JPH06504041A - 虚血性傷害を減少させる方法と組成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 虚血性傷害を減少させる方法と組成 １折玉！ 本発明は、虚血性傷害または敗血症や炎症のあとに起こる傷害を減らすためにス ーパーオキシドジスムターゼ（５００）を投与する技術分野に関するものである 。さらに詳しくは、本発明はＳＯＤとペルオキシニトライトの反応によっておこ る有害な副作用を減少する方法と組成に関する。具体的には、ＳＯＤの反応部位 に近いアミノ酸残基ＳＯＤとニトロニウムイオンなどのペルオキシニトライトと の反応によって生じる毒性副産物を捕捉できるチロシン、メチオニンまたはシス ティン残基などのアミノ酸残基と置換することにより修飾したＳＯＤの有効量を 動物に投与する。本発明は、脳卒中、頭部外傷、心筋虚血、敗血症、炎症、成人 性呼吸窮迫症候群、気管支肺形成異常などの治療にとくに関連する。

１五韮舅 ペルオキシニトライトアニオン（ＯＮＯＯ）は強力な酸化剤である。ペルオキシ ニトライトは、スーパーオキシド（０２）と酸化窒素とが虚血状態、炎症、ある いは敗血症状を呈している組織中で反応して生成される。酸化窒素はかかる組織 内に存在する。たとえば、虚血性傷害では、虚血によりイオンポンプが曇かなく なり、イオンチャンネルが開放されてカルシウムが内皮細胞質内に侵入する。

内皮トニューロンはカルモジュリンによって活性化される酸素（０２）依存性酸 化窒素合成酵素により酸化窒素を生成するが、この合成酵素はＮＡＤＰＨの存在 下でアルギニン（ＵＳＡ）８６；５１５９−６２（１９８９）：　Ｍａｒｌｅｔ ｔａ　ｅｔ　ａｔ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

２７：８７０１１ｉ−８７１１（１９８８））。再潅流により０２を酵素やその 他虚血の結果すでに存在しているその他の基質に供給して酸化窒素の合成を迅速 に行うことができる。

スーパーオキシドは傷害をうけた組織にも存在している。たとえば虚血は、キサ ンチンオキシダーゼ、ミトコンドリア、その他による細胞内の０２生成を誘発す る。０２は陰イオンチャンネルを通って細胞外の環境へ脱出することができる（ Ｌｙｎｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５３：４Ｇ９７−４ ６９９（１９７８））。細胞外の０２と酸化窒素とは活性化された好中球とマク ロファージにより、また肝臓から放出されたキサンチンオキシダーゼの循環によ り血管腔内でも生成される（Ｙｏｋｏｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｍｅｒｊ、 Ｐｈ　５ｉｏ１．＋２５８：Ｇ５Ｇ４−Ｇ５７０（１９９０）　；Ｍｏｎｃａｄ ａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、３８：ｌ７０９−１７１５（１９８９））。スーパーオ キシド基もまた好中球の炎症に対する反応と臓器移植の後または血餅の除去のあ との酸素欠乏組織の再潅流中に生じる損傷の両方について重要なメゾイエイタ− の役目をはたす（Ｐｅｔｒｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃ１．（ＵＳＡ）、７７：１１５９−１１６３（１９８０））　。

酸化窒素は細胞内でも血管内でも０２と迅速に反応してペルオキシニトライトを 生成する（Ｂｌｏｕｇｈ　ｅｔ　ａｌ、。

凰肛ＬΩ〃、、２４：３５０４−３５０５（１９８５）；　Ｂｅｃｋｍａｎ　ｅ ｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、　８７：ｌＧ２０−ｌＧ ２４（１９９０））。ペルオキシニトライト生成の速度は、０２と酸化窒素の濃 度に依存する。ペルオキシニトライトは少なくとも三つの機序によって毒性を発 現することがある。すなわち水素イオンを触媒とするホモリチック開裂によるヒ ドロキシル基（・ＯＨ）と二酸化窒素（Ｎｏ２）の生成、スルフヒドリル基との 直接反応、ＳＯＤと遷移金属との反応によるヒドロキシルイオン（−ＯＨ）と強 力なニトロ化剤であるニトロニウムイオン（ＮＯ２＋）の生成である（Ｂｅｃｋ ｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）３４５：２７−２８（１９９０））。したがっ て、ペルオキシニトライトはその他の・ＯＨ，ＮＯ，、ＮＯ２＋などの反応性の 高い種を生成することのできる反応種である。

スーパーオキシドジスムターゼは、次の二つのステップからなる反応によりオキ シジエン・ラディカル・スーパーオキシドの不均化において触媒として作用する 金属含有酵素のいくつかの族からなる。

０２＋　Ｍｅ−ＳＯＤ＝　＝　＝　＝　＞　０２＋Ｍｒ　’　−５ＯＤ２Ｂ’　 ＋９２＋　Ｍｅ”　−５Ｑｐ＝　＝　＝　＝　＞　ｔＴ２０．　＋　Ｍｅ−５０ ０式中、Ｍｅは活性部位で結合した金属である。この金属は、上述した反応で、 酸化と還元のサイクルを繰り返し行う。

スーパーオキシドを還元または酸化する化合物は多いが、スーパーオキシドジス ムターゼの顕著な特徴は上記二つの反応の触媒作用である。ＳＯＤの活性部位近 くの正の荷電をもつ一連のアミノ酸は静電勾配を生じ、負の荷電をもつ０２を活 性部位へと引き付ける。

ＳＯＤの三つの族は活性中心にある金属を特徴とする。すなわち調子亜鉛（Ｃｕ 、Ｚｎ）　ＳＯＤ族、マンガン（Ｍｎ）　ＳＯＤ族、鉄（Ｆｅ）　ＳＯＤ族であ る。治験研究の大部分は、真核細胞の細胞質で二つの同一１６Ｋｄペプチドの二 量体として天然に存在するＣｕ　、Ｚｎ５ＯＤを用いて行われている。プラズマ にも四量体であるＣｕ、Ｚｎ５ＯＤが明らかに見られる。ＳＯＤの別の形はマン ガン（Ｍｎ）を含有し、ミトコンドリア内に見いたされる。このタンパク質のア ミノ酸配列は、Ｃｕ、Ｚｎ５ＯＤとは明らかに異なるが、バクテリア中に見られ るＭｎ５ＯＤやＦｅ５ＯＤにおける配列と似ている。

