DE3625205C2

DE3625205C2 -

Info

Publication number: DE3625205C2
Application number: DE3625205A
Authority: DE
Inventors: Ulrich Dipl.-Chem. Dr. 8223 Trostberg De Rust
Original assignee: SKW Trostberg AG
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 1985-08-22
Filing date: 1986-07-25
Publication date: 1990-04-12
Also published as: DE3625205A1; FR2586480A1; AU567419B2; NZ217178A; AU6116086A; FR2586480B1; US4692415A; CA1299474C

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Cyanamid in Pflanzen oder Pflanzenteilen, insbesondere in Früchten.

Entsprechend der DE-OS 31 50 404 kann Cyanamid als Mittel zur Brechung der Knospendormanz, insbesondere bei Weintrauben und sonstigen Früchten, eingesetzt werden. Aus Gründen des Umweltschutzes ist es wünschenswert, den Rückstandgehalt von Cyanamid in diesen Pflanzen exakt zu bestimmen. Bis jetzt ist jedoch keine praktikable Analysenmethode bekannt, um Cyanamid im Spurenbereich mit ausreichender Genauigkeit nachzuweisen.

Die bisher üblichen Nachweismethoden beruhen auf der stark elektronenziehenden Wirkung der Cyanogruppe und der daraus resultierenden Acidität der NH-Protonen des Cyanamids, welche im alkalischen Medium leicht substituiert werden können. Insbesondere die Bildung von Silbercyanamid wurde in einer Reihe von Analysenverfahren (vgl. R. Perotte, Gazz. Chim. Ital. Band 35, Seite 228 (1905)) zur Gehaltsbestimmung ausgenutzt. Gehalte von <0,1% Cyanamid lassen sich mit diesen Methoden jedoch nicht bestimmen. Für eine Reihe kolorimetrischer Verfahren bildet das Chlorcyanamid die reaktive Zwischenstufe zum Cyanamidnachweis. Exakte Bestimmungen im Spurenbereich sind mit diesen Methoden ebenfalls nicht möglich.

Im alkalischen Medium läßt sich Cyanamid als Ligand in Cyanoferrate einbauen, wobei die daraus resultierenden, gefärbten Komplexe sich zur Cyanamidbestimmung im Spurenbereich ausnutzen lassen (vgl. D. A. Buyske u. V. Downing, Anal. Chem. 32, 1798 (1960)). Der Nachteil dieser Methoden besteht in ihrer Unspezifität, da auch eine Reihe anderer nucleophiler Verbindungen diese Farbreaktion ergeben. Die deshalb erforderliche Abtrennung dieser Störsubstanzen vor der Farbreaktion ist ziemlich problematisch.

Auch die bisher beschriebenen papier- und dünnschichtchromatographischen Analysenmethoden, bei denen als Farbreagens bspw. 1,2-Naphthochinon-4-sulfonat eingesetzt wird, sind nicht empfindlich genug.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung von Cyanamid in Pflanzen oder Pflanzenteilen zu entwickeln, welches diese Nachteile des Standes der Technik nicht aufweist, sondern in einfacher Weise eine problemlose Meßmethode mit hoher Empfindlichkeit und hinreichender Genauigkeit bereitstellt und die insbesondere auch für den Spurenbereich geeignet ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man

a) das Cyanamid aus den Pflanzen extrahiert,
b) es anschließend in wäßrig-alkalischem Medium mit 1,2-Naphthochinon-4-sulfonat zu 4-Cyanimido-1,2-Naphthochinon umsetzt,
c) dieses Umsetzungsprodukt durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) an einer Umkehrphase abtrennt und es
d) spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 485 nm oder 272 nm bestimmt.

Es hat sich nämlich überraschenderweise gezeigt, daß man mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens Cyanamid äußerst spezifisch und empfindlich auch in Gegenwart störender Substanzen wie z. B. Aminosäuren nachweisen kann.

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Pflanzen oder Pflanzenteile, insbesondere Trauben, mit den technisch üblichen Geräten zerkleinert und das Cyanamid, welches dann in wäßriger Lösung vorliegt, durch Extraktion aus den Früchten isoliert. Dies erfolgt vorzugsweise durch Flüssig-Flüssig-Extraktion. Als Solvens für die Flüssig-Flüssig-Extraktion sind alle wasserunlöslichen, organischen Lösungsmittel geeignet, die einen ausreichenden Verteilungskoeffizienten bezüglich des Cyanamids im Vergleich zu Wasser aufweisen. Als besonders vorteilhaft haben sich hierbei Ester wie Ethylacetat oder Ether wie Diethylether erwiesen. Die Art der Durchführung der Flüssig-Flüssig-Extraktion kann in beliebiger Weise erfolgen. In der einfachsten Ausführungsform wird das Cyanamid in einer der üblichen Extraktionsapparaturen extrahiert oder durch mehrfaches Ausschütteln der wäßrigen Phase mit dem entsprechenden Solvens gewonnen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die cyanamidhaltige wäßrige Lösung vom unlöslichen Früchterückstand abgetrennt und das Cyanamid anschließend durch Flüssig-Flüssig-Extraktion vorzugsweise an einem festen Adsorbens isoliert, wobei als Extraktionsmittel ebenfalls die genannten wasserunlöslichen organischen Lösungsmittel bzw. Gemische davon in Frage kommen. Als festes Adsorbens wird bevorzugt Kieselgur, insbesondere Diatomeenerde verwendet, doch können im Prinzip auch andere Adsorbenzien wie z. B. Kieselgel u. ä. eingesetzt werden.

