Beispiel ein Antigen auf. Das Befestigen kann durch jedes bekannte Mittel wie thermische Behandlung oder chemische Behandlung unter anderem bewirkt werden. Die vorbereitete Oberfläche 10 (im folgenden als "die befestigte Oberfläche" bezeichnet), die jetzt ein reagierendes Material trägt, von dem bekannt ist, daß es mit einer nachzuweisenden immunologischen Substanz reagiert und sich damit verbindet, wird anfänglich mit Mitteln zum Zuführen kohärenter Strahlung wie eine Laserquelle 20 beschossen. Optional ist zusammen mit dem Laser 20 ein Mittel 30 wie ein Strahlausweiter angebracht, der die Fläche der befestigten Oberfläche 10 erweitert auf die die kohärente Strahlung auftritt, wodurch entsprechend die Fläche der befestigten Oberfläche 10 vergrößert wird, die qualitativ und quantitativ untersucht wird.
Für den Fachmann ist es leicht ersichtlich, daß die Benutzung von Mitteln zum Verändern der kohärenten Strahlung vor dem Auftreffen optional ist und klarerweise nicht gemäß der vorliegenden Erfindung notwendig ist. Für den Fall, in dem ein relativ klein ausgewählter Abschnitt der befestigten Oberfläche 10 zu untersuchen ist, ist keine Ausweitung des Laserstrahles nötig. Weiterhin kann die kohärente Strahlung durch jedes gewünschte Mittel wie ein Strahldiffusor, ein Strahlfilter oder andere modifizierende Mittel modifiziert werden.
Durch das Auftreffen auf die befestigte Oberfläche 10 wird ein Teil der Strahlung gestreut und zu einem Nachweismittel 40 wie ein Schirm gerichtet, wodurch ein Speckelmuster 50 erzeugt wird, das darauf angezeigt wird.
Aufgrund des relativ hohen Grades von Kohärenz, das immer noch in der gestreuten Strahlung vorhanden ist, kann die relative Rauigkeit der Oberfläche des Schirmes 40 selbst zu dem beobachteten Speckelmuster beitragen. Im allgemeinen wird dieser Beitrag jedoch ein kleiner konstanter Anteil des gesamten darauf erzeugten Speckelmusters sein, und er wird nicht die Genauigkeit und Präzision der vorliegenden Methode zerstören.
Für den Fachmann wird es unmittelbar einsichtig sein, daß eine breite Vielfalt von Nachweismitteln 40 alternativ zum Beobachten des Speckelmusters 50 entsprechend dem Charakter der befestigten Oberfläche 10 benutzt werden können. Indem zum Beispiel das Auge an die Schirmposition gebracht wird und zu der beleuchteten befestigten Oberfläche 10 blickt, können die Speckel 50 leicht beobachtet werden.
Das Speckelmuster 50 wird bevorzugt dann quantitativ durch geeignete Meßmittel wie ein photometrischer Detektor oder ähnliches gemessen.
Danach reagiert die befestigte Oberfläche 10, die zum Beispiel das Antigen trägt, mit dem Fluidmedium oder den Media, die zu testen sind. Nach ausreichender Zeit zum Reagieren, die von einigen Sekunden bis zu 24 Stunden variiert, wie es für die spezielle Probe notwendig ist, wird das überflüssige Fluid entfernt.
Nach dem Kontakt zwischen der befestigten Oberfläche 10 und dem zu testenden Medium oder Media, die jetzt "reagierte befestigte Oberfläche" kann wahlweise behandelt werden, zum Beispiel gebrütet werden, gewaschen werden, getrocknet oder weiter konventionell behandelt werden, wie es für die nachzuweisende spezifische Substanz angemessen sein kann. Es soll jedoch verstanden werden, daß solche folgende Behandlung nicht notwendig sein kann in Abhängigkeit der benutzten Substanzen und der Empfindlichkeit der auszuführenden Probe gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die reagierte befestigte Oberfläche wird wieder mit im wesentlichen der gleichen kohärenten Strahlung und der im wesentlichen dem gleichen Winkel und Orientierung beschossen, die zum vorigen Messen der befestigten Oberfläche 10 benutzt wurde.