ＳＯＤは、脳卒中や頭部外傷、心筋虚血、腹部血管閉塞、膀胱炎９種々の炎症の 治療における酸化傷害を防止または減らすためによく用いられてきた（Ｇｒｅｅ ｎｗａｌｄ、　Ｆｒｅｅ−Ｒａｄｉｃａｌ　ＢＩｏｌ、ａｎｄ　Ｍｅｄ、、　８ ：２０１−２０９（＋９９０）；ＭｃＣｏｒｄ。

Ｎｅｔｒ　Ｅｎ　、Ｊ、Ｍｅｄ、、３［２：１５９−１８３（１９８５）；米国 特許第４．６９５．４５Ｇ号、米国特許第４．６５Ｇ、０３４号）。

天然に存在するヒトのＣｕ、Ｚｎ５ＯＤを用いてヒトの治療をおこなった場合に 結果かよくなかった場合がいくつかあった。これは、多分腎臓のクリアランスが 早いので天然酵素の循環半減期が分単位であるせいかも知れない（Ｐｅｔｋａｕ 　ｅｔ　ａｌ、、Ｒｅｓ、Ｃｏ　ｕｎ、Ｃｅｍ、Ｐａｔｈｏｌ、Ｐｈａｒｍａり 弓、、Ｉ５：Ｇ４１−１；５７　（１９７Ｇ））。

この問題に対処するために、寿命の長いＳＯＤの誘導体がいくつか開発された。

ＮｆＩ！ｒｏｄ他によるヒトのＮｎ５ＯＤのクローニングと、ヒトにおける治験 がＭｅｄｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ａｎｄＣｈｅｗ、　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏ ｆ　Ｆｒｅｅ　Ｒａｄｉｃａｌｓ、　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　 ５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂ、、７４３−７４６（１９８９））で報告されている。

遺伝子操作によりヒト細胞質在Ｃｕ　、Ｚｎ５ＯＤの寿命が延長されている（Ｈ ａｌｌｅｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、ＢｌｏＪ、Ｃｈｅｍ、、２［Ｉ４：５ ２８０−５２６８（１９８９））。そのほかの修飾によってもヒトとウシのＣｕ 、Ｚｎ５ＯＤのポリエチレングリコール結合体などが無修飾型と（らべて半減期 が長くなり、免疫原性が少なくなっている（Ｐｙａｔａｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｒ ｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、Ｃｈｅｍ、Ｐａｔｈｏｌ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ。

２９：１１３−１２７（１９８０）；　５ａｉｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ 、ＦｉｆｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｌ、　Ｃｏｎｆ、　ｏｎ　Ｓｕ　ｅｒｏｘｌｄｅ 　ａｎｄ　Ｓｕ　ｅｒｏｘｉｄｅＤｉｓｍｕｔａｓｅ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ）　 （１９８９））。

ｉｎ　ｖｉｖｏ　ＳＯＤ療法での問題がさらに最近報告されたが、虚血性傷害を 減らすためにＳＯＤ投与量を高くしたところ梗塞が大きくなったという（Ｏｍａ ｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ８０：５１１−２９４（１９８９ ）；　ｆｅｒｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｒ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｓｃｉ、。

１：　１６１−ＩＧＧ（１９８８））。さらに０ＮＯＯを含む組織内のＳＯＤを 用いると、ＮＯ□゛などの破壊種の生成につながることがある。

ゆえに虚血、炎症、敗血症の治療法の改善がのぞまれる。

光ｌ目■ｌ示 従来技術における上記欠陥は、スーパーオキシドジスムターゼを用いた治療を改 良する本発明によって改良さされる。本発明は、ＳＯＤとペルオキシニトライト との反応によって生じる有毒副作用を減少することによって虚血性傷害、すなわ ち敗血症や炎症と関連する傷害を減少させる方法と組成に関するものである。Ｓ ＯＤの修飾を化学的または部位特異的な変異誘発、すなわちＳＯＤの活性部位に 近い、特に活性部位のまわりのリムに近く、さらに活性部位から３−Ｉ２Ｘ内に ある少なくとも一つのアミノ酸残基を、ＳＯＤとペルオキシニトライトとの反応 の有毒副産物であるＮｏ２’を捕捉することのできるチロシン、メチオニン残基 、システィン残基などのアミノ酸残基と置換することによっておこなう。修飾Ｓ ＯＤの有効量を動物に非経口的に、特に静脈内、動脈内、筋向、皮下、気管内注 入、吸入、杆鼻管投与し、脳卒中、頭部傷害、関節炎などの虚血、炎症、敗血症 などを治療する。かかる有効量は好ましくは体重キログラムあたり１００から１ ０．０００活性単位であり、さらに好ましくは体重キログラムあたり１００θか らｔｏ、ｏｏｏ活性単位である。

したがって、本発明の目的は虚血、炎症、敗血症などに関連する酸化傷害から組 織を保護する手段を提供するものである。本発明のさらなる目的は、スーパーオ キシドジスムターゼの副作用による組織の傷害を防ぐことにある。

さらに本発明の目的は、ＳＯＤを用いる治療法に見られる傷害、副作用を減少さ せる方法と組成を提供することでもある。本発明の目的のひとつは、ＳＯＤを用 いた治療でｉｎ　ｖｌｖｏで生成される有毒物質を捕捉できるよう修飾したＳＯ Ｄを提供することにある。さらにＳＯＤの活性部位の近くにある少なくとも−の アミノ酸残基を、ＳＯＤ療法中に生成される有毒副産物を捕捉できるアミノ酸残 基と置換して修飾されるＳＯＤを提供することも、本発明の目的である。

修飾ＳＯＤを動物に投与することからなる虚血状態、炎症、敗血症の治療方法を 提供することも本発明の目的のひとつである。

本発明の上記目的ならびに他の目的および利点は、以下の詳細な説明に記すが、 これは限定を意図するものではない。

日　を　る　の熊 ＳＯＤはアミノ酸配列が異なるいくつかのはっきりと異なる酵素の族から成るが 、その触媒作用機序は非常に似通っている。したがってさまざまなＳＯＤの活性 部位を囲む三次構造は相同性を有し、同じまたは非常に似通った方法を用いて有 効な修飾ができる。

