DE3628508A1 - Polypeptide und verfahren zur herstellung derselben - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Polypeptide, die der Humansuperoxiddismutase analog sind, welche eine Sequenz von mindestens 152 Aminosäuren aufweisen und durch die folgende, allgemeine Formel (I) dargestellt werden:

Dabei bedeutet X₁ ein Wasserstoffatom, eine Acetylgruppe oder einen Aminosäurerest, X₂ und X₃ können gleich oder verschieden sein und bedeuten jeweils einen Aminosäurerest, und falls X₂ für Cys steht, bezeichnet X₃ einen Aminosäurerest, der nicht Cys ist. Die Erfindung betrifft ferner das Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden der Formel (I) sowie ihre Kupfer- und/oder Zink-koordinierten Dimeren gemäß der folgenden Formel (II)

wobei Y₁ und Y₂ unabhängig für eine ganze Zahl von 0 bis 4 stehen und Y₁ + Y₂ 2 oder 4 ist.

Superoxiddismutase (im folgenden als "SOD" abgekürzt) ist eine Verbindung, die erstmals von Fridovich, McCord et al. im Jahre 1969 im Zuge ihrer Untersuchungen der Xanthinoxidase als Enzym mit der Fähigkeit zur Umwandlung von Superoxiden, die als Zwischenprodukte bei der Oxidation von Xanthinoxidase entstehen, gefunden wurde. Die Verbindung kann auf verschiedene Weise gereinigt werden, z. B. durch eine Hitzebehandlung [JA-AS 39 832/ 1970 und 48 721/1974; Sugiura et al., J. Pharm. Dyn. 4, 235-244 (1981), etc.], durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat und Fällung in einem organischen Lösungsmittel [JA-OS 1 55 991/1982; A. G. Stephen et al., Biochimica et Biophysica Acta, 289, 276-283 (1972)], durch Gelfiltrationschromatographie [JA-OSen 1 02 787/1981 und 10 382/ 1982), durch Affinitätschromatographie (JA-OS 1 21 791/ 1983) usw. Diese SOD hat Aufmerksamkeit erweckt unter dem Gesichtspunkt des Schutzmechanismus gegen Sauerstofftoxizität im lebenden Körper. Sie wird derzeit als entzündungshemmdendes Mittel zur Behandlung von chronischer arthrorheumatischer Osteoarthritis, zur Behandlung von strahlungsinduzierten Nebenwirkungen, bei bestimmten Urosen und dergl. verwendet. Insbesondere Rinderleber-SOD wird klinisch eingesetzt.

Mittlerweile ist die Sequenz der Aminosäuren bei Humanerythrocyt Cu-Zn-SOD kürzlich berichtet worden [Jabusch et al., Biochemistry, 19, 2310-2316 (1980); und Barra et al., FEBS Letters, 120, 53-55 (1980)]. Es gibt ferner einen Bericht über die Basensequenz in einem Gen der SOD, das vom Menschen stammt (human-origin SOD, im folgenden als "h-SOD" bezeichnet") [Sherman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5465-5469 (1983)]. Die Herstellung von h-SOD in Escherichia coli (im folgenden als "E.coli" bezeichnet) und Hefe durch genetische Verfahren wurde ebenfalls beschrieben (JA-OS 1 37 286/1985).

Um SOD klinisch einsetzen zu können, insbesondere als entzündungshemmendes Mittel oder für andere therapeutische Zwecke, ist es von besonderer Bedeutung, daß physiologisch akzeptable SOD in stabiler Weise zur Verfügung gestellt wird. Um die in vivo-Applikation von SOD beim Menschen zu ermöglichen, ist SOD erforderlich, die im Hinblick auf voraussehbare immunologische Probleme eine h-SOD sein muß oder zumindest ein h-SOD-analoges Polypeptid in einer immunologisch akzeptablen Klasse und auch ein homogenes Enzym sein muß. Hinsichtlich h-SOD besteht jedoch ein Problem bei ihrer stabilen Zurverfügungstellung.

Im Hinblick auf diesen Stand der Technik ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue h-SOD-analoge Polypeptide zur Verfügung zu stellen, welche sich als Medikamente eignen. Es wurde festgestellt, daß rekombinante h-SOD in vorteilhafter Weise erhalten werden kann, falls man eine genetische Operation anwendet.

Die rekombinante h-SOD (I) hat gleich große oder höhere Aktivitäten als native h-SOD. Anders als bei nativer h-SOD werden keine geladenen Isomere beobachtet. Es handelt sich daher um ein hochreines Produkt mit äußerst hoher Stabilität. Verglichen mit nativer h-SOD verhält sich das Produkt auch äußerst stabil im Zeitverlauf in wäßrigen Lösungen oder in Wasser-organischen Lösungsmittel- Lösungen. Zusätzlich ist das Produkt frei von Nebeneffekten, wie Antigenizität. Die rekombinante h-SOD (I) der vorliegenden Erfindung kann daher in effektiver Weise verwendet werden, z. B. als entzündungshemmendes Mittel und als Medikament für weitere therapeutische Zwecke sowie als Rohmaterial für klinische Diagnosen und dergl.

Im folgenden wird die Erfindung anhand bevorzugter Ausführungsformen in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen erläutert; es zeigen:

Fig. 1 die Basensequenz des SOD-Polypeptids von einem Plasmid pSOD14, konstruiert in Beispiel 1;

Fig. 2 die Restriktions-Endonucleasekarte eines DNA-Fragments, enthaltend das h-SOD-Gen;

Fig. 3 das h-SOD-Gen und sein korrespondierendes Polypeptid, aufgebaut aus 153 Aminosäuren;

Fig. 4 ein vereinfachtes Fließschema der Rekombination für die Konstruktion eines Plasmids pSOD6;

Fig. 5 ein vereinfachtes Fließschema der Rekombination für die Konstruktion des Plasmids pSOD14;

Fig. 6 ein Elektropherogramm eines h-SOD-analogen, rekombinanten Polypeptids, erhalten in Beispiel 1;

Fig. 7 ein vereinfachtes Fließschema der Rekombination für die Konstruktion eines Plasmids pTJ102-SOD14; und

Fig. 8 ein Elektropherogramm eines h-SOD-analogen, rekombinanten Polypeptids, erhalten in Beispiel 5 (auf der linken Seite), und von nativem h-SOD (auf der rechten Seite).

Im Hinblick auf das Endziel h-SOD haben die Erfinder zunächst RNA aus dem Gewebe einer normalen Humanleber gesammelt, welche vollständig entfernt worden war. Nachdem man Poly(A)⁺RNA erhalten hatte, wurde c-DNA nach Routineverfahren des genetic engineering synthetisiert. Im Anschluß an seine Rekombination zu einem Vektor wurde dann E.coli unter Verwendung des Vektors transformiert. Das E.coli wurde dann kultiviert, gefolgt von einem Screening hinsichtlich eines Klons mit dem h-SOD- Gen aus der resultierenden Kolonie. Aus dem obigen Klon wurde DNA mit dem h-SOD-Gen erhalten, indem man als Sonde ein synthetisches Nucleotid verwendet, das der 5-Aminosäure- Einheit, -5′ATGGCGACGAAGGCC3′- des N-Terminals von h-SOD, entspricht. Durch die Restriktions-Endonucleasen Pst I und Pvu II wird das Gel als 700bp DNA- Fragment, enthaltend das h-SOD-Gen, erhalten. Aus dem obigen DNA-Fragment wird ferner eine Restriktionsenzymkarte, wie in Fig. 2 gezeigt, erhalten unter Verwendung der Restriktions-Endonucleasen TthHB8I, Stu I, Hinf I, Rsa I, Fok I, Fnu 4Hi und Sau 3AI. Basierend auf der Restriktionsenzymkarte wird die Basensequenz im Codierungsbereich des h-SOD-Polypeptids angegeben, und zwar nach der Maxam-Gilbert-Methode [Method Enzymol, 65, 449 (1979)]. Auf diese Weise wird die Polypeptid-Sequenz von h-SOD bestimmt und die Basensequenz, welche die Polypeptid- Sequenz codiert, wie in Fig. 3 dargestellt. Von den Erfindern wurde je Basensequenz, welche für die Sequenz der Aminosäuren in dem h-SOD-Polypeptid codiert, weiter untersucht im Hinblick auf eine Umwandlung des Cys an der 111-Stelle und/oder der 6-Stelle (gezählt von dem Ala des Polypeptids) in einen anderen Aminosäurerest, und zwar unter Anwendung einer stellenspezifischen Mutagenese-Methode. Dabei wurde eine Basensequenz erhalten, welche die Fähigkeit aufweist, dieses Ziel zu erreichen. Es wurde ferner festgestellt, daß rekombinante Polypeptide gemäß der obigen Formel (I) und mit h-SOD-Aktivität (im folgenden als "rekombinante h-SODs″ bezeichnet) sowie die Kupfer- und/oder Zink-koordinierten, rekombinanten h-SOD-Dimere gemäß der obigen Formel (II) erhalten werden können unter Verwendung der Basensequenz und E.coli gemäß den Routineverfahren des genetic engineering. Es wurde ferner entdeckt, daß die Dimeren (II) der rekombinanten h-SODs (I) als homogene Enzyme erhalten werden und daß es sich dabei um stabile h-SOD-artige Plypeptide handelt mit Aktivitäten, die gleich groß oder größer sind als die von h-SOD.

Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen Untersuchungsergebnissen.

Unter den rekombinanten h-SODs (I) der vorliegenden Erfindung seien als bevorzugte Beispiele solche erwähnt, die durch die allgemeine Formel (I) dargestellt werden, bei der X₂ einen neutralen Aminosäurerest, z. B. Cys, Ser, Ala oder Thr, bedeutet und X₃ für einen neutralen Aminosäurerest, z. B. Ser, Ala oder Thr, steht. Unter diesen sind speziell bevorzugt Polypeptide der allgemeinen Formel (I), worin X₁ ein Wasserstoffatom oder eine Acetylgruppe gedeutet, X₂ für Cys und X₃ für Ser steht. Unter den rekombinanten h-SOD-Dimeren (II) seien als bevorzugte Beispiele diejenigen erwähnt, die durch die allgemeine Formel (II) dargestellt werden, bei der Y₁ und Y₂ beide 2 bedeuten, und die, bei denen Y₁ und Y₂ 4 bzw. 0 bedeuten.

Polymerisate, gebildet aus diesen Dimeren (II) als Struktureinheiten und mit SOD-Aktivitäten, sind von der vorliegenden Erfindung ebenfalls umfaßt.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen h-SODs (I) und ihrer Dimere (II) wird jeweils eine rekombinante DNA konstruiert aus einer Polydesoxyribonucleinsäure mit einer Basensequenz, welche für die Aminosäuresequenz des Polypeptids der Formel (I) codiert, und einem replikativen Vektor. Ein bakterieller Wirt wird unter Verwendung der rekombinanten DNA transformiert. Der Transformant wird anschließend in einem Kulturmedium kultiviert, um das gewünschte Polypeptid-Gen zu erzeugen. Dann wird das angestrebte Produkt aus der kultivierten Zellbrühe gesammelt.

Zur Konstruktion der rekombinanten DNA aus der Polydesoxyribonucleinsäure, welche die für die rekombinante h-SOD (I) codierende Basensequenz aufweist, und dem replikativen Vektor ist es lediglich erforderlich, die für das rekombinante h-SOD (I) codierende Polydesoxyribonucleinsäure in einen bekannten Replikationsvektor zu insertieren, wie er aus den in den obigen Literaturstellen beschriebenen DNA- libraries (Genbanken) bekannt ist [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5465-5469, (1983); JA-OS 1 37 286/1985]. Dabei können auf dem Gebiet des genetic engineering bekannte Techniken angewandt werden.

Die oben erwähnte Insertion kann z. B. nach einer bekannten Technik der Gentechnologie gemäß einer Anzahl von Literaturverfahren durchgeführt werden, z. B. nach experimentellen Handbüchern, wie:

(1) TAKAGI, Yasuyuki, "Idenshi Sosa Manual (Manual of Genetic Operations)", Kodansha;

(2) TAKAGI, Yasuyuki, "Idenshi Sosa Jikkenho (Laboratory Manual of Genetic Operations), Kodansha;

(3) MANIATIS, T., et al., "Molecular Cloning: "Laboratory Manual", Cold Spring Harber Laboratory, Cold. Sp. Harb., U.S.A.; and

(4) WU, Ray, et. al., "Method in Enzymology", 101, Academic Press, U.S.A.

Es ist beispielsweise lediglich erforderlich, die Leber- cDNA-Genbank einer Humanleber durch molekulare Klonierung im Hinblick auf h-SOD cDNA zu erhalten, einen bakteriellen Wirt mit der Leber-cDNA-Genbank zu transformieren, ein Klon-Screening des resultierenden Transformanten nach der Kolonienhybridisationsmethode durchzuführen, um ein h-SOD-codierendes Plasmid zu erhalten, und anschließend den h-SOD-codierenden Bereich in einen produzierenden Vektor zu integrieren. In Fig. 4 ist diese Verfahrensweise in groben Zügen dargestellt.