Nach der Isolierung des Cyanamids ggf. zusammen mit anderen Pflanzeninhaltsstoffen wird das organische Lösungsmittel entfernt und anschließend die Umsetzung des 1,2-Naphthochinon-4-sulfonats in wäßriger alkalischer Lösung mit dem Cyanamid durchgeführt. Als pH-Wert wird ein solcher von 8 bis 12, vorzugsweise 9,5 bis 10,5 gewählt, um eine möglichst rasche Umsetzung zu erreichen. Die pH-Werteinstellung kann mit den üblichen alkalischen Reagenzien wie Kalium- oder Natriumhydroxid oder Natrium- oder Kaliumcarbonat vorgenommen werden. Auch die Reaktionstemperatur ist eine wesentliche Einflußgröße für die Reaktionsgeschwindigkeit. Sie sollte zwischen 10 und 150°C, vorzugsweise zwischen 80 und 120°C liegen, damit die Reaktion einerseits relativ schnell abläuft, andererseits aber keine Zersetzung des Cyanamids bzw. des Umsetzungsproduktes zwischen dem Cyanamid und dem 1,2-Naphthochinon-4-sulfonat eintritt. Die Menge des eingesetzten 1,2-Naphthochinon-4-sulfonats, welches bevorzugt als Natriumsalz eingesetzt werden kann, richtet sich im wesentlichen nach dem Cyanamidgehalt in der Probe. Das 1,2-Naphthochinon-4- sulfonat muß mindestens in stöchiometrischer Menge zugegen sein, um eine quantitative Umsetzung mit dem Cyanamid zu ermöglichen. Bevorzugt verwendet man einen 10- bis 1000fachen Überschuß bezogen auf den erwarteten Cyanamidgehalt. Die Konzentration der Lösung des 1,2-Naphthochinon- 4-sulfonats kann in weiten Grenzen variiert werden. Bevorzugt ist eine Konzentration von 500 bis 1500 mg pro 1000 ml Reaktionslösung.

Bei der Umsetzung des Cyanamids mit dem 1,2-Naphthochinon- 4-sulfonat im alkalischen Medium entsteht das Natrium- bzw. Kaliumsalz des 4-Cyanimido-1,2-Naphthochinons, als orange-roter Farbstoff. Daneben bilden sich bei der Reaktion noch Nebenprodukte, die in einer nachfolgenden Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) abgetrennt werden müssen. Zur Aufbereitung für die HPLC wird die wäßrige Reaktionslösung nach dem Abkühlen vorzugsweise mit einem Tetraalkylammonium-Salz versetzt und anschließend das entstehende Tetraalkylammonium- Salz des 4-Cyanimido-1,2-Naphthochinons mit einem wasserunlöslichen, organischen Lösungsmittel extrahiert.

Das Tetraalkylammonium-Salz verbessert die Retention des Naphthochinon-Derivats bei der anschließenden Umkehr-Phasen-HPLC und erleichtert somit eine Abtrennung von den Nebenprodukten. Hierbei können die üblichen Tetraalkylammonium-Salze mit gleichen oder verschiedenen Alkylresten, die jeweils 1 bis etwa 12 C-Atome enthalten, z. B. mit Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl- und/oder Octylresten sowie den üblichen Anionen wie z. B. Fluorid, Chlorid, Bromid, Jodid, Hydroxid, Acetat und Hydrogensulfat verwendet werden. Als besonders geeignet hat sich hierbei das Tetrabutylammonium-Hydrogensulfat und das Methyl-trioctylammonium-Chlorid erwiesen.

Als Lösungsmittel für die Extraktion des 4-Cyanimido- 1,2-Naphthochinons kommen vor allem chlorierte Kohlenwasserstoffe wie Dichlormethan, Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff in Frage. Es können jedoch auch noch andere Solvenzien wie Kohlenwasserstoffe (z. B. Toluol) verwendet werden.