Danach wird eine andere Messung des Speckelmusters 50' der von der reagierten befestigten Oberfläche gestreuten Strahlung durchgeführt und optional quantifiziert. Das Speckelmuster 50' wird dann mit dem zuvor gemessenen Speckelmuster 50 verglichen. Es wird Bezug genommen auf den Nachweis immunologischer Substanzen, das Anhaften oder die Affinität von Antikörpern zu Antigenplätzen, die an die Oberfläche hafteten, wurde derart beobachtet, daß eine mikroskopische reguläre Rauigkeit auf einer relativ glatten Tragoberfläche resultierte.
Nach dem Durchgang von hochkohärentem Licht, das davon oder dadurch gerichtet war, wurde folglich ein resultierendes Speckelmuster erzeugt, das einen relativ hohen Grad gestreifter Organisation zusätzlich zu den Überbleibseln des überlebenden Speckelmusters aufwies. Es wird angenommen, daß der Grad der organisierten Streifigkeit korreliert werden kann als direktes Maß des Betrages von Antikörpern, die mit dem an der Oberfläche befestigten Antigen kombiniert haben.
Für den Fachmann ist es leicht verständlich, daß es viele Mittel gibt, durch die die relative Änderung des Speckelmusters beobachtet und reguläre niederfrequente Merkmale auf einem Hintergrund relativ hochfrequenter Speckel erfaßt werden können. Ein Beispiel solcher Mittel ist räumliches Filtern, das im einzelnen hier beschrieben wird.
Es wird jetzt Bezug genommen auf Fig. 2, dort ist eine zweite Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung dargestellt, bei der ein reagierendes Material, von dem bekannt ist, daß es mit einer nachzuweisenden Substanz reagiert und damit verbindet oder eine relativ hohe Affinität dazu hat, auf der Oberfläche 10 befestigt ist. Die Oberfläche 10 in dieser Ausführungsform ist von dem Typ, der vorgeschriebene Durchlaßeigenschaften aufweist und bevorzugt durchsichtig sein kann.
Wie bei der vorigen Ausführungsform wird die befestigte Oberfläche 10 mit kohärenter Strahlung beschossen, wie sie von der Laserquelle 20 erhalten wird. Der Laserstrahl wird optional durch einen Strahlausweiter 30 modifiziert, zum Beispiel ein Objektiv relativ kurzer Brennweite, entsprechend der zu beschießenden Fläche.
Das resultierende Muster der kohärenten Strahlung, die durch die befestigte Oberfläche durchgegangen ist, wird geeigneter Weise gemessen, wie zuvor beschrieben wurde. Danach reagiert die befestigte Oberfläche mit mindestens einem zu testenden Medium, das die nachzuweisende immunologische Substanz enthält.
Die reagierte befestigte Oberfläche wird wieder mit im wesentlichen der gleichen kohärenten Strahlung unter im wesentlichen dem gleichen Winkel und Orientierung beschossen, wie sie zuvor benutzt wurden, und das erzeugte Strahlungsmuster wird wieder gemessen. Danach werden die gemessenen Strahlungsmuster verglichen zum Bestimmen irgendwelcher Differentiationen dazwischen.
Fig. 3 stellt eine noch weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, die ein vollständiges System zur qualitativen und quantitativen Analyse der nachzuweisenden immunologischen Substanz vorsieht.
Bei der dritten Ausführungsform erzeugt die von zum Beispiel einer Laserquelle 20 abgeleitete kohärente Strahlung einen Strahl, der durch geeignetes Mittel wie einen Strahlausweiter 30 ausgeweitet wird und auf die befestigte Oberfläche 10.
Eine räumliche Filteroptik 70 sieht ein resultierendes Signal vor, das zum Beispiel durch eine photometrische Detektorvorrichtung 80 nachgewiesen wird. Die photometrische Detektorvorrichtung 80 ist bevorzugt mit einer geeigneten Signalverstärkervorrichtung 90 verbunden, die das abgeleitete photometrische Signal verstärkt. Danach wird das verstärkte Signal zu einem Signalprozessor 100 zugeführt zum Übertragen in digitaler Form und zu einer zentralen Verarbeitungseinheit 110 geführt, zum Beispiel zu einer geeigneten Mikroprozessoreinheit.