Indem man die so erhaltene, rekombinante DNA (pSOD6), welche zur Herstellung von h-SOD verwendet wird, einer stellenspezifischen Mutagenese-Methode unterwirft, ist es möglich, eine replikative, rekombinante DNA zu konstruieren, welche eine Basensequenz aufweist, die für die Sequenz der Aminosäuren des rekombinanten h-SOD (I) codiert, wobei eine oder zwei Aminosäuren sich von der Aminosäuresequenz von h-SOD unterscheiden.

Als stellenspezifische Mutagenese-Methode seien die folgenden Methoden erwähnt. BamHI wird auf pSOD6 mit geschlossener Ringstruktur (cc) in Gegenwart von Ethidiumbromid (EtBr) unter Lichtausschluß einwirken lassen. Dabei wird pSOD6 in die geöffnete Ringstruktur (oc) umgewandelt. Exonuclease III wird anschließend einwirken lassen, wobei die DNA an der Stelle, wo die Mutagenese gewünscht ist, in eine Einzelstrangform umgewandelt wird. Das resultierende, synthetische Nucleotid mit der mutierbaren Stelle wird zu dem teilweise einzelsträngigen Plasmid ausgerichtet. DNA-Polymerase und T₄DNA- Ligase werden dann in Gegenwart dNTP einwirken lassen, so daß das synthetische Nucleotid in das Plasmid einverleibt wird [Experimental Manipulation of Gene Expression, 291-303 (1983), Academic Press]. Dieses Rekombinationsverfahren ist in groben Zügen in Fig. 5 dargestellt.

Auf die oben beschriebene Weise wird das Plasmid pSOD14 DNA erhalten, welches das h-SOD-Gen enthält, das beispielsweise einen Basencode TCC aufweist, und wodurch beispielsweise das Cys (TGC) in der 111. Stelle vom Ala zu Ser geändert wird.

In der folgenden Tabelle 1 sind verschiedene Beispiele für synthetische Nucleotide angegeben, welche bei der oben beschriebenen Variationsmethode brauchbar sind. Unter Verwendung dieser synthetischen Nucleotide werden deren korrespondierende Plasmide erhalten.

Tabelle 1

Außer dem oben beschriebenen stellenspezifischen Mutagenese- Verfahren kann man andere in der Literatur beschriebenen Methoden ebenfalls anwenden [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4008 (1984); Nucl. Acid. Res., 10, 6487 (1982)].

Um beispielsweise das Cys an der 6-Stelle, gezählt von dem Ala, in eine andere Aminosäure umzuwandeln, ist es lediglich erforderlich, ein Fragment eines h-SOD-analogen Gens, z. B. von pSOD14, zu isolieren, an einer zweckentsprechenden Stelle stromabwärts von dem TGC, welches für das 6-Stellen-Cys codiert, mit einer Restriktions- Endonuclease zu spalten und anschließend an ein synthetisches Nucleotid zu binden, welches ein Codon aufweist, das für eine andere Aminosäure als Cys (TGC) codiert, z. B. 5′-TGTCCGTGCTGAAGGG-3′ mit dem Codon TCC von Ser. Das Plasmid pSOD53, das beispielsweise auf obigem Wege hergestellt wurde, hat einen Code mit der Fähigkeit zur Erzeugung einer rekombinanten h-SOD, bei der das Cys an jeder der 6-Stelle und der 111-Stelle des h-SOD durch Ser ersetzt wurde.

Als Wirtszellen, welche bevorzugt für die Klonierung und/oder Replikation von Genen eingesetzt werden, die für die rekombinante h-SOD (I) der vorliegenden Erfindung codieren, seien solche erwähnt, welche in Kulturen bei Fermentation von Procaryoten, wie Bakterien, und Eucaryoten, wie Hefe und Affennierenzellen, wachsen. Besonders bevorzugte Wirtszellen sind E. coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Streptomyces sowie COS-Zellen, die aus Affennierenzellen stammen.

Als Vektoren kommen verschiedene Arten von Vektoren in Frage, wie sie bei den oben beschriebenen Zellen verwendet werden können. Die Vektoren können je nach den Erfordernissen des Falls von Plasmiden und Viren abgeleitet sein. Die Vektoren wirken bei der Klonierung und/ oder Replikation. Es steht eine umfangreiche Literatur, betreffend Vektoren, zur Verfügung und zahlreiche Vektoren sind im Handel erhältlich. Diese Vektoren enthalten im allgemeinen Marker, durch die ihr Screening erleichtert wird. Als Marker wird Cytotoxizitätsresistenz, Auxotrophismus und dergl. verwendet. Ein einzelner Vektor kann oft viele Vektoren enthalten, welche unterschiedliche Charakteristika aufweisen. Im Falle eines Klonierungsvektors sind sowohl Kontrollsignale für den Transkriptionsstart als auch für den Transkriptionsstopp vorhanden.

Als solche mit Vorteil eingesetzbare Vektoren seien beispielsweise erwähnt: Vektoren, welche lpp-Promotoren enthalten, wie pIN-I, pIN-II und pIN-III (PKEN-Vektoren), Vektoren, welche pho5-Promotoren enthalten, wie pAM82, SV40-Vektoren, wie Plasmid pSV2, usw.

Falls man als Wirtsorganismus für die Expression Hefe einsetzt, ist die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung brauchbare DNA nicht notwendigerweise auf die in den Beispielen eingesetzte pTJ102-SOD14 beschränkt; es kommt vielmehr jeder beliebige Hefe-Vektor in Frage, vorausgesetzt, er enthält einen in Hefe funktionalen Promotor und eine DNA- Sequenz, welche durch den oben erwähnten funktionalen Promotor auf ein m-RNA transkribiert werden kann, welche wiederum h-SOD oder ein von h-SOD abgeleitetes Polypeptid gemäß der vorliegenden Beschreibung translatieren kann. Bei dem Hefevektor kann es sich um einen beliebigen der folgenden drei Vektortypen handeln [YI _p , YE _p und YR _p Typen] gemäß der Klassifikation durch Struhl et al. [K. Struhl, D.T. Stinchcomb, S. Sherer, R.W. Davis, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 76, 1035 (1979)] oder um einen beliebigen der YC _p -Typ-Vektoren gemäß der Klassifikation von Clarke et al. [L. Clarke, J. Carbon, Nature, 287, 504 (1980)]. Als weitere Alternativ kann es sich um einen Vektor handeln, der eine Kombination von mehr als einem Typ von Vektoren, wie pAM82, darstellt. Eine weitere Alternative besteht darin, daß der Hefevektor ein Schaukelvektor sein kann, wie pAM82, der zusätzlich eine DNA-Sequenz trägt, wie sie für die Replikation und Aufrechterhaltung des Plasmids in E.coli erforderlich ist.

Als Promotor kann nicht nur Pho5-Promotor gewählt werden, sondern auch ADH1-Promotor [V.M. Williamson, J. Bennetzen, E.T. Young, K. Naysmith und B.D. Hall, Nature, 283, 214 (1980)], Ga110-Promotor [St. John, T.P., Davis, R.W., "Cell", 16, 443 (1979)] sowie andere bekannte Promotoren. Die Promotor-Screening-Methoden sind ebenfalls beschrieben worden, z. B. von Akio Tohe in "Kagaku to Seibutsu (Chemistry & Living Organism)", 21, 183-193 (1983). Eine DNA mit einer Promotorsequenz kann somit erhalten werden, indem man z. B. die Screening-Methode nach Angaben dieses Autors durchführt.

Es sei ferner darauf hingewiesen, daß der Hefestamm, der für die praktische Durchführung der Erfindung brauchbar ist, nicht notwendigerweise auf den AH22-Stamm limitiert ist. Grundsätzlich kann jeder beliebige Stamm verwendet werden, welcher zu Saccharomyces cerevisiae gehört. Falls man einen none-YIp-Typ-Vektor verwendet, ist es jedoch erforderlich, ihn in einen Wirtsstamm einzuführen, der eine auxotrophische Mutation aufweist, wie eine leu2^-- Mutation im AH22- Stamm. Es wird somit angenommen, daß der Vektor eine DNA-Sequenz mit der Fähigkeit hat, die obige Mutation zu komplementieren. Hierbei handelt es sich um eine der Routinetechniken, welche praktiziert werden, um Plasmide auf ihren korrespondierenden Wirtszellen stabil zu halten. Andere Hefen als S.cerevisiae können ebenfalls eingesetzt werden, um eine Expression von h-SOD und der h-SOD-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung zu erreichen, vorausgesetzt, daß man Hefevektoren verwendet, die bei derartigen anderen Hefen geeignet sind.

Brauchbare Kulturmedien, die bei der Herstellung des rekombinanten h-SOD (I) aus dem resultierenden Transformanten eingesetzt werden können, umfassen bekannte Kulturmedien, wie sie für derartige Zwecke verwendet werden. Bevorzugt sind Kulturmedien mit einem Gehalt zweckentsprechender Mengen an Kupfer- und/oder Zinkionen.

Die rekombinante h-SOD (I) der vorliegenden Erfindung kann erhalten werden, indem man den Transformanten bei 30 bis 42°C, vorzugsweise im Bereich von 37°C, während 3 bis 48 Stunden nach bekannten Verfahren kultiviert, z. B. unter Belüftung und Rühren, nach einem Schüttel- Kultivierungsverfahren, einem Rotationskultivierungsverfahren, einem Kultivierungsverfahren unter Stehenlassen der Kultur oder dergl. Falls man die rekombinante h-SOD (I) innerhalb von Zellen repliziert, werden die Zellen durch Zentrifugation abgetrennt, nachdem die kultivierte Zellbrühe eine hohe Konzentration erreicht hat. Die Zellen werden lysiert und anschließend erfolgt eine Abtennung und Reinigung der rekombinanten h-SOD (I) unter Anwendung verschiedener, in der Literatur beschriebener Methoden, z. B. durch Extraktion, Ionenaustausch- Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Elektrophorese oder Dialyse oder einer Kombination dieser Verfahren. In den Fällen, in denen das Produkt sekretiert, wird das Kulturmedium in ähnlicher Weise aufgearbeitet.

Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die rekombinante h-SOD (I) vor allem als Kupfer- und/oder Zink-koordiniertes Dimeres erhalten, wie es durch die Formel (II) dargestellt ist. Die rekombinante h-SOD (I) kann jedoch mit großer Leichtigkeit durch eine an sich bekannte Behandlung des Dimeren erhalten werden.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiele

Die Erfindung wird anhand der folgenden Referenzbeispiele und Beispiele erläutert. Eine Beschränkung der Erfindung durch diese Beispiele erfolgt nicht.

Referenzbeispiel 1

Herstellung von h-SOD-poly(A)⁺RNA

(i) Nach der Homogenisation von 5 g normalem Humanlebergewebe in 25 ml 4M Guanidin-isothiocyanat wird das Homogenat bei 60°C gehalten. Das gleiche Volumen Phenol wird zugesetzt und vermischt. Das Gemisch wird durch eine 18-Gauge Injektionsnadel geleitet, und zwar 10 Mal, so daß die DNA gespalten wird und die Viskosität reduziert wird. Dann erfolgt eine Zugabe von 12,5 ml einer flüssigen Mischung, bestehend aus 0,1 M Natriumacetat, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) und 1 mM EDTA sowie 25 ml Chloroform/Isoamylalkohol (24/1). Das resultierende Gemisch wird 10 min bei 60°C gerührt, in Eis gekühlt und 10 min bei 10 000 U/min zentrifugiert. Dabei erhält man eine Wasserschicht. Das gleiche Volumen an Chloroform/ Phenol wird der Wasserschicht zugesetzt. Die resultierende Mischung wird 10 min bei 60°C gerührt und dann in Eis gekühlt. Durch 10minütige Zentrifugation bei 10 000 U/min wird eine Wasserschicht erhalten. Nach Extraktion zur Entfernung des Phenols, die zweimal mit dem gleichen Volumen an Chloroform/Isoamylalkohol durchgeführt wird, setzt man 2 Vol. Ethanol zu und läßt das resultierende Gemisch 2 h bei -20°C stehen. Das Präziptat wird durch 30minütiges Zentrifugieren bei 10 000 U/ min gesammelt, mit 25 ml einer Lösung, enthaltend 0,1 M Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,2% SDS (Natriumdodecylsulfat) und 5 mg "Proteinase K" (Protease; Produkt der Merck & Co., Inc.), aufgelöst und 1,5 h bei 37°C inkubiert. Die Temperatur wird auf 60°C gesteigert. Anschließend erfolgt eine Zugabe von 12,5 ml Phenol und 12,5 ml Chloroform/Isoamylalkohol. Nach 10minütigem Rühren der resultierenden Mischung bei 60°C läßt man sie in Eis abkühlen und zentrifugiert 10 min bei 10 000 U/min, um eine Wasserschicht zu erhalten. Die Wasserschicht wird wiederum mit Phenol behandelt, gefolgt von einer zweimaligen Extraktion des Chloroforms. Nach einer Zugabe von 2 Vol. Ethanol wird das resultierende Gemisch zentrifugiert und das Präzipitat gesammelt und dann unter verringertem Druck getrocknet. Auf die obige Weise erhält man 4,04 mg rohe RNA.