例をあげれば、Ｃｕ、Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ分子はすべて、同一の サブユニットをもつ二量体であり、各サブユニットは約１５３個のアミノ酸（数 は種によって異なる）、−個の銅イオンと一個の亜鉛イオンをもつ。つシＣｕ、 Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼの結晶学的構造は、７つのターンまたはルー プで結合している８つの逆平行ベータ鎖からなるギリシャ文字のベータを平たく したバレル型であることがわかる。銅イオン触媒は４つのヒスチヂン残基により ベータ様バレルの表面につながっており、ベータ様バレルから突出している２つ のループにより形成されるチャンネルの基部で見られる。スーパーオキシドチャ ンネルを形成する以外に、この２つのループは基質の衝突前静電誘導（ループＶ Ｈ）　、亜鉛結合（ループＩＶ）　、二量体接合（ループＶ）に拘わる特異機能 サブドメインをコード化する（Ｇｅｔｚｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ 、　３０Ｇ：２８７−２９０　（＋９８３））。

スーパーオキシドは、活性部位の近くに環を形成する正の荷電をもつアミノ酸と 活性部位から遠いところの負の荷電をもつアミノ酸とのスペース的配置から生じ る静電界により活性部位内へ引き込まれる。これにより、負の荷電をもつスーパ ーオキシドが活性部位内に引き込まれる傾向が生じ、反応速度を速めて、理論上 の分散限界に近くなる。

一般的にいって、ＳＯＤの触媒機序は、二つの連続した反応にかかわる。第一に 、スーパーオキシドの一つの分子が電子をＳＯＤの活性部位内の金属へ転移させ 、分子は酸素として放出される。ＳＯＤの活性部位内へ入った第二のスーパーオ キシドの分子が金属から電子を拾い、天然のＳＯＤを再生しながら過酸化水素に 還元される。ＳＯＤタンパク質内の金属の配位が酸化還元電位を変え、スーパー オキシドによる還元、酸化の繰り返しを有利にする。たとえば、Ｃｕ　、Ｚｎ５ ＯＤ内のＣｕの中点電位は約０．４ボルトであり、以下の反応を生じる。

０２　＋　Ｃｕ’　２−５ＯＤ＝　＝　＝　＝　＞　０２　＋　Ｃｕ”　’　− ５ＯＤ０２　＋　Ｃｕ”　’　−５ＯＤ＝　＝　＝　＝　＞　１１２０２　＋　 Ｃｕ”　−５ＯＤペルオキシニトライトもＳＯＤの活性部位と反応してＮｏ２＋ を生成するが、これはＩｎ　ｖｉｖｏでかなりの身体的傷害を生しることのある 反応活性の強い種であり、虚血性心疾患患者にＳＯＤを高用量投与した場合に見 られる毒性の原因であるかも知れない。ペルオキシニトライトは０２を活性部位 内へ引き付ける静電界と同じ静電界によっても活性部位に引き付けられる（Ｇｅ ｔｚｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、３０１２８７−２９０（１９８３ ）；　Ｔａ１ｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｏｔ、回、、　１６０：１８１−２１ ７（１９８２））。ペルオキシニトライトのＯ−０部分は活性部位の疎水性ポケ ット様部分に収まり、酸化窒素は溶媒スペース内へとひろがる。

Ｃｕ　、Ｚｎ５ＯＤは０Ｎ００を分解する触媒として作用し、Ｎｏ２＋と０■− とをペルオキシニトライトから生成するがその除銅が重要な役割を果たす。活性 部位内に入った０ＯＮＯは分解し、以下に示す一過性第一銅付加生成物を生じる ことによってＯＨ−とニトロニウムイオン（Ｎｏ２つを生成する。

Ｃｕｈ２−０−０−Ｎ＝　０＋　Ｘ＝　＝　＞　Ｃｕ”−０・・０＝　Ｎ”＝Ｏ ＝Ｘ＝＝＞Ｃｕ′２＋Ｏ’Ｆｉ＋Ｎ０２”−Ｘ生成熱の高いニトロニウムイオン は、リン酸塩または塩素陰イオン（Ｘ′）と錯体を作って、塩として一過性の安 定度を見せることもある。正の荷電をもつニトロニウムイオンは、０ＮＯＯを活 性部位に引き込んだ電界によって反発され、唯一のチロシンが位置する負の荷電 をもつ遠い領域方向へ弧をなして動く。この配置によりＮＯ□゛がチロシン残基 をニトロ化し、公知のチロシン環の水素イオンをニトロニウムイオンと置換して ３−ニトロチロシンを生成する方法と同じように３−ニトロチロシンを生成する 。

Ｘ−は水溶液の中でニトロニウムイオンのキャリア陰イオンとなり、それによっ てチロシンをニトロ化するニトロニウムイオンが水溶液内に存在できる。

ＳＯＤがペルオキシニトライトと反応するとＮ０２゛を生成に加えたときに生成 される安定した黄色付加生成物を分離することにより立証することができる。下 記にのべるように、黄色付加生成物はＳＯＤのチロシン残基上の３−ニトロチロ シン生成と対応する。黄色付加生成物は、ｐ−ニトロフェノールなどのニトロ化 フェノールなどの典型的なものである（Ｈａｌｆｐｅｎｎｙ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、　１９５２：９３９−９４６（１９５２））。さらに 、ＳＯＤは触媒として他のフェノールや他のタンパク質上のチロシンのニトロ化 を生物学的に有意な速度ですすめる。

ＳＯＤを触媒とするＳＯＤとフェノール樹脂のニトロ化０Ｎ００と反応するウシ Ｃｕ　、Ｚｎ５ＯＤから生成される黄色付加生成物を結晶化し、Ｘ線構造を得る のに用いた。これらの結晶から得たＸ線回折図から計算した電子密度図によると 、ウシＣｕ　、Ｚｎ５ＯＤ上の唯一のチロシン残基１０８のオルト位近くの電子 密度が高くなり、３−ニトロチロシンが生成された。この位置は同じサブユニッ トの活性部位から１８−２１　のところと二量体の反対側にあるサブユニットよ りさらにかなり離れたところとの間にあり、正の荷電をもつニトロニウムイオン がＳＯＤ活性部位に生成され、次いでＳＯＤ活性部位のまわりにリムを形成する 帯電アミノ酸から生じた静電界によって遠位のチロシンへ向けられたことを示し ている。