Nach der Extraktion des 4-Cyanimido-1,2-Naphthochinons und gegebenenfalls der Nebenprodukte wird das Lösungsmittel bspw. am Rotationsverdampfer, vollständig entfernt und der Rückstand anschließend mit dem für die Hochdruckflüssigkeitschromatographie vorgesehenen Elutionsmittel aufgenommen. Vor der Aufgabe auf das HPLC-System wird das flüssige Gemisch zweckmäßig durch ein Membranfilter von eventuell vorhandenen Farbstoffpartikeln befreit.

Bei der anschließenden Hochdruckflüssigkeitschromatographie an einer Umkehrphase, vorzugsweise an einer handelsüblichen C-B Umkehrphase, erfolgt dann die Auftrennung der Umsetzungsprodukte. Als mobile Phase wird zweckmäßigerweise ein bei der Ionenpaar-Chromatographie übliches Gemisch vorzugsweise als Methyl-trioctylammonium-Salz und Methanol/Wasser/Phosphatpuffer (Verhältnis 800 : 100 : 50 bis 600 : 350 : 50) verwendet. Der Phosphatpuffer weist in diesem Fall vorzugsweise einen pH-Wert von 7,0 auf und besteht wie üblich aus Dinatriumhydrogenphosphat und Kaliumdihydrogenphosphat. Die Menge an Methyl-trioctylammonium- Salz, z. B. Chlorid, liegt normalerweise zwischen 0,1 und 2,0 g pro 1000 ml Methanol/Wasser/Phosphatpuffer- Lösung. Die spektralphotometrische Bestimmung des 4-Cyanimido-1,2-Naphthochinon-Derivats kann bei einer Wellenlänge von 485 nm oder 272 nm erfolgen. Durch Auswertung der Peakhöhe im Vergleich zu einer Standard- Lösung (0,01 mg Cyanamid) läßt sich dann der Cyanamidgehalt bestimmen.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich relativ einfach und problemlos der Cyanamidgehalt mit einer unteren Bestimmungsgrenze von 0,01 bis 0,05 ppm nachweisen.

Die Fig. 1 bis 4 der Zeichnung zeigen HPLC-Chromatogramme, die nach dem Verfahren der Erfindung erhalten wurden, zur weiteren Veranschaulichung.

Fig. 1 zeigt ein Chromatogramm, welches durch zweifache Aufgabe einer Standard-Lösung mit einem Gehalt von 10 µg Cyanamid erhalten wurde. Paek A ist der Cyanamidpeak, Peak B der Nebenprodukt- oder Reagenz- Peak.

Fig. 2 zeigt ein Chromatogramm, das ausgehend von unbehandelten, reifen Trauben erhalten wurde. Die Peaks B sind Störpeaks, die von den Pflanzeninhaltsstoffen herrühren.

Fig. 3 zeigt ein entsprechendes HPLC-Chromatogramm, das ausgehend von reifen Weintrauben, welche mit Cyanamid behandelt wurden, erhalten wurde. Man sieht, daß praktisch kein Cyanamid mehr nachzuweisen ist. Es sind nur die Störpeaks B zu erkennen.

Fig. 4 zeigt Chromatogramme, die ausgehend von unbehandelten Trauben nachträglich zusätzlich mit 10 µg Cyanamid versetzt wurden. Peak A entspricht wieder dem Cyanamid- Peak, Peaks B sind Störpeaks.

Das nachfolgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern:

Beispiel A) Probenaufbereitung

50 g Trauben werden in einem Mixer zerkleinert und dann mit wenig Wasser in einen 250 ml Erlenmeyerkolben gespült und 5 Minuten lang in ein Ultraschallbad gestellt. Danach wird zentrifugiert und der Überstand abdekantiert. Der Niederschlag wird zweimal mit 20 ml Wasser gewaschen und zentrifugiert. Die vereinigten Überstände werden mittels NaOH auf einen pH-Wert von 5,8-6,2 eingestellt und bei einer maximalen Badtemperatur von 35°C am Rotationsverdampfer auf etwa 20 ml eingeengt. Die Probenlösung wird nun mit 10 g Extrelut (Merck. Art. Nr. 11738) aufgenommen und quantitativ auf eine Diatomeenerde enthaltende Fertigsäule (Markenname CT 2050 der Firma ICT) aufgebracht, die zuvor mit 10 ml Wasser beladen wurde. Man beginnt sofort mit der Elution mittels 400 ml Ethylacetat. Unter Zusatz von 30 ml Wasser wird der Ester am Rotationsverdampfer bei max. 35°C abgezogen. Die verbleibende Lösung wird zur nachfolgenden Umsetzung mit 1,2-Naphthochinon-4- sulfonat eingesetzt.