(ii) Nach Auflösen des oben erhaltenen Präzipitats in 5 ml sterilisiertem Wasser wird die Lösung 5 min bei 65°C inkubiert und anschließend rasch abgekühlt, gefolgt von einer Zugabe von 5 ml einer Lösung, enthaltend 40 mM Tris-HCl (pH 7,6), 1,0 M NaCl, 2 mM EDTA und 0,2% SDS. Das Gesamtvolumen der resultierenden Mischung wird zur Adsorption durch eine Säule geleitet, die gepackt ist mit 0,2 g Oligo(dT)-cellulose (Produkt der Colaborative Company) und mit einem Gemisch aus 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA und 0,2% SDS äquilibriert worden war. Nach Waschen der Säule mit 10 ml der gleichen Lösung werden andere RNAs als Poly(A)⁺RNA zunächst mit einem Elutionsmittel eluiert, das aus 5 ml 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA und 0,1% SDS besteht. Dann wird Poly(A)⁺RNA mit einem Elutionsmittel eluiert, bestehend aus 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA und 0,05% SDS. Das Eluat wird in Fraktionen von jeweils 1 ml aufgefangen. Aufgrund der Bestimmung des OD₂₆₀-Werts werden die Fraktionen Nr. 2 bis 8 als Poly(A)⁺RNA-Fraktionen gesammelt. Diesen Fraktionen werden 1/10 Vol. 2,5 M Natriumacetat und 2 Vol. Ethanol zugesetzt. Nach dem Stehenlassen der resultierenden Mischung über Nacht bei -20°C wird sie 20 min bei 25 000 U/min zentrifugiert, um ein Präzipitat zu erhalten. Das Präzipitat wird dann unter verringertem Druck getrocknet. Auf diese Weise erhält man 114,4 µg Poly- (A)⁺RNA.

Referenzbeispiel 2

Synthese und Klonierung von cDNA

(i) Die Synthese und Klonierung von cDNA wird durchgeführt gemäß der Okayama-Berg-Methode [Mol. Cell. Biol. 2, 161 (1982)]. 114,4 µg der in Referenzbeispiel 1 erhaltenen Poly(A)⁺RNA werden in 100 µl Wasser aufgelöst. Ein 4 µl-Aliquot der resultierenden Lösung wird in ein Mikrorohr transferiert und dann unter verringertem Druck getrocknet. Anschließend wird mit 10 µl 5 mM Tris- HCl (pH 8,3) gelöst und die Lösung 5 min bei 65°C erhitzt. Nachdem die Temperatur der Lösung auf 37°C abgesunken ist, gibt man 20 µl einer Lösung, enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 8 mM MgCl₂, 30 mM KCl, 0,3 mM Dithiothreit und 2 mM dNTP (ein Gemisch von dATP, dGTP, dCTP und dTTP in den gleichen Mengen), 10 µCi [α-³²p]- dCTP, 1,4 µg vector primer DNA (Produkt von PL-Biochemical Company) und 5 Einheiten reverse Transcriptase (Produkt der Life Science Company) zu und setzt das Ganze 20 min bei 37°C um. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 2 µl 0,25 M EDTA und 1 µl 10% SDS versetzt, um die Reaktion zu beenden. Dann erfolgt eine Behandlung mit 20 µl Phenol/Chloroform. Zu einer Wasserschicht, die durch Zentrifugieren erhalten wurde, gibt man das gleiche Volumen 4 M Ammoniumacetat und 80 µl Ethanol. Das resultierende Gemisch wird 15 min bei -70°C stehengelassen. Ein durch 10minütiges Zentrifugieren bei 15 000 U/min erhaltenes Präzipitat wird in 10 µl einer gemischten Lösung (nachfolgend als "TE" abgekürzt) von 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA aufgelöst. Die Ethanol-Fällung wird wiederholt und nach einmaligem Waschen mit 50 µl 75%igem Ethanol wird das Präzipitat unter verringertem Druck getrocknet. Es wird dann mit 15 µl einer Lösung, enthaltend 140 mM Natriumcacodylat, 30 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1 mM CoCl₂, 0,1 mM Dithiothreit, 0,2 µg "Poly A" (Produkt der Sigma Company) und 10 µCi [α-³²p]dCTP, aufgelöst. Während man die resultierende Lösung bei 37°C inkubiert, werden 18 Einheiten einer terminalen Transferase (Produkt der PL-Biochemical Company) zugesetzt. Das Ganze wird 20 min bei 37°C umgesetzt, mit Phenol/Chloroform behandelt, mit Ethanol ausgefällt, mit Ethanol gewaschen, getrocknet und dann unter verringertem Druck getrocknet. Das so erhaltene Produkt wird aufgelöst mit 10 µl einer Lösung, enthaltend 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl₂ und 1 mM Dithiothreit, mit 2,5 Einheiten "Hind III" (Produkt der Takara Shuzo Co., Ltd.) versetzt und 1 h bei 37°C inkubiert. Nach der Chloroform/Phenol-Behandlung, der Ethanol-Fällung, dem Waschen mit Ethanol und dem Trocknen wird das resultierende Präzipitat erneut aufgelöst in 10 µl TE, mit 3 µl Ethanol versetzt und dann bei -20°C gelagert. Eine Lösung, welche hergestellt wurde durch Auflösen von 7 ng einer Oligo(dG)- integrierter Linker-DNA (Produkt von PL-Biochemical Company) mit 10 µl TE (pH 7,5), enthaltend 0,1 M NaCl, gibt man zu 1 µl-Aliquot der oben erhaltenen Lösung. Die resultierende Lösung wird 5 min bei 65°C inkubiert und weitere 30 min bei 42°C und dann auf 0°C gekühlt. Daraufhin wird die Lösung so eingestellt, daß sie 20 mM Tris- HCl (pH 7,5), 4 mM MgCl₂, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1 M KCl, 0,1 mM β-NAD, 50 µg/ml BSA und 0,6 µg E.coli-DNA-Ligase PL-Biochemical Co.) enthält. Wasser wird zugesetzt, um das Gesamtvolumen auf 100 µl zu bringen. Das resultierende Gemisch wird anschließend über Nacht bei 12°C stehengelassen. Nach Zugabe von 1 µl 4 mM dNTP, 1 µl 15 mM β-NAD, 1 µl E.coli-DNA-Ligase (0,4 µg; PL-Biochemical Co.), 1 µl DNA-Polymerase I (0,3 µg; PL-Biochemical Co.), 1 µl E. coli RNaseH (1 Einheit; PL-Biochemical Co.) wird das resultierende Gemisch 1 h bei 12°C und eine weitere Stunde bei 25°C inkubiert.

(ii) E. coli dH1 [J. Mol. Biol., 166, 557 (1983), ein E. coli-Stamm, der zur Verfügung gestellt wurde von Genetic Stock Center, School of Medicine, Yale University (Stock Nr. CGSC Stamm 6040)], der in 100 ml BHI- Kulturmedium (DIFCO Company; ein Rinder-Hirn-Herz-Extraktmedium) kultiviert wurde und sich in der logarithmischen Wachstumsphase befand, wird geerntet und dann in 40 ml einer eisgekühlten Lösung (pH 5,8) von 30 mM Kaliumacetat, 100 mM RbCl, 10 mM CaCl₂, 50 mM MnCl₂ und 15% Glycerin suspendiert. Nachdem man die Suspension 5 min bei 0°C hat stehenlassen, werden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt. Dann erfolgt ihre Suspension in einer Lösung (pH 6,5) von 4 ml 10 mM MOPS- Puffer (Dotai Company), 75 mM CaCl₂, 10 mM RbCl und 15% Glycerin. Die Suspension wird 15 min bei 0°C stehengelassen, um kompetente Zellen zu erhalten.

(iii) Ein 20 µl-Aliquot der in Stufe (i) hergestellten DNA-Lösung wird zu 200 µl der E.coli-Suspension gegeben und die resultierende Mischung 30 min bei 0°C stehengelassen. Das Gemisch wird 90 sec bei 42°C hitzebehandelt. Dazu gibt man 800 µl des LB(Luria-Bertani)- Kulturmediums (10 g Bactotrypton, 5 g Bactohefeextrakt, 10 g NaCl, 1 l Wasser; pH 7,5) zu und führt dann eine Inkubation bei 37°C während 90 min durch. Ein 100 µl- Aliquot des Gemisches wird auf einer LB-Agarplatte, enthaltend 50 µg/ml Ampicillin, ausgebreitet und über Nacht kultiviert, um einen Transformanten zu erhalten.

Referenzbeispiel 3

Screening des h-SOD-Klons

Das Screening des h-SOD-Genklons wird auf dem Transformanten durchgeführt, der nach der Kultivierung über Nacht unter Verwendung der Kolonienhybridisations- Methode erhalten wurde. Nachdem man die Kolonien, die auf dem LB-Agar gewachsen waren, auf Nitrocellulose- Membranen überführt hat, werden die Membranen auf LB- Agarmedien mit einem Gehalt an Chloramphenicol (100 µg/ ml) placiert, und zwar mit der die Kolonie tragenden Seite nach oben. Die Membranen werden über Nacht bei 37°C inkubiert, um die Plasmid-DNA in den Zellen zu verstärken. Nach 5minütiger Behandlung der Membranen in 0,5 N NaOH, während 3 min in 1 m Tris-HCl (pH 7,4) und weiterer 5 min in 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5)-1,5 M NaCl werden die Membranen 3 h bei 80°C getrocknet. Daraufhin werden die Membranen in einem Polyvinylchlorid- Beutel eingeschlossen und einer 15minütigen Waschbehandlung bei 60°C unter Verwendung von 30 ml dreifachem SSC (26,28 g NaCl, 13,23 g Natriumcitrat, 1 l Wasser) und 0,1% SDS unterworfen. Diese Behandlung wird weitere zwei Mal wiederholt. Nach der Waschbehandlung wird der Film in dreifaches SSC, enthaltend 60 µg/ml Salmon DNA, zehnfache Denhalt-Lösung (50 g Ficoll, 50 g Polyvinylpyrrolidon, 50 g Rinderserumalbumin, 500 ml Wasser) und 0,1% Natriumpyrophosphat, eingetaucht und über Nacht bei 60°C stehengelassen. Nach zweimaligem Waschen der Membranen mit 30 ml einer Lösung, bestehend aus vierfachem SSC (35,04 g NaCl, 17,64 g Natriumcitrat und 1 l Wasser), zehnfacher Denhalt-Lösung und 0,1% Natriumpyrophosphat, werden sie über Nacht bei 43°C hybridisiert unter Verwendung eines synthetischen Nucleotids, 5′ATGGCGACGAAGGCC3′, als Sonde, markiert am 5′-Ende mit ³²p (10⁷ cpm/ µg). Das synthetische Nucleotid hat eine Basensequenz, welche für die N-terminale 5-Aminosäure- Einheit (Met, Ala, Thr, Lys, Ala) von h-SOD codiert. Nach zweimaligem Waschen (jeweils 15 min) bie Raumtemperatur mit vierfachem SSC, zehnfacher Denhalt- Lösung und 0,1% SDS werden die Membranen getrocknet und einer Autoradiographie unterworfen. Als Ergebnis des Screening der Transformanten auf die oben beschriebene Weise wird ein Klon mit dem h-SOD-Gen erhalten. Dieser wird als pSOD1 bezeichnet.

Referenzbeispiel 4

Bestimmung der Basensequenz des h-SOD-Gens

Nach der Herstellung von pSOD1 DNA in großen Mengen durch die Lysozym-SDS-Methode und die Cäsiumchlorid- Ethidiumbromid-Methode [Maniatis et al., Molecular Cloning, 86-94, Cold Spring Harber (1982)] werden DNA- Fragmente von etwa 700 bp, enthaltend das h-SOD-Gen, erhalten unter Verwendung der Restriktions-Endonucleasen "Pst I" und "Pvu II" (Takara Shuzo Co., Ltd.). Unter Verwendung der Restriktions-Endonucleasen TthHB8I, StuI, HinfI, RsaI, FokI, Sau3AI (sämtlich von Takara Shuzo Co., Ltd.) und Fnu4HI (NEB) wird eine Restriktionskarte des obigen Fragments hergestellt. Die Restriktionskarte ist in Fig. 2 dargestellt. Ausgehend von dieser Restriktions- Endonuclease-Karte wird die Basensequenz des für das h-SOD-Polypeptid codierenden Bereichs bestimmt nach der Maxam-Gilbert-Methode [Method Enzymol, 65, 449 (1979)]. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 aufgeführt. Aus der Basensequenz ergibt sich, daß das h-SOD- Gen für 154 Aminosäuren codiert.