Bevorzugt ist in der zentralen Verarbeitungseinheit 110 eine Speichervorrichtung 120, eine Ausgabedruckervorrichtung 130 und ein Kathodenstrahlröhren-(CRT)-Anschluß 140 vorgesehen, wodurch Benutzer- und Programmsteuerung für das System vorgesehen werden. Die befestigte Oberfläche 10 kann geeigneterweise zum Bestrahlen und Messen durch eine programmierte Vorrichtung wieder orientiert werden, die in der Zentralverarbeitungseinheit 110 eingebaut ist. Die räumliche Filteroptik 70 kann ebenfalls durch die Zentralverarbeitungseinheit 110 programmiert werden.
Bei einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform, wie sie in Fig. 4 dargestellt ist, wird das erfindungsgemäße Verfahren und Instrumentation in Zusammenhang mit einer zylindrischen Oberfläche wie ein durchsichtiges Fläschchen oder Teströhrchen 150 verwendet, das aus geeignetem Material zusammengesetzt ist. Solche Materialien sind zum Beispiel in dem US-Patent 3 720 760 offenbart, das am 13. März 1973 an Bennich u. a. ausgegeben ist. Das Röhrchen 150 weist einen Diffusor 160 an seinem Basisabschnitt auf. Zum Beispiel kann ein kleiner Diffusor oder Knopf während des Gießens des Fläschchens gebildet werden.
Der Diffusor 160 wirkt als Linse mit sehr kurzer Brennweite zum Einkoppeln eines wesentlichen Anteiles des einfallenden Laserlichtes in das Innere des Röhrchens, sehr in der Form eines Wellenleiters.
Das Röhrchen 150 wird bevorzugt durch eine Haltevorrichtung 170 zum Positionieren und Zentrieren der Längsachse des Röhrchens 150 in den Weg der Laserstrahlachse gehalten. Eine Vielzahl von Komplexen internen Reflexionen ermöglichen das Belichten der befestigten Oberfläche 150' mit der kohärenten Strahlung, wobei ein Teil solcher Strahlung durch das Röhrchen 150 und aus einem offenen Abschnitt des Röhrchens übertragen wird. Die entweichende Strahlung von dem Röhrchen 150 wird zu einer ersten Linsenvorrichtung 180 gerichtet.
In der Brennebene der Linsenvorrichtung 180 ist eine Öffnungsvorrichtung 190 zum Auswählen des zentralen Abschnittes des Strahles (wenn hohe Frequenz gewünscht wird) oder zum Blockieren des zentralen Abschnittes des Strahles (wenn niedrige Frequenz gewünscht wird) positioniert.
Eine zweite Linsenvorrichtung 200 ist in einem Abstand von dem Schirm 210 positioniert, der im wesentlichen gleich ihrer Brennweite ist. Folglich wird ein Bild auf einer Photodetektorvorrichtung 220 erzeugt, die das abgeleitete Signal von dem einfallenden Bild an eine Verarbeitungseinheitsvorrichtung 230 überträgt.
Die obige Ausführungsform ermöglicht das räumliche Filtern der hohen oder niedrigen Frequenzmerkmale des Speckelmusters, wie es für den Fachmann sofort ersichtlich ist. Da das Speckelmuster im allgemeinen den hochfrequentigen Komponenten entspricht, sind irgendwelche regulären Strukturen, die auftreten, nachdem die Oberfläche reagiert hat, von niederer Frequenz sein, deren Sichtbarkeit durch die oben erwähnten oder andere Mittel erhöht werden kann, die Mustererkennungsprozeduren, drehende Gitter und Masken wie andere Typen von Signalverarbeitungs- und Verstärkungstechniken enthalten, aber nicht darauf beschränkt sind.
Die in Fig. 4 dargestellte räumliche Filtertechnik ist eine illustrative Prozedur zum Nachweisen der Oberflächenänderungen, die mit der Bildung regulärer Strukturen verknüpft ist, wie zuvor beschrieben wurde. Für feinere Änderungen wird es ersichtlich sein, daß digitale Verarbeitungstechniken anwendbar und bevorzugt sind.
Wenn insbesondere das Musterbild auf eine Multipixelnachweisvorrichtung wie ein Retikonfeld des Types projiziert wird, wie er von EG hergestellt wird, dann ergibt jede Auflösungszelle des Bildes, die der Größe des Pixels entspricht, einen digitalen Wert zum Speichern in einer Computerspeichervorrichtung, der charakteristisch ist für den auf das Pixel auffallenden Photonfluß während der Zeit der Messung.