ＳＯＤペルオキシニトライト付加物のｐＨ依存性スペクトルは、３−ニトロチロ シンの形成と一致し、４３８ｎｍ　（）：＝＝４　、ＧＯＯＭ−’　ｃｍ−’　 ）でのアルカリ領域の最大吸光度とｐＨ６，０，３５［ｉｎｍ　（Ｅ３＠６ｎｍ ＝３，５００Ｍ−’ｃｍ−’　）での最大吸光度との間にｐＫ、７．Ｅｉを示す 。天然のＳＯＤをタンパク質を専門とする化学者がタンパク質中に３−二トロチ ロジンを生成するのに用いる標準試薬であるテトラニトロメタンで処理して同様 のスペクトルが得られる。３−ニトロチロシンのｐＫ、は、７．０近くであって 、酸においてＥ、、、ｎｉ＝　３，４００Ｍ−’ｃｒ’、アルカリにおいてＥ、 ｌｌｎｍ＝４．２００Ｍ−’ｃｍ−’である。５ＯＤ−０ＯＮＯの３５０．４３ ８ｎｍにおける最大付加生ぽ物は、ヂチオナイト（硫化水素ナトリウム）による 還元により消失するが、アスコルベイト、グルタチオン、ボロハイドライドでは 消失しない。これはヂチオナイトが３−二トロチロジンを還元して無色のアミン となす確認済み反応と一致する。ペルオキシニトライトで処理したＳＯＤのレー ザー・ラマン・スペクトル１ヨ、本物の３−ニトロチロシンとほぼ同じである。

スペクトルの唯一の相違は、１３４０ｃｒ’での大きなピークが広がっているの と、８３０ｅｒ’での小さなピークが割れている点であるが、その両方がＳＯＤ タンパク質内の３−二トロチロジンの回転が限定されているのと一致している。

Ｃｕ　、Ｚｎ５ＯＤとのペルオキシニトライトとの反応によって天然ポリアクリ ルアミドのゲル電気泳動上のＳＯＤ変異型の電荷がますます負となるシリーズを も産出し、タンパク質上に２−５追加の負の電荷が存在することを示す。したが って、ＳＯＤ」この複数の部位がペルオキシニトライトとの反応中に修飾され、 ニトロチロシンの生成がＳＯＤタンパク質に起こるいくつかの変異のうち最もよ く見えるものだということを示唆している。ＳＯＤに対するペルオキシニトライ トが仲介する修飾の数は、フェノールまたはチロシン含有タンパク質すソザイム のどちらかによって濃度依存性をもって減らすことができる。以下にフェノール とりソザイムの双方がニトロ化されることを示す証拠を記載する。したがってＳ ＯＤの自己ニトロ化は、外因性フェノール化合物を添加することによって競合的 に抑制できる方法に関するものである。

ＳＯＤはさらに、チロシンを含む広い範囲のフェノール化合物が卵白シンザイム のごとき他のタンパク質におけるニトロ化でも触媒として作用する。ＳＯＤを触 媒とする０Ｎ００と１ｍＭフェノールとの反応から得た生成品をＩＩＰＬＣ分析 したところ、２−１４−二トロフェノールを得たが、ビフェノールは得られなか った。ＨＰＬＣで測定したフェノールのニトロ化の増加は、ＳＯＤ濃度と直線関 係にあった。

Ｃｕ　、Ｚｎ５ＯＤの存在下でのフェノールのペルオキシニトライトによるニト ロ化度合はストップド・フロラ分光法により４１２ｎｍで測定することができる 。中程度のアルカリｐｎ　（ｐｔｌｓとＩＯの間）では、ＳＯＤを触媒とするニ トロ化の動力学的挙動は比較的単純で解釈しやすいが、これはペルオキシニトラ イトの分解が徐々に進むこと、フェノールのニトロ化分解物の吸光係数が大きい こと、０ＮＯＯのプロトンを触媒とする分解によるフェノールの自然ニトロ化が 非常に少なくなっていることによる。４１２ｎｍでの吸光増大の速度は、ｐＨ９ で最初の３−５秒間は直線的であり。

ＳＯＤ濃度に直接比例していた。ｐＨ９では、ＳＯＤと０ＮＯＯとによるフェノ ールのニトロ化の見かけの二次速度定数を見積もると、最低で約１０’Ｍ−１５ −１である。この速度は０２との反応とくらべて約１０４倍遅いが、ペルオキシ ニトライト反応の進行が有意な速度であることを示す。

Ｍｎ５ＯＤは、Ｃｕ、Ｚｎ５ＯＤと同様にフェノールのニトロ化において触媒作 用を示す。Ｍｎ５ＯＤにはいくつかのチロシンが存在している。酵素をフェノー ルの不在下でペルオキシニトライトで処理すると７つのチロシンのうち少なくと も３つから４つがニトロ化される。Ｃｕ　、Ｚｎ５ＯＤとは違って、Ｍｎ５ＯＤ はペルオキシニトライトの濃度が高いと不活性化される。Ｍｎ５ＯＤをまずｐＥ Ｉ７．８で１５０１Ｍのペルオキシニトライトで処理すると、スーパーオキシド とペルオキシニトライト反応両方の触媒活性が失われる。Ｍｎ５ＯＤの活性部位 に近いところにある必須チロシン（細菌配列でのチロシン３４、ヒト配列でのチ ロシン５８）が、酵素のターンオーバーのわずかの部分によってか徐々に修飾さ れる（Ｓｔａｌｌｆｎｇｓｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６０ ：ｌＧ４２４−１６４３２（１９８９））。この示唆するところは、アミノ酸を 置喚して、チロシンを活性部位近くの別のところにおくことが有効であるという ことである。したがって、スルフヒドリル基又はチロシンを活性部位の近くに添 加することによって改善をはかるのはＭｎとＣｕ　、Ｚｎ５ＯＤのどちらにも可 能である。