Referenzbeispiel 5

Expression von h-SOD in E. coli

(i) Unter Verwendung von EcoRI- und BamHI-Stellen von pIN-I-A2, bei dem es sich um einen der Expressionsvektoren für E.coli handelt [der gleiche Vektor, wie pKEN 039, beschrieben in JA-OS 1 40 800/1982; EMBO, J., 6, 771-775 (1982); erhalten von State University of New York, 4,9 KbP Amp^r], wurde die Expression von h-SOD in E.coli untersucht, basierend auf der Basensequenz des h-SOD-Gens, welche in Referenzbeispiel 4 ermittelt wurde. Zu 2 µl (0,1 µg) einer Lösung, enthaltend 700 bp DNA-Fragment, welches erhalten wurde durch Verdauung von PstI und PvuII, gibt man 2 µl 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 2,4 µl 0,1 M MgCl₂, 2 µl 1 M NaCl, 0,8 µl 0,3 M Dithiothreit, 2 µl 5 mM dNTP, 3 Einheiten T4 von DNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) und Wasser, um das Gesamtvolumen auf 50 µl zu bringen. Nach 10minütiger Inkubation der Mischung bei 37°C wird das Gemisch einer Phenol/ Chloroform-Behandlung und einer Ethanol-Fällung unterworfen und das Präzipitat gewaschen und dann unter verringertem Druck getrocknet. Es wird mit 70 µl Wasser aufgelöst, gefolgt von einer Zugabe von 6,5 µl 1 M Tris-HCl (pH 7,6), 10 µl 0,1 M MgCl₂, 10 µl 10 mM ATP, 1,5 µl 0,3 M Dithiothreit, 1 µl 5′-phosphatiertem BamHI Linker [1 µg CGGATCCG (Takara Shuzo Co., Ltd.) pro µl] und 2 Einheiten T4 DNA-Ligase. Das resultierende Gemisch wird über Nacht bei 22°C stehengelassen und dann einer Phenol/Chloroform-Behandlung und einer Ethanol- Fällung unterzogen. Das Präzipitat wird in 70 µl einer wäßrigen Lösung aufgelöst, welche 1 µg eines Klonierungsvektors, pACYC184 DNA [Journal of Bacteriology, 134, 1141 (1978); ATCC 37033] enthält, mit BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut und mit 0,6 Einheiten bakterieller, alkalischer Phosphatase (im folgenden als BAP abgekürzt; Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt. Zu dieser Lösung werden 10 µl zehnfacher Ligationspuffer [0,5 M Tris-HCl (pH 7,4), 0,1 M MgCl₂, 0,1 M Dithiothreit, 10 mM Spermidin und 10 mM ATP] und 1 Einheit T4 DNA- Ligase gegeben. Wasser wird zugesetzt, um das Gesamtvolumen auf 100 µl zu bringen. Dann wird das resultierende Gemisch bei 4°C über Nacht stehengelassen. Nach der Phenol/Chloroform-Behandlung, der Ethanol-Ausfällung und Waschen und Trocknen unter verringertem Druck wird das resultierende Produkt in 10 µl TE (pH 8,0) aufgelöst. Unter Verwendung der so erhaltenen DNA wird E. coli DH1 transformiert, wobei die Verfahrensweisen (ii) und (iii) des Referenzbeispiels 2 befolgt werden. Man erhält ein Plasmid, aus dem DNA-Fragmente durch Verdauung mit BamHI herausgeschnitten werden können, die das SOD-Gen enthalten. Das Plasmid wird als pSOD5 bezeichnet.

(ii) Zu 150 µl (100 µg) pSOD5 DNA gibt man Wasser, 18 µl zehnfachen BamHI-Verdauungspuffer [100 mM Tris- HCl (pH 8,0), 70 mM MgCl₂, 1 M NaCl, 10 mM Dithiothreit] und 180 Einheiten BamH1. Das Gesamtvolumen wird auf 180 µl eingestellt. Dann wird 3 h bei 37°C verdaut. Ein Gelschnitt, enthaltend etwa 700bp DNA-Fragmente, wird durch Elektrophorese in einem 0,7% Agarosegel herausgeschnitten. Nach Extraktion der DNA aus dem Gel wird sie zur Reinigung einer Phenol/Chloroform-Behandlung unterworfen, mit Ethanol gefällt und gewaschen und dann unter verringertem Druck getrocknet. Die DNA wird aufgelöst in 44 µl TE (pH 8,0). Dazu gibt man 10 µl zehnfachen TthHB8I Verdauungspuffer [100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM MgCl₂, 1 M NaCl, 10 mM Dithiothreit] und 10 µl (80 Einheiten) TthHb8I (Takara Shuzo Co., Ltd.). Die DNA wird 3 h bei 37°C hydrolysiert und DNA-Fragmente von etwa 600bp werden durch Elektrophorese in einem 0,7% Agarosegel getrennt. Nach Reinigung der DNA-Fragmente auf gleiche Weise wie oben werden sie in 100 µl Wasser gelöst. Die DNA-Fragmente hatten an ihren beiden terminalen Enden kohäsive Bindungen zu TthHB8I und BamHI und enthielten an der Seite des TthHB8I eine Basensequenz, welche für die Aminosäuren nach der Glutaminsäure codiert, welche die 22. Aminosäure in dem SOD- Polypeptid ist.

(iii) Es wurden ferner die folgenden 12 Oligo-Nucleotide chemisch synthetisiert für die Expression von h-SOD.

Zu einem 1 µl (1 µg) Aliquot jedes dieser synthetischen Nucleotide gibt man 5 µl des zehnfachen konzentrierten Linker-Kinasepuffers [0,7 M Tris-HCl (pH 7,6), 0,1 M MgCl₂, 50 mM Dithiothreit], 1 µl 50 mM ATP, 31 µl Wasser und 1 µl (10 Einheiten) Polynucleotidkinase (Takara Shuzo Co., Ltd.). Das resultierende Gemisch wird 1 h bei 37°C und weitere 10 min bei 85°C inkubiert und dann allmählich abgekühlt. Zu einem 25 µl Aliquot dieses Reaktionsgemisches gibt man 10 µl zehnfachen Ligationspuffer, 64 µl Wasser und 1 µl (2,8 Einheiten) T4 DNA Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.). Das resultierende Gemisch wird über Nacht bei 4°C stehengelassen. Danach wird die Mischung mit Phenol/Chloroform behandelt und die Wasserschicht gesammelt.

(iv) Darüber hinaus wird nach 2stündigem Inkubieren bei 37°C eine flüssige Mischung aus 3 µl (2 µg) pIN-I- A2-Vektor, 3 µl zehnfacher BamHI-Verdauungspuffer, 1 µl (20 Einheiten) EcoRI, 2 µl (16 EinheitenZ BamHI und 21 µl Wasser, 5 µl Tris-HCl (pH 8,0), 60 µl Wasser und 5 µl (0,6 Einheiten) BAP zugesetzt. Das resultierende Gemisch wird eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert. Danach wird es mit Phenol/Chloroform behandelt und die Wasserschicht gesammelt.

(v) 10 µl Aliquots der so hergestellten DNA-Fragmentlösung, enthaltend die DNA, welche für das TthHB8I- BamHI h-SOD-Gen codiert, Lösungen der vereinigten, synthetischen Nucleotide und pIN-I-A2 Vektor werden vermischt, gefolgt von einer Zugabe von 3 µl 3 M Natriumacetat und 66 µl Ethanol. Nachdem das resultierende Gemisch 15 min bei -70°C gestanden hat, wird ein Präzipitat durch Zentrifugieren gesammelt. Nach dem Trocknen des Präzipitats unter verringertem Druck wird es mit 89 µl Wasser und 10 µl zehnfachem Ligationspuffer aufgelöst und nach Zugabe von 1 µl (2,8 Einheiten) T4 DNA- Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) wird das Gemisch über Nacht bei 4°C stehengelassen. Nach Phenol/Chloroform- Behandlung, Fällung mit Ethanol, Waschen und Trocknen wird die DNA in 10 µl TE (pH 8,0) aufgelöst und E.coli DH1, der auf die oben beschriebene Weise kompetent eingestellt wurde, damit transformiert. Die Zellen werden auf dem LB Agar-Medium, das 50 µg/ml Ampicillin enthält, ausgebreitet und über Nacht bei 37°C kultiviert. Der auf diese Weise erhaltene h-SOD Expressionsklon wird als pSOD6 bezeichnet. Die obigen Verfahrensstufen sind in Fig. 4 dargestellt.

Als Ergebnis eines EIA unter Verwendung eines Antikörpers gegen h-SOD findet man, daß der das pSOD6 tragende E.coli-Stamm DH1 zu einer Expression von 2 µg/ml (kultivierte Zellbrühe) h-SOD führt, wenn die Kultivierung über Nacht in dem BHI-Kulturmedium erfolgt.

(vi) Reinigung von h-SOD: Nachdem man 200 g E. coli mit der pSOD6-Expression in 600 ml einer Lösung von Tris-HCl- Puffer (pH 7,6), enthaltend 1 mM CuSO₄, 1 mM ZnSO₄ und 50 mM Saccharose, suspendiert hat, wird die resultierende Suspension 30 min einer Überschallbehandlung unterworfen, um eine Lysis der Zellen durchzuführen. Es wird ein Gerät Cell Disruptor 90® (Branson, Inc.) verwendet. Das Lysat wird mit 600 ml einer 3/5-Lösungsmittelmischung aus Chloroform und Ethanol versetzt und 15 min bei 4°C gerührt. Das resultierende Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt. K₂HPO₄ (300 g) wird in der überstehenden Flüssigkeit aufgelöst und die resultierende Ethanolschicht (500 ml) 30 min auf -20°C gekühlt. Das resultierende Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Flüssigkeit unter verringertem Druck in einem Evaporator eingedampft. Das so erhaltene Kondensat (300 ml) wird dann einer Gelfiltration unterworfen, unter Verwendung einer Säule (4,5 × 60 cm), die gepackt ist mit Sephadex G-25 gel® (Pharmacia AB) und äquilibriert wurde mit einer Lösung, enthaltend 50 mM Saccharose und 25 mM Phosphatpuffer (pH 7,8). Dabei wird das Kondensat durch die Lösung substituiert. 10 g DE52® (Whatman Company) zugesetzt und das resultierende Gemisch 30 min bei 4°C gerührt, so daß die Verunreinigungen adsorbiert werden. Danach werden die Verunreinigungen auf einem Glasfilter entfernt. Nach der Dialyse des Filtrats gegen 2,2 mM Phosphatpuffer (pH 6,5), enthaltend 50 mM Saccharose, wird es durch eine Säule (1,6 × 20 cm) geleitet, gepackt mit DEAE-Sepharose CL-6B® (Pharmacia AB), die zuvor mit dem gleichen Puffer äquilibriert wurde. Dabei wird das rekombinante h-SOD adsorbiert. Die Säule wird dann mit dem gleichen Puffer gewaschen und die Konzentration des Phosphatpuffers linear erhöht von 2,5 mM auf 50 mM. Auf diese Weise wird die rekombinante h-SOD eluiert. Da bei zwei separaten Peaks SOD-Aktivitäten beobachtet wurden, werden die Eluat-Fraktionen, welche dem ersten Peak entsprechen, gesammelt und lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver wird in 10 ml destilliertem Wasser aufgelöst und auf eine Säule gegossen (4,5 × 80 cm), gepackt mit Sephadex G-100 (Pharmacia AB), welche zuvor mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,0), enthaltend 50 mM Saccharose, äquilibriert wurde. Auf diese Weise wird das lyophilisierte Pulver durch Gelfiltration gereinigt. Die auf die obige Weise erhaltene h-SOD hat Aktivitäten von 3000 bis 3500 Einheiten/mg SOD. Sie zeigt bei ihrer Elektrophorese ein einziges Band.

Beispiel 1

Umwandlung von Cys (111) von h-SOD in Ser

Die stellenspezifische Mutagenese wurde durchgeführt gemäß der Vlasuk-Inouye-Methode [Experimental Manipulation of Gene Expression, 291-303, Academic Press (1983)].

(i) 5 µg cc (geschlossen zirkular) DNA von pSOD6 (5,6 kb, Ap ^r ), wobei es sich um ein Plasmid handelt, enthaltend das h-SOD Gen, wird aufgelöst in 300 µl einer Lösung, enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 10 mM NaCl und 0,15 mg/ml EtBr. Unter Lichtschutzbedingungen werden 200 Einheiten BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.) zugesetzt, gefolgt von einer 90minütigen Inkubation bei 37°C. 10 µl 0,5 M EDTA (pH 8,0) und 300 µl Phenol/Chloroform werden zugesetzt und vermischt. Eine Wasserschicht wird durch Zentrifugieren gesammelt. Dazu gibt man 30 µl 3 M Natriumacetat und 660 µl Ethanol. Das resultierende Gemisch wird 10 min bei -70°C stehengelassen und ein Präzipitat durch Zentrifugieren gesammelt und unter verringertem Druck zum Feststoff getrocknet. Dieser wird dann aufgelöst in 40 µl einer Lösung, enthaltend 66 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,66 mM MgCl₂ und 10 mM Dithiothreit. Anschließend erfolgt die Zugabe von 50 Einheiten Exonuclease III (PL-Biochemical Company). Das resultierende Gemisch wird 90 min bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 2 µl 0,5 M EDTA (ph 8,0) und Behandlung mit Phenol/Chloroform wird die DNA durch Ethanol-Ausfällung gesammelt und dann unter verringertem Druck zu einem Feststoff getrocknet. Dieser wird in 50 µl einer Lösung gelöst, die 200 mM NaCl, 13 mM Tris-HCl (pH 7,6), 9 mM MgCl₂ und 10 mM Dithiothreit enthält, wobei man Flüssigkeit (1) erhält. Ferner löst man 1 µg synthetisches Nucleotid 5′AGACCATTCCATCATTG 3′ (Bemerkung: die 9-Stelle C ist im ursprünglichen SOD- Gen G) in 10 µl einer Lösung, enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreit, 0,1 mM Spermidin, 0,1 mM EDTA und 5 mM ATP. Dazu gibt man 3,2 Einheiten T4 Nucleotidkinase (Takara Shuzo Co., Ltd.). Das Ganze wird 1 h bei 37°C umgesetzt, wobei man Flüssigkeit (2) erhält. Ein 50 µl Aliquot der Flüssigkeit (1) und ein 5 µl Aliquot der Flüssigkeit (2) werden vermischt, 3 min bei 100°C erhitzt und dann schnell abgekühlt. Das resultierende Gemisch wird dann 2 h bei 4°C stehengelassen und dann mit 7 µl 5 mM dNTP, 2 µl 50 mM ATP, 3 µl (6 Einheiten) T₄ DNA Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), 3 µl (4,2 Einheiten) T4 DNA Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) und 30 µl Wasser versetzt. Man läßt das resultierende Gemisch über Nach bei 12,5°C stehen und behandelt es mit Phenol. Das Ethanol-Präzipitat wird gesammelt. Die DNA wird unter verringertem Druck zu einem Feststoff getrocknet. Nach Auflösen der DNA in 10 µl TE (pH 8,0) wird der E.coli Stamm DH 1 transformiert, um einen Ampicillin-resistenten Transformanten zu erhalten.