B) Umsetzung und Bestimmung

Die Probenlösung wird mit 5 ml Naphthochinonlösung (Konzentration 1 g 1,2-Naphthochinon-4-sulfonat pro 100 ml Wasser) und mit 10 ml Natriumcarbonatlösung (Konzentration 0,2 Mol/l) versetzt und 5 Min. lang in einem Ölbad auf eine Temperatur von 100°C erhitzt. Anschließend wird die Probenlösung mit einem Eisbad auf Raumtemperatur abgekühlt und quantitativ (mit wenig ml Wasser nachspülen) in einen Schütteltrichter überführt. Nun wird viermal mit je 30 ml Dichlormethan, unter Zusatz von jeweils 1 ml Tetrabutylammonhydrogensulfat-Lösung (Konzentration 0,1 Mol/l) ausgeschüttelt. Die vereinigten, organischen Phasen werden bei 35°C am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird dann mit 5 ml Methanol aufgenommen und nach Filtration durch ein Membranfilter auf das HPCL-System aufgegeben.
Als Standard werden 0,01 mg Cyanamid in gleicher Weise analysiert.

C) Chromatographische Bedingungen

HPLC-System:
Kontron HPLC 600

UV/VIS-Detektor:
Kontron LC 720 (digitale Auflösung 0,001 AE)

Mobile Phase:
0,5 g Methyl-trioctylammonium- Chlorid werden in 1000 ml Methanol/ Phosphatpuffer (1 : 1) gelöst.
Phosphatpuffer:
610 ml Lösung I und 390 ml Lösung II werden gemischt
Lösung I:
11,8 g Dinatriumhydrogenphosphat werden zu 1000 ml mit Wasser gelöst
Lösung II:
9,0 g Kaliumdihydrogenphosphat werden zu 1000 ml mit Wasser gelöst

Trennsäule:
Zorbax C8, 4,6×250 mm (Du Pont Instr.)

Durchflußgeschwindigkeit:
0,8-1,2 ml/Minute

Meßwellenlänge:
485 nm

D) Auswertung

Die Auswertung erfolgt nach folgender Gleichung

ppm CY = Cyanamidgehalt in der Probe (mg/kg)
HPr = Peakhöhe des Signals aus der Probe
Add. = Cyanamidmenge im Standard (µg)
HV = Peakhöhe des Vergleichssignals
Ein = Einwaage Probe (g)

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung von Cyanamid in Pflanzen oder Pflanzenteilen, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) das Cyanamid aus den Pflanzen extrahiert,
b) es anschließend in wäßrig-alkalischem Medium mit 1,2-Naphthochinon-4-sulfonat zu 4-Cyanimido- 1,2-Naphtochinon umsetzt,
c) dieses Umsetzungsprodukt durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie an einer Umkehrphase abtrennt und es
d) spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 485 nm oder 272 nm bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen wäßrigen Pflanzenextrakt herstellt und aus diesem das Cyanamid durch Flüssig-Flüssig- Extraktion abtrennt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion des in Wasser gelösten Cyanamids mit Hilfe von wasserunlöslichen, organischen Lösungsmitteln vornimmt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel Ethylacetat oder Diethylether verwendet.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Isolierung des Cyanamids durch Flüssig- Flüssig-Extraktion an einem festen Adsorbens vornimmt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als festes Adsorbens Kieselgur, insbesondere Diatomeenerde verwendet.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung des Cyanamids mit dem 1,4-Naphthochinon- sulfonat im pH-Bereich von 8 bis 12, vorzugsweise von 9,5 bis 10,5 vornimmt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung des Cyanamids mit dem 1,2-Naphtochinon- 4-sulfonat zwischen 10 und 150°C, insbesondere zwischen 80 und 120°C durchführt.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das 1,2-Naphthochinon-4-sulfonat in mindestens stöchiometrischer Menge zusetzt.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Umsetzungsprodukt von Cyanamid und 1,2-Naphthochinon-sulfonat als Tetraalkylammonium- Salz in die Hochdruckflüssigkeitschromatographie einsetzt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung des Tetraalkylammonium-Salzes Tetrabutylammonium-Hydrogensulfat oder Methyltrioctylammonium- Chlorid verwendet.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das 4-Cyanimido-1,2-Naphthochinonsalz aus dem alkalisch wäßrigen Medium mit einem organischen Lösungsmittel, wie einem chlorierten Kohlenwasserstoff, insbesondere Methylenchlorid, extrahiert.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hochdruckflüssigkeitschromatographie an einer C-8 Umkehrphase durchführt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als mobile Phase für die Hochdruckflüssigkeitschromatographie ein Gemisch aus Methyl-trioctylammonium- Salz und Methanol/Wasser/Phosphatpuffer-Lösung (Verhältnis 850 : 100 : 50 bis 600 : 350 : 50) einsetzt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Phosphatpuffer einen pH-Wert von 7,0 aufweist.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man 0,1 bis 2,0 g Methyl-trioctylammonium-Salz pro 1000 ml Methanol/Wasser/Phosphatpuffer-Lösung verwendet.