Ｃｕ　、Ｚｎ５ＯＤ−０ＯＮＯ付加物は、キサンチンオキシダーゼで還元した場 合のチトクロームＣの抑制を用いた標準ＳＯＤアッセイによって測定すると通常 の触媒活性作用を有しくＭｃＣｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、旧ｏ１．ｃｈｅｍ、 、　２４４１０４９−６０５５（１９６９））、０ＯＮＯが活性部位に結合して 止まっているのではないことを示唆した。しかし、３−ニトロチロシンは７．５ のそばにｐＫをもっており、その結果見られた活性部位での負の電荷が、スーパ ーペルオキシドとペルオキシニトライト双方に対するＳＯＤ活性を減少すること ができることを示した。

ＳＯＤ活性部位における銅は付加物の生成に必要であって、これは１ｍＭフェノ ールが２．０ｍｇ１０ｆの銅非含有ＳＯＤと１ｍＭ−０ＯＮＯによりｐＨ７，４ でニトロ化が行われないことからも明らかである。銅非含有ＳＯＤは、銅をＫＣ Ｎで可逆除去することによって得ることができる。この種のＣ１１、Ｚｎ５ＯＤ を用いた金属置換実験はこの２０年間頻回に行われている。Ｒｏｔｉｌｉ他の開 発した方法をわずかに変更して、銅をボロハイドライドによる還元をおこなって 除去したのち５０ｉＮ　ＫＧＮで透析すると、亜鉛含をアポタンパク質は、ペル オキシニトライトを添加しても特徴的な３−ニトロチロシンを形成しない。これ は４１２ｎｍのところに大きな吸光ピークがないことから立証される。活性部位 で銅を置き換えると、０、と０Ｎ００の両方の通常の酵素活性の回復が見られた 。シアン化物もＣｕ　、Ｚｎ５ＯＤをわずかに抑制し、ペルオキシニトライトに よるＳＯＤを触媒とするニトロ化をも抑制する。これらの結果によりＳＯＤがペ ルオキシニトライトによるニトロ化の触媒として作用することが分かる。

ニトロ化の遊離基機序に対する反証 潜在的なニトロ化の機序がＳＯＤを触媒とする二酸化窒素（Ｎ０２）の生成に係 わっているかもしれないし、またＳＯＤが水酸基のような強力な酸化剤や、二酸 化窒素の生成に触媒として作用することもありうる。ＳＯＤを触媒とするフェノ ール環のニトロ化を説明する機序としてこれら二つのいずれの説をも裏付ける証 拠を見いだすことはできなかった。

ＳＯＤとのニトロ化反応は０ＮＯＯに限られており、これは還元または酸化ＳＯ Ｄを最高４ａ＋Ｍ酸化窒素、Ｎｏ、　Ｎｏ、−あるいはＮＯｌで処理しても錯体 の生成はまったくまたはほとんどなかったことで立証される。さらにＳＯＤと１ ０００μＭ　０ＮＯＯと反応させてもわずかに０．２９±０．０９μＭＮＯ，Ｌ か生成されなかった。また１００ａ＋Ｍジメチルスルホキシドを添加して０ＮＯ ＯＩＩの分解によって生成された水酸基を捕捉しようとすると、ＳＯＤが触媒と して作用したフェノールのニトロ化量に影響することなくＮＯ□が２５０倍増加 した。しかしながら、ニトロ化のバックグラウンド値はＳＯＤを伴わないＤＮＳ Ｏの存在下での方が高かった。最後にＮＯ２によるニトロ化はフェニール基中間 体を介して進行し、かなりの量のビフェニールを産生ずる。ｐＨがアルカリの時 （ｐＨ＞７．５）、ＳＯＤとペルオキシニトライトによるフェノールのニトロ化 ではビフェニール生成を■ＰＬＣで検出できなかった。ｐｉが中性から酸性の時 には、ペルオキシニトライトのプロトンを触媒とした分解により少量のビフェニ ールが生成され、これが・ＨＯとＮＯ２とを中間体として生成する。

修飾ＳＯＤの調製 上述したように、ＳＯＤは０Ｎ００産生毒性副産物と反応する。

本発明はＳＯＤを修飾してこれらの毒性副産物と反応させ、これらの副産物とく にＮＯ□°の毒性を弱めることを目的とする。たとえばＳＯＤを修飾してチロシ ン残基を活性部位のそばにおき、産生されるＮｏ２’がチロシンをニトロ化し、 毒性を宵するＮＯ□°種を除去することができる。

チロシン残基を活性部位の近くへおき、チロシン環のオルト位が０ＮＯＯ部分と 反応できるようにするのが好ましい。ペルオキシニトライトが活性部位で銅と反 応して、ニトロニウムイオンヲ生成スると、ニトロニウムイオンはチロシンのフ ェノール環を攻撃して、溶液中に放出されずに３−二トロチロジンを生成する。

さらに核的な硫黄であるシスティンまたはメチオニン残基を活性部位の近くに置 くことにより、ニトロニウムイオンまたはペルオキシニトライトを補足すること もできる。中間体であるニトロチオールは不安定で、低分子量のチオールと自発 的に反応してスルフヒドリル基を再生することもできる。

ペルオキシニトライト陰イオンはスルフヒドリル基と急速に反応するが、これは 多分下記の一連の反応によるものと思われる。

ＯＮＯＯ＋　Ｒ５Ｈ：：：＞　Ｒ５−Ｎｏ２＋　０ＨＲ５−Ｎｏ２＋　−ＯＨ： ＝：＞　Ｒ５ＯＨ＋　Ｎｏ２反応生成物であるスルホン酸は下記のとおりグルタ チオンまたはその他のチオール剤と反応させて再生し、スルフヒドリル基とする こともできる。

Ｒ５ＯＨ＋　ＧＳＨ：＝＞　Ｒ５５Ｇ　＋　Ｈ２ＯＲ５５Ｇ　＋　Ｒ５Ｈ＝＝＞ 　Ｇ５５ＧＲ５ＳＧ　＋　ＧＳＨ：＝＞　Ｒ５Ｈ＋　Ｇ５５Ｇ式中ＧＳＨはグル タチオンまたはその他の低分子量のスルフヒドリル剤である。