(ii) Unter diesen Transformanten wird ein Screening hinsichtlich Klonen durchgeführt, welche mit dem synthetischen Nucleotid hybridisiert sind, das mit ³²P am 5′-Ende (10⁷ cpm/ µg) markiert ist. Dabei wird das Kolonie-Hybridisationsverfahren angewendet. Der auf die obige Weise erhaltene Klon wird als pSOD14 bezeichnet. In ähnlicher Weise wird anschließend die Basensequenz von pSOD14 DNA mittels der Maxam-Gilbert-Methode bestimmt. Dabei wird festgestellt, daß das für Cys codierende TGC zu dem für Ser codierenden TCC geändert wurde. Die Basensequenz der Plasmid pSOD14 DNA ist in Fig. 1 dargestellt.

(iii) Der E.coli Stamm DH1, enthaltend pSOD14, das auf die oben beschriebene Weise erhalten wurde, wird über Nacht bei 37°C kultiviert unter Anwendung der Rotationskultivier-Methode auf dem BHI-Kulturmedium (pH 7,4 ± 0,2). Nach beendeter Kultivierung wird die kultivierte Brühe 30 sec bei 15 000 U/min zentrifugiert, um die Zellen zu ernten.

(iv) Die Sammlung der rekombinanten h-SOD in ihrer gereinigten Form aus den oben erwähnten Zellen wird gemäß der Methode durchgeführt, wie sie von I. Fridovich et al. vorgeschlagen wurde [J. Biol. Chem., 244(22), 6049-6055 (1969)]. Demgemäß werden 200 g der Zellen in 600 ml einer Lösung suspendiert, enthaltend 50 mM Tris- HCl-Puffer (ph 7,6), der 1 mM CuSO₄, 1 mM ZnSO₄ und 50 mM Saccharose enthält. Dann wird eine Überschallbehandlung während 30 min mittels eines Cell Disrupter 900 (Branson Company) durchgeführt, so daß eine Lysis der Zellen eintritt. Das Lysat wird mit 0,75 Vol. einer 3/5-Mischung von Chloroform/Ethanol versetzt und das resultierende Gemisch 15 min bei 4°C gerührt und dann zentrifugiert, um das Präzipitat zu entfernen. In der überstehenden Flüssigkeit wird Dikaliumhydrogenphosphat aufgelöst zu einer Konzentration von 300 g/l, so daß die Ethanolschicht (etwa 500 ml) ausgesalzt wird. Die Ethanolschicht wird durch Zentrifugieren gesammelt und 30 min bei -20°C gekühlt. Das kristallisierte Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Flüssigkeit (etwa 300 ml) unter vermindertem Druck in einem Evaporator konzentriert. Die so konzentrierte Lösung wird einer Gelfiltration auf einer Säule (4,5 × 60 cm) unterworfen, gepackt mit Sephadex G-25 (Farmacia AB) und äquilibriert mit 25 mM Phosphatpuffer (pH 7,8). Auf diese Weise wird die Lösung für den 25 mM Phosphatpuffer substituiert. Die konzentrierte Lösung wird mit 10 g DE52 (Whatman Company) versetzt und das resultierende Gemisch 30 min bei 4°C gerührt. Verunreinigungen werden adsorbiert und die Lösung wird anschließend filtriert. Nach der Dialyse des Filtrats gegen 2,5 mM Phosphatpuffer (pH 6,5), enthaltend 50 mM Saccharose, wird es auf eine Säule (1,6 × 20 cm) gegossen, bepackt mit DEAE-Sepharose CL-6B-Gel (Farmacia AB) und mit dem gleichen Puffer äquilibriert. Auf diese Weise wird die rekombinante h-SOD adsorbiert. Die Säule wird dann mit dem gleichen Puffer gewaschen und die Konzentration des Phosphatpuffers linear gesteigert von 2,5 mM bis 50 mM. Auf diese Weise wird die rekombinante h-SOD eluiert. Da SOD-Aktivitäten in zwei gesonderten Peaks beobachtet werden, werden diese aktiven Fraktionen gesondert gesammelt und lyophilisiert. Lyophilisiertes Pulver von einem der beiden aktiven Peaks, welches als erstes eluiert wurde, wird in 10 ml destilliertem Wasser aufgelöst und in eine Säule (4,5 × 80 cm) gegossen, bepackt mit Sephadex G-100 (Farmacia AB) und äquilibriert mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,0), der 50 mM Saccharose enthält. Auf diese Weise wird das lyophilisierte Pulver durch Gelfiltration gereinigt. Die Aktivitäten der rekombinanten h-SOD, erhalten nach dem obigen Verfahren, werden bestimmt unter Anwendung der von Fridovich et al. vorgeschlagenen, oben erwähnten Methode. Pro mg SOD beobachtet man 3000 bis 3600 Einheiten. Die rekombinante h-SOD ist hinsichtlich ihrer spezifischen Aktivitäten und physikochemischen Eigenschaften zumindest gleichwertig der h-SOD, die durch Reinigung aus menschlichen roten Blutzellen erhalten wurde.

Es wird festgestellt, daß diese rekombinante h-SOD der allgemeinen Formel (II) entspricht, worin X₁, X₂ und X₃ ein Wasserstoffatom, Cys bzw. Ser bedeuten und Y₁ und Y₂ jeweils für 2 stehen (bestimmt durch EIA- und Atomabsorptionsspektroskopie).

(v) Von 1 ml der Übernacht-Kultur des pSOD14-tragenden E. coli-Stamms DH1 in dem BHI Kulturmedium werden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt. Nach Entfernung der überstehenden Flüssigkeit werden Zellen mit 1 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) versetzt, der 1 mM CuSO₄, 1 mM ZnSO₄ und 50 mM Saccharose enthält. Unter Eiskühlung wird das resultierende Gemisch einer Ultraschallbehandlung während 5 min unterworfen (unter Verwendung von Handy Sonic UR-20P der Tomy Corp.). Auf diese Weise werden die Zellen lysiert. Ein 1 µl Aliquot des Lysats wird in die Probenschlitze eines Agarosegelfilms eingetropft (Universal der Corning Company), der zuvor mit 20 ml Tris-Glycin-Puffer (pH 8,45) äquilibriert wurde. Nach Durchführung der Elektrophorese bei 250 V während 20 min in einem 20 mM Tris-Glycin-Puffer (pH 8,45) wird der Film 2 min in eine 5 mg/ml Nitroblautetrazolium- Lösung eingetaucht, die 0,1 mM Riboflavin enthält. Man läßt die Lösung von dem Film abtropfen. Nach einminütigem Eintauchen des Films in eine 1%ige Tetramethyl-Ethylendiamin-Lösung läßt man die Lösung von dem Film abtropfen. Der Film wird dazu gebracht, in weißem Licht eine Farbe zu erzeugen, bis ein Kontrast mit einem weißen Hintergrund in einem Gel erscheint. Nach Bildung der Farbe wird das nichtumgesetzte Reagens mit destilliertem Wasser weggewaschen und der Film anschließend getrocknet. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt, wobei ein Bereich mit h-SOD-Aktivitäten keine Farbe erzeugt, die anderen Bereiche jedoch eine Purpurfarbe annehmen. Aus der Figur wird deutlich, daß die Breite des aktiven Bands im Falle der rekombinanten h-SOD der vorliegenden Erfindung schmal ist (linke Seite; Ser an der 111. Stelle der Aminosäuresequenz). Dieses Produkt wurde erhalten aus der kultivierten Zellbrühe des das Plasmid pSOD14 tragenden E.coli-Stamms. Es zeigt sich somit, daß die rekombinante h-SOD kaum Isomere ergibt und darüber hinaus stabil ist. Andererseits hatte die h-SOD, welche aus dem das Plasmid pSOD6 tragende E. coli erhalten wurde, ein breites Band und bildete viele Isomere.

(vi) Stabilität von h-SOD und rekombinanter h-SOD beim Stehenlassen: 1 mg Aliquote von h-SOD, erhalten nach Verfahren (vi) von Referenzbeispiel 5, und von rekombinanter h-SOD, erhalten in Beispiel 1, werden gesondert aufgelöst in Portionen eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 7,0), enthaltend 50 mM Saccharose. Dann werden die Proben 1 Woche bei Raumtemperatur stehengelassen. Die resultierenden Lösungen werden einer isoelektrischen Fokussierung unterworfen. h-SOD und die rekombinante h-SOD zeigen jeweils ein einziges Signal am isoelektrischen Punkt (pI) von 5,0 zu Beginn des Experiments. Dieses Signal wird im folgenden als "S ₀" bezeichnet. Als Ergebnis des Experiments werden vier Isomere mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten (pI = 5,1, 4,9, 4,85 und 4,8) gebildet. Die diesen Isomeren entsprechenden Signale werden im folgenden als S _-1, S ₁, S ₂ bzw. S ₃ bezeichnet. Das Verhältnis des Ausgangssignals h-SOD (S ₀) fällt auf etwa 70%. Bei der rekombinanten h-SOD wird ein Isomeres bei pH = 4,9 gebildet. Der diesem Isomeren entsprechende Peak wird im folgenden als "S ₁" bezeichnet. Das Verhältnis dieses Isomeren ist jedoch so gring wie 7,9% und mehr als 90% der rekombinanten h-SOD bleiben somit erhalten. S ₁ hat zwar vergleichbare Aktivitäten mit S ₀, die Aktivitäten von S ₂ sind jedoch niedriger als die von S ₀. Die Aktivitäten von S ₃ sind geringer als die Hälfte derjenigen von S ₀ und S _-1 hat im wesentlichen keine Aktivitäten. Folglich wird als Resultat der Umwandlung von h-SOD in die rekombinante h-SOD eine signifikante Verbesserung bei der Stabilität sowohl der Struktur als auch der enzymatischen Aktivität festgestellt.

Zusammensetzungen von h-SOD und rekombinanter h-SOD nach 1 Woche

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt. pSOD35 wird erhalten unter Verwendung eines Nucleotids 5′ GAGACCATACCATCATT 3′, das nebenher synthetisiert wurde. Zusätzlich wurde pSOD36 erhalten aus einem Experiment, bei dem das synthetische Nucleotid 5′ GAGACCATGCCATCATT 3′ auf dem in Beispiel 1 erhaltenen pSOD14 verwendet wurde. Bei den h-SODs, die durch pSOD35 bzw. pSOD36 codiert wurden, ist das Cys in der 111-Stelle geändert zu Thr bzw. Ala. Die durch E.coli DH1, enthaltend pSOD35 bzw. p-SOD36, erzeugten h-SODs sind jeweils rekombinante h-SODs, die als Proteine stabilisiert sind und die Fähigkeit aufweisen, ähnliche SOD-Aktivitäten wie die von Beispiel 1 zu zeigen.

Es sei noch darauf hingewiesen, daß rekombinante h-SOD, welche jeweils den synthetischen Nucleotiden der obigen Tabelle 1 entsprechen, erhalten werden können, falls man die obigen Verfahren unter Verwendung dieser synthetischer Nucleotide anstelle der oben beschriebenen synthetischen Nucleotide durchführt.