Nach dem Belichten der befestigten Oberfläche und Reagieren mit einem Material und Wiederuntersuchung unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen der auftreffenden Strahlung kann ein anderer Satz von Pixelwerten digital erzeugt und gespeichert werden. Wenn die gespeicherte Information zwei gestreute Muster in einer Computervorrichtung betrifft, ist es eine relativ klare Aufgabe des Durchführens einer Korrelationsberechnung zwischen zwei oder mehr Sätzen von digitalisierten Pixelwerten. Kleine Korrelationen entsprechen höheren Konzentrationen des reagierenden Mittels und umgekehrt.
Die Analyse und Vergleich solcher komplexer Streumuster der Strahlung und Indifferenz kohärenter Strahlung von einer vorbereiteten Oberfläche können verstärkt werden durch die Untersuchung verschiedener Merkmale des Musters, das bei verschiedenen Orientierungen zu der Quelle der einfallenden Strahlung erzeugt wird.
In Bezug auf das Letztere stellt Fig. 5 Mittel zum Untersuchen der befestigten Oberfläche und der reagierten befestigten Oberfläche bei verschiedenen Orientierungen zu der einfallenden Quelle dar. Dargestellt in einer Ausführungsform ist ein Mittel 240, das eine periodische Drehung der Oberfläche (in diesem Falle eines Röhrchens 150) koaxial ausgerichtet mit dem einfallenden Laserstrahl und ein Photodetektor- oder digitales Detektorfeld vorsieht. Das Röhrchen 150 ist auf einer Tragvorrichtung 250 angebracht, wobei seine Umfangsoberfläche auf zylindrischen Lagern 260 ruht, wodurch eine freie Rotation ermöglicht wird.
Ein Reibungsriemen 270, der zum Beispiel aus Gummi oder ähnlichem zusammengesetzt ist, wird angrenzend an die äußere Oberfläche des Röhrchens zum Vorsehen eines zusätzlichen Kontaktpunktes positioniert.
Eine Motorvorrichtung 280 treibt den Riemen 270 gegen die äußere Oberfläche des Röhrchens 150, wodurch eine Drehung des Röhrchens 150 und entsprechend eine Drehung des Streumusters resultieren, das aus dem offenen Ende des Röhrchens 150 heraustritt.
Mit der Drehung des Röhrchens 150 und der entsprechenden Drehung des Streumusters kann das Streumuster gemäß der zuvor beschriebenen Analyseverfahren analysiert werden und bezüglich der Zeit und/oder Orientierung gemittelt werden. Die Präzision des schlußendlichen Vergleiches der Muster der Strahlung zum Bestimmen irgendwelcher Differentiationen dazwischen kann so bequem gemäß einem noch anderen Merkmal der vorliegenden Erfindung erhöht werden.
Während sich die zuvor angegebene Beschreibung allgemein auf spezielle nachzuweisende und quantitativ zu bestimmende immunologische Substanzen als auch auf die Strahlung im sichtbaren Spektrum bezog, ist es für den Fachmann leicht ersichtlich, daß eine Vielzahl von speziellen chemischen Substanzen bestimmt werden kann, und daß das erfindungsgemäße System in dem nichtsichtbaren Spektrum wie Röntgenstrahlen, ultravioletter und infraroter Strahlung benutzt werden kann. Weiterhin kann das Medium oder die Media, die die nachzuweisende chemische Substanz enthalten eine Flüssigkeit sein wie Wasser, eine Mischung von Gasen wie Luft oder sie können fest wie Erde sein. Folglich wird ein voller Bereich von Nachweismöglichkeiten mit einem breiten Bereich der Anwendbarkeit auf chemische Substanzen des biologischen Ursprunges auf der Grundlage der Benutzung kohärenter Strahlung umfaßt.
Bei der Anwendung auf nachzuweisende und quantitativ zu bestimmende immunologische Substanzen ist für den Fachmann der volle Bereich von Oberflächen, an denen angebracht wird und sie den Klassen von Reaktionsmaterialien, die zum Ausführen der vorliegenden Erfindung nützlich sind, ersichtlich.
Folglich erfüllt die vorliegende Erfindung die deutliche Forderung nach einer empfindlichen und doch schnellen Nachweis- und Quantitativbestimmungstechnik, die eine Anwendung auf einen breiten Bereich biologischer Gebiete hat.