Ｃｕ　、Ｚｎ５ＯＤの活性部位内またはその近くにいくつかのトレオニンがあり 、これらはシスティン残基と置換することができるが、構造に与える影響はわず かである。システィン残基置換の限界は、ＳＨ基が自己酸化しやすいことと、ス ーパーオキシドの触媒サイクル中に酸化されることがあるという点である。

活性部位近くのメチオニン残基置換の宵月性が高いかもしれない。メチオニンの 硫黄は自己酸化されることは非常に少ないはずだが、やはりかなり核的であり、 ニトロニウムまたはペルオキシニトライトの攻撃を受けやすい。メチオニンはシ スティンよりもすこし大きくかつ疏水性があり、メチオニンがタンパク質上で置 換される部位を限定する。

部位特異的突然変異体の調製 部位特異的変異体の調製は、標準的に行えばよい。たとえば、ヒ）　Ｃｕ　、Ｚ ｎ５ＯＤの活性部位近くの部位特異的変異体の調製は、基本的にＢｅｙｅｒ　ｅ ｔ　ａｔの用いたものと同様である。（Ｂｅｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂ ｌｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２８２：１１１８２−１１１８７　（＋９８７））。

ＤＮＡ操作は、阿ａｎｌａｔ１ｓ　ｅｔ　ａｌ、の報告した方法を用いる（Ｃｏ ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐ ｒｉｎｇｓ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、（１９８２））。たとえば、修 飾したヒト細胞質Ｃｕ　、Ｚｎ５ＯＤを調製するには、野生型ＥＩＳＯＤ（ヒト Ｃｕ　、Ｚｎ５ＯＤ配列）を含む１．８Ｋｂｐ　ＢａｍＨＩ　ＤＮＡ７　ラグメ ントラＭ１３　（ｍｐｌｏ）中でサブクローニングすると、Ｉ　ｌ５ＯＤの解読 鎖を含んだ一本鎖の鋳型ＤＮＡができる。所望のアミノ酸置換に適したアンチコ ドンを含む突然変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマーを、標準ホスホラミド 合成技術を用いて自動化ＤＮＡシンセサイザー（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｇｅｎｅ−０− Ｍａｔｉｃなど）で合成する。突然変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマーは 、突然変異性配列の両側にＨＳＯＤとマツチする配列の８−１５ｂｐを含む構造 である。それから突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを雑種形成して、■ＳＯＤ フラグメントを含む一本鎖Ｍ１３ＤＮＡとし、プライマー拡張により共有結合的 に閉環した二重鎖ＤＮＡを合成する。Ｎ１３ウィルスで形質転換したＥ、ｃｏｌ ｉ　ＪＭＩＯＩから得た突然変異プラークを、放射能標識した突然変異誘発性オ リゴヌクレオチドをハイブリッド形成プローブとして用いて同定し、その後ＤＮ Ａ配列により確認する。二重鎖ＤＮＡは配列単離物より調製し、Ｎｃｏｌと５ａ ｌｌとともに消化して、ＨＳＯＤ　ｃＤＮＡを含む５２０ｂｐフラグメントを単 離し、ＰＡＧＥ電気泳動により精製する。この精製フラグメントをクローニング して、Ｍａｎｌａｔｌｓらの報告したグリセルアルデヒドホスフェートデヒドロ ゲナーゼ遺伝子４９プロモーターを含む酵母発現型プラスミド（ｐｃ！／　ＩＰ ＧＡＰＳＯＤ）内へ入れる。

酵母菌株ＡＢＩＩＯはＰｃｌ／　ＩＰＧＡＰｓＯＤおよび対応する突然変異プラ スミドで形質転換する。転換したコロニーはロイシン欠如寒天平板上で選択する 。その後これらのコロニ−を用いて大型発酵フラスク内の３ｍＭ　Ｃｕ５Ｏ，で 補った非選択性のＹＥＰＤ培地に接種し、最終培地をガラスピーズで溶解する。

Ｃｕ　、Ｚｎ５ＯＤを硫安沈殿と上記Ｂｅｙｅｒ他によるＤＥＡＥクロマトグラ フィーにより単離する。

突然変異Ｈ５ＯＤをＥ、ｃｏｌｌで発現させ突然変異の第一次スクリーニングを おこない、ペルオキシニトライトのもっともよいスカベンジャーを選ぶこともで きる。ヒトに用いるには、最終生成物を酵母から調製し、細菌金膜のエンドトキ シンによる汚染を避ける。

ヒトＭｎ５ＯＤと細胞外（：ｕ、ｚｎＳＯＤの両方をコード化したＤＮＡ配列を クローニングした。突然変異をさせる最初のＤＮＡフラグメントの切断に用いた 制限ヌクレアーゼにわずかな変更を加えるだけで、上述した手順をすべてのＳＯ Ｄに対して所望の部位特異的突然変異体を得るため用いることが可能である。Ｍ ｎ５ＯＤを発現させるには、Ｍｎを培地に加えればよい。

修飾ＳＯＤの化学的調製法 チロシン様の残基を人工的に構築するには、直接化学的修飾をおこなってもでき る。これはタンパク質専門の化学者がおこなう標準的な修飾法であり、フェノー ル基をリジンのε−アミノ基へＨｕｎｔｅｒ−Ｂｏｌｔｏｎ試薬（Ｔｈｏｍｐｓ ｏｎｅｔ　ａｌ、、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、、２６：７４３−７５０（１９８７）） と共に加える。

この方法はフェノール環を＋２Ｊと反応させ小さなペプチドに放射能標識をする のによく用いる方法である。Ｃｕ。

Ｚｎ５ＯＤは約１３の遊離アミン基を含有し、その多くは活性部位近くに集まっ て静電界を作り、負の電荷をもつスーパーオキシドとペルオキシニトライト陰イ オンを活性部位内へ引き込む。したがって簡単な化学反応を用いていくつかのフ ェノール環を活性部位の近くにおくことも可能である。直接化学修飾の限界は、 タンパク質上の複数の部位が修飾され、その結果酵素活性を低下させたり、新し い抗原性部位ができることが点にある。