Beispiel 3

Zu 100 µg (100 µl) in Beispiel 1 erhaltener pSOD14 DNA gibt man 18 µl zehnfachen BamHI Verdauungspuffer [100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 70 mM MgCl₂, 1 M NaCl, 10 mM Dithiothreit], 120 Einheiten (10 µl) BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.) und 52 µl Wasser. Nach 2stündiger Umsetzung bei 37°C werden DNA-Fragmente mit etwa 700bp extrahiert, gereinigt und in einen trocknenen Zustand überführt, und zwar auf gleiche Weise wie oben beschrieben durch Elektrophorese in einem 0,7% Agarosegel. Die so erhaltene DNA wird aufgelöst in 44 µl TE (pH 8,0), gefolgt von einer Zugabe von 6 µl zehnfachem TthHb8I Verdauungspuffer [100 mM Tris-HC1, 100 mM MgCl₂, 1 mM NaCl, 10 mM Dithiothreit] und 80 Einheiten (10 µl) TthHB8I (Takara Shuzo Co., Ltd.). Die DNA wird 3 h bei 37°C hydrolysiert. Es werden DNA-Fragmente mit etwa 600bp isoliert und auf gleiche Weise wie oben gereinigt. Anschließend erfolgt ihre Auflösung in 100 µl Wasser. Außerdem wird pSOD53 auf exakt die gleiche Weise wie in Referenzbeispiel 5(v) beschrieben unter Verwendung von 5′ TGTCCGTGCTGAAGGG 3′ und 5′ CACGGACACGGCCTT 3′ anstelle von 5′ TGTGCGTGCTGAAGGG 3 ′ und 5′ CACGCACACGGCCTT 3′ unter den 12 Strängen der in Referenzbeispiel 5(iii) verwendeten synthetischen Nucleotide erhalten. Bei Bestimmung der Basensequenz der DNA von pSOD53 auf die vorstehend beschriebene Weise wird festgestellt, daß TGC, welches für Cys an der 6. und 111. Stelle codierte, in beiden Fällen zu TCC geändert wurde.

Im Hinblick auf die Ergebnisse einer elektrophoretischen Analyse in Agarose wird festgestellt, daß die rekombinante h-SOD, welche aus dem pSOD53 tragenden E.coli-Stamm DH1 auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten wurde, in ähnlicher Weise stabil ist wie die rekombinante h-SOD, welche durch den pSOD14 tragenden E.coli-Stamm DH1 erzeugt wird.

Beispiel 4

(i) Ein für das h-SOD-Gen klonierendes Plasmid wird hergestellt durch Modifizierung eines klonierenden Plasmids pSV2-dhfr [Produkt der BRL Company; Mol. & Cell. Biol. 1, 854 (1918)], welches den SV40-Promotor des Gens von Mausfolsäurereductase enthält. pSOD14 wird durch die Restriktionsendonucleasen XbaII und BamHI verdaut, und das h-SOD-Gen zu isolieren. Fragmente dieses Gens werden dann durch T4-Ligase mit einem Vektor zerschnitten, welcher erhalten wurde durch Verdauung von pSP64-Plasmid [Produkt der Amasham Company; Nucleic Acid Res. 12, 7035 (1984)] mit den Restriktionsendonucleasen Xba1 und BamHI. Auf diese Weise erhält man das pSP64-h-SOD-Plasmid. Durch Verdauung von pSP64-h- SOD mit den Restriktionsendonucleasen HindIII und BamHI werden wiederum DNA-Fragmente isoliert, welche das h-SOD-Gen enthalten. Schließlich werden die obigen HindIII-BamHI-Fragmente geschnitten mit T4-Ligase auf dem Vektor, welcher erhalten wurde durch Verdauung des pSV2-dhfr-Plasmids mit HindIII und Bg1II, so daß ein Plasmid pSV2-h-SOD für die Expression des h-SOD-Gens in Säugetierzellen erhalten wurde.

(ii) Die Einführung (Transformation) der so erhaltenen Plasmid-DNA in Zellen wurde durchgeführt nach dem DNA-Calciumphosphat-Fällungsverfahren [Tanpakushitsu. Kakusan. Koso (Proteins, Nucleid Acids & Enzymes, Sonderausgabe, 27, 340 (1984)]. Sterile Luft wurde in 1 ml einer Lösung eingeblasen, die zusammengesetzt war aus 20 mM Hepes-Puffer (pH 7,10), 50 mM NaCl, 0,7 mM Natriumphosphat, 120 mM CaCl₂ und pSV2-h-SOD-Plasmid (10 µg/ ml). Es bildet sich eine trübe DNA-Calciumphosphatlösung. Diese wird dann in 50 Petrischalen (Durchmesser 8 cm) gegeben, in denen COS-Zellen [Cold Spring Harbor, Symp. Quant. Biol., 44, 293 (1979)] in DMEM-Medium + 10% Neonatalkalbsserum vermehrt worden waren. Nach Kultivierung der COS-Zellen bei 37°C während 48 h in einem Inkubator, der 5% CO₂ enthält, werden die Zellen geerntet und dann in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) suspendiert. Die Zellen werden anschließend mittels "Polytron" zerrissen und nachfolgend 10 min bei 15 000 U/min zentrifugiert, um eine überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Die überstehende Flüssigkeit wird durch Elektrophorese in Agarose isoliert und ein Band, entsprechend h-SOD, aktiviert und angefärbt, um dessen Mobilität zu untersuchen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Beispiel 5 Expression von h-SOD in Hefe

(i) Herstellung des Klonierungsplasmids

(1) 1 µg Plasmid pSOD14 von Beispiel 1 und 1 µg pUC19 [gekauft bei Takara Shuzo Co., Ltd.; C. Yanisch- Perron et al., Gene (1985), 33, 103-119] werden 2 h bei 37°C in gesonderten Behältern verdaut unter Verwendung von 50 µl XbaI-Puffer [6 mM MgCl₂, 6 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7,4], welcher die Restriktionsendonucleasen XbaI und BamHI enthält (Handelsprodukt der Takara Shuzo Co., Ltd.; alle Restriktionsendonucleasen und andere Enzyme, die zur DNA-Modifizierung und -Ligation eingesetzt wurden und nachfolgend erwähnt werden, wurden von der gleichen Firma hergestellt, sofern nicht anders angegeben). Die eingesetzten Mengen betragen jeweils etwa 10 Einheiten. Die XbaI-BamHI-Verdauung von pUC19 wird mit Phenol behandelt, mit Ethanol gefällt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet. Das Präzipitat wird dann in 10 µl TE aufgelöst [10 mM Tris-HCl (pH 8,0) -1 mM EDTA-Lösung]. Dazu gibt man 10 µl fünffacher BAP-Puffer [250 mM Tris-HCl (pH 8,3)], 29 µl steriles, destilliertes Wasser und 1 µl (etwa 0,4 Einheiten) alkalische Phosphatase bakteriellen (E.coli) Ursprungs [bakterielle alkalische Phosphatase] (im folgenden als BAP abgekürzt). Das resultierende Gemisch wird 30 min bei 65°C inkubiert (hierbei handelt es sich um eine enzymatische Behandlung zur Entfernung des Phosphorsäurerestes am 5′-Ende; sie wird im folgenden als BAP-Behandlung bezeichnet). Die BAP-behandelte XbaI-BamHI-Verdauung von pUC19 und die XbaI-BamHI-Verdauung von pSOD14 werden in 1% (Gew./Vol) Agarosegel der Elektrophorese unterworfen. Das resultierende Gel wird in eine Lösung eingetaucht, die erhalten wurde durch Zugabe von Ethidiumbromid bei einer Konzentration von 0,5 µg/ml zu einem elektrophoretischen Puffer [0,04 M Tris-Acetat, 2 mM EDTA (pH 8,1)] (im folgenden als EtBr-Anfärbelösung bezeichnet). Das Gel wird 20 min stehengelassen. Dann wird das Gel ausgezogen und auf einen Tisch placiert, wo es einer langwelligen UV- Strahlung ausgesetzt wird (366 nm; bestrahlt aus Modell UVL-56 der Ultraviolet Products Inc.), um die DNAs sichtbar zu machen. Aufgrund der Beurteilung aus einem DNA-Fragment-Größenmarkierer der HindIII-Restriktionsenzymverdauung des λ-Phagen-DNA, die gleichzeitig der Elektrophorese unterworfen wurde, werden Gelstücke jeweils mit einem anatomischen Skalpell aus der Elektrophoresebahn der pUC19-Verdauung bzw. der pSOD14-Verdauung abgeschnitten, welche die XbaI-BamHI-DNA von etwa 2680 Basenpaaren (im folgenden als "bp" abgekürzt) und die XbaI-BamHI-DNA-Fragmente von etwa 700 bp enthalten. Diese Gelstücke werden in gesonderte Dialyserohre placiert, von denen jedes etwa 0,4 ml des obigen elektrophoretischen Puffers enthält. Nachdem man beide Enden des jeweiligen Rohrs verschlossen hat, wird das Rohr stillstehend in ein horizontales, elektrophoretisches Bad placiert, das mit dem oben erwähnten elektrophoretischen Puffer gefüllt ist. Dann wird eine elektrische Elution bei 200 V während 30 min durchgeführt. Ein Ende des Dialyserohrs wird geöffnet und der Puffer, enthaltend das eluierte DNA, aus dem Rohr in ein Eppendorf-Rohr transferiert.

Die so erhaltenen Eluate, welche diese Fragmente enthalten, werden jeweils mit Phenol behandelt, mit Ethanol gefällt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet. Die resultierenden Präzipitate werden gesondert aufgelöst in 10 µl TE. Ein 2 µl-Aliquot der oben hergestellten Lösung, welche Fragmente mit etwa 2680 bp enthält, die aus pUC19 erhalten wurde, wird einem 2 µl-Aliquot der oben hergestellten Lösung von Fragmenten mit etwa 700 bp zugesetzt, die aus pSOD14 erhalten wurden. 1 µl zehnfacher Ligationspuffer [beschrieben bei Referenzbeispiel 5] und 1 µl (etwa 350 Einheiten) T4 DNA-Ligase werden zugesetzt. Das resultierende Gemisch wird über Nacht bei 4°C stehengelassen. Unter Verwendung der so hergestellten Ligationsflüssigkeit wird der E.coli Stamm DH1 transformiert gemäß den bei Referenzbeispiel 2 beschriebenen Verfahren (ii) und (iii).

(2) Vier Transformanten werden nach dem Zufallsprinzip aus den resultierenden Transformanten ausgewählt. Diese werden über Nacht bei 37°C in einem flüssigen BHI- Kulturmedium (Ampicillingehalt = 50 µg/ml) kultiviert und ein Plasmid wird aus der kultivierten Zellbrühe folgerndermaßen erhalten.

Ein 1,5 ml-Aliquot der kultivierten Zellbrühe, welche die in dem flüssigen Medium kultivierten Zellen enthält, wird in ein Eppendorf-Rohr (Eppendorf Company) transferiert und 30 sec bei 15 000 U/min und 4°C mittels einer kleinen Zentrifuge (MR-15A; Tomy Seiko K.K.) zentrifugiert. Die resultierende, überstehende Lösung wird weggeworfen. Zu den am Boden des Rohrs gesammelten Zellen gibt man 100 µl Lysozymlösung [20% Glucose, 50 mM Tris-HC1 (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0); eine Lösung, erhalten durch Auflösen von aus Hühnereiweiß stammendem Lysozym (Sigma Company) in einer Menge von 2 mg/ml Lösung]. Die Zellen werden suspendiert. Nachdem man den Behälter 20 min stillstehend in Eis-Wasser gehalten hat, werden 0,2 N NaOH und 200 µl 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) außerdem zugesetzt. Die resultierende Mischung wird gründlich gerührt und dann 5 min in Eis aufbewahrt. Dann werden 159 µl 3 M Natriumacetat (pH 4,8) zugesetzt und die resultierende Mischung wird gründlich gerührt und 3 h in Eis stehengelassen. Die Mischung wird dann 10 min bei 15 000 U/min und 4°C mittels der obigen Zentrifuge zentrifugiert und die resultierende, überstehende Flüssigkeit in ein gesondertes Eppendorf-Rohr transferiert. 1,2 ml Ethanol werden zugesetzt, gründlich vermischt und dann 20 min bei -20°C stehengelassen. Das Gemisch wird dann 10 min bei 15 000 U/min und 4°C mittels der obigen Zentrifuge zentrifugiert und die resultierende, überstehende Flüssigkeit weggeworfen. Um das Präzipitat zu waschen, wird 1 ml wasserfreies Ethanol in den Behälter gefüllt. Das resultierende Gemisch wird 30 sec bei 15 000U/min und 4°C mittels der obigen Zentrifuge zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit erneut weggeworfen. Die noch in dem Behälter verbleibende Flüssigkeit, die im wesentlichen aus Ethanol besteht, wird 10 min bei Raumtemperatur unter verringertem Druck mittels einer Vakuumpumpe abgedampft. Eine geringe Menge an Feststoffen (welche das Plasmid DNA enthalten) erscheint am Boden des Behälters. Dazu gibt man 50 µl TE (pH 8,0), um das Ganze aufzulösen. Ein 2 µl -Liquot der TE- Lösung wird 2 h bei 37°C in 20 µl XbaI-Puffer, welcher 2,5 Einheiten XbaI, 2,5 Einheiten BamHI und 1 µg aus Rindermilz stammende Ribonuclease (Farmacia AB; im folgenden als "RNase" abgekürzt) enthält, verdaut. Die resultierende Verdauung wird einer Elektrophorese in 0,7% Agarose unterworfen. Als Ergebnis erscheint ein Fragment von etwa 700 bp von jedem der vier Plasmide. Eines der vier Plasmide wird als "pUC19-SOD14" bezeichnet.