Claims

1. Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart einer immunologischen Substanz in einem Medium, mit den Schritten:

a) Befestigen eines reagierenden Materiales an einer Oberfläche, von dem bekannt ist, daß es mit der nachzuweisenden immunologischen Substanz reagiert, wobei die immunologische Substanz in mindestens einem Medium vorhanden ist;

b) Beschießen der befestigten Oberfläche mit einer Quelle kohärenter Strahlung;

c) Messen eines Speckelmusters der von der befestigten Oberfläche gestreuten Strahlung;

d) Reagierenlassen der befestigten Oberfläche mit mindestens einem die immunologische Substanz enthaltenden Medium;

e) Beschießen der reagierten befestigten Oberfläche unter im wesentlichen dem gleichen Winkel und Orientierung, wie sie in Schritt b) benutzt worden sind;

f) Messen eines Speckelmusters der von der reagierten befestigten Oberfläche gestreuten Strahlung, wobei das Muster der gestreuten Strahlung aus der Änderung in der einfallenden Strahlung resultiert, die mit der Änderung der Richtung, Änderung der Frequenz, Änderung der Intensität oder Änderung der Polarisation einhergeht; und

g) Vergleichen der in den Schritten b) und f) erhaltenen Speckelmuster der Strahlung zum Bestimmen irgendeines Unterschiedes dazwischen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das reagierende Material mit der immunologischen Substanz reagiert und sich verbindet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das reagierende Material mit der nachzuweisenden immunologischen Substanz reagiert und eine relativ hohe Affinität dazu hat.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche weiter mit den Schritten des Bebrütens der befestigten Oberfläche mit dem die immunologische Substanz enthaltenden Medium.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche weiter mit dem Schritt des Waschens und/oder Trocknens der befestigten Oberfläche vor dem Beschießen.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche weiter mit dem Schritt des Entfernens eines jeglichen überschüssigen Mediums von der reagierten befestigten Oberfläche vor dem Beschießen der Oberfläche.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche weiter mit dem Schritt des Aufzeichnens der in den Schritten b) und f) erhaltenen Speckelmuster der Strahlung.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Aufzeichnen durch Aufwerfen der Speckelmuster auf ein Detektorfeld und Wandeln jedes Detektorsignales in eine Darstellung der darin nachgewiesenen relativen Intensität bewirkt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die aufgezeichneten Speckelmuster miteinander durch Berechnen der mathematischen Korrelation zwischen entsprechenden Feldelementen eines jeden Musters verglichen werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Menge der nachzuweisenden immunologischen Substanz aus dem Grad der Korrelation zwischen den entsprechenden Feldelementen der Speckelmuster abgeleitet wird.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche weiter mit dem Schritt des Quantitativbestimmens jeglicher Unterschiede zwischen den in den Schritten b) und f) erhaltenen Speckelmuster der Strahlung als Maß der Gegenwart und des Betrages der nachzuweisenden immunologischen Substanz.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die kohärente Strahlung durch einen Laser erzeugt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der Laser kohärente Strahlung im sichtbaren Spektrum erzeugt.

14. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der Laser Röntgenstrahlung, infrarote oder ultraviolette Strahlung oder andere Strahlung in dem nicht sichtbaren Spektrum erzeugt.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die immunologische Substanz ein natürliche Protein, ein komplexes Protein, Antikörper, Antigen oder Allergen ist.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Oberfläche eine zwei medien- oder phasentrennende Schnittstelle ist.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das die immunologische Substanz enthaltende Medium fest oder ein menschliches Serum, ein tierisches Serum, Wasser oder ein anderes flüssiges Medium oder Luft oder ein anderes gasförmiges Medium ist.

18. Vorrichtung zum Nachweisen der Gegenwart und zum Bestimmen der Menge einer immunologischen Substanz in einem Medium, wobei die Vorrichtung folgende Kombination aufweist:

a) eine Oberfläche zum Befestigen eines reagierenden Materials, von dem bekannt ist, daß es mit der nachzuweisenden immunologischen Substanz reagiert;

b) einen Laser zum Erzeugen kohärenter Strahlung und Mittel zum Richten der Strahlung in einen Weg zum Auftreffen auf die Oberfläche;

c) Mittel zum Halten der Oberfläche an einer festen Position und Orientierung im Bezug auf die einfallende kohärente Strahlung;

d) Mittel zum Messen eines Speckelmusters der von der Oberfläche gestreuten Strahlung, wobei das Mittel ein Feld von strahlungsempfindlichen Detektoren aufweist, bei dem ein Signal von jedem der Detektoren durch ein elektronisches Analog-Digital-Wandelmittel umgewandelt wird und in einem Speichermittel gespeichert wird; und

e) digitales Computermittel zum Vergleichen des Speckelmusters der Strahlung mit einem Speckelmuster der Strahlung, die von der Oberfläche nach der Reaktion erzeugt wird.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, die die folgende Kombination aufweist:

a) eine durchlassende Oberfläche zum Befestigen eines reagierenden Materials, von dem bekannt ist, daß es mit der immunologischen Substanz reagiert;

b) einen Laser zum Erzeugen kohärenter Strahlung in einer Richtung zum Auftreffen auf die Oberfläche;

c) Mittel zum Halten der durchlässigen Oberfläche an einer festen Position und Orientierung im Bezug auf den Laser;

d) Mittel zum Messen eines Musters einer Speckelstrahlung, die durch die Oberfläche durchgelassen ist, wobei das Mittel ein Feld von strahlungsempfindlichen Detektoren aufweist, bei dem ein Signal von jedem der Detektoren durch ein elektronisches Analog-Digital-Wandelmittel gewandelt wird und in einem Speichermittel gespeichert wird; und

e) digitales Computermittel zum Vergleichen des aufgezeichneten Speckelmusters der Strahlung, die durch die Oberfläche durchgelassen ist, nach dem Reagieren des reagierenden Materials.

20. Vorrichtung nach Anspruch 18 oder 19, bei dem der Laser Strahlung in dem sichtbaren oder nicht sichtbaren Spektrum erzeugt.

21. Vorrichtung nach einem der Anspruch 18 bis 20 weiter mit Mittel zum Quantitativbestimmen der Speckelmuster der Strahlung und jeder Unterschiede dazwischen, wodurch ein quantitatives Maß der Menge der Substanz in dem Medium gegeben ist.

22. Vorrichtung nach Anspruch 21, bei der das Mittel zum Quantitativbestimmen der Unterschiede zwischen den Speckelmustern der Strahlung aufweist:

a) Mittel zum Fokussieren des Speckelmusters;

b) Öffnungsmittel zum Abdecken eines Teiles des fokussierten Speckelmusters in einer Brennebene des Fokussiermittels;

c) Mittel zum Wiederherstellen des verbleibenden Speckelmusters, das durch das Öffnungsmittel geht, durch ein zweites Fokussiermittel; und

d) Nachweismittel, das ein Maß des resultierenden wiederhergestellten Speckelmusters ergibt, das darauffällt.