アミノ酸置換 細胞質ＳＯＤと細胞外ヒ）　ＳＯＤでは、中心の銅から１２Ａ内のアミノ酸残基 はすべてチロシン、システィン、メチオニン残基との置換に適している。銅とこ れらの残基との間の距離は５からＩＯ，７Ａである。ヒトの細胞質Ｃｕ　、Ｚｎ ５ＯＤにおける置換に用いるアミノ酸としては残基１３２−１４２が好ましく、 これらは活性部位のまわりにループまたはリムを形成する。ヒトの細胞外Ｃｕ　 、Ｚｎ５ＯＤにおいて同じように用いられる残基は、残基１７２−１８５である 。残基４８はフェニールアラニンだが、修飾してチロシンとしてもよい。

トレオニン５８、アラニン６０からプロリン６２、グルタミンｌＧ５が活性部位 の一部を構成する。トレオニン５８とアラニン６０はシスティンまたはメチオニ ンと置換することができる。

ウシＣｕ　、Ｚｎ５ＯＤでは、アミノ酸５Ｇ、５８からＧＯ１Ｇ３．１３１と１ ３４から１４０までが活性部位のまわりにリムを形成し、これはスーパーオキシ ドの結合部位を破壊することなく修飾できる。残基１３５はトレオニンであり、 銅からはわずか５．３ＡＬか離れておらず、システィンと置換することもできる 。残基４８はフェニールアラニンであって、構造にほとんど影響を与えることな くチロシンに転換することができるが、活性部位からはやや離れている。他のモ ノマーのアミノ末端リジン１５１は活性部位に近いので、修飾が可能である。

ヒトの細胞外ＳＯＤは細胞質酵素に密接な関係がある（■ｊａ１ｍａｒｓｓｏｎ 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．８４：　６３４０ −６３４４（＋９８７））が、長くのびたアミノ末端部は例外であってこれは多 分、細胞外ＳＯＤを内皮細胞表面に存在するヘパリン−サルフェート基に結合す るカルボキシ末端配列と四量体のアセンブリーに必要だと思われる。記載した細 胞外ＳＯＤの位置はウシの細胞質ＳＯＤ配列から類推したものであって、活性部 位周辺の配列の相同性が高いところから見て妥当と思われる。

以下のＭｎ５ＯＤのアミノ酸置換物は、バシラス・ステアロサーモフィラスへの 相同性とＸ−線構造を考慮して確認した（Ｐａｒｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、 Ｍｏ１．Ｂｌｏｌ、、１９９：　６４９−８６１（１９８８））。番号はＮ−末 端信号配列をもつヒトの肝臓Ｍｎ　−８ＯＤに関するものである。活性部位領域 はロイシン４９からグルタミン５９までの第一のαヘリックス（ａｌ）の一部を なす。この領域は活性部位の片側の裏にあり、スーパーオキシドが活性部位に入 るときに通る可能性が高い。第三のαヘリックス（α３）のアラニン９６からフ ェニルアラニン１０１への配列は活性部位の反対側の裏にあるが、やや深く、ス ーパーオキシドの結合部位の近くでボケ、ットを形成している。セリン１３９か らセリン１４６への配列にあるひだは第五のαヘリックス（α５）をベータ・シ ート（ａｌ）の尾部へつなぎ、活性部位の別の部分を形作っている。システィン ＩＧ４からロイシン１７０までの配列は、β３の尾部へ続くベータ・シート（β ２）の頭の間に曲げ部を形成している。この配列内のグルタミン１６６は、チロ シン５８への水素結合に重要な役割をはたす。活性部位につながる最後の配列は バリン１８４からグルタミン１９２につながるものであって、これはすべての種 で保存性が高い。

部位特異的突然変異体の試験 ＳＯＤの部位特異的突然変異体を精製したあとで、試料をペルオキシニトライト で処理して変異体ＳＯＤが不活性化されたかどうかを調べる。スーパーオキシド ジスムターゼの触媒活性は、ペルオキシニトライト処理の前後にキサンチンオキ シダーゼを用いてシトクロムＣ還元の阻害をしらべる標準アッセイによって確認 する。ペルオキシニトライトによるフェノールのニトロ化の割合はストップトノ ロー分光法を用い、４１２ｎｍでの吸光度増大をモニターして確かめる。野生型 のＳＯＤでは、フェノールのニトロ化はアッセイのｐＨに依存して最初の２−６ 秒間直線を示す。

フェノールのニトロ化において非直線的減少が見られるときは、ＳＯＤの不活性 化が進んでいることを示す。これらのデータから、各突然変異体ＳＯＤのスーパ ーオキシド酸化還元同時反応、ペルオキシニトライトを介したニトロ化、ペルオ キシニトライトによるＳＯＤの不活性化について反応速度を計算することができ る。高いスーパーオキシド酸化還元性とフェノールのニトロ化速度の遅い変異体 を選んで、虚血性傷害を減らすのに有効であるか否かを確かめるための動物実験 に用いる。特に再現性の高い外科的手法を用いて、ラットに脳卒中をおこし、梗 塞サイズ（死んだ脳細胞）の減少量を測定して有効性を確認する。

この外科的手法は、中太脳動脈を閉塞すること、３０分間にわたって総頚動脈を 閉塞すること、その後２４時間にわたって再潅流することからなる（Ｌｉｕ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ａｍ、　Ｊ。

胆が刀０．２５Ｇ：　１１５８９−１５９３（１９８Ｂ））。修飾ＳＯＤの有効 量を動物に投与して、虚血、炎症、敗血症の治療をおこなう。かかる投与は、有 効であれば経路を問わないが、好ましくは非経口的経路、たとえば静脈内、動脈 内、筋肉、皮下、または気管内注入、吸入または経鼻管的に投与する。有効用量 は好ましくは体重キログラムあたり１００から１０．０００活性単位であり、さ らに好ましくは体重キログラムあたり１０００から１０，０００活性単位である 。投与速度は、具体的症状や、治療の対象である器官によって異なる。

Ｃｕ　、Ｚｎ５ＯＤの修飾で重要なことは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ） （−０−（ＣＨ，−ＣＨ２−０）。−ＣＨ，）の５−１７分子を５００表面のリ ジンに結合することである。ＰＥＧは、毒性または反応性がまったくないかまた はほとんどないので理想的なポリマーである。タンパク質をＰＥＧで修飾すると 、免疫原性を減らし、ヒトでの循環半減期を数分から最大７日まで延長し、培養 内皮細胞への細胞会合を増大させることができる。ＳＯＤをＰＥＧで適切に修飾 することが、治療に宵月なＳＯＤを調製するのに適していることは今後も変わら ないと思われる。