Der Stamm DH1, welcher dieses Plasmid zurückhält, wird als "DH1/pUC19-SOD14" bezeichnet. Dieses Bakterium wird in einer großen Menge kultiviert, um die DNA zu erhalten. Dabei wird DH1/pUC19-SOD14 über Nacht bei 37°C in 100 ml flüssigem BHI-Kulturmedium kultiviert, in dem 50 µg/ml Ampicillin enthalten sind. Die kultivierte Zellbrühe wird 10 min bei 5000 U/min und 4°C zentrifugiert unter Verwendung eines "Nr. 17N Rotors" (Tomy Seiko K.K.) zentrifugiert und die überstehende, resultierende Flüssigkeit weggeworfen. Dem Zentrifugenrohr werden 20 ml 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) zugesetzt, um die Zellen am Boden zu suspendieren. Die Suspension wird in einen gesonderten Behälter überführt, dann 10 min bei 5000 U/ min und 4°C mittels des gleichen "Nr. 4 Rotors" (Tomy Seiko K.K.) zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird weggeworfen und die Zellen werden am Boden gesammelt. Die Zellen werden dann in 2 ml Lysozymlösung suspendiert und der Behälter 30 min in Eis stehengelassen. Nach Zugabe von 0,2 N NaOH und 4 ml 1% SDS-Lösung und gründlichem Rühren der resultierenden Mischung wird der Behälter 20 min in Eis stehengelassen. Dann gibt man 3 ml 3 M Natriumacetat (pH 4,8) zu, rührt das resultierende Gemisch gründlich und läßt den Behälter 2 h in Eis stehen. Unter Verwendung des obigen Nr. 4 Rotors wird die oben hergestellte Mischung 10 min bei 14 000 U/min und 4°C zentrifugiert und die resultierende, überstehende Flüssigkeit in einen gesonderten Behälter transferiert. Zu dem abgetrennten Überstand gibt man 2,5 Vol. wasserfreies Ethanol. Nach Abkühlen der resultierenden Lösung bei -20°C während 20 min wird 10 min bei 14 000 U/min und 4°C mittels des obigen Nr. 4 Rotors zentrifugiert. Der Resultierende Überstand wird weggeworfen und das an der Wand und am Boden des Behälters erscheinende Präzipitat in 4 ml TE aufgelöst, gefolgt von einer Zugabe und Auflösung von 4,2 g Cäsiumchlorid. Ferner werden 0,5 ml 10 mg/ml Ethidiumbromid-Lösung zugesetzt. Die resultierende Mischung wird in ein "Quick Seal"-Zentrifugenrohr (Beckman Company) überführt und dessen obere Endöffnung mittels eines "Tube Sealer" (Beckman Compay) verschlossen. Anschließend wird 16 h bei 50 000 U/min und 15°C unter Verwendung eines "VTi 65.2 Rotors", hergestellt von der gleichen Firma, zentrifugiert. Das Rohr wird vorsichtig aus dem Rotor entfernt und in einem Dunkelraum das zweite Band von oben in dem zentralen Abschnitt aus den Bändern, die im orangefarbenen Bereich bei Strahlung mit langwelliger UV-Strahlung beobachtet werden, gesondert gesammelt, während man die innere Flüssigkeit durch ein Loch austropfen läßt, das mittels einer Injektionsnadel durch den Boden des Zentrifugenrohrs gestoßen wurde.

Die das oben gesammelte Band enthaltende Flüssigkeit wird bei Raumtemperatur mit n-Butanol in einer Menge von 1 Vol. zu 3 Vol. versetzt. Das resultierende Gemisch wird geschüttelt und vermischt, um Ethidiumbromid zu extrahieren und zu entfernen, das in der DNA intercalatiert ist. Nach 5maliger Wiederholung dieser Extraktions- und Entfernungsoperation wird die untere Schicht, d. h. die Wasserphase, in ein Dialyserohr überführt, um das Cäsiumchlorid loszuwerden. Unter Verwendung von 500 ml TE als äußere Lösung wird die Wasserphase 2 bis 30 h bei 4°C dialysiert, wobei man die äußere Lösung dreimal im Verlauf der Dialyse ersetzt. Die innere Lösung des Dialyserohrs wird dann in ein Eppendorf-Rohr überführt. Dazu gibt man die gleiche Menge an TE-gesättigtem Phenol. Die resultierende Mischung wird gründlich gerührt und 30 sec bei Raumtemperatur und 15 000 U/min mittels einer kleinen Zentrifuge zentrifugiert. Von den resultierenden beiden Schichten wird die obere Schicht gesondert gesammelt. Die gleiche Menge an Diethylether wird zugesetzt und das resultierende Gemisch gründlich gerührt. Die obere Etherschicht wird dann verworfen. Diese Etherextraktion (zur Entfernung des Phenols) wird insgesamt dreimal durchgeführt. Der restliche Ether wird durch Vakuumverdampfung entfernt. Pro 400 µl Flüssigkeit gibt man dann 10 µl 1 M MgCl₂ und 40 µl 5 M Kaliumacetat zu, gefolgt von einer weiteren Zugabe von 1 ml wasserfreiem Ethanol. Die resultierende Lösung wird abgekühlt und 10 min bei -110°C lyophilisiert. Dann wird 10 min bei 4°C und 15 000 U/ min mittels einer kleinen Zentrifuge zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit verworfen, 1 ml wasserfreies Ethanol zugesetzt und die resultierende Mischung 30 sec bei den gleichen Bedingungen zentrifugiert. Das Präzipitat wird unter verringertem Druck zu einem Feststoff getrocknet. Dieser wird dann in 400 µl TE aufgelöst. Auf diese Weise erhält man das pUC19-SOD14-Plasmid in großen Mengen.

(3) Anschließend wird 1 µg DNA von pAM82 (zur Verfügung gestellt von Dr. Kenichi Matsubara, Cytoengineering Center der Osaka University; beschrieben in der JA-OS 36 699/1984; FERM-P-8838) verdaut durch etwa 10 Einheiten Restriktionsendonuclease PvuII bei 37°C während 2 h in 10 µl M Puffer [10 ml Tris-HC1, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT und 50 mM NaCl, pH 7,5]. Das resultierende Gemisch wird mit Phenol behandelt, mit Ethanol gefällt, mit Ethanol gewaschen und dann getrocknet. Das so erhaltene Präzipitat wird wiederum verdaut bei 37°C während 2 h in 20 µl H Puffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT und 100 mM NaCl; pH7,5), welcher etwa 10 Einheiten der Restriktionsendonuclease XhoI enthält. Nachdem man die Verdauung der Phenolbehandlung, der Ethanolfällung, dem Waschen mit Ethanol und Trocknen unterworfen hat, wird das resultierende Präzipitat aufgelöst in 10 µl TE, dem 10 µl fünffacher BAP-Puffer (wie oben beschrieben), 29 µl steriles, destilliertes Wasser und 1 µl (etwa 0,4 Einheiten)BAP zugesetzt wurden. Dann erfolgt eine BAP-Behandlung während 30 min bei 65°C. Die so behandelte Lösung wird als pAM82 PvuII-XhoI/BAP-Lösung bezeichnet. Mittels etwa 10 Einheiten der Restriktionsendonuclease SalI wird 1 µg Aliquot der zuvor erhaltenen pUC19-SOD14 Plasmid DNA 2 h bei 37°C in 20 µl H Puffer verdaut. Nach Phenolbehandlung, Ethanolfällung, Waschen mit Ethanol und Trocknen wird die Verdauung wiederum verdaut durch etwa 10 Einheiten der Restriktionsendonuclease SmaI bei 30°C während 2 h in 20 µl SmaI Puffer (10 mM Tris-HCl, 7 mM MgCl₂, 20 mM KCl, 7 mM 2-Mercaptoethanol, pH 8,0). Die resultierende Verdauung und die pAM82 PvuII-XhoI/BAP-Lösung werden jeweils einer Elektrophorese unterworfen in einem 1%igen Agarosegel. Auf diese Weise erhält man aus pUC19-SOD14 stammende SalI-SmaI DNA-Fragmente von etwa 700 bp sowie von pAM82 stammende PvuII-XhoI DNA-Fragmente von etwa 10 Kilo bp durch elektrische Elution. Nachdem die Eluate mit einem Gehalt der jeweiligen DNA-Fragmente der Phenolbehandlung, Ethanolpräzipitation, Waschen mit Ethanol und Trocknen unterworfen wurden, werden die resultierenden Präzipitate gesondert in 10 µl TE aufgelöst. 2 µl von jeder der beiden Typen von DNA-Fragmentlösungen, 4 µl steriles, destilliertes Wasser, 1 µl zehnfacher Ligationspuffer und 1 µl (etwa 350 Einheiten) Te DNA-Ligase werden zusammengegeben und dann über Nacht bei 4°C stehengelassen. Unter Verwendung dieser Ligationsflüssigkeit wird der E.coli-Stamm DH 1 transformiert, und zwar gemäß den Verfahrensweisen (ii) und (iii) von Referenzbeispiel 2. Zwei der so erhaltenen Transformanten werden über Nacht bei 37°C in dem BHI flüssigen Kulturmedium, welches 50 µ/ml Ampicillin enthält, kultiviert. Aus den kultivierten Zellen wird die Plasmid DNA enthaltende Lösung auf gleiche Weise, wie oben beschrieben, erhalten. 2 µl Aliquots der Lösung werden gesondert zu H Puffer mit einem Gehalt an 2,5 Einheiten AatI und 1 µg RNase und zu H Puffer mit einem Gehalt an 2,5 Einheiten BamHI und 1 µg RNase gegeben. Jeder dieser Puffer wird in solchen Mengen eingesetzt, daß das Endvolumen 20 µl erreicht. Die Plasmid DNA wird 2 h bei 37°C durch die jeweiligen Restriktionsendonucleasen verdaut. Die resultierenden Verdauungen werden in einem 0,7% Agarosegel der Elektrophorese unterworfen. Als Ergebnis wird festgestellt, daß in Verbindung mit den Plasmiden beider Stämme Fragmente, die die gleiche Mobilität wie die DNA-Fragmente von etwa 0,5 kbp aufweisen, die mittels der AatI-BamHI-Verdauung von pUC19-SOD14 erhalten wurden, lediglich bei der Verdauung auftreten, welche mittels der beiden Restriktionsendonucleasen AatI und BamHI erhalten wurden. Eines dieser Plasmide wird als pTJ102-SOD14 bezeichnet.

Das Fließschema des obigen Verfahrens ist in Fig. 7 dargestellt.

(ii) Herstellung von transformierter Hefe

Als Hefestamm wird Saccharomyces cerevisiae AH22 [ein leu2 his 4 can1 (cir⁺)] (zur Verfügung gestellt von Dr. Kenichi Matsubara, Cytoengineering Center der Osaka University; JA-OS 36 699/1984; FERM P-8840) verwendet. Der Stamm wird auf 3 ml YPD-Kulturmedium (2% Polypepton, 1% Hefeextrakt, 2% Glucose) inokuliert, über Nacht bei 30°C kultiviert und zentrifugiert, um Zellen zu ernten. Die Zellen werden in 1 ml vorbereiteter Protoplastlösung [50 µg/ml Zymolyase-100T (Seikagaku Kogyo Co., Ltd.), 100 mM Citratpuffer (pH 5,8), 10 mM EDTA, 1 M Sorbit] suspendiert und die resultierende Suspension wird 1 h bei 30°C aufbewahrt. Die Zellen werden gesammelt und dann zweimal mit 1 ml 1M Sorbitlösung, welche 10 mM CaCl₂ enthält, gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in 0,1 ml der Lösung suspendiert. Etwa 5 µg (5 µl) pTJ102-SOD14 werden zu einem 50 µl Aliquot der Suspension zugesetzt. Das resultierende Gemisch wird 15 min bei Raumtemperatur stehengelassen und dann mit 1 ml PEG-Lösung [20% (Gew./Vol.) PEG 4000, 10 mM Tris- HCl (pH 7,0), 10 mM CaCl₂] versetzt. Die resultierende Suspension wird 15 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Zellen werden gesammelt, in 0,1 ml 1 M Sorbit suspendiert und anschließend zu 5 ml eines geschmolzenen Regenerationsagars [1 M Sorbit, 3% Agar und "Leu minus COM" (0,17% Hefe-Stickstoff-Base, 0,5% Ammoniumsulfat, 2% Glucose, 20 µg/ml Adeninsulfat, 20 µg/ml L-Arginin. HCl, 20 µg/ml L-Histidin. HC1, 20 µg/ ml L-Methionin, 20 µg/ml L-Tryptophan, 20 µg/ml Uracil, 30 µg/ml Isoleucin, 30 µg/ml L-Lysin. HCl, 30 µg/ml L- Tyrosin, 50 µg/ml L-Phenylalanin, 150 µg/ml L-Valin)] gegeben, welches bei 45°C gehalten wird. Die so hergestellte Suspension wird auf einer Platte für ihre Kultivierung ausgebreitet. Vom 3. Tage an wird ein Transformant sichtbar, der mit L-Leucin-Nicht-Auxotrophismus versehen ist. Diese Eigenschaft wird der Retention des Plasmids pTJ102-SOD14 durch den Hefestamm AH22 zugeschrieben. Die transformierte Hefe wird als "AH22/pTJ102-SOD14" bezeichnet. In ähnlicher Weise wird, um zu zeigen, daß ein Transormant als Ergebnis der Transformation von AH22 mittels eines bestimmten Plasmids erhalten wurde, der Transformant im folgenden als "AH22/Name des eingesetzten Plasmids" bezeichnet. Beispielsweise wird AH22, welches pAM82 trägt, als "AH22/pAM82" bezeichnet.