フロントページの続き （７２）発明者　スミス　フレイブ　ディーアメリカ合衆国　３５２１０　アラ バマ州　バーミンガム　ホワイトオーク　ロード ４９６幡 （７２）発明者　イスキロポウロス　ハラランボスアメリカ合衆国　３５２０９ 　アラバマ州　バーミンガム　ビーコン　パークウェイ　イー　１２５１−Ｊ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １：修飾スーパーオキシドジスムターゼからなる酸化による傷害を減少させる化 合物において、修飾がスーパーオキシドジスムターゼの活性部位から３−１２Å 内にある第一のアミノ酸残基を、ペルオキシニトライトとスーパーオキシドジス ムターゼの反応によって生成される反応性の高いニトロ化種と反応することがで きる第二のアミノ酸残基と置換することからなる化合物。 ２：反応性の高いニトロ化種がニトロニウムイオンである請求項１に記載の化合 物。 ３：第二のアミノ酸残基が、チロシン残基、メチオニン残基とシステイン残基か らなるグループから選択される請求項１に記載の化合物。 ４：スーパーオキシドジスムターゼが真核細胞の細胞質から得られたＣｕ，Ｚｎ スーパーオキシドジスムターゼである請求項１に記載の化合物。 ５：スーパーオキシドジスムターゼがプラズマから得られたＣｕ，Ｚｎスーパー オキシドジスムターゼである請求項１に記載の化合物。 ６：スーパーオキシドジスムターゼがミトコンドリアから得られたＭｎスーパー オキシドジスムターゼである請求項１に記載の化合物。 ７：Ｃｕ，ＺｎスーパーオキシドジスムターゼがウシＣｕロ，Ｚｎスーパーオキ シドジスムターゼである請求項４に記載の化合物。 ８：Ｃｕ，ＺｎスーパーオキシドジスムターゼがヒトＣｕ，Ｚｎスーパーオキシ ドジスムターゼである請求項４に記載の化合物。 ９：修飾スーパーオキシドジスムターゼからなる炎症性傷害を減少させる組成に おいて、修飾が基本的にスーパーオキシドジスムターゼの活性部位からの３−１ ２Å内にある第一のアミノ酸残基を、ペルオキシニトライトとスーパーオキシド ジスムターゼの反応によって生成されるニトロ化反応性の高い種と反応すること ができる第二のアミノ酸残基と置換することからなる組成。 １０：スーパーオキシドジスムターゼ表面上のリジンに結合している修飾がＯ− （ＣＨ２−ＣＨ２）Ｏ）ｎ−ＣＨ３からなり、式中ｎは５−１７である請求項１ ９の化合物１１：修飾スーパーオキシドジスムターゼからなる酸化による傷害を 減少させる化合物において、修飾がスーパーオキシドジスムターゼの活性部位内 の触媒活性遷移金属から半径３−１２Ａのところにある第一のアミノ酸残基を、 ヌクレオフィル・サルファーまたはフェノール基を含み、反応性の高いニトロ化 種と反応することのできる第二のアミノ酸残基と置換することからなる化合物。 １２：修飾スーパーオキシドジスムターゼからなる酸化による傷害を減少させる 化合物で、修飾が硫黄含有部分をスーパーオキシドジスムターゼの活性部位内の 触媒活性遷移金属から半径３−１２Åのところにあるアミノ酸残基へ接合させる ことからなる化合物。 １３：修飾スーパーオキシドジスムターゼからなる酸化による傷害を減少させる 化合物で、修飾がフェノール基をスーパーオキシドジスムターゼの活性部位内の 触媒活性遷移金属から半径３−１２Åのところにあるアミノ酸残基へ接合させる ことからなり、フェノール基は反応性の高いニトロ化種と反応することのできる 化合物。 １４：複数の修飾スーパーオキシドジスムターゼからなる酸化による傷害を減少 させる化合物で、修飾が硫黄を含む部分をスーパーオキシドジスムターゼの活性 部位内の触媒活性遷移金属から半径３−１２Åのところにあるアミノ酸残基へ接 合させることからなり、硫黄を含む部分は反応性の高いニトロ化種と反応するこ とのできる化合物。 １５：複数の修飾スーパーオキシドジスムターゼからなる酸化による傷害を減少 させる組成で、修飾はフェノール基をスーパーオキシドジスムターゼの活性部位 内の触媒活性遷移金属から半径３４２Åのところにあるアミノ酸残基へ接合させ ることからなり、フェノール基は反応性の高いニトロ化種と反応することのでき る組成。 １６：ａ）修飾がスーパーオキシドジスムターゼの活性部位から３−１２Åのと ころにある第一のアミノ酸残基を、ペルオキシニトライトとスーパーオキシドジ スムターゼとの反応により生成された反応性の高いニトロ化種と反応することの できる第二のアミノ酸残基と置換することからなる修飾スーパーオキシドジスム ターゼｂ）低分子量チオールとからなる 組成 １７：低分子量チオールがグルタチオンである請求項３５の組成 １８：低分子量チオールが、グルタチオン、システイン、Ｎ−アセチルシステイ ン、メチオニンまたはメルカプトプロプリオニルグリシンからなるグループから 選ばれる請求項３５の組成 １９：修飾ヒト細胞質Ｃｕ，Ｚｕスーパーオキシドジスムターゼからなる酸化に よる傷害を減少させる化合物で、修飾がヒト細胞費Ｃｕ，Ｚｕスーパーオキシド ジスムターゼの残基１３２から１４１のなかから選んだ第一のアミノ酸残基を、 第二の硫黄含有アミノ酸残基と置換することからなる化合物。 ２０：修飾ヒト細胞外Ｃｕ，Ｚｕスーパーオキシドジスムターゼからなる酸化に よる傷害を減少させる化合物で、修飾がヒト細胞外Ｃｕ，Ｚｕスーパーオキシド ジスムターゼの残基１７２から１８１のなかから選んだ第一のアミノ酸残基を、 第二の硫黄含有アミノ酸残基と置換することからなる化合物。