(iii) Die transformierte Hefe AH22/pTJ102-SOD14, die nach dem Verfahren (II) erhalten wurde und die Eigenschaft des L-Leucin-Nicht-Auxotrophismus erworben hat, wird bei 30°C in 100 ml Burkholder-Minimalmedium [vergl. Toh-e A. et al. (1973), J. Bacteriol., 113, 727-738] kultiviert, welches 20 µg/ml L-Histidin und 20 µg/ml L-Tryptophan enthält. In der logarithmischen Wachstumsphase werden die Zellen nach Entfernung des Mediums geerntet und 100 ml frisches Medium zugesetzt. Das frische Medium enthält 20 µg/ml L-Histidin und 20 µg/ml L-Tryptophan. Es enthält ferner KH₂PO₄ in einer Menge von 1/15 derjenigen Menge in dem Burkholder-Minimalmedium. Stattdessen wurde KCl in einer Menge zugesetzt, die das verringerte Gewicht an KH₂PO₄ ausgleicht. Die AH22/pTJ102-SOD14, deren Kulturmedium gewechselt worden war, wird weitere 24 h bei 30°C kultiviert und die resultierenden Zellen werden geerntet. Nach der von Goscin et al. vorgeschlagenen Verfahrensweise [Biochemica et Biophysica Acta, 289, 276-283 (1972)] wird die rekombinante h-SOD extrahiert und durch Ionenaustauschchromatographie erhält man die rekombinante h-SOD in gereinigter Form. Dieses Verfahren wird nachfolgend erläutert.

Nachdem die AH22/pTJ102-SOD14-Zellen, welche zur Expression induziert worden waren durch Kultivierung der rekombinanten h-SOD unter den Bedingungen einer niedrigen anorganischen Phosphatkonzentration auf die oben beschriebene Weise geerntet worden waren und bei -20°C über Nacht ausgefroren wurden, werden sie auf Raumtemperatur aufgetaut. Eine 0,1 M NaHCO₃-Lösung wird in einer Menge von 1,9 ml/g Naßgewicht zugesetzt und das resultierende Gemisch gründlich gerührt, um die Zellen zu suspendieren. Außerdem wird Ethanol- Chloroform (5/3 Vol/Vol) in einer Menge von 1,1 ml/g Naßgewicht zugesetzt und die resultierende Mischung über Nacht bei 30°C geschüttelt. Durch diese Bearbeitung wird die rekombinante h-SOD aus den Hefezellen extrahiert. Durch Zentrifugieren (RPR 20 Rotor der Hitachi, Ltd.; 10 000 U/min, 25°C, 10 min) werden die Pellets und der Überstand voneinander getrennt und der Überstand wird in einen gesonderten Behälter überführt. Pro 1 ml des Überstands gibt man 30 mg K₂HPO₄ allmählich in fester Form zu und löst anschließend auf. Als Behälter wird ein Eppendorf-Rohr mit einer Kapazität von etwa 1,5 ml verwendet.

Nachdem die Lösung etwa 40 min bei Raumtemperatur gestanden hat, wird sie 1 min bei 15 000 U/min und 4°C mittels einer kleinen Zentrifuge zentrifugiert. Von den resultierenden beiden Schichten und der dazwischenliegenden, dünnfilmartigen Substanz wird die obere Schicht in ein gesondertes Eppendorf-Rohr transferiert. Der die obere Schicht einschließende Behälter wird 20 min bei -110°C eingefroren und anschließend 10 min bei 15 000 U/min und -7°C mittels einer kleinen Zentrifuge zentrifugiert. Von den resultierenden beiden Schichten und der dazwischenliegenden, dünnfilmartigen Substanz wird die obere Schicht in ein gesondertes Eppendorf- Rohr transferiert. Das Rohr wird mit Eis gekühlt und eiskaltes Aceton in einer Menge zugesetzt, die dem 0,75fachen des Inhaltsvolumens entspricht. Das resultierende Gemisch wird gerührt und die Eiskühlung weitere 5 min fortgesetzt. Der Behälter wird 10 min bei 15 000 U/min und 4°C mittels der kleinen Zentrifuge zentrifugiert und der resultierende Überstand verworfen. Das erhaltenen Präzipitat wird vollständig in 1 ml destilliertem Wasser gelöst, gefolgt von einer Zugabe von 1 µl Zn-Cu-Lösung (1 M CuSO₄, 1 M ZnSO₄) und 20 µl Kaliumphosphatpuffer (pH 6,8). Zur Entfernung eines Präzipitats, welches sich bei der Zugabe der Zn-Cu- Lösung gebildet hat, wird das Gemisch 1 min bei 15 000 U/min und 4°C mittels der kleinen Zentrifuge zentrifugiert. Der resultierende Überstand wird in einen gesonderten Behälter überführt. Dieser Überstand wird in einen CF 25-Behälter (Amicon Company; Zentrifugen- Ultrafiltrationsmembran) überführt und 10 min bei 1500 U/min und 4°C zentrifugiert, wobei man einen TS-7- Rotor (Tomy Seiko K.K.) verwendet. Ferner gibt man 1 ml destilliertes Wasser in den CF25-Behälter und zentrifugiert erneut unter den gleichen Bedingungen. Es werden weitere 300 µl destilliertes Wasser in den CF25- Behälter gegeben, um die Komponenten abzuwaschen, welche nicht durch die Filtrationsmembran hindurchgegangen sind. Die Waschlösung wird in einen gesonderten Behälter überführt. Die Waschflüssigkeit wird in ein Dialyserohr überführt und dann über Nacht bei 4°C gegen 500 ml 2,5 mM Na-K-Phosphatpuffer dialysiert, der hergestellt wurde durch Vermischen von 0,5 M KH₂PO₄-Lösung und 0,5 M Na₂HPO₄-Lösung bei pH 6,5 (Raumtemperatur) und nachfolgendes Verdünnen der resultierenden Mischung mit destilliertem Wasser. Die innere Lösung des Dialyserohrs wird entnommen und nach der Filtration durch "Column Guard SJHV 004NS" (Millipore Corp.) wird die rekombinante h-SOD fraktioniert unter Anwendung einer Methode, bei der ein Ionenaustauschmaterial eingesetzt wird. Dabei wird die in dem Filtrat enthaltene, rekombinante h-SOD auf einer "Mono W 5/5 column (HPLC- Säule; Farmacia AB) adsorbiert, welche zuvor äquilibriert wurde mit dem oben erwähnten 2,5 mM Na-K-Phosphatpuffer. Nach Abwaschen von nicht-adsorbierten Komponenten mit dem 2,5 mM Na-K-Phosphatpuffer wird die Konzentration des Na-K-Phosphatpuffers linear geändert von 2,5 mM auf 15 mM. Auf diese Weise wird die rekombinante h-SOD aus der Säule eluiert. Die auf diese Weise gesammelte, rekombinante h-SOD wird als aktives Band bei der gleichen elektrophoretischen Position ermittelt, wie die native h-SOD, erhalten aus menschlichen roten Blutzellen (Sigma Company), die als Kontrolle der Elektrophorese unterworfen wurde. Bei der Elektrophorese wurde die in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise (v) der Aktivitätsanfärbung unter Einsatz eines Agarosegelfilms angewandt. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 dargestellt (rechte Seite: die rekombinante h-SOD, enthaltend Ser an der 111-Stelle der Aminosäuresequenz und an ihrem N-Ende acetyliert; linke Seite: h-SOD, erhalten aus menschlichen roten Blutzellen).

In dem h-SOD klonierenden Plasmid pTJ102-SOD14 ist das h-SOD Gen stromabwärts des pho5-Promotors insertiert, der von pAM82 stammt. Die Transkription der m-RNA, die das h-SOD Gen enthält, wird bewirkt unter der Steuerung des pho5-Promotors. Es ist bekannt, daß die Aktivitäten des pho5-Promotors beispielsweise, abhängig von der Konzentration an anorganischen Phosphaten in einem Kulturmedium, im Falle der Kombination des pho5-Promotors und AH22-Stamms auftreten [Miyanohara, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1-5 (1983)]. Folglich wird bei diesem Beispiel eine ähnliche induzierbare Expression versucht. Dabei wird tatsächlich gefunden, daß die von der Konzentration an anorganischen Phosphaten abhängige Expressionssteuerung auch im Falle von AH22/pTJ102-SOD14 beobachtet wird. Die gleichen Stämme werden auf die gleiche Weise in Kulturmedien mit unterschiedlichen Konzentrationen an anorganischem Phosphat kultiviert. Die kultivierten Zellen werden der Zymolyase-Behandlung und der Ultraschall-Lysis unterworfen. Anschließend wird die Menge an h-SOD Derivat in dem Gesamtzellextrakt eines gleichen Volumens jeder Kultur mittels EIA [Enzym-Immunoassay; ein spezifischer Antikörper gegen Zn- und Cu-Typ SOD, der aus menschlichem Blut erhalten wurde, wird eingesetzt] bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Die obigen Werte wurden erhalten durch EIA aus den korrespondierenden, kultivierten Zellbrühen von jeweils gleichem Volumen. Der Wert 3,5 in der Tabelle wird als Hintergrundwert angesehen. Aufgrund der Ergebnisse des obigen Beispiels wird angenommen, daß die Reduktion bei der Konzentration an anorganischem Phosphat die Expression des SOD induziert.

Die Erfindung erstreckt sich auch auf Arzneimittel mit einem Gehalt der erfindungsgemäßen Polypeptide.

Claims (23)

1. Polypeptid der folgenden allgemeinen Formel (I) wobei X₁ ein Wasserstoffatom, eine Acetylgruppe oder einen Aminosäurerest bedeutet, X₂ und X₃ für Cys steht, bezeichnet X₃ einen Aminosäurerest, der nicht Cys ist.

2. Polypeptid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X₁ ein Wasserstoffatom, eine Acetylgruppe oder Met ist.

3. Polypeptid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X₂ einen neutralen Aminosäurerest bedeutet.

4. Polypeptid gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der neutrale Aminosäurerest Cys, Ser, Ala oder Thr ist.

5. Polypeptid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X₃ einen neutralen Aminosäurerest bedeutet.

6. Polypeptid gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der neutrale Aminosäurerest Ser, Ala oder Thr ist.

7. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der folgenden allgemeinen Formel (I) wobei X₁ ein Wasserstoffatom, eine Acetylgruppe oder einen Aminosäurerest bedeutet, X₂ und X₃ entweder gleich oder verschieden sind und unabhängig einen Aminosäurerest darstellen, und wenn X₂ für Cys steht, bezeichnet X₃ einen Aminosäurerest, der nicht Cys ist, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen, von denen jede eine rekombinante DNA einer Polydesoxyribonucleinsäure mit einer Basensequenz, welche für das Polypeptid codiert, und einem replikativen Vektor enthält, in einem Kulturmedium kultiviert, um eine Replikation des Polypeptids zu erreichen, und daß man das so erzeugte Polypeptid sammelt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß X₁ ein Wasserstoffatom, eine Acetylgruppe oder Met bedeutet.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß X₁ einen neutralen Aminosäurerest darstellt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der neutrale Aminosäurerest Cys, Ser, Ala oder Thr ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß X₃ einen neutralen Aminosäurerest darstellt.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der neutrale Aminosäurerest Ser, Ala oder Thr ist.

13. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der replikative Vektor ein einen lpp-Promotor enthaltendes Plasmid ist.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das den lpp-Promotor enthaltende Plasmid pIN-I ist.

15. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der replikative Vektor ein einen pho5-Promotor enthaltendes Plasmid ist.

16. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Zellen um Zellen eines unicellulären Organismus handelt.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der unicelluläre Organismus ein Mikroorganismus von Escherichia ist.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus von Escherichia E.coli ist.

19. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der unicelluläre Organismus ein Mikroorganismus von Saccharomyces ist.

20. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der replikative Vektor ein SV40-Vektor ist.

21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der SV40-Vektor pSV2 ist.

22. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen COS-Zellen sind.

23. Polypeptid-Dimeres der folgenden allgemeinen Formel (II) wobei X₁ ein Wasserstoffatom, eine Acetylgruppe oder einen Aminosäurerest bedeutet, X₂ und X₃ entweder gleich oder verschieden sind und unabhängig einen Aminosäurerest darstellen, X₃ für einen Aminosäurerest, der nicht Cys ist, steht, wenn X₂ für Cys steht, Y₁ und Y₂ unabhängig für eine ganze Zahl von 0 bis 4 stehen und Y₁ + Y₂ = 2 oder 4 